Summary

글라이딩 키네신 운동성 분석을 이용한 다성분 지질 나노튜브 네트워크 제작

Published: July 26, 2021
doi:

Summary

이 프로토콜은 거대한 유니라멜라 지질 소포와 함께 글라이딩 키네신 운동성을 사용하여 지질 나노튜브 네트워크를 제조하는 과정을 기술한다.

Abstract

지질 나노튜브(LNT) 네트워크는 진핵 세포에서 발견되는 유비쿼터스 지질 세관과 관련성이 있는 분자 수송 및 지질 생물물리학을 연구하기 위한 시험관내 모델 시스템을 나타낸다. 그러나 생체 내 LNT는 화학 에너지와 분자 모터를 조립, 유지 및 재구성해야하는 매우 비평형 구조입니다. 또한, 생체내 LNTs의 조성은 다수의 상이한 지질 종들로 구성된 복합체이다. LNT를 압출하는 일반적인 방법은 시간과 노동 집약적이며, 거대한 지질 소포에서 나노 튜브를 강제로 끌어 오기 위해 광학 핀셋, 마이크로 비드 및 마이크로 피펫이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 글라이딩 운동성 분석 (GMA)을위한 프로토콜이며, 대규모 LNT 네트워크는 키네신 구동 미세 소관 운동성을 사용하여 거대한 unilamellar vesicles (GUVs)에서 빠르게 생성됩니다. 이 방법을 사용하여, LNT 네트워크는 생물학적 LNT의 복잡성을 모방하는 광범위한 지질 제형으로 형성되어, 지질 생물물리학 및 막 관련 수송의 시험관내 연구에 점점 더 유용하게 된다. 또한이 방법은 일반적으로 사용되는 실험실 장비를 사용하여 단시간 (<30 분) 내에 LNT 네트워크를 안정적으로 생산할 수 있습니다. 길이, 폭 및 지질 분할과 같은 LNT 네트워크 특성도 네트워크 제조에 사용되는 GUV의 지질 구성을 변경하여 조정할 수 있습니다.

Introduction

지질 나노튜브(LNT) 네트워크의 제작은 비평형 지질 구조 1,2,3의 시험관내 검사에 대한 관심이 증가하고 있다. 세포는 단백질(4)과 핵산(5)의 확산 수송뿐만 아니라 세포-세포간 통신(6,7)을 위해 지질 세관을 사용한다. 소포체 및 골지 장치는 특히 흥미로운데, 이러한 막-결합된 소기관은 지질 및 단백질 합성을 위한 주요 위치일 뿐만 아니라 세포의 세포질 내에서 이들 필수적인 생체분자의 수송을 위한 주요 위치이기 때문이다8,9. 이들 소기관의 막은 궁극적으로 그들의 기능을 정의하는 데 도움이 되는 스핑고지질, 콜레스테롤 및 인지질(10)을 포함하는 다수의 지질 종으로 구성된다. 따라서, 이들 소기관을 보다 밀접하게 복제하고 연구하기 위해, 시험관내 LNT는 점점 더 복잡한 지질 제형(11)을 갖는 소포로부터 제조되어야 한다.

거대 유니라멜라 소포(GUVs)는 콜레스테롤, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜이노시톨(PI)12,13을 포함하는 복잡한 제형으로 안정적으로 합성될 수 있기 때문에 지질막 거동을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 여기에 설명 된 것은 글라이딩 운동성 분석 (GMA)을 사용하여 다양한 지질 제형을 가진 GUVs에서 LNT를 제조하는 방법이며, LNT는 GUV에 작용하는 키네신 모터 및 미세 소관 필라멘트에 의해 수행 된 작업을 기반으로 압출됩니다. 이 시스템에서, 표면에 흡착된 키네신 모터 단백질은 비오티닐화된 미세소관을 추진하여, ATP의 가수분해로부터 화학 에너지를 유용한 작업(특히, 비오티닐화 소포로부터 LNT의 압출)으로 변환한다11. 생성된 LNT 네트워크는 LNT 형태학의 변화에 대한 지질 위상의 차이의 영향을 연구하기 위한 모델 플랫폼을 제공한다.

간략하게, 키네신 모터 단백질은 카제인을 함유하는 용액의 유동 챔버 내로 도입되며, 이는 챔버의 유리 표면 상으로의 모터의 흡착을 가능하게 한다. 다음으로, ATP를 함유하는 용액 중의 비오티닐화된 미세소관은 챔버를 통해 유동하고 키네신 모터에 결합하고 운동성을 시작하도록 허용된다. 그런 다음 스트렙타비딘 용액을 챔버 내로 도입하고 미세 소관에 비공유적으로 결합하도록 허용한다. 마지막으로, 비오티닐화 지질을 함유하는 GUVs를 챔버 내로 도입하고 스트렙타비딘 코팅된 미세소관에 결합시킨 다음, LNT를 압출하여 15-30분 동안 대규모 네트워크를 형성한다. 이 방법은 표준 실험실 장비 및 시약을 사용하여 대규모 분기 LNT 네트워크를 저렴한 비용으로 생산합니다11.

