Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

ग्लाइडिंग किन्सिन गतिशीलता परख का उपयोग करके मल्टी-घटक लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क बनाना

Published: July 26, 2021 doi: 10.3791/60899

Summary

यह प्रोटोकॉल विशाल यूनिलामेलर लिपिड पुटिकाओं के साथ संयोजन के रूप में ग्लाइडिंग किनेसिन गतिशीलता का उपयोग करके लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क बनाने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है।

Abstract

लिपिड नैनोट्यूब (एलएनटी) नेटवर्क यूकेरियोटिक कोशिकाओं में पाए जाने वाले सर्वव्यापी लिपिड नलिकाओं की प्रासंगिकता के साथ आणविक परिवहन और लिपिड बायोफिजिक्स का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, विवो एलएनटी में अत्यधिक गैर-संतुलन संरचनाएं हैं जिन्हें रासायनिक ऊर्जा और आणविक मोटर्स को इकट्ठा करने, बनाए रखने और पुनर्गठित करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, विवो एलएनटी की संरचना जटिल है, जिसमें कई अलग-अलग लिपिड प्रजातियां शामिल हैं। एलएनटी को बाहर निकालने के विशिष्ट तरीके समय और श्रम-गहन दोनों हैं, और उन्हें विशाल लिपिड पुटिकाओं से नैनोट्यूब को जबरन खींचने के लिए ऑप्टिकल चिमटी, माइक्रोबीड्स और माइक्रोपिपेट्स की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तुत ग्लाइडिंग गतिशीलता परख (जीएमए) के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसमें बड़े पैमाने पर एलएनटी नेटवर्क तेजी से किनेसिन संचालित सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का उपयोग करके विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) से उत्पन्न होते हैं। इस पद्धति का उपयोग करके, एलएनटी नेटवर्क लिपिड योगों की एक विस्तृत श्रृंखला से बनते हैं जो जैविक एलएनटी की जटिलता की नकल करते हैं, जिससे वे लिपिड बायोफिजिक्स और झिल्ली से जुड़े परिवहन के इन विट्रो अध्ययनों के लिए तेजी से उपयोगी होते हैं। इसके अतिरिक्त, यह विधि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके थोड़े समय (<30 मिनट) में मज़बूती से एलएनटी नेटवर्क का उत्पादन करने में सक्षम है। लंबाई, चौड़ाई और लिपिड विभाजन जैसी एलएनटी नेटवर्क विशेषताओं को नेटवर्क बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले जीयूवी की लिपिड संरचना को बदलकर भी ट्यून किया जा सकता है।

Introduction

लिपिड नैनोट्यूब (एलएनटी) नेटवर्क का निर्माण नॉनक्विलिब्रियम लिपिड संरचनाओं 1,2,3 की इन विट्रो परीक्षा के लिए बढ़ती रुचि का है। कोशिकाएं प्रोटीन4 और न्यूक्लिक एसिड5 के साथ-साथ सेल-टू-सेल संचार 6,7 के विसारक परिवहन के लिए लिपिड नलिकाओं का उपयोग करती हैं। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और गोल्गी तंत्र विशेष रूप से दिलचस्प हैं, क्योंकि ये झिल्ली-बाउंड ऑर्गेनेल लिपिड और प्रोटीन संश्लेषण के साथ-साथ सेल 8,9 के साइटोप्लाज्म के भीतर इन अभिन्न बायोमोलेक्यूल्स के परिवहन के लिए प्राथमिक स्थान हैं। इन ऑर्गेनेल की झिल्ली में स्फिंगोलिपिड्स, कोलेस्ट्रॉल और फॉस्फोलिपिड्स10 सहित कई लिपिड प्रजातियां शामिल हैं जो अंततः उनकी कार्यक्षमता को परिभाषित करने में मदद करती हैं। इस प्रकार, इन ऑर्गेनेल को अधिक बारीकी से दोहराने और अध्ययन करने के लिए, इन विट्रो एलएनटी को तेजी से जटिल लिपिड योगों के साथ पुटिकाओं से गढ़ा जाना चाहिए11.

विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) का उपयोग लिपिड झिल्ली व्यवहार का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है क्योंकि उन्हें जटिल योगों के साथ मज़बूती से संश्लेषित किया जा सकता है जिसमें कोलेस्ट्रॉल, फॉस्फेटिडिलकोलाइन (पीसी), फॉस्फेटिडिलइथेनॉलमाइन (पीई), फॉस्फेटिडिलसेरिन (पीएस), और फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (पीआई) 12,13 शामिल हैं। यहां वर्णित ग्लाइडिंग गतिशीलता परख (जीएमए) का उपयोग करके अलग-अलग लिपिड योगों के साथ जीयूवी से एलएनटी बनाने की एक विधि है, जिसमें एलएनटी को जीयूवी पर अभिनय करने वाले किन्सिन मोटर्स और सूक्ष्मनलिका फिलामेंट्स द्वारा किए गए काम के आधार पर बाहर निकाला जाता है। इस प्रणाली में, एक सतह पर अधिशोषित किन्सिन मोटर प्रोटीन बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं को प्रेरित करते हैं, एटीपी के हाइड्रोलिसिस से रासायनिक ऊर्जा को उपयोगी काम में परिवर्तित करते हैं (विशेष रूप से, बायोटिनिलेटेड पुटिकाओं से एलएनटी का बाहर निकालना)11. परिणामी एलएनटी नेटवर्क एलएनटी आकृति विज्ञान में परिवर्तन पर लिपिड चरणों में अंतर के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल मंच प्रदान करता है।

संक्षेप में, किन्सिन मोटर प्रोटीन को कैसिइन युक्त समाधान में एक प्रवाह कक्ष में पेश किया जाता है, जो कक्ष की कांच की सतह पर मोटर्स के सोखना को सक्षम बनाता है। अगला, कक्ष के माध्यम से एटीपी प्रवाह वाले समाधान में बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं और किन्सिन मोटर्स को बांधने और गतिशीलता शुरू करने की अनुमति दी जाती है। एक स्ट्रेप्टाविडिन समाधान तब कक्ष में पेश किया जाता है और सूक्ष्मनलिकाएं के लिए गैर-सहसंयोजक रूप से बांधने की अनुमति दी जाती है। अंत में, बायोटिनिलेटेड लिपिड युक्त जीयूवी को कक्ष में पेश किया जाता है और स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित सूक्ष्मनलिकाएं से बांधा जाता है, फिर 15-30 मिनट के दौरान बड़े पैमाने पर नेटवर्क बनाने के लिए एलएनटी को बाहर निकालता है। यह विधि कम लागत पर मानक प्रयोगशाला उपकरण और अभिकर्मकों का उपयोग करके बड़े, शाखित एलएनटी नेटवर्क का उत्पादन करतीहै 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. स्टॉक सूक्ष्मनलिका समाधान की तैयारी

सावधानी: सुरक्षा चश्मे, दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट हमेशा प्रोटोकॉल भर में पहना जाना चाहिए।

  1. 5x बीआरबी 80 बफर तैयार करें: 1 एल ग्लास की बोतल में 24.19 ग्राम पाइप्स (पिपराज़िन-एन, एन'-बिस [2-एथेनेसल्फोनिक एसिड]) और 0.38 ग्राम ईजीटीए (एथिलीन ग्लाइकोल-बिस [β-एमिनोएथिल ईथर] -एन, एन', एन'-टेट्राएसेटिक एसिड) जोड़ें। 1 एम एमजीसीएल2 के 1 एमएल जोड़ें और पीएच को केओएच के साथ 6.9 में समायोजित करें। समाधान को 500 मिलीलीटर अंतिम मात्रा में लाने के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें।
  2. जीटीपी समाधान का 100 एमएम स्टॉक तैयार करें: 52 मिलीग्राम जीटीपी का वजन करें और आसुत जल के 1 मिलीलीटर में निलंबित करें। 100 एमएम समाधान को 20 μL विभाज्य में विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. जीपीईएम समाधान तैयार करें: 5x बीआरबी 80 के 200 μL, 100 एमएम जीटीपी समाधान के 10 μL, 100% ग्लिसरॉल के 100 μL, और विआयनीकृत पानी के 600 μL मिलाएं। जीपीईएम समाधान को 100 μL विभाज्य में विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।
  4. एमएल की स्टॉक एकाग्रता के लिए ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) जीपीईएम समाधान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, लियोफिलाइज्ड ट्यूबुलिन (बायोटिनिलेटेड, फ्लोरोसेंटली लेबल और अनलेबल में से प्रत्येक की एक शीशी) की शीशियों का पुनर्गठन करके सूक्ष्मनलिका समाधान तैयार करें।
  5. 32 एमएल की अंतिम मात्रा में 1: 1: 6 का अनुपात बनाने के लिए बायोटिनिलेटेड ट्यूबुलिन के 4 μL, फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूबुलिन के 4 μL, और बिना लेबल वाले ट्यूबुलिन के 24 μL (सभी 5 मिलीग्राम / इसे बर्फ पर रखें। ट्यूबुलिन मिश्रण को 2 μL विभाज्य में विभाजित करें और आवश्यकता पड़ने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: कुशल पोलीमराइजेशन के लिए आवश्यक है कि ट्यूबुलिन की एकाग्रता महत्वपूर्ण एकाग्रता (5 मिलीग्राम / एमएल) 14 के बराबर या उससे ऊपर हो। यहां, ट्यूबुलिन अनुपात का चयन स्ट्रेप्टाविडिन और जीयूवी को कुशलतापूर्वक बांधने के लिए पर्याप्त एकाग्रता बायोटिनिलेटेड ट्यूबुलिन के लिए अनुकूलित किया गया है, साथ ही सूक्ष्म लक्षण वर्णन के लिए फ्लोरोसेंट ट्यूबुलिन की पर्याप्त एकाग्रता भी है।

