Summary
このプロトコルは、巨大な単層脂質小胞と組み合わせて滑空キネシン運動性を使用して脂質ナノチューブネットワークを作製するためのプロセスを記載している。
Abstract
脂質ナノチューブ(LNT)ネットワークは、真核細胞に見られるユビキタス脂質細管に関連する分子輸送および脂質生物物理学を研究するためのin vitroモデルシステムを表す。しかし、in vivo LNTは高度に非平衡な構造であり、化学エネルギーと分子モーターを組み立て、維持、再編成する必要があります。さらに、インビボLNTsの組成物は、複合体であり、複数の異なる脂質種からなる。LNTを押し出す典型的な方法は、時間と労力の両方を要し、巨大な脂質小胞からナノチューブを強制的に引き抜くために光学ピンセット、マイクロビーズ、およびマイクロピペットを必要とする。ここに提示されるのは、キネシン駆動微小管運動性を使用して巨大な単層小胞(GUV)から大規模なLNTネットワークが迅速に生成される滑空運動性アッセイ(GMA)のプロトコルです。この方法を使用して、LNTネットワークは、生物学的LNTの複雑さを模倣する幅広い脂質製剤から形成され、脂質生物物理学および膜関連輸送のin vitro研究にますます有用になる。さらに、この方法は、一般的に使用される実験装置を使用して、短時間(<30分)でLNTネットワークを確実に製造することができる。長さ、幅、脂質分配などのLNTネットワーク特性も、ネットワークの構築に使用されるGUVの脂質組成を変更することによって調整可能です。
Introduction
脂質ナノチューブ(LNT)ネットワークの作製は、非平衡脂質構造のインビトロ検査のための関心が高まっている1、2、3。細胞は、タンパク質4および核酸5の拡散輸送ならびに細胞間通信6,7のために脂質細管を使用する。小胞体およびゴルジ体装置は、これらの膜結合小器官が脂質およびタンパク質合成ならびに細胞の細胞質内のこれらの不可欠な生体分子の輸送のための主要な場所であるため、特に興味深い8,9。これらの細胞小器官の膜は、スフィンゴ脂質、コレステロール、およびリン脂質10を含む複数の脂質種で構成されており、最終的にそれらの機能を定義するのに役立つ。したがって、これらの細胞小器官をより密接に複製および研究するためには、インビトロLNTは、ますます複雑な脂質製剤11を有する小胞から作製されなければならない。
巨大な単層小胞(GUV)は、コレステロール、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルセリン(PS)、およびホスファチジルイノシトール(PI)12,13を含む複雑な製剤で確実に合成できるため、脂質膜挙動を研究するために広く使用されている。ここで説明するのは、グライダー運動性アッセイ(GMA)を使用して、GUVから様々な脂質製剤を有するGUVからLNTを製造する方法であり、LNTは、キネシンモーターおよびGUVに作用する微小管フィラメントによって行われる作業に基づいて押し出される。このシステムでは、表面に吸着したキネシンモータータンパク質がビオチン化微小管を推進し、ATPの加水分解からの化学エネルギーを有用な仕事(具体的には、ビオチン化小胞からのLNTの押し出し)に変換します11。得られたLNTネットワークは、LNT形態の変化に対する脂質相の違いの影響を研究するためのモデルプラットフォームを提供する。
簡単に言えば、キネシンモータータンパク質は、カゼインを含む溶液中のフローチャンバに導入され、チャンバのガラス表面へのモータの吸着を可能にする。次に、ATPを含む溶液中のビオチン化微小管がチャンバ内を流れ、キネシンモーターに結合し、運動性を開始する。次いで、ストレプトアビジン溶液をチャンバーに導入し、微小管に非共有結合で結合させる。最後に、ビオチン化脂質を含むGUVをチャンバーに導入し、ストレプトアビジン被覆微小管に結合し、LNTを押し出して15〜30分間にわたって大規模なネットワークを形成する。この方法は、標準的な実験装置と試薬を使用して大規模で分岐したLNTネットワークを低コストで生成します11。
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Protocol
1. ストック微小管溶液の調製
警告: 安全ゴーグル、手袋、および白衣は、プロトコル全体を通して常に着用する必要があります。
- 5x BRB80バッファーを調製する:1Lのガラス瓶に、24.19gのパイプ(ピペラジン-N,N'-ビス[2-エタンスルホン酸])と0.38gのEGTA(エチレングリコール-ビス[β-アミノエチルエーテル]-N,N,N',N'-四酢酸)を加える。1 mL の 1 M MgCl2 を加え、KOH で pH を 6.9 に調整します。脱イオン水を加えて、溶液を500mLの最終容量にする。
- 100 mM ストックの GTP 溶液を調製する: 52 mg の GTP を秤量し、1 mL の蒸留水に懸濁する。100 mM 溶液を 20 μL アリコートに分割し、-20 °C で保存します。
- GPEM溶液を調製する:200μLの5x BRB80、10μLの100mM GTP溶液、100μLの100%グリセロール、および600μLの脱イオン水を混合する。GPEM溶液を100μLアリコートに分割し、-20°Cで保存する。
- 市販の凍結乾燥チューブリン(ビオチン化、蛍光標識、および非標識の各バイアル1本)のバイアルを低温(4°C)GPEM溶液中で再構成して微小管溶液を調製し、原液濃度5mg/mLにする。
- 4 μLのビオチン化チューブリン、4 μLの蛍光標識チューブリン、および24 μLの非標識チューブリン(すべて5 mg/mL濃度)を混合して微小管重合を行い、最終容量32 mLで1:1:6の比率を作成します。氷の上に保管してください。チューブリン混合物を2μLアリコートに分割し、必要になるまで-80°Cで保存する。
注:効率的な重合には、チューブリンの濃度が臨界濃度(5mg/mL)14以上である必要があります。ここで、チューブリン比の選択は、ストレプトアビジンおよびGUVを効率的に結合するのに十分な濃度のビオチン化チューブリン、ならびに顕微鏡的特性評価のための十分な濃度の蛍光チューブリンのために最適化される。
2. 巨大単層小胞(GUV)の作製
- アガロースフィルム調製
注:このプロトコルはGreene et al.15から適応されています。- 250 mL 三角フラスコ内の 100 mL の脱イオン水に 1 g のアガロースを混合して、1% w/v 溶液を調製します。標準的なマイクロ波を使用して、アガロース溶液を1〜2分間加熱します。
注:アガロースが完全に溶解すると、溶液は半透明になります。使用前に溶液を65〜75°Cに冷却してください。 - カットした 1,000 μL のピペットチップを使用して、300 ~ 400 μL のアガロース溶液を 25 mm x 25 mm のガラスカバースリップにピペットで送ります。手袋をはめた指でカバースリップの端を持ちながら、別の1,000 μLのピペットチップを使用して、溶けたアガロースをカバースリップ全体に均等に広げます。
注:アガロースを65~75°Cに維持すると、カバースリップ表面に効率的に広がることができます。 - アガロースコーティングされたカバースリップを37°Cのインキュベーターで少なくとも2時間乾燥させ、その時点でアガロースが透明になります。アガロースコーティング面を上向きにして、糸くずの出ない紙やワックス系フィルムなどの清潔な面に室温(RT)で置き、カバースリップを保管します。
- 250 mL 三角フラスコ内の 100 mL の脱イオン水に 1 g のアガロースを混合して、1% w/v 溶液を調製します。標準的なマイクロ波を使用して、アガロース溶液を1〜2分間加熱します。
- 脂質製剤
- クロロホルムに溶解した脂質を-20°Cの冷凍庫から取り出し、RTに達するまで化学ヒュームフードに入れます。
- 製剤化に必要な各成分脂質の脂質ストックの体積を下記式を用いて計算する:
ここで、V脂質は使用する脂質の体積であり、モル%は脂質成分のモル百分率であり、nは製剤に使用される脂質の総モル数であり、Mはモル単位における脂質の濃度である。
注:例えば、原液濃度12.72mMの45モル%の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)および製剤中の総脂質1マイクロモルを含む製剤を使用する場合、製剤に使用されるDOPCストックの体積は、
- 化学ヒュームフード内のガラスバイアル中で計算された比率で脂質を一緒に混合する。
- 脂質溶液30 μLのピペットを、製剤の飽和脂質成分の融点以上に設定された予熱ホットプレート上のアガロースコーティングカバーグラス上に(例えば、40°CのTmを有する脂質用の50°Cホットプレート)。
- クロロホルムが蒸発し、脂質の均一な層が形成されるまで、18G針の長い縁を使用して、アガロース膜全体に円運動で溶液を広げる。このステップを実行する間、手袋をはめた指でカバースリップの端を持ちます。
注:針でアガロース層を傷つけないように注意する必要があります。 - アルミ箔で覆われたシャーレにアガロース層と脂質膜の入ったカバースリップを置き、フィルム側を上向きにし、シャーレを真空デシケーターに2時間以上入れて残留溶媒を除去した。
- その間、1.92gのスクロースと10mLの脱イオン水を混合して560mMのスクロース溶液を調製する。
注:スクロース溶液の濃度は、GUVsが希釈される緩衝液の浸透圧に依存する。典型的には、スクロース溶液の浸透圧は、GUVが希釈される緩衝液、特に運動性緩衝液よりも10%大きくてはならない(ステップ3.11を参照のこと)。 - GUVフォーメーション
- 脂質フィルムが上を向いた状態で接着チャンバを脂質コーティングされたカバースリップに穏やかに押し付けることによって、脂質フィルムでコーティングされたカバースリップに接着チャンバを接着し、タイトなシールが形成されるようにする。
- 400 μLの560 mMスクロース溶液(ステップ2.3で調製)をチャンバーに加える。
- カバースリップを湿度室に置き、蓋を閉めます。
- 製剤の飽和脂質成分の融点以上に設定された予熱ホットプレート上に湿度チャンバーを置く。
- 回復前に小胞を≥1時間形成させる。
注:小胞の形成は、40倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡で確認することができます。
3. 運動性アッセイストックおよび試薬の調製
- カゼインストックの準備
- 50mLの円錐形遠心管に3gの乾燥カゼインを加え、次いで30mLの1x BRB80を加え、溶液が粘性になるまで回転させる。チューブを15,000 x g で30分間遠心分離します。
- 上清を別の50mL円錐形遠沈管に移し、ペレットを廃棄する。溶液を1μmのシリンジフィルターでろ過し、溶液を50mLの円錐形バイアルに集める。溶液を0.2 μmフィルターでろ過し、溶液を50 mLの円錐形バイアルに集めます。
- UV-Vis分光光度計および石英キュベットを用いて280nmにおける吸光度を測定することによりタンパク質濃度を求める。
- カゼイン濃度を mg/mL 単位で計算するには、以下の式を使用します。
- 溶液を1x BRB80で20 mg/mLに希釈し、100 μLのアリコートに分割し、-20 °Cで保存します。
- グルコースオキシダーゼ2mgを1mLの1x BRB80と混合して、グルコースオキシダーゼ(2mg/mL)原液を調製する。100 μLのアリコートに分け、-20°Cで保存します。
- カタラーゼ0.8mgと1mLの1x BRB80を混合してカタラーゼ(0.8mg/mL)原液を調製する。100 μLのアリコートに分け、-20°Cで保存します。
- 1mLの脱イオン水に0.3gのD-グルコースを懸濁して2 Mグルコース溶液を調製する。100 μLのアリコートに分け、-20°Cで保存します。
- 1 mL の脱イオン水に 0.015 g の DTT を懸濁して、100 mM DTT ストックを調製します。100 μLのアリコートに分け、-20°Cで保存します。
- 0.055 g の ATP 二ナトリウムを 100 mM MgCl2 の 1 mL 溶液に懸濁することにより、100 mM Mg-ATP ストックを調製します。100 μLのアリコートに分け、-20°Cで保存します。
- 100 mM MgCl2 の 1 mL 溶液に 0.055 g の AMP-PNP を懸濁して 100 mM Mg-AMP-PNP 溶液を調製し、100 μL のアリコートに分割して -20 °C で保存します。
- メタノール1mLにトロロックス25.03mgを加えて100mMトロロックス溶液を調製し、-20°Cで保存する。
- BRB80 100 μL にストレプトアビジン 1 mg を加えてストレプトアビジン溶液 10 mg/mL を調製し、2 μL アリコートに分割して -80ۛ °C で保存します。
- BRB90CATは、BRB80の5倍量200 μL、カゼイン溶液20 μL、MgATP溶液10 μL、トロロックス10 μL、パクリタキセル溶液5 μL、DI水765 μLを混合して調製する。4°Cで保存する。
- BRB80CAT192 μL、D-グルコース溶液2 μL、グルコースオキシダーゼ溶液2 μL、DTT溶液2 μL、カタラーゼ溶液2 μLを混合して運動性溶液を調製した。4°Cで保存する。
- 原液のキネシン溶液をBRB80CATで希釈して1 μMキネシン溶液を調製し(例えば、BRB80CATの98 μLに2 μLの50 mMキネシン溶液を2 μL)、4°Cで保存する。
- 安定化微小管10 μLを室温BRB80CATの90 μLに希釈して、10 μg/mLの微小管溶液を調製する。RTで保存してください。
- 99.9 μLの運動性溶液に10 mg/mLストレプトアビジン溶液を0.1 μL加えて、10 μg/mLストレプトアビジン溶液を調製する。4°Cで保存する。
- 5 μL の GUV ストックを 55 μL の運動性溶液に希釈して、12x GUV 溶液を調製します。4°Cで保存する。
- チューブリンの微小管への重合
- 予め調製した2μLのチューブリンアリコートを-80°Cの冷凍庫(ステップ1.5で調製)から回収し、37°Cの水浴中に30分間入れる。
- 1 mLの無水DMSOに1.71 mgのパクリタキセルを加えて2 mM パクリタキセル溶液を調製し、10 μLのアリコートに分割し、-20°Cで保存する。
- 99.5 μL の 1x BRB80 と 0.5 μL の 2 mM パクリタキセルを混合して、BRB80T を新たに調製します。 100 μLのBRB80Tをウォーターバスで37°Cに温めます。
- 30分後、100μLのBRB80Tをチューブリンアリコートに添加して微小管を安定化させた。RTで保存してください。
滑空運動性アッセイ(GMA)
- スライドガラスに5mmで区切られた両面テープを2枚貼り付けてフローチャンバーを作製する。3 層のテープが各ストリップを構成するまで、このプロセスを繰り返します。
- カバースリップをテープの上に置き、ピンセットまたはペンでカバースリップ/テープのインターフェースを軽く押し下げて、十分な接着力を確保します。
メモ: チャネルは、幅 5 mm、長さ 25 mm、高さ 300 mm にする必要があります。 - 30 μLの1 mmキネシン溶液(ステップ3.12で調製)をフローセルにピペットで入れ、5分間インキュベートさせた。
注:カゼインは、カバースリップ/スライドガラスの表面に二重層を形成し、キネシンテールの表面への取り付けを容易にします。 - 10 μg/mL 微小管溶液 (ステップ 3.13 で調製) のピペット 30 μL をフローセルに入れ、ラボ用ワイプを使用して流路の反対側の端に優しく押し付けて、溶液交換を容易にします。5分間インキュベートする。
- フローセルをRTで1x運動性溶液(ステップ3.11で調製)で1x~3x洗浄します。
注:この時点で、40倍の空気対物レンズを使用した蛍光顕微鏡を使用して、微小管の付着と運動性を確認することができます。微小管は、蛍光フィラメント(長さ数十ミクロン)として現れ、表面を横切って約0.5μm/sで移動(滑空)します(図1)。 - 10 μg/mL ストレプトアビジン溶液 (ステップ 3.14 で調製) のピペット 30 μL をフローセルに挿入し、ラボ用ワイプを使用して流路の反対側の端に優しく押し付けて、溶液交換を容易にします。10分間インキュベートする。
- 溶液交換を容易にするために、12x GUV溶液(ステップ3.15で調製)の30μLを、流路の反対側の端に穏やかに押し付けた実験室用ワイプを用いて流れに流す。30分間インキュベートする。
- 2 μL の 100 mM AMP-PNP 溶液 (ステップ 3.7 で調製) を加えて運動性を停止し、チャンバーをシーラントで密封します。
5. LNTネットワークの特性評価
- フローチャンバを倒立顕微鏡に移してイメージングします。
- 使用する蛍光脂質またはチューブリンの波長に基づいて適切なフィルターセットを選択します。例えば、テキサスレッド標識脂質を使用する場合は、560nm/25nm励起フィルターと607nm/36nm発光フィルターを使用してください。
- 100x オイル対物レンズを使用して、カバースリップの表面に焦点を合わせます。
- 蛍光顕微鏡を用いてLNTネットワークを画像化する。
注:LNTは、より大きな小胞から押し出された線形構造です。LNTはGUVよりもはるかに小さく、蛍光シグナルが弱い。したがって、露出とコントラストは、画像LNTに応じて調整する必要があります。これらの調整はGUVの過剰暴露にもつながるため、GUVのラメラ性と相分離を独立して特徴付けることが推奨されます。 - 目的のネットワークに顕微鏡を集中させ、標準画像またはタイル画像を撮影します。
- 露光時間とニュートラル濃度フィルタを調整してLNTを撮像し、GUVの飽和露光量を最小限に抑えます。赤チャンネルと緑チャンネルの両方で画像を取得します。
注:ここでは、赤チャネルはテキサス - レッド脂質の視覚化を可能にし、緑色チャネルは微小管(例えば、オレゴングリーン脂質およびHiLyte488色素)の視覚化を可能にする。 - 赤と緑のチャンネルを重ね合わせて合成画像を作成します(図1)。
- LNTの長さ測定によるLNTネットワークの特性評価
- ImageJなどの画像解析ソフトで取得した画像を開きます。
- セットスケール機能を使用して顕微鏡のスケールを較正し、ピクセルをmm変換係数に塗りつぶして、「 OK」をクリックします。
注:変換係数は顕微鏡、対物レンズ、およびカメラに依存し、顕微鏡校正スライドを使用して取得できます。通常はピクセル/mm で表されます。 - マルチポイントラインツールを使用して、親GUVから始まるナノチューブの長さを測定します。Ctrl + M キーを押しながら長さを測定します。
- 上記の手順に従って、個々のチューブの長さの測定を続けます。画像処理ツールは、新しい各測定値を結果ウィンドウに保存します。
- 各線を引いた後に Ctrl + D を押したままにして、どのチューブが測定されたかを追跡します。
- LNT厚さの測定(図2)
- ImageJ で画像を開き、[画像] タブで [しきい値] 機能を選択します。
- 「適用」をクリックしてしきい値を適用します。
- 目的のチューブの上に既知の長さの四角形を描画します (黒いピクセルの値は 0、赤いピクセルの値は 255 です)。
- 面積の積分密度を測定します。
- 密度をLNTの長さ(ピクセル単位)で除算して、厚さ(ピクセル単位)を求めます。
メモ:厚さの測定値は、イメージング設定としきい値が同じように設定されている場合にのみ、画像間で比較できます。
- LNTのノードにおける脂質分配の決定(図3)
- ImageJ で画像を開きます。
- 線ツールを使用して、目的のノードに 線 を描画します。
- オレゴングリーンチャンネルとテキサスレッドチャンネルの両方でノード強度を測定します。
- ラインをLNTに移動し、オレゴングリーンチャンネルとテキサスレッドチャンネルの両方でLNT強度を測定します。
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Representative Results
LNTネットワーク(図4)は、微小管のキネシン輸送によって実行される作業を使用して、GUVからLNTを押し出すために記載されたプロトコルを使用して製造されました。簡単に説明すると、GUVsは、スクロース溶液を用いたアガロースゲル再水和を用いて調製され、微小管は、GPEM溶液中で重合され、BRB80T中で安定化された。次に、キネシンモータをフローセルに導入し、カバースリップの表面にモータの活性層を形成した。次いで、微小管を導入し、ストレプトアビジン溶液を添加し、ビオチン化脂質とGUVとの間の結合を促進した(その後導入された)。
フローセルにすべての成分が存在する状態で、LNTを30分間形成させ、その時点でAMP-PNPを導入して運動性を停止した。次に、LNTsを、100倍のオイル対物レンズを用いて落射蛍光顕微鏡下で画像化した。LNT は非常に大きくなる可能性があります。したがって、より低い出力の目標を使用して、より大きなLNTを捕獲することもできます。LNTネットワークは、GUVから伸びて接続する薄いウェブ状の突起によって特徴付けられる。LNTの数と分岐は、表面上の微小管の密度、ストレプトアビジン濃度、および存在するGUVの数を含むいくつかの要因に依存する。
この方法は、固体相、液体無秩序相、および液体規則相からなるGUVおよびLNTならびに、広範囲の異なる組成にわたってこれらの相の共存を示す相分離小胞を生成することができる(図4)。例えば、45%飽和脂質および55%不飽和脂質を有する小胞を合成すると、共存する液体無秩序相および固相に分離する小胞が生じる。しかし、コレステロールを含めると、液液共存が観察できます。例えば、50%不飽和脂質、30%コレステロール、および20%飽和脂質からなる混合物は、共存する液体秩序(Lo)相および液体無秩序(LD)相に分離するGUVを生成する。この製剤中のコレステロールの取り込みは、飽和脂質を流動化させ、液相の形成を可能にする。
さらに、節点(すなわち、LNTよりも大きい丸い球状構造)が相分離混合物中に形成されることが観察された(図4)。ナノチューブおよびノード内の脂質タイプの分割は、ノードの最大バックグラウンド減算ピーク強度を見出すためのラインプロファイルツールを使用して特徴付けることができる。ノードとLNTのラインプロファイルを決定し、これらのプロファイルのバックグラウンド蛍光を差し引いて最大値を決定しました。次に、パーティショニングは、ノード内の蛍光の最大値をLNTの最大蛍光値で割ることによって計算されます。このアプローチにより、LNTとより大きなネットワークで形成されるノードの両方で脂質を分割できます。
図1:GUVと微小管から作製したLNTの合成画像 LNTは、キネシンモーターの上を滑空する運動性微小管によってGUVから押し出されます。スケール バー = 10 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:厚さを取得するためのしきい値処理(A) [画像|調整] タブで [しきい値] を選択します。(B) しきい値を適用します。(C)目的のチューブの上に既知の長さの長方形を描きます。黒のピクセルの値は 0 で、赤のピクセルの値は 255 です。(D)面積の積分密度を測定する。チューブ幅を計算するには、積分密度を255で除算し、この出力を(B)で作成した長方形の長さで除算します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ノード内の脂質分割の決定。(A) ImageJで画像を開き、線ツールを使用して目的のノードに線を描画します。 (B) オレゴングリーンチャンネルのノード強度を測定します。 (C) ラインをLNTに移動し、オレゴングリーンチャンネルの強度を測定します。 (D,E,F) テキサスレッドチャンネルでプロセスを繰り返します。スケール バー = 20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:異なるGUV脂質製剤から製造されたLNTs。 液体無秩序(LD)相から押し出されたLNTは薄くて長いが、液体秩序(Lo)相から押し出されたLNTは短くて厚い。両方のタイプのLNTは、Lo-L D 相分離小胞がGMAで使用される場合に観察される。液固相 GUV からの LNT は、LD GUV から押し出されたものに似ています。液体秩序製剤は飽和脂質とコレステロールの組み合わせを使用して作成することができ、液体無秩序製剤は不飽和脂質を使用して作成することができる。スケール バー = 20 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
LNTネットワークは、膜特性および膜貫通タンパク質などの生体分子の輸送に対するin vitro研究のための有用なツールである。さらに、複合脂質製剤を使用してLNTネットワークを製造することで、より生物学的に関連する研究が可能になります。他の作製研究は、1)単純な脂質製剤および多層状小胞、または2)複雑な脂質製剤からなるGUVからネットワークを作製するために、より厄介な運動性技術のいずれかを使用している。ここで説明する方法は、安価な試薬および装置を使用して、複雑な脂質製剤およびGUVからの大規模なLNTネットワークの効率的な製造を可能にする。このように、この方法論は、相分離および膜タンパク質輸送を含むさまざまな生物学的プロセスを研究する能力を提供する。このプロトコルは、LNTの組成がそれらの生物学的類似体(例えば、ゴルジ体)に近似するように最適に調整され得るインビトロモデルを使用する。
ここで説明する方法におけるLNTネットワークの形成には多くの利点があります。例えば、微小管は凍結乾燥チューブリンを用いて容易かつ迅速に重合され、パクリタキセル16で安定化されるとRTで少なくとも1〜2週間安定に保たれる。そのため、LNTの押し出しと大規模なネットワークの形成を促進するために容易に実装できます1,2。さらに、複数の脂質成分(すなわち、不飽和および飽和脂質およびコレステロール)からなるGUVは、わずかな修正を伴う以前のプロトコルに基づいて迅速に形成することができる。これらの修飾は、膜相分離の物理化学的プロセスを受けることができるGUVの合成を可能にする。一旦準備されると、GUVは保管条件に応じて数週間から数ヶ月保存することができます。ただし、新しいバッチを準備する前に、GUVSを最大1ヶ月間使用することをお勧めします。脂質溶液は、-20°Cまたは-80°Cで数ヶ月間保存することができ、アガロースゲルおよびコーティングカバースリップは、RTで数ヶ月間保存することができる。アガロースコーティングされたカバースリップ上の脂質フィルムは、真空下で保管し、48時間以内に再水和する必要があります。
この技術を使用してGUVからLNTを形成する際の課題の1つは、フローセル内のGUV、ストレプトアビジン、および微小管の濃度のバランスをとることです。例えば、微小管とGUVの比率が正しくない場合、LNTの形成は制限されます。GUVの濃度が低すぎると凝集体が形成されず、LNT形成の第一歩となります。このプロトコールに記載されている微小管およびGUVの濃度について、微小管ストックの10倍希釈およびGUVストックの12倍希釈は、一般に良好なLNTネットワークをもたらした。それぞれ5倍と6倍の希釈も良好なネットワークを生み出しました。
もう1つの課題は、GUV溶液が微小管溶液と浸透圧的にバランスが取れていることを確認することです。2つの溶液間の浸透圧の差が大きすぎると、GUVは不安定になり、破裂する可能性があります。溶液が浸透圧的にバランスが取れていない場合(例えば、2つの溶液間の測定された浸透圧濃度の10%の差)、濃縮された(例えば、2Mの)スクロース溶液を使用して、測定された浸透圧濃度が低い溶液の浸透圧を増加させるべきである。このシステムのもう1つの制限は、結果として得られるLNTネットワークの安定性であり、これは時間単位で安定しており、フローチャンバが連続的に水和される(またはチャンバをシーラントで密封する)ことに大きく依存する。溶液がフローチャンバから蒸発すると、蒸発後も少数の残留LNTの存在が持続する可能性があるという事実にもかかわらず、LNTはもはや有用ではない。
これらの滑空微小管およびGUVから作成されたLNTネットワークは、脂質二重層のダイナミクスならびに膜表面上のタンパク質(例えば、膜貫通タンパク質)拡散の理解において有用であり得る。ここで説明するプロトコルは、生物学的LNT様トンネルナノチューブならびに膜結合型細胞小器官(すなわち、小胞体およびゴルジ体)に見られるナノチューブをより容易に模倣する様々な脂質製剤からなるLNTネットワークを迅速に作成することができる。大規模なLNTネットワークを形成する能力は、細胞通信の研究、ナノ流体生体分子輸送の研究、合成ニューロンネットワークの開発に向けた重要な第一歩です。このプロトコルは、LNTの組成を天然の細胞構造を模倣するように容易に変更できる最小限のin vitroモデルシステムを使用して、LNTの生理化学的特性に関するより広範な研究への扉を開きます。
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Disclosures
サンディア国立研究所は、米国DOEの国家核セキュリティ局(DE-NA-0003525)の契約に基づき、ハネウェル・インターナショナルの完全子会社であるサンディアLLCのナショナル・テクノロジー&エンジニアリング・ソリューションズが管理・運営するマルチミッション研究所です。このホワイトペーパーでは、客観的な技術的結果と分析について説明します。この論文で表明される可能性のある主観的な見解や意見は、必ずしも米国エネルギー省または米国政府の見解を表すものではありません。
Acknowledgments
この研究は、米国エネルギー省基礎エネルギー科学局、材料科学工学部(BES-MSE)の支援を受けた。キネシン合成と蛍光顕微鏡は、米国エネルギー省(DOE)科学局のために運営されている科学局のユーザー施設である統合ナノテクノロジーセンターのユーザープロジェクト(ZIM)を通じて実施されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
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