Protocol

1. 재고 미세소관 용액의 제조 주의: 안전 고글, 장갑 및 실험실 코트는 항상 프로토콜 전체에서 착용해야 합니다. 5x BRB80 버퍼를 준비하십시오: 24.19 g의 파이프(피페라진-N,N’-비스[2-에탄설폰산])와 0.38g의 EGTA(에틸렌 글리콜-비스[β-아미노에틸 에테르]-N,N,N’,N’-테트라아세트산)를 1L 유리 병에 넣으십시오. 1 mL의 1 MMgCl2 를 첨가하고, KOH로 pH를 6.9로 조정하였다. 탈?…

Representative Results

LNT 네트워크(그림 4)는 GUV로부터 LNT를 밀어내기 위해 미세소관의 키네신 수송에 의해 수행된 작업을 사용하는 설명된 프로토콜을 사용하여 제작되었다. 간략하게, GUVs는 수크로오스 용액을 사용하여 재수화된 아가로스 겔을 사용하여 제조되었고, 미세소관은 GPEM 용액에서 중합되고 BRB80T에서 안정화되었다. 다음으로, kinesin 모터를 유동 셀에 도입하여 커버슬립 표면에 모터?…

Discussion

LNT 네트워크는 막횡단 단백질과 같은 생체분자의 특성 및 수송에 대한 시험관내 연구에 유용한 도구이다. 또한, LNT 네트워크를 제조하기 위해 복잡한 지질 제제를 사용하는 것은 생물학적으로 더 관련성이 높은 연구를 가능하게 한다. 다른 제조 연구는 1) 단순 지질 제제 및 다중 라멜라 소포 또는 2) 복잡한 지질 제형으로 구성된 GUV의 네트워크를 제조하기 위해보다 성가신 운동성 기술을 사용했?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 미국 에너지부, 기본 에너지 과학 사무소, 재료 과학 및 엔지니어링 부서 (BES-MSE)의 지원을 받았습니다. Kinesin 합성 및 형광 현미경 검사는 미국 에너지부 (DOE) 과학 사무소에서 운영되는 과학 사용자 시설 인 통합 나노 기술 센터 (Center for Integrated Nanotechnologies)의 사용자 프로젝트 (ZIM)를 통해 수행되었습니다.

Materials

100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective Olympus 1-U2B836 Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread
Working Distance 0.12mm
3.0 ND Filter Olympus Neutral Density Filter
AMP-PNP Sigma-Aldrich A2647 (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate)
ATP Sigma-Aldrich A7699 Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set Semrock LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000
BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources
Casein Sigma-Aldrich 22090 Casein hydrolysate for microbiology
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Catalase from Bovine Liver
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Cholesterol Avanti 700000P cholesterol (ovine wool, >98%) (powder)
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021 D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
DOPC Avanti 850375C 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform)
DOPE-Biotin Avanti 870282C 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DPPC Avanti 850355P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder)
DPPE-Biotin Avanti 870285P 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt)
DTT Sigma-Aldrich 43816 DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA Sigma-Aldrich E4378 EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid
Glucose Oxidase Sigma-Aldrich G6125 Glucose Oxidase from Aspergillus niger
Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen)
Glycerol Fisher G33 Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical
GTP Sigma-Aldrich G8877 Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate
IX-81 Olympus Microscope Olympus N/A IX81 Inverted Microscope from Olympus
KOH Sigma-Aldrich 1050121000 Potassium Hydroxide
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M1028 1.00 M magnesium chloride solution
Orca Flash 4.0 Digital Camera Hamamatsu C13440-20CU ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera
Oregon Green-DHPE Invitrogen O12650 Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel ThermoFisher P3456 Paclitaxel (Taxol Equivalent) – for use in research only
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPE Invitrogen T1395MP Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine,
Triethylammonium Salt
Trolox Sigma-Aldrich 238813 (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
Tubulin, Biotin Cytoskeleton T333P Tubulin protein (biotin) porcine brain
Tubulin, Hy-Lite 488 Cytoskeleton TL488M Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain
Tubulin, Unlabeled Cytoskeleton T240 Tubulin protein porcine brain

References

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Cite This Article
Imam, Z. I., Bachand, G. D. Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay. J. Vis. Exp. (173), e60899, doi:10.3791/60899 (2021).

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