2. विशाल यूनिलामेलर पुटिकाओं (जीयूवी) की तैयारी

  1. अगरोस फिल्म की तैयारी
    नोट: इस प्रोटोकॉल ग्रीन एट अल .15 से अनुकूलित है।
    1. 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 100 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 1 ग्राम एगरोज मिलाकर 1% डब्ल्यू / 1-2 मिनट के लिए एगरोज़ समाधान को गर्म करने के लिए एक मानक माइक्रोवेव का उपयोग करें।
      नोट: एक बार अगारोज पूरी तरह से भंग हो जाने के बाद समाधान पारदर्शी हो जाएगा। उपयोग करने से पहले समाधान को 65-75 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
    2. एक 25 मिमी x 25 मिमी ग्लास कवरस्लिप पर अगरोज़ समाधान के 300-400 μL विंदुक करने के लिए एक कटौती 1,000 μL विंदुक टिप का प्रयोग करें। दस्ताने उंगलियों के साथ कवरस्लिप के किनारे को पकड़ते समय, कवरस्लिप में समान रूप से पिघला हुआ एगरोज़ फैलाने के लिए एक और 1,000 μL विंदुक टिप का उपयोग करें।
      नोट: 65-75 डिग्री सेल्सियस पर एगरोज को बनाए रखने से कवरस्लिप सतह पर कुशल प्रसार की अनुमति मिलेगी।
    3. कम से कम 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एगरोज़-लेपित कवरलिप्स को सुखाएं, जिस बिंदु पर एगरोज़ पारदर्शी हो जाएगा। कमरे के तापमान (आरटी) पर लिंट-फ्री पेपर या मोम-आधारित फिल्म जैसी साफ सतह पर ऊपर की ओर एगरोज़ लेपित सतह को रखकर कवरलिप्स स्टोर करें।
  2. लिपिड फॉर्मूलेशन
    1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से क्लोरोफॉर्म में भंग लिपिड को पुनः प्राप्त करें और उन्हें आरटी तक पहुंचने तक रासायनिक धूआं हुड में रखें।
    2. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके सूत्रीकरण के लिए आवश्यक प्रत्येक घटक लिपिड के लिपिड स्टॉक की मात्रा की गणना करें:
      Equation 1
      कहा पे: वीलिपिड उपयोग करने के लिए लिपिड की मात्रा है, मोल % लिपिड घटक का दाढ़ प्रतिशत है, एन सूत्रीकरण में उपयोग किए जाने वाले लिपिड के मोल्स की कुल संख्या है, और एम दाढ़ इकाइयों में लिपिड की एकाग्रता है।
      नोट: उदाहरण के लिए, यदि 12.72 एमएम की स्टॉक समाधान एकाग्रता के साथ 45 मोल% 1,2-डायोलॉयल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी) युक्त फॉर्मूलेशन का उपयोग करते हैं, और फॉर्मूलेशन में कुल लिपिड के 1 माइक्रोमोल, फॉर्मूलेशन में उपयोग किए जाने वाले डीओपीसी स्टॉक की मात्रा होगी:
      Equation 2
    3. रासायनिक धूआं हुड में एक कांच की शीशी में गणना अनुपात में लिपिड को एक साथ मिलाएं।
    4. विंदुक एक पहले से गरम गर्म प्लेट पर अगारोज लेपित कवरलिप्स पर लिपिड समाधान के पिपेट 30 μL जो सूत्रीकरण के संतृप्त लिपिड घटक के पिघलने बिंदु से ऊपर सेट है (उदाहरण के लिए, 40 डिग्री सेल्सियस के टीएम के साथ एक लिपिड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस गर्म प्लेट)।
    5. 18 जी सुई के लंबे किनारे का उपयोग करके एक परिपत्र गति में एगरोज़ फिल्म में समाधान फैलाएं जब तक कि क्लोरोफॉर्म वाष्पित न हो जाए और लिपिड की एक समान परत न बन जाए। इस चरण को करते समय दस्ताने वाली उंगलियों के साथ कवरस्लिप के किनारे को पकड़ें।
      नोट: सुई के साथ एगरोज़ परत को नुकसान नहीं पहुंचाने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
    6. एल्यूमीनियम पन्नी से ढके पेट्री डिश में एगरोज़ परत और लिपिड फिल्म के साथ कवरस्लिप रखें, ऊपर की ओर फिल्म की ओर, और अवशिष्ट विलायक को हटाने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए वैक्यूम डिसिकेटर में पेट्री डिश रखें।
  3. इस बीच, 10 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी के साथ 1.92 ग्राम सुक्रोज मिलाकर 560 एमएम सुक्रोज घोल तैयार करें।
    नोट: सुक्रोज समाधान की एकाग्रता बफर जीयूवी की परासरणता पर निर्भर करती है जिसमें पतला किया जाता है। आमतौर पर, सुक्रोज समाधान की परासरणता बफर से 10% से अधिक नहीं होनी चाहिए, जिसमें जीयूवी को पतला किया जाएगा, विशेष रूप से गतिशीलता बफर (चरण 3.11 देखें)।
  4. जीयूवी का गठन
    1. लिपिड फिल्म के साथ लेपित कवरस्लिप के लिए एक चिपकने वाला कक्ष का पालन करें धीरे-धीरे लिपिड-लेपित कवरस्लिप पर लिपिड फिल्म के साथ ऊपर की ओर मुंह करके, यह सुनिश्चित करते हुए कि एक तंग सील का गठन किया जाता है।
    2. कक्ष में 560 एमएम सुक्रोज समाधान (चरण 2.3 में तैयार) के 400 μL जोड़ें।
    3. कवरस्लिप को आर्द्रता कक्ष में रखें और ढक्कन बंद करें।
    4. सूत्रीकरण के संतृप्त लिपिड घटक के पिघलने बिंदु के ऊपर सेट एक पहले से गरम गर्म प्लेट पर आर्द्रता कक्ष रखें।
    5. वसूली से पहले पुटिकाओं को ≥1 घंटे के लिए बनाने की अनुमति दें।
      नोट: पुटिका गठन एक 40x वायु उद्देश्य लेंस के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ जाँच की जा सकती है।

3. गतिशीलता परख स्टॉक और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. कैसिइन स्टॉक की तैयारी
    1. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में 3 ग्राम शुष्क कैसिइन जोड़ें, फिर 1x बीआरबी 80 के 30 मिलीलीटर जोड़ें और समाधान चिपचिपा होने तक घुमाएं। 30 मिनट के लिए 15,000 एक्स जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
    2. सतह पर तैरनेवाला एक और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरण और गोली त्यागें। 1 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी में समाधान इकट्ठा। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी में समाधान एकत्र करते हुए, 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
    3. यूवी-विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और क्वार्ट्ज क्युवेट का उपयोग करके 280 एनएम पर अवशोषण को मापकर प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें।
    4. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके मिलीग्राम /एमएल में कैसिइन एकाग्रता की गणना करें:
      Equation 3
    5. 1x BRB80 में 20 मिलीग्राम / एमएल के लिए समाधान पतला, 100 μL विभाज्य में विभाजित, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. 1x बीआरबी 80 के 1 एमएल के साथ 2 मिलीग्राम ग्लूकोज ऑक्सीडेज मिश्रण करके ग्लूकोज ऑक्सीडेज (2 मिलीग्राम / 100 μL विभाज्य में विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 1x बीआरबी 80 के 1 एमएल के साथ 0.8 मिलीग्राम कैटालेज़ को मिलाकर कैटालेज़ (0.8 मिलीग्राम / एमएल) स्टॉक समाधान तैयार करें। 100 μL विभाज्य में विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 1 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 0.3 ग्राम डी-ग्लूकोज को निलंबित करके 2 एम ग्लूकोज समाधान तैयार करें। 100 μL विभाज्य में विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 1 एमएल विआयनीकृत पानी में 0.015 ग्राम डीटीटी को निलंबित करके 100 एमएम डीटीटी स्टॉक तैयार करें। 100 μL विभाज्य में विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. 100 एमएम एमजीसीएल2 के 1 एमएल समाधान में 0.055 ग्राम डिसोडियम एटीपी को निलंबित करके 100 एमएम एमजी-एटीपी स्टॉक तैयार करें। 100 μL विभाज्य में विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. 100 एमएम एमजीसीएल2 के 1 एमएल समाधान में एएमपी-पीएनपी के 0.055 ग्राम को निलंबित करके 100 एमएम एमजी-एएमपी-पीएनपी समाधान तैयार करें, फिर 100 μL विभाज्य में विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. मेथनॉल के 1 एमएल में 25.03 मिलीग्राम ट्रोलॉक्स जोड़कर 100 एमएम ट्रोलॉक्स समाधान तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. एमएल स्ट्रेप्टाविडिन समाधान बीआरबी 80 के 100 μL में 1 मिलीग्राम स्ट्रेप्टाविडिन जोड़कर तैयार करें, फिर 2 μL विभाज्य में विभाजित करें और -80 ° डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  10. 5x BRB80 के 200 μL, कैसिइन समाधान के 20 μL, एमजीएटीपी समाधान के 10 μL, ट्रोलॉक्स के 10 μL, पैक्लिटैक्सेल समाधान के 5 μL, और डीआई पानी के 765 μL मिश्रण करके BRB90CAT तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  11. बीआरबी 80 सीएटी के 192 μL, डी-ग्लूकोज समाधान के 2 μL, ग्लूकोज ऑक्सीडेज समाधान के 2 μL, डीटीटी समाधान के 2 μL, और कैटालेज़ समाधान के 2 μL को मिलाकर गतिशीलता समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  12. बीआरबी 80 सीएटी (उदाहरण के लिए, बीआरबी 80 सीएटी के 98 μL में 50 एमएम किनेसिन समाधान के 2 μL) में स्टॉक किन्सिन समाधान को पतला करके 1 μM किन्सिन समाधान तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  13. कमरे के तापमान बीआरबी 80 सीएटी के 90 μL में स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं के 10 μL को पतला करके 10 μg / एमएल सूक्ष्मनलिकाएं समाधान तैयार करें। आरटी पर स्टोर करें।
  14. गतिशीलता समाधान के 99.9 μL में 10 मिलीग्राम /एमएल स्ट्रेप्टाविडिन समाधान के 0.1 μL जोड़कर एक 10 μg/mL स्ट्रेप्टाविडिन समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  15. गतिशीलता समाधान के 55 μL में जीयूवी स्टॉक के 5 μL पतला करके एक 12x GUV समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  16. सूक्ष्मनलिकाएं में ट्यूबुलिन का पोलीमराइजेशन
    1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर (चरण 1.5 में तैयार) से ट्यूबुलिन के पहले से तैयार 2 μL विभाज्य ले लीजिए और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह।
    2. निर्जल डीएमएसओ के 1 एमएल में 1.71 मिलीग्राम पैक्लिटैक्सेल जोड़कर 2 एमएम पैक्लिटैक्सेल समाधान तैयार करें, 10 μL विभाज्य में विभाजित करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 2 एमएम पैक्लिटैक्सेल के 0.5 μL के साथ 1x BRB80 के 99.5 μL मिश्रण करके ताजा तैयार BRB80T।  पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए बीआरबी 80 टी के गर्म 100 μL।
    4. 30 मिनट के बाद, सूक्ष्मनलिकाएं को स्थिर करने के लिए ट्यूबुलिन विभाज्य में बीआरबी 80 टी के 100 μL जोड़ें। आरटी पर स्टोर करें।

4. ग्लाइडिंग गतिशीलता परख (जीएमए)

  1. एक ग्लास स्लाइड पर 5 मिमी से अलग डबल-पक्षीय टेप के दो स्ट्रिप्स चिपकाकर एक प्रवाह कक्ष तैयार करें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि टेप की तीन परतों में प्रत्येक पट्टी शामिल न हो।
  2. टेप के शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें, फिर पर्याप्त आसंजन सुनिश्चित करने के लिए चिमटी या कलम के साथ कवरस्लिप /टेप इंटरफ़ेस पर धीरे से दबाएं।
    नोट: चैनल ऊंचाई में 300 मिमी द्वारा लंबाई में 25 मिमी चौड़ाई में 5 मिमी होना चाहिए।
  3. प्रवाह सेल में 1 मिमी किन्सिन समाधान (चरण 3.12 में तैयार) के पिपेट 30 μL और यह 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: कैसिइन कवरस्लिप/ग्लास स्लाइड की सतह पर एक बाइलेयर बनाता है और सतह पर किन्सिन पूंछ के लगाव की सुविधा प्रदान करता है।
  4. एमएल सूक्ष्मनलिका समाधान (चरण 3.13 में तैयार) प्रवाह सेल में, समाधान विनिमय की सुविधा के लिए प्रवाह चैनल के विपरीत छोर के खिलाफ धीरे दबाए गए एक प्रयोगशाला पोंछ का उपयोग कर। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. आरटी पर 1x गतिशीलता समाधान के साथ प्रवाह सेल 1x-3x धो लें (चरण 3.11 में तैयार)।
    नोट: सूक्ष्मनलिका लगाव और गतिशीलता की पुष्टि करने के लिए इस बिंदु पर 40x वायु उद्देश्य का उपयोग करके प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है। सूक्ष्मनलिकाएं फ्लोरोसेंट फिलामेंट्स (लंबाई में दसियों माइक्रोन) के रूप में दिखाई देती हैं जो ~ 0.5 μm / s (चित्रा 1) पर सतह पर चलती (ग्लाइडिंग) चलती हैं।
  6. एमएल स्ट्रेप्टाविडिन समाधान (चरण 3.14 में तैयार) के पिपेट 30 μL प्रवाह सेल में एक प्रयोगशाला पोंछ समाधान विनिमय की सुविधा के लिए प्रवाह चैनल के विपरीत छोर के खिलाफ धीरे दबाया का उपयोग कर। 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. समाधान विनिमय की सुविधा के लिए प्रवाह चैनल के विपरीत छोर के खिलाफ धीरे दबाए गए प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग करके प्रवाह में 12x जीयूवी समाधान (चरण 3.15 में तैयार) के 30 μL प्रवाह। 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  8. गतिशीलता को रोकने के लिए 100 एमएम एएमपी-पीएनपी समाधान (चरण 3.7 में तैयार) के 2 μL जोड़ें, फिर सीलेंट के साथ कक्ष को सील करें।

5. एलएनटी नेटवर्क लक्षण वर्णन

  1. इमेजिंग के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए प्रवाह कक्ष स्थानांतरण।
  2. फ्लोरोसेंट लिपिड या ट्यूबुलिन के तरंग दैर्ध्य के आधार पर उपयुक्त फ़िल्टर सेट चुनें। उदाहरण के लिए, टेक्सास रेड-लेबल वाले लिपिड का उपयोग करते समय, 560 एनएम / 25 एनएम उत्तेजना फ़िल्टर और 607 एनएम / 36 एनएम उत्सर्जन फ़िल्टर का उपयोग करें।
  3. कवरस्लिप की सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 100x तेल उद्देश्य का उपयोग करें।
  4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एलएनटी नेटवर्क की छवि।
    नोट: एलएनटी रैखिक संरचनाएं हैं जो बड़े पुटिकाओं से बाहर निकलती हैं। एलएनटी जीयूवी की तुलना में बहुत छोटे हैं और कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत हैं। इस प्रकार, एक्सपोज़र और कंट्रास्ट को छवि एलएनटी के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। ये समायोजन भी जीयूवी के ओवरएक्सपोजर का कारण बनते हैं, और इस प्रकार, यह अनुशंसा की जाती है कि जीयूवी में लैमेलरिटी और चरण पृथक्करण को स्वतंत्र रूप से चित्रित किया जाए।
  5. ब्याज के एक नेटवर्क पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें और एक मानक या टाइल वाली छवि लें।
  6. एलएनटी की छवि के लिए एक्सपोजर समय और तटस्थ घनत्व फिल्टर समायोजित करें और जीयूवी के संतृप्त एक्सपोजर को कम करें। लाल और हरे रंग के चैनलों दोनों में छवियों को प्राप्त करें।
    नोट: यहां, लाल चैनल टेक्सास-रेड लिपिड के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, जबकि हरा चैनल सूक्ष्मनलिकाएं (जैसे, ओरेगन ग्रीन लिपिड और हाइलाइट 488 रंजक) के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
  7. लाल और हरे रंग के चैनलों (चित्रा 1) को ओवरले करके एक समग्र छवि बनाएं।
  8. एलएनटी लंबाई को मापने के द्वारा एलएनटी नेटवर्क की विशेषता
    1. इमेजजे जैसे छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अधिग्रहित छवियों को खोलें।
    2. सेट स्केल सुविधा का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के लिए स्केल कैलिब्रेट करें, पिक्सेल को मिमी रूपांतरण कारक में भरें, और ठीक पर क्लिक करें।
      नोट: रूपांतरण कारक माइक्रोस्कोप, उद्देश्य लेंस और कैमरे पर निर्भर है, और इसे माइक्रोस्कोप अंशांकन स्लाइड का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह आमतौर पर पिक्सेल / मिमी में व्यक्त किया जाता है।
    3. पैरेंट जीयूवी से शुरू होने वाले नैनोट्यूब की लंबाई को मापने के लिए मल्टीपॉइंट लाइन टूल का उपयोग करें। लंबाई मापने के लिए सीटीआरएल + एम पकड़ो।
    4. ऊपर दिए गए चरणों का पालन करते हुए अलग-अलग ट्यूबों की लंबाई को मापना जारी रखें। छवि प्रसंस्करण उपकरण परिणाम विंडो में प्रत्येक नए माप को बचाएगा।
    5. प्रत्येक पंक्ति खींचने के बाद सीटीआरएल + डी पकड़ो ताकि यह ट्रैक किया जा सके कि कौन सी ट्यूबों को मापा गया है।
  9. एलएनटी मोटाई को मापने (चित्रा 2)
    1. छविजे में छवि खोलें और छवि टैब के तहत थ्रेशोल्ड सुविधा का चयन करें।
    2. थ्रेशोल्ड लागू करने के लिए लागू करें क्लिक करें .
    3. वांछित ट्यूब पर ज्ञात लंबाई का एक आयत बनाएं (काले पिक्सेल का मान 0 है, और लाल पिक्सेल का मान 255 है)।
    4. क्षेत्र के एकीकृत घनत्व को मापें।
    5. मोटाई (पिक्सेल में) प्राप्त करने के लिए एलएनटी की लंबाई (पिक्सेल में) से घनत्व को विभाजित करें।
      नोट: मोटाई माप केवल छवियों भर में तुलना की जा सकती है जब इमेजिंग सेटिंग्स और थ्रेसहोल्ड समान रूप से सेट कर रहे हैं।
  10. एलएनटी के नोड्स में लिपिड विभाजन का निर्धारण (चित्रा 3)
    1. छवि को इमेजजे में खोलें।
    2. वांछित नोड पर एक रेखा खींचने के लिए रेखा उपकरण का उपयोग करें।
    3. ओरेगन ग्रीन और टेक्सास रेड चैनलों दोनों में नोड तीव्रता को मापें।
    4. लाइन को एलएनटी में ले जाएं और ओरेगन ग्रीन और टेक्सास रेड चैनलों दोनों में एलएनटी तीव्रता को मापें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एलएनटी नेटवर्क (चित्रा 4) वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके गढ़े गए थे, जो जीयूवी से एलएनटी को बाहर निकालने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं के किन्सिन परिवहन द्वारा किए गए कार्य का उपयोग करता है। संक्षेप में, जीयूवी सुक्रोज समाधान का उपयोग करके एगरोज़ जेल पुनर्जलीकरण का उपयोग करके तैयार किए गए थे, और सूक्ष्मनलिकाएं जीपीईएम समाधान में बहुलकीकृत की गई थीं और बीआरबी 80 टी में स्थिर थीं। अगला, किन्सिन मोटर्स को एक प्रवाह सेल में पेश किया गया था जो कवरस्लिप की सतह पर मोटर्स की एक सक्रिय परत बनाता था। सूक्ष्मनलिकाएं तब पेश की गईं और एक स्ट्रेप्टाविडिन समाधान जोड़ा गया, जिसने बायोटिनिलेटेड लिपिड और जीयूवी (जिन्हें बाद में पेश किया गया) के बीच बंधन की सुविधा प्रदान की।

प्रवाह सेल में मौजूद सभी घटकों के साथ, एलएनटी को 30 मिनट के लिए बनाने की अनुमति दी गई थी, जिस बिंदु पर गतिशीलता को रोकने के लिए एएमपी-पीएनपी पेश किया गया था। फिर, एलएनटी को 100x तेल उद्देश्य का उपयोग करके एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया गया था। एलएनटी काफी बड़े हो सकते हैं; इस प्रकार, बड़े एलएनटी को पकड़ने के लिए एक कम संचालित उद्देश्य का भी उपयोग किया जा सकता है। एलएनटी नेटवर्क को पतली, वेब जैसे प्रोट्रूशियंस की विशेषता है जो जीयूवी से फैली हुई है और कनेक्ट कर रही है। एलएनटी की संख्या और शाखाएं कई कारकों पर निर्भर करती हैं, जिनमें सतह पर सूक्ष्मनलिकाएं का घनत्व, स्ट्रेप्टाविडिन एकाग्रता और मौजूद जीयूवी की संख्या शामिल है।

यह विधि ठोस, तरल-अव्यवस्थित और तरल-आदेशित चरणों के साथ-साथ चरण-पृथक पुटिकाओं से बना जीयूवी और एलएनटी उत्पन्न कर सकती है जो विभिन्न रचनाओं (चित्रा 4) की एक विस्तृत श्रृंखला पर इन चरणों के सह-अस्तित्व को प्रदर्शित करती हैं। उदाहरण के लिए, 45% संतृप्त लिपिड और 55% असंतृप्त लिपिड के साथ पुटिकाओं को संश्लेषित करने से पुटिकाएं होती हैं जो सह-मौजूदा तरल अव्यवस्थित और ठोस चरणों में अलग हो जाती हैं। यदि कोलेस्ट्रॉल शामिल है, हालांकि, तरल-तरल सह-अस्तित्व तब देखा जा सकता है। उदाहरण के लिए, 50% असंतृप्त लिपिड, 30% कोलेस्ट्रॉल और 20% संतृप्त लिपिड से युक्त मिश्रण जीयूवी बनाएगा जो सह-मौजूदा तरल-आदेशित (एल) और तरल-अव्यवस्थित (एलडी) चरणों में अलग हो जाएगा। इस सूत्रीकरण में कोलेस्ट्रॉल का समावेश संतृप्त लिपिड को तरल बनाता है, जिससे तरल चरण का गठन होता है।

इसके अलावा, नोड्स (यानी, एलएनटी से बड़ी गोल गोलाकार संरचनाएं) चरण अलग मिश्रण (चित्रा 4) में बनाने के लिए मनाया गया था। नैनोट्यूब और नोड्स के भीतर लिपिड प्रकारों के विभाजन को लाइन प्रोफाइल टूल का उपयोग करके विशेषता दी जा सकती है, नोड की अधिकतम पृष्ठभूमि-घटाया चोटी की तीव्रता को ढूंढना था। नोड और एलएनटी की लाइन प्रोफाइल निर्धारित की गई थी और अधिकतम मूल्य निर्धारित करने के लिए इन प्रोफाइल की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को घटाया गया था। विभाजन की गणना तब नोड में प्रतिदीप्ति के अधिकतम मूल्य को एलएनटी के अधिकतम प्रतिदीप्ति मूल्य से विभाजित करके की जाती है। यह दृष्टिकोण एलएनटी के साथ-साथ नोड्स दोनों में लिपिड के विभाजन को सक्षम बनाता है जो बड़े नेटवर्क में बनते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: जीयूवी और सूक्ष्मनलिकाएं से निर्मित एलएनटी की समग्र छवि। एलएनटी को किनेसिन मोटर्स के शीर्ष पर ग्लाइडिंग करने वाले मोटाइल सूक्ष्मनलिकाएं द्वारा जीयूवी से बाहर निकाला जाता है। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मोटाई प्राप्त करने के लिए थ्रेसहोल्डिंग प्रक्रिया। (A) छवि | समायोजित टैब के तहत थ्रेशोल्ड का चयन करें. (B) थ्रेशोल्ड लागू करें। (सी) वांछित ट्यूब पर ज्ञात लंबाई का एक आयत ड्रा करें। काले पिक्सेल का मान 0 और लाल पिक्सेल का मान 255 है। (डी) क्षेत्र के एकीकृत घनत्व को मापें। ट्यूब चौड़ाई की गणना करने के लिए, एकीकृत घनत्व को 255 से विभाजित करें, फिर इस आउटपुट को (बी) में बनाए गए आयत की लंबाई से विभाजित करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: नोड्स में लिपिड विभाजन का निर्धारण। (ए) इमेजजे में छवि खोलें और वांछित नोड पर एक रेखा खींचने के लिए लाइन टूल का उपयोग करें। (बी) ओरेगन ग्रीन चैनल में नोड तीव्रता को मापें। (सी) लाइन को एलएनटी में ले जाएं और ओरेगन ग्रीन चैनल में तीव्रता को मापें। (डी, ई, एफ) टेक्सास रेड चैनल के लिए प्रक्रिया दोहराएं। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न जीयूवी लिपिड योगों से निर्मित एलएनटी। तरल अव्यवस्थित (एलडी) चरण से निकाले गए एलएनटी पतले और लंबे होते हैं, जबकि तरल ऑर्डर (एल) चरण से निकाले गए एलएनटी छोटे और मोटे होते हैं। दोनों प्रकार के एलएनटी तब देखे जाते हैं जब जीएमए में एलओ-एल डी चरण-पृथक पुटिकाओं का उपयोग किया जाता है। तरल-ठोस चरण जीयूवी से एलएनटी एलडी जीयूवी से निकाले गए लोगों सेमिलते जुलते हैं। तरल-आदेशित योगों को संतृप्त लिपिड और कोलेस्ट्रॉल के संयोजन का उपयोग करके बनाया जा सकता है, जबकि तरल-अव्यवस्थित योगों को असंतृप्त लिपिड का उपयोग करके बनाया जाता है। स्केल सलाखों = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एलएनटी नेटवर्क झिल्ली गुणों और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन जैसे बायोमोलेक्यूल्स के परिवहन के लिए इन विट्रो अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है। इसके अलावा, एलएनटी नेटवर्क बनाने के लिए जटिल लिपिड योगों का उपयोग करना अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक अध्ययनों को सक्षम बनाता है। अन्य निर्माण अध्ययनों ने या तो 1) सरल लिपिड योगों और मल्टीलैमेलर पुटिकाओं या 2) जटिल लिपिड योगों से युक्त जीयूवी से नेटवर्क बनाने के लिए अधिक बोझिल गतिशीलता तकनीकों का उपयोग किया है। यहां वर्णित विधि जटिल लिपिड योगों और जीयूवी से बड़े पैमाने पर एलएनटी नेटवर्क के कुशल निर्माण और सस्ती अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग करने में सक्षम बनाती है। इस प्रकार, यह पद्धति चरण पृथक्करण और झिल्ली प्रोटीन परिवहन सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करती है। प्रोटोकॉल एक इन विट्रो मॉडल का उपयोग करता है जिसमें एलएनटी की संरचना को उनके जैविक एनालॉग्स (जैसे, गोल्गी उपकरण) का अनुमान लगाने के लिए बेहतर ढंग से ट्यून किया जा सकता है।

यहां वर्णित विधि में एलएनटी नेटवर्क के गठन के कई फायदे हैं। उदाहरण के लिए, सूक्ष्मनलिकाएं आसानी से और तेजी से लियोफिलाइज्ड ट्यूबुलिन का उपयोग करके बहुलकीकृत होती हैं, और पैक्लिटैक्सेल 16 के साथ स्थिर होने पर वे कम से कम 1-2 सप्ताह तक आरटी पर स्थिररहते हैं। इस प्रकार, उन्हें एलएनटी के एक्सट्रूज़न और बड़े पैमाने पर नेटवर्क 1,2 के गठन को चलाने के लिए आसानी से लागू किया जाता है। इसके अतिरिक्त, कई लिपिड घटकों (यानी, असंतृप्त और संतृप्त लिपिड और कोलेस्ट्रॉल) से बना जीयूवी मामूली संशोधनों के साथ पिछले प्रोटोकॉल के आधार पर जल्दी से बनाया जा सकता है। ये संशोधन झिल्ली चरण पृथक्करण की भौतिक रासायनिक प्रक्रिया से गुजरने में सक्षम जीयूवी के संश्लेषण को सक्षम करते हैं। एक बार तैयार होने के बाद, भंडारण की स्थिति के आधार पर जीयूवी को हफ्तों से महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, एक नया बैच तैयार करने से पहले 1 महीने तक जीयूवी का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। लिपिड समाधान कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, साथ ही साथ एगरोज़ जेल और लेपित कवरलिप्स, जिसे महीनों तक आरटी पर संग्रहीत किया जा सकता है। एगरोज़-लेपित कवरलिप्स पर लिपिड फिल्मों को वैक्यूम के तहत संग्रहीत किया जाना चाहिए और 48 घंटे के भीतर पुनर्जलीकरण किया जाना चाहिए।

जीयूवी से एलएनटी बनाने के लिए इस तकनीक का उपयोग करने की एक चुनौती प्रवाह सेल में जीयूवी, स्ट्रेप्टाविडिन और सूक्ष्मनलिकाएं की एकाग्रता को संतुलित कर रही है। उदाहरण के लिए, एलएनटी गठन सीमित होगा यदि सूक्ष्मनलिकाएं और जीयूवी के बीच का अनुपात सही नहीं है। यदि जीयूवी की एकाग्रता बहुत कम है, तो समुच्चय नहीं बनेंगे, जो एलएनटी गठन में पहला कदम है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित सूक्ष्मनलिकाएं और जीयूवी की सांद्रता के लिए, सूक्ष्मनलिका स्टॉक के 10x कमजोर पड़ने और जीयूवी स्टॉक के 12x कमजोर पड़ने के परिणामस्वरूप आम तौर पर अच्छे एलएनटी नेटवर्क होते हैं। क्रमशः 5x और 6x के कमजोर पड़ने से भी अच्छे नेटवर्क मिले हैं।

एक और चुनौती यह सुनिश्चित कर रही है कि जीयूवी समाधान सूक्ष्मनलिका समाधान के साथ आसमाटिक रूप से संतुलित है। यदि दो समाधानों के बीच परासरणता में अंतर बहुत बड़ा है, तो जीयूवी अस्थिर हो जाएंगे और संभावित रूप से फट जाएंगे। यदि समाधान आसमाटिक रूप से संतुलित नहीं हैं (उदाहरण के लिए, दो समाधानों के बीच मापा परासरण के बीच 10% का अंतर), तो कम मापा परासरणता के साथ समाधान की परासरणता को बढ़ाने के लिए एक केंद्रित (जैसे, 2 एम) सुक्रोज समाधान का उपयोग किया जाना चाहिए। इस प्रणाली की एक और सीमा परिणामी एलएनटी नेटवर्क की स्थिरता है, जो घंटों के क्रम पर स्थिर हैं और प्रवाह कक्ष पर अत्यधिक निर्भर हैं जो लगातार हाइड्रेटेड हैं (या सीलेंट के साथ कक्ष को सील कर दिया गया है)। एक बार जब समाधान प्रवाह कक्ष से वाष्पित हो जाता है, तो एलएनटी अब उपयोगी नहीं होंगे, इस तथ्य के बावजूद कि वाष्पीकरण के बाद कुछ अवशिष्ट एलएनटी की उपस्थिति बनी रह सकती है।

इन ग्लाइडिंग सूक्ष्मनलिकाएं और जीयूवी से बनाए गए एलएनटी नेटवर्क झिल्ली सतहों पर लिपिड बाइलेयर गतिशीलता के साथ-साथ प्रोटीन (जैसे, ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन) प्रसार को समझने में उपयोगी हो सकते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल जल्दी से एलएनटी नेटवर्क बना सकता है जिसमें विभिन्न लिपिड फॉर्मूलेशन शामिल हैं जो जैविक एलएनटी जैसी टनलिंग नैनोट्यूब के साथ-साथ झिल्ली-बाध्य ऑर्गेनेल (यानी, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और गोल्गी तंत्र) में पाए जाने वाले नैनोट्यूब की अधिक आसानी से नकल करते हैं। बड़े पैमाने पर एलएनटी नेटवर्क बनाने की क्षमता सेल संचार का अध्ययन करने, नैनोफ्लुइडिक बायोमोलेक्यूल परिवहन का अध्ययन करने और सिंथेटिक न्यूरोनल नेटवर्क विकसित करने की दिशा में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। यह प्रोटोकॉल न्यूनतम, इन विट्रो मॉडल सिस्टम का उपयोग करके एलएनटी के भौतिक रासायनिक गुणों पर व्यापक अध्ययन के लिए दरवाजा खोलता है जिसमें प्राकृतिक सेलुलर संरचनाओं की नकल करने के लिए एलएनटी की संरचना को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सैंडिया नेशनल लेबोरेटरीज एक बहु-मिशन प्रयोगशाला है जिसे सैंडिया, एलएलसी के राष्ट्रीय प्रौद्योगिकी और इंजीनियरिंग समाधान द्वारा प्रबंधित और संचालित किया जाता है, जो अनुबंध डीई-एनए -0003525 के तहत अमेरिकी डीओई के राष्ट्रीय परमाणु सुरक्षा प्रशासन के लिए हनीवेल इंटरनेशनल, इंक की पूर्ण स्वामित्व वाली सहायक कंपनी है। यह पत्र वस्तुनिष्ठ तकनीकी परिणामों और विश्लेषण का वर्णन करता है। पेपर में व्यक्त किए जा सकने वाले किसी भी व्यक्तिपरक विचार या राय आवश्यक रूप से अमेरिकी ऊर्जा विभाग या संयुक्त राज्य सरकार के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिकी ऊर्जा विभाग, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान कार्यालय, सामग्री विज्ञान और इंजीनियरिंग विभाग (बीईएस-एमएसई) द्वारा समर्थित किया गया था। किन्सिन संश्लेषण और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सेंटर फॉर इंटीग्रेटेड नैनोटेक्नोलॉजीज में एक उपयोगकर्ता परियोजना (जेडआईएम) के माध्यम से किया गया था, जो अमेरिकी ऊर्जा विभाग (डीओई) विज्ञान कार्यालय के लिए संचालित विज्ञान उपयोगकर्ता सुविधा का एक कार्यालय है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective Olympus 1-U2B836 Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread
Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter Olympus Neutral Density Filter
AMP-PNP Sigma-Aldrich A2647 (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP Sigma-Aldrich A7699 Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set Semrock LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein Sigma-Aldrich 22090 Casein hydrolysate for microbiology
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Catalase from Bovine Liver
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol Avanti 700000P cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021 D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC Avanti 850375C 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin Avanti 870282C 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC Avanti 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin Avanti 870285P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT Sigma-Aldrich 43816 DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA Sigma-Aldrich E4378 EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase Sigma-Aldrich G6125 Glucose Oxidase from Aspergillus niger
Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol Fisher G33 Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-Aldrich G8877 Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope Olympus N/A IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH Sigma-Aldrich 1050121000 Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M1028 1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera Hamamatsu C13440-20CU ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE Invitrogen O12650 Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher P3456 Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE Invitrogen T1395MP Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Triethylammonium Salt
Trolox Sigma-Aldrich 238813 (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin Cytoskeleton T333P Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488 Cytoskeleton TL488M Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled Cytoskeleton T240 Tubulin protein porcine brain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
  2. Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
  3. Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
  5. Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
  6. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  7. Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
  8. Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
  9. Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
  10. Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
  11. Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
  12. Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
  13. Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
  14. Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
  15. Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  16. Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 173 बायोइंजीनियरिंग लिपिड नैनोट्यूब किन्सिन सूक्ष्मनलिकाएं ग्लाइडिंग गतिशीलता चरण पृथक्करण
ग्लाइडिंग किन्सिन गतिशीलता परख का उपयोग करके मल्टी-घटक लिपिड नैनोट्यूब नेटवर्क बनाना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imam, Z. I., Bachand, G. D.More

Imam, Z. I., Bachand, G. D. Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay. J. Vis. Exp. (173), e60899, doi:10.3791/60899 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter