Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية متعددة المكونات باستخدام اختبار حركية Kinesin المنزلق

Published: July 26, 2021 doi: 10.3791/60899
Automatic Translation
1, 1
1Center for Integrated Nanotechnologies, Sandia National Laboratories

Summary

يصف هذا البروتوكول عملية لتصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية باستخدام حركية كينيسين الانزلاقية بالتزامن مع الحويصلات الدهنية أحادية الصفيحة العملاقة.

Abstract

تمثل شبكات الأنابيب النانوية الدهنية (LNT) نظاما نموذجيا في المختبر لدراسة النقل الجزيئي والفيزياء الحيوية للدهون ذات الصلة بأنابيب الدهون الموجودة في كل مكان الموجودة في الخلايا حقيقية النواة. ومع ذلك ، في الجسم الحي LNTs هي هياكل غير متوازنة للغاية تتطلب طاقة كيميائية ومحركات جزيئية ليتم تجميعها وصيانتها وإعادة تنظيمها. علاوة على ذلك ، فإن تكوين LNTs في الجسم الحي معقد ، ويتألف من أنواع مختلفة من الدهون. الطرق النموذجية لبثق LNTs تتطلب وقتا طويلا وعمالة كثيفة ، وتتطلب ملاقط بصرية ، وبيدات دقيقة ، وماصات دقيقة لسحب الأنابيب النانوية بالقوة من حويصلات الدهون العملاقة. يظهر هنا بروتوكول لفحص حركية الانزلاق (GMA) ، حيث يتم إنشاء شبكات LNT واسعة النطاق بسرعة من حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) باستخدام حركية الأنابيب الدقيقة التي تعمل بالطاقة الكينيسينية. باستخدام هذه الطريقة ، يتم تشكيل شبكات LNT من مجموعة واسعة من تركيبات الدهون التي تحاكي تعقيد LNTs البيولوجية ، مما يجعلها مفيدة بشكل متزايد للدراسات في المختبر للفيزياء الحيوية للدهون والنقل المرتبط بالغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الطريقة قادرة على إنتاج شبكات LNT بشكل موثوق به في وقت قصير (<30 دقيقة) باستخدام معدات المختبرات شائعة الاستخدام. خصائص شبكة LNT مثل الطول والعرض وتقسيم الدهون قابلة للضبط أيضا عن طريق تغيير تكوين الدهون من GUVs المستخدمة لتصنيع الشبكات.

Introduction

إن تصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية (LNT) ذو أهمية متزايدة للفحص المختبري للهياكل الدهنية غير المتوازنة1،2،3. تستخدم الخلايا أنابيب الدهون للنقل المنتشر للبروتينات4 والأحماض النووية5 وكذلك الاتصال من خلية إلى خلية 6,7. تعتبر الشبكة الإندوبلازمية وجهاز غولجي مثيرة للاهتمام بشكل خاص ، حيث أن هذه العضيات المرتبطة بالغشاء هي المواقع الرئيسية لتخليق الدهون والبروتين وكذلك نقل هذه الجزيئات الحيوية المتكاملة داخل سيتوبلازم الخلية 8,9. تتكون أغشية هذه العضيات من أنواع متعددة من الدهون بما في ذلك الدهون السفينغولية والكوليسترول والفوسفوليبيد10 التي تساعد في نهاية المطاف على تحديد وظائفها. وبالتالي ، لتكرار هذه العضيات ودراستها عن كثب ، يجب تصنيع LNTs في المختبر من الحويصلات ذات تركيبات الدهون المعقدة بشكل متزايد11.

تستخدم حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) على نطاق واسع لدراسة سلوك الغشاء الدهني لأنه يمكن تصنيعها بشكل موثوق مع تركيبات معقدة تشمل الكوليسترول والفوسفاتيديل كولين (PC) والفوسفاتيديل إيثانولامين (PE) والفوسفاتيديل سيرين (PS) والفوسفاتيديلينوسيتول (PI) 12,13. الموصوفة هنا هي طريقة لتصنيع LNTs من GUVs مع تركيبات دهنية مختلفة باستخدام مقايسة الحركة الانزلاقية (GMA) ، حيث يتم بثق LNTs بناء على العمل الذي تقوم به محركات kinesin وخيوط microtubule التي تعمل على GUVs. في هذا النظام ، تدفع البروتينات الحركية كينيسين الممتصة إلى سطح الأنابيب الدقيقة البيوتينيل ، وتحول الطاقة الكيميائية من التحلل المائي ل ATP إلى عمل مفيد (على وجه التحديد ، بثق LNTs من الحويصلات البيوتينيلية)11. توفر شبكة LNT الناتجة منصة نموذجية لدراسة آثار الاختلافات في مراحل الدهون على التغيرات في مورفولوجيا LNT.

باختصار ، يتم إدخال بروتينات محرك كينيسين في غرفة تدفق في محلول يحتوي على الكازين ، مما يتيح امتزاز المحركات على السطح الزجاجي للغرفة. بعد ذلك ، تتدفق الأنابيب الدقيقة البيوتينيل في محلول يحتوي على ATP عبر الغرفة ويسمح لها بالارتباط بمحركات kinesin وتبدأ الحركة. ثم يتم إدخال محلول ستربتافيدين في الغرفة ويسمح له بالارتباط بشكل غير تساهمي بالأنابيب الدقيقة. وأخيرا ، يتم إدخال GUVs التي تحتوي على دهون البيوتينيل إلى الغرفة وترتبط بالأنابيب الدقيقة المغلفة بالستربتافيدين ، ثم تقذف LNTs لتشكيل شبكات واسعة النطاق على مدار 15-30 دقيقة. تنتج هذه الطريقة شبكات LNT كبيرة ومتفرعة باستخدام معدات المختبرات القياسية والكواشف بتكلفة منخفضة11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد حلول الأنابيب الدقيقة للمخزون

تنبيه: يجب دائما ارتداء نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر طوال البروتوكول.

  1. تحضير 5x BRB80 العازل: إضافة 24.19 غرام من الأنابيب (بيبيرازين-N، N′-مكرر [2-حمض الإيثان سلفونيك]) و 0.38 غرام من EGTA (الإيثيلين جلايكول-بيس [β-أمينو إيثيل الأثير]-N,N,N′,N′-حمض رباعي الأسيتيك) إلى زجاجة زجاجية سعة 1 لتر. أضف 1 مل من 1 M MgCl2 واضبط الرقم الهيدروجيني على 6.9 مع KOH. أضف الماء منزوع الأيونات للوصول بالمحلول إلى حجم نهائي يبلغ 500 مل.
  2. تحضير مخزون 100 mM من محلول GTP: يزن 52 ملغ من GTP ويعلق في 1 مل من الماء المقطر. قسم محلول 100 mM إلى 20 ميكرولتر من الأليكوتات وخزنه عند -20 درجة مئوية.
  3. تحضير محلول GPEM: امزج 200 ميكرولتر من 5x BRB80 ، و 10 ميكرولتر من محلول GTP 100 mM ، و 100 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 100٪ ، و 600 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. قسم حل GPEM في 100 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. قم بإعداد محلول الأنابيب الدقيقة عن طريق إعادة تشكيل قوارير من التوبولين المجفف بالتجميد المتاح تجاريا (قارورة واحدة لكل من البيوتينيل ، الموسوم بالفلورسنت ، وغير الموسوم) في محلول GPEM البارد (4 درجات مئوية) إلى تركيز مخزون يبلغ 5 ملغ / مل.
  5. قم بإجراء بلمرة الأنابيب الدقيقة عن طريق خلط 4 ميكرولتر من التوبولين الحيوي ، و 4 ميكرولتر من التوبولين المسمى بالفلورسنت ، و 24 ميكرولتر من التوبولين غير المسمى (كل ذلك بتركيزات 5 ملغ / مل) لإنشاء نسبة 1: 1: 6 عند حجم نهائي قدره 32 مل. احتفظ به على الجليد. يقسم خليط التوبولين إلى 2 ميكرولتر أليكوت ويخزن في -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
    ملاحظة: تتطلب البلمرة الفعالة أن يكون تركيز التوبولين مساويا للتركيز الحرج أو أعلى منه (5 ملغم/مل)14. هنا ، يتم تحسين اختيار نسبة التوبولين للحصول على تركيز كاف من التوبولين البيوتينيل لربط الستربتافيدين و GUVs بكفاءة ، بالإضافة إلى تركيز كاف من التوبولين الفلورسنت للتوصيف المجهري.

2. إعداد حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs)

  1. إعداد فيلم أغاروز
    ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من Greene et al.15.
    1. تحضير محلول 1٪ ث / v عن طريق خلط 1 غرام من الأغاروز في 100 مل من الماء منزوع الأيونات في 250 مل من قارورة Erlenmeyer. استخدم ميكروويف قياسي لتسخين محلول الأغاروز لمدة 1-2 دقيقة.
      ملاحظة: سيصبح المحلول شفافا بمجرد إذابة الأغاروز تماما. اترك المحلول يبرد إلى 65-75 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    2. استخدم طرف ماصة مقطوع 1000 ميكرولتر لماصة 300-400 ميكرولتر من محلول الأغاروز على غطاء زجاجي مقاس 25 مم × 25 مم. أثناء الإمساك بحافة الغطاء بأصابع القفاز ، استخدم طرف ماصة آخر سعة 1000 ميكرولتر لنشر الأغاروز المذاب بالتساوي عبر الغطاء .
      ملاحظة: إن الحفاظ على الأغاروز عند 65-75 درجة مئوية سيسمح بالانتشار الفعال على سطح الغطاء.
    3. جفف الأغطية المطلية بالأغاروز في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل ، وعند هذه النقطة ستصبح الأغاروز شفافة. قم بتخزين الأغطية عن طريق وضع السطح المطلي بالأغاروز متجها لأعلى على سطح نظيف مثل الورق الخالي من الوبر أو الفيلم القائم على الشمع في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. تركيبة الدهون
    1. استرجع الدهون الذائبة في الكلوروفورم من الفريزر -20 درجة مئوية وضعها في غطاء دخان كيميائي حتى تصل إلى RT.
    2. احسب حجم مخزون الدهون لكل مكون من الدهون اللازمة للتركيبة باستخدام الصيغة التالية:
      Equation 1
      حيث: V الدهون هي حجم الدهون المراد استخدامها ، و mol ٪ هي النسبة المئوية المولية لمكون الدهون ، n هي إجمالي عدد مولات الدهون المستخدمة في التركيبة ، و M هي تركيز الدهون في الوحدات المولية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم استخدام تركيبة تحتوي على 45٪ مول٪ 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) بتركيز محلول مخزون يبلغ 12.72 ملليمتر، وميكرومول واحد من إجمالي الدهون في التركيبة، فإن حجم مخزون DOPC المستخدم في التركيبة سيكون:
      Equation 2
    3. امزج الدهون معا بنسبة محسوبة في قارورة زجاجية في غطاء الدخان الكيميائي.
    4. ماصة 30 ميكرولتر من محلول الدهون على الغطاء المطلي بالأغاروز على صفيحة ساخنة مسخنة مسبقا يتم تعيينها فوق نقطة انصهار مكون الدهون المشبعة في التركيبة (على سبيل المثال ، صفيحة ساخنة 50 درجة مئوية للدهون مع Tm من 40 درجة مئوية).
    5. انشر المحلول عبر فيلم الأغاروز في حركة دائرية باستخدام الحافة الطويلة لإبرة 18 جم حتى يتبخر الكلوروفورم وتتشكل طبقة موحدة من الدهون. أمسك حافة الغطاء بأصابع القفاز أثناء تنفيذ هذه الخطوة.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم إتلاف طبقة الأغاروز بالإبرة.
    6. ضع الغطاء مع طبقة الأغاروز وفيلم الدهون في طبق بتري مغطى بورق الألمنيوم ، ووجه جانب الفيلم لأعلى ، وضع طبق بتري في مجفف فراغ لمدة 2 ساعة على الأقل لإزالة المذيبات المتبقية.
  3. في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول السكروز 560 mM عن طريق خلط 1.92 غرام من السكروز مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: يعتمد تركيز محلول السكروز على الأسمولية للمركبات متعددة الاستخدامات العازلة التي يتم تخفيفها. عادة ، يجب ألا تزيد أوزمولية محلول السكروز عن 10٪ أكبر من المخزن المؤقت الذي سيتم تخفيف GUVs فيه ، وتحديدا المخزن المؤقت للحركة (انظر الخطوة 3.11).
  4. تشكيل GUV
    1. قم بلصق غرفة لاصقة بالغطاء المطلي بغشاء الدهون عن طريق الضغط برفق على الغرفة اللاصقة على الغطاء المطلي بالدهون مع توجيه فيلم الدهون لأعلى ، مما يضمن تشكيل ختم محكم.
    2. أضف 400 ميكرولتر من محلول السكروز 560 mM (المحضر في الخطوة 2.3) إلى الغرفة.
    3. ضع الغطاء في غرفة الرطوبة وأغلق الغطاء.
    4. ضع غرفة الرطوبة على صفيحة ساخنة مسخنة مسبقا فوق نقطة انصهار مكون الدهون المشبعة في التركيبة.
    5. اسمح للحويصلات بالتشكل لمدة ≥1 ساعة قبل الشفاء.
      ملاحظة: يمكن فحص تكوين الحويصلة باستخدام الفحص المجهري الفلوري باستخدام عدسة الهدف الجوي 40x.

3. إعداد مخزون مقايسة الحركة والكواشف

  1. إعداد مخزون الكازين
    1. أضف 3 غرام من الكازين الجاف إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل ، ثم أضف 30 مل من 1x BRB80 وقم بالتدوير حتى يصبح المحلول لزجا. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 15000 × جم لمدة 30 دقيقة.
    2. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي آخر سعة 50 مل وتخلص من الكرية. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح حقنة 1 ميكرومتر ، وجمع المحلول في قارورة مخروطية سعة 50 مل. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر ، وجمع المحلول في قارورة مخروطية سعة 50 مل.
    3. حدد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV-Vis وكوفيت الكوارتز.
    4. احسب تركيز الكازين في ملغم/مل باستخدام الصيغة التالية:
      Equation 3
    5. قم بتخفيف المحلول إلى 20 مجم / مل في 1x BRB80 ، وقسمه إلى 100 ميكرولتر أليكوتس ، وخزنه عند -20 درجة مئوية.
  2. تحضير محلول أوكسيديز الجلوكوز (2 مجم / مل) عن طريق خلط 2 ملغ من أوكسيديز الجلوكوز مع 1 مل من 1x BRB80. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  3. تحضير محلول الكاتالاز (0.8 ملغ / مل) عن طريق خلط 0.8 ملغ من الكاتالاز مع 1 مل من 1x BRB80. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  4. تحضير محلول الجلوكوز 2 M عن طريق تعليق 0.3 غرام من الجلوكوز D في 1 مل من الماء منزوع الأيونات. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  5. قم بتحضير مخزون DTT سعة 100 مللي متر عن طريق تعليق 0.015 جم من DTT في 1 مل من الماء منزوع الأيونات. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  6. تحضير مخزون 100 mM Mg-ATP عن طريق تعليق 0.055 g من ATP ثنائي الصوديوم في محلول 1 مل من 100 mM MgCl2. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  7. قم بتحضير محلول 100 mM Mg-AMP-PNP عن طريق تعليق 0.055 جم من AMP-PNP في محلول 1 مل من 100 mM MgCl2 ، ثم قسمه إلى 100 ميكرولتر من الأليكوت وخزنه عند -20 درجة مئوية.
  8. تحضير محلول Trolox 100 mM عن طريق إضافة 25.03 ملغ من Trolox إلى 1 مل من الميثانول وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  9. تحضير محلول ستربتافيدين 10 ملغم / مل عن طريق إضافة 1 ملغ من الستربتافيدين إلى 100 ميكرولتر من BRB80 ، ثم قسمها إلى 2 ميكرولتر أليكوت وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  10. تحضير BRB90CAT عن طريق خلط 200 ميكرولتر من 5x BRB80 ، 20 ميكرولتر من محلول الكازين ، 10 ميكرولتر من محلول MgATP ، 10 ميكرولتر من Trolox ، 5 ميكرولتر من محلول باكليتاكسيل ، و 765 ميكرولتر من ماء DI. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  11. تحضير محلول الحركة عن طريق خلط 192 ميكرولتر من BRB80CAT ، و 2 ميكرولتر من محلول الجلوكوز D ، و 2 ميكرولتر من محلول أوكسيديز الجلوكوز ، و 2 ميكرولتر من محلول DTT ، و 2 ميكرولتر من محلول الكاتالاز. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  12. قم بإعداد محلول كينيسين 1 ميكرومتر عن طريق تخفيف محلول كينيسين المخزون في BRB80CAT (على سبيل المثال ، 2 ميكرولتر من محلول كينيسين 50 mM في 98 ميكرولتر من BRB80CAT) وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  13. قم بإعداد محلول 10 ميكروغرام / مل من الأنابيب الدقيقة عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة المستقرة في 90 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة BRB80CAT. يخزن في RT.
  14. تحضير محلول ستربتافيدين 10 ميكروغرام/مل عن طريق إضافة 0.1 ميكرولتر من محلول ستربتافيدين 10 ملغم/مل في 99.9 ميكرولتر من محلول الحركة. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  15. قم بإعداد محلول GUV 12x عن طريق تخفيف 5 ميكرولتر من مخزون GUV إلى 55 ميكرولتر من محلول الحركة. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  16. بلمرة التوبولين إلى أنابيب دقيقة
    1. اجمع أليكوت 2 ميكرولتر معد مسبقا من التوبولين من الفريزر -80 درجة مئوية (المحضر في الخطوة 1.5) وضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. تحضير محلول باكليتاكسيل 2 مللي متر عن طريق إضافة 1.71 ملغ من باكليتاكسيل في 1 مل من DMSO اللامائي ، وتقسيمها إلى 10 ميكرولتر أليكوتس ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    3. تحضير BRB80T طازجا عن طريق خلط 99.5 ميكرولتر من 1x BRB80 مع 0.5 ميكرولتر من 2 mM paclitaxel.  تدفئة 100 ميكرولتر من BRB80T إلى 37 درجة مئوية في الحمام المائي.
    4. بعد 30 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من BRB80T إلى أليكوت توبولين لتحقيق الاستقرار في الأنابيب الدقيقة. يخزن في RT.

4. فحص الحركة المنزلقة (GMA)

  1. قم بإعداد غرفة تدفق عن طريق لصق شريطين من الشريط على الوجهين مفصولين بمقدار 5 مم على شريحة زجاجية. كرر هذه العملية حتى تشكل ثلاث طبقات من الشريط كل شريط.
  2. ضع غطاء أعلى الشريط، ثم اضغط برفق على واجهة الغطاء/الشريط باستخدام ملاقط أو قلم لضمان الالتصاق الكافي.
    ملاحظة: يجب أن يكون عرض القناة 5 مم وطولها 25 مم وارتفاعها 300 مم.
  3. ماصة 30 ميكرولتر من محلول كينيسين 1 مم (أعدت في الخطوة 3.12) في خلية التدفق واتركها تحضن لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يشكل الكازين طبقة ثنائية الطبقة على سطح شريحة الغطاء / الزجاج ويسهل ربط ذيل كينيسين بالسطح.
  4. ماصة 30 ميكرولتر من محلول الأنابيب الدقيقة 10 ميكروغرام / مل (المحضر في الخطوة 3.13) في خلية التدفق ، باستخدام مسح مختبري مضغوط برفق على الطرف الآخر من قناة التدفق لتسهيل تبادل المحلول. احتضان لمدة 5 دقائق.
  5. اغسل خلية التدفق 1x-3x بمحلول الحركة 1x في RT (تم إعداده في الخطوة 3.11).
    ملاحظة: يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري باستخدام هدف هوائي 40x في هذه المرحلة لتأكيد ارتباط الأنابيب الدقيقة وحركيتها. تظهر الأنابيب الدقيقة على شكل خيوط فلورسنت (طولها عشرات الميكرونات) تتحرك (تنزلق عبر السطح عند ~ 0.5 ميكرومتر / ثانية (الشكل 1).
  6. ماصة 30 ميكرولتر من محلول ستربتافيدين 10 ميكروغرام / مل (محضر في الخطوة 3.14) في خلية التدفق باستخدام مسح مختبري مضغوط برفق على الطرف الآخر من قناة التدفق لتسهيل تبادل المحلول. احتضان لمدة 10 دقائق.
  7. تدفق 30 ميكرولتر من محلول GUV 12x (المعد في الخطوة 3.15) في التدفق باستخدام مسح مختبري مضغوط برفق على الطرف الآخر من قناة التدفق لتسهيل تبادل المحلول. تحضن لمدة 30 دقيقة.
  8. أضف 2 ميكرولتر من محلول 100 mM AMP-PNP (المعد في الخطوة 3.7) لوقف الحركة ، ثم أغلق الغرفة بمادة مانعة للتسرب.

5. توصيف شبكة LNT

  1. انقل غرفة التدفق إلى مجهر مقلوب للتصوير.
  2. اختر مجموعة المرشحات المناسبة بناء على الأطوال الموجية للدهون الفلورية أو التوبولين المستخدمة. على سبيل المثال ، عند استخدام الدهون ذات العلامات الحمراء في تكساس ، استخدم مرشح إثارة 560 نانومتر / 25 نانومتر ومرشح انبعاث 607 نانومتر / 36 نانومتر.
  3. استخدم هدف زيت 100x للتركيز على سطح الغطاء.
  4. صورة لشبكات LNT باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
    ملاحظة: LNTs هي هياكل خطية تقذف من الحويصلات الأكبر. LNTs أصغر بكثير من GUVs ولها إشارات فلورية أضعف. وبالتالي ، يجب ضبط التعريض الضوئي والتباين وفقا ل LNTs للصورة. وتؤدي هذه التعديلات أيضا إلى التعرض المفرط للمركبات متعددة الرسومات، ومن ثم، يوصى بوصف الصفائح والفصل الطوري في المركبات متعددة الاستخدامات بشكل مستقل.
  5. ركز المجهر على شبكة ذات أهمية والتقط صورة قياسية أو مبلطة.
  6. اضبط وقت التعريض الضوئي ومرشحات الكثافة المحايدة لتصوير LNTs وتقليل التعرض المشبع للمركبات متعددة الرسومات. احصل على صور في كل من القنوات الحمراء والخضراء.
    ملاحظة: هنا ، تسمح القناة الحمراء بتصور الدهون الحمراء في تكساس ، بينما تسمح القناة الخضراء بتصور الأنابيب الدقيقة (على سبيل المثال ، دهون أوريغون الخضراء وأصباغ HiLyte488).
  7. قم بإنشاء صورة مركبة عن طريق تراكب القنوات الحمراء والخضراء (الشكل 1).
  8. توصيف شبكات LNT عن طريق قياس طول LNT
    1. افتح الصور التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج تحليل الصور مثل ImageJ.
    2. قم بمعايرة مقياس المجهر باستخدام ميزة المقياس المعين، واملأ وحدات البكسل إلى عامل تحويل مم، وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: يعتمد عامل التحويل على المجهر والعدسة الموضوعية والكاميرا، ويمكن الحصول عليه باستخدام شريحة معايرة المجهر. يتم التعبير عنه بشكل عام بالبكسل / مم.
    3. استخدم أداة الخط متعدد النقاط لقياس طول الأنابيب النانوية بدءا من GUV الأصلي. اضغط باستمرار على Ctrl + M لقياس الطول.
    4. استمر في قياس أطوال الأنابيب الفردية باتباع الخطوات المذكورة أعلاه. ستقوم أداة معالجة الصور بحفظ كل قياس جديد في نافذة النتائج.
    5. اضغط باستمرار على Ctrl + D بعد رسم كل خط لتتبع الأنابيب التي تم قياسها.
  9. قياس سمك LNT (الشكل 2)
    1. افتح الصورة في ImageJ وحدد ميزة العتبة ضمن علامة التبويب صورة .
    2. انقر على تطبيق لتطبيق الحد الأدنى.
    3. ارسم مستطيلا بطول معروف فوق الأنبوب المطلوب (البيكسلات السوداء لها قيمة 0، والبيكسلات الحمراء لها قيمة 255).
    4. قياس الكثافة المتكاملة للمنطقة.
    5. اقسم الكثافة على طول LNT (بالبكسل) للحصول على السماكة (بالبكسل).
      ملاحظة: لا يمكن مقارنة قياسات السماكة عبر الصور إلا عند تعيين إعدادات التصوير والعتبة بشكل متطابق.
  10. تحديد تقسيم الدهون في عقد LNTs (الشكل 3)
    1. افتح الصورة في ImageJ.
    2. استخدم أداة الخط لرسم خط فوق العقدة المطلوبة.
    3. قياس شدة العقدة في كل من قناتي أوريغون غرين وتكساس الحمراء.
    4. انقل الخط إلى LNT وقم بقياس كثافة LNT في كل من قناتي أوريغون غرين وتكساس ريد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تصنيع شبكات LNT (الشكل 4) باستخدام البروتوكول الموصوف ، والذي يستخدم العمل الذي يؤديه نقل الكينيسين للأنابيب الدقيقة لبثق LNTs من GUVs. باختصار ، تم تحضير GUVs باستخدام إماهة هلام الأغاروز باستخدام محلول السكروز ، وتم بلمرة الأنابيب الدقيقة في محلول GPEM واستقرت في BRB80T. بعد ذلك ، تم إدخال محركات كينيسين في خلية تدفق تشكل طبقة نشطة من المحركات على سطح الغطاء. ثم أدخلت الأنابيب الدقيقة وأضيفت محلول ستربتافيدين ، مما سهل الارتباط بين الدهون البيوتينيل و GUVs (التي تم إدخالها لاحقا).

مع وجود جميع المكونات في خلية التدفق ، تم السماح ل LNTs بالتشكل لمدة 30 دقيقة ، وعند هذه النقطة تم إدخال AMP-PNP لوقف الحركة. بعد ذلك ، تم تصوير LNTs تحت مجهر epifluorescence باستخدام هدف نفطي 100x. LNTs يمكن أن تكون كبيرة جدا. وبالتالي ، يمكن أيضا استخدام هدف أقل طاقة لالتقاط LNTs أكبر. تتميز شبكات LNT بنتوءات رقيقة تشبه الويب تمتد من GUVs وتتصل بها. يعتمد عدد LNTs وتفرعها على عدة عوامل ، بما في ذلك كثافة الأنابيب الدقيقة على السطح ، وتركيز الستربتافيدين ، وعدد الكائنات متعددة الاستخدامات الموجودة.

يمكن لهذه الطريقة توليد GUVs و LNTs تتكون من مراحل صلبة ومضطربة سائلة ومرتبة بالسائل ، بالإضافة إلى حويصلات مفصولة عن الطور تظهر تعايشا بين هذه المراحل عبر مجموعة واسعة من التراكيب المختلفة (الشكل 4). على سبيل المثال ، يؤدي توليف الحويصلات مع 45٪ من الدهون المشبعة و 55٪ من الدهون غير المشبعة إلى حويصلات تنفصل إلى مراحل سائلة مضطربة وصلبة متعايشة. ومع ذلك ، إذا تم تضمين الكوليسترول ، فيمكن ملاحظة التعايش السائل والسائل. على سبيل المثال ، فإن الخليط المكون من 50٪ من الدهون غير المشبعة و 30٪ من الكوليسترول و 20٪ من الدهون المشبعة سيخلق GUVs تنفصل إلى مراحل سائلة (Lo) ومضطربة بالسائل (LD). يؤدي دمج الكوليسترول في هذه التركيبة إلى تسييل الدهون المشبعة ، مما يتيح تكوين مرحلة سائلة.

وعلاوة على ذلك، لوحظت العقد (أي الهياكل الكروية المستديرة الأكبر من LNTs) تتشكل في مخاليط مفصولة عن الطور (الشكل 4). يمكن وصف تقسيم أنواع الدهون داخل الأنابيب النانوية والعقد باستخدام أداة ملف تعريف الخط للعثور على أقصى كثافة ذروة مطروحة في الخلفية للعقدة. تم تحديد ملفات تعريف الخط للعقدة و LNT وتم طرح التألق الخلفي لهذه الملفات لتحديد القيمة القصوى. ثم يتم حساب التقسيم عن طريق قسمة القيمة القصوى للتألق في العقدة على الحد الأقصى لقيمة التألق في LNT. يتيح هذا النهج تقسيم الدهون في كل من LNT وكذلك العقد التي تتشكل في الشبكات الأكبر.

Figure 1
الشكل 1: صورة مركبة ل LNTs المصنعة من GUVs والأنابيب الدقيقة. يتم قذف LNTs من GUVs بواسطة الأنابيب الدقيقة المتحركة التي تنزلق فوق محركات kinesin. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: عملية العتبة للحصول على سمك. (أ) حدد عتبة ضمن علامة التبويب ضبط | الصورة. (ب) تطبيق العتبة. (ج) ارسم مستطيلا بطول معروف فوق الأنبوب المطلوب. تحتوي وحدات البكسل السوداء على قيمة 0 والبكسل الأحمر على قيمة 255. (د) قياس الكثافة المتكاملة للمنطقة. لحساب عرض الأنبوب، اقسم الكثافة المتكاملة على 255، ثم قسم هذا الناتج على طول المستطيل الذي تم إنشاؤه في (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحديد تقسيم الدهون في العقد. (أ) افتح الصورة في ImageJ واستخدم أداة الخط لرسم خط فوق العقدة المطلوبة. (ب) قياس شدة العقدة في قناة أوريغون الخضراء. (ج) حرك الخط إلى LNT وقم بقياس الكثافة في قناة أوريغون الخضراء. (دال، هاء، و) كرر العملية لقناة تكساس الحمراء. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: LNTs المصنعة من تركيبات مختلفة من الدهون GUV. LNTs المبثوقة من مرحلة السائل المضطرب (LD) رقيقة وطويلة ، في حين أن LNTs المبثوقة من مرحلة السائل المطلوب (Lo) قصيرة وسميكة. ويلاحظ أن ال LNTs من كلا النوعين تستخدم الحويصلات المنفصلة عن الطور Lo-L D في GMA. تشبه LNTs من GUVs ذات الطور السائل الصلب تلك المبثوقة من LD GUVs. يمكن إنشاء تركيبات مرتبة بالسائل باستخدام مزيج من الدهون المشبعة والكوليسترول ، في حين يتم إنشاء تركيبات مضطربة بالسائل باستخدام الدهون غير المشبعة. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعد شبكات LNT أداة مفيدة للدراسات المخبرية لخصائص الغشاء ونقل الجزيئات الحيوية مثل البروتينات عبر الغشاء. علاوة على ذلك ، فإن استخدام تركيبات الدهون المعقدة لتصنيع شبكات LNT يتيح إجراء المزيد من الدراسات ذات الصلة بيولوجيا. استخدمت دراسات تصنيع أخرى إما 1) تركيبات دهنية بسيطة وحويصلات متعددة الصفائح أو 2) تقنيات حركية أكثر تعقيدا لتصنيع شبكات من GUVs تتكون من تركيبات دهنية معقدة. تتيح الطريقة الموضحة هنا التصنيع الفعال لشبكات LNT واسعة النطاق من تركيبات الدهون المعقدة و GUVs واستخدام كواشف ومعدات غير مكلفة. على هذا النحو ، توفر هذه المنهجية القدرة على دراسة مجموعة من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك فصل الطور ونقل البروتين الغشائي. يستخدم البروتوكول نموذجا في المختبر يمكن فيه ضبط تكوين LNTs على النحو الأمثل لتقريب نظائرها البيولوجية (على سبيل المثال ، جهاز Golgi).

إن تشكيل شبكات LNT بالطريقة الموضحة هنا له العديد من المزايا. على سبيل المثال ، يتم بلمرة الأنابيب الدقيقة بسهولة وسرعة باستخدام توبولين مجفف بالتجميد ، وتظل مستقرة عند RT لمدة 1-2 أسابيع على الأقل عند استقرارها مع باكليتاكسيل16. على هذا النحو ، يتم تنفيذها بسهولة لدفع قذف LNTs وتشكيل شبكات واسعة النطاق 1,2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تشكيل GUVs المكونة من مكونات دهنية متعددة (أي الدهون والكوليسترول غير المشبع والمشبع) بسرعة بناء على بروتوكول سابق مع تعديلات طفيفة. تمكن هذه التعديلات من تخليق GUVs القادرة على الخضوع للعملية الكيميائية الفيزيائية لفصل طور الغشاء. بمجرد إعدادها ، يمكن تخزين GUVs لأسابيع إلى أشهر اعتمادا على ظروف التخزين. ومع ذلك ، يوصى باستخدام GUVS لمدة تصل إلى 1 شهر قبل إعداد دفعة جديدة. يمكن تخزين محاليل الدهون عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لعدة أشهر ، بالإضافة إلى جل الأغاروز والأغطية المطلية ، والتي يمكن تخزينها في RT لعدة أشهر. يجب تخزين الأغشية الدهنية الموجودة على الأغطية المطلية بالأغاروز تحت فراغ وإعادة ترطيبها في غضون 48 ساعة.

أحد التحديات التي تواجه استخدام هذه التقنية لتشكيل LNTs من GUVs هو موازنة تركيز GUVs و streptavidin و microtubules في خلية التدفق. على سبيل المثال ، سيكون تكوين LNT محدودا إذا كانت النسبة بين الأنابيب الدقيقة إلى GUVs غير صحيحة. إذا كان تركيز GUVs منخفضا جدا ، فلن تتشكل المجاميع ، وهي الخطوة الأولى في تكوين LNT. وفيما يتعلق بتركيزات النبيبات الدقيقة والكائنات الجوية الأحادية البنفسجية الموصوفة في هذا البروتوكول، أدى تخفيف مخزون الأنابيب الدقيقة بمقدار 10 أضعاف وتخفيف مخزون النبيبات الدقيقة بمقدار 12 ضعفا عموما إلى شبكات LNT جيدة. كما أدت عمليات التخفيف بمقدار 5x و 6x ، على التوالي ، إلى شبكات جيدة.

وثمة تحد آخر يتمثل في ضمان توازن حل GUV بشكل تناضحي مع محلول الأنابيب الدقيقة. إذا كان الفرق في الأسمولية بين الحلين كبيرا جدا ، فستصبح GUVs غير مستقرة وربما تنفجر. إذا لم تكن المحاليل متوازنة تناغميا (على سبيل المثال ، فرق بنسبة 10٪ بين الأسمولية المقاسة بين الحلين) ، فيجب استخدام محلول سكروز مركز (على سبيل المثال ، 2 M) لزيادة الأسمولية للمحلول مع الأسمولية الأقل قياسا. هناك قيد آخر لهذا النظام وهو استقرار شبكات LNT الناتجة ، والتي تكون مستقرة في ترتيب الساعات وتعتمد اعتمادا كبيرا على غرفة التدفق التي يتم ترطيبها باستمرار (أو إغلاق الغرفة بمادة مانعة للتسرب). بمجرد تبخر المحلول من غرفة التدفق ، لن تكون LNTs مفيدة بعد الآن ، على الرغم من حقيقة أن وجود عدد قليل من LNTs المتبقية قد يستمر بعد التبخر.

قد تكون شبكات LNT التي تم إنشاؤها من هذه الأنابيب الدقيقة الانزلاقية و GUVs مفيدة في فهم ديناميكيات الطبقة الثنائية للدهون وكذلك انتشار البروتين (على سبيل المثال ، البروتينات عبر الغشاء) على أسطح الغشاء. يمكن للبروتوكول الموصوف هنا إنشاء شبكات LNT بسرعة تتكون من تركيبات دهنية مختلفة تحاكي بسهولة أكبر الأنابيب النانوية النفقية البيولوجية الشبيهة ب LNT بالإضافة إلى الأنابيب النانوية الموجودة في العضيات المرتبطة بالغشاء (أي الشبكة الإندوبلازمية وجهاز غولجي). تعد القدرة على تشكيل شبكات LNT واسعة النطاق خطوة أولى رئيسية نحو دراسة الاتصالات الخلوية ، ودراسة نقل الجزيئات الحيوية النانوية ، وتطوير شبكات عصبية اصطناعية. يفتح هذا البروتوكول الباب أمام دراسات أوسع نطاقا حول الخواص الفيزيائية الكيميائية ل LNTs باستخدام الحد الأدنى من نظام النموذج في المختبر حيث يمكن تعديل تكوين LNTs بسهولة لمحاكاة الهياكل الخلوية الطبيعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

مختبرات سانديا الوطنية هي مختبر متعدد المهام تديره وتشغله شركة الحلول الوطنية للتكنولوجيا والهندسة التابعة لشركة سانديا ، ذ.م.م ، وهي شركة تابعة مملوكة بالكامل لشركة هانيويل إنترناشيونال ، إنك ، للإدارة الوطنية للأمن النووي التابعة لوزارة الطاقة الأمريكية بموجب العقد DE-NA-0003525. تصف هذه الورقة النتائج الفنية الموضوعية والتحليل. أي وجهات نظر أو آراء ذاتية قد يتم التعبير عنها في الورقة لا تمثل بالضرورة وجهات نظر وزارة الطاقة الأمريكية أو حكومة الولايات المتحدة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الطاقة الأمريكية ، ومكتب علوم الطاقة الأساسية ، وقسم علوم وهندسة المواد (BES-MSE). تم إجراء تركيب Kinesin والفحص المجهري الفلوري من خلال مشروع مستخدم (ZIM) في مركز تقنيات النانو المتكاملة ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة الأمريكية (DOE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective Olympus 1-U2B836 Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread
Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter Olympus Neutral Density Filter
AMP-PNP Sigma-Aldrich A2647 (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP Sigma-Aldrich A7699 Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set Semrock LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein Sigma-Aldrich 22090 Casein hydrolysate for microbiology
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Catalase from Bovine Liver
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol Avanti 700000P cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021 D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC Avanti 850375C 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin Avanti 870282C 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC Avanti 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin Avanti 870285P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT Sigma-Aldrich 43816 DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA Sigma-Aldrich E4378 EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase Sigma-Aldrich G6125 Glucose Oxidase from Aspergillus niger
Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol Fisher G33 Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-Aldrich G8877 Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope Olympus N/A IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH Sigma-Aldrich 1050121000 Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M1028 1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera Hamamatsu C13440-20CU ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE Invitrogen O12650 Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher P3456 Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE Invitrogen T1395MP Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Triethylammonium Salt
Trolox Sigma-Aldrich 238813 (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin Cytoskeleton T333P Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488 Cytoskeleton TL488M Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled Cytoskeleton T240 Tubulin protein porcine brain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
  2. Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
  3. Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
  5. Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
  6. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  7. Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
  8. Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
  9. Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
  10. Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
  11. Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
  12. Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
  13. Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
  14. Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
  15. Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  16. Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 173 ، الهندسة الحيوية ، الأنابيب النانوية الدهنية ، الكينيسين ، الأنابيب الدقيقة ، الحركة المنزلقة ، فصل الطور
تصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية متعددة المكونات باستخدام اختبار حركية Kinesin المنزلق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imam, Z. I., Bachand, G. D.… More

Imam, Z. I., Bachand, G. D. Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay. J. Vis. Exp. (173), e60899, doi:10.3791/60899 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter