Summary
이 프로토콜은 거대한 유니라멜라 지질 소포와 함께 글라이딩 키네신 운동성을 사용하여 지질 나노튜브 네트워크를 제조하는 과정을 기술한다.
Abstract
지질 나노튜브(LNT) 네트워크는 진핵 세포에서 발견되는 유비쿼터스 지질 세관과 관련성이 있는 분자 수송 및 지질 생물물리학을 연구하기 위한 시험관내 모델 시스템을 나타낸다. 그러나 생체 내 LNT는 화학 에너지와 분자 모터를 조립, 유지 및 재구성해야하는 매우 비평형 구조입니다. 또한, 생체내 LNTs의 조성은 다수의 상이한 지질 종들로 구성된 복합체이다. LNT를 압출하는 일반적인 방법은 시간과 노동 집약적이며, 거대한 지질 소포에서 나노 튜브를 강제로 끌어 오기 위해 광학 핀셋, 마이크로 비드 및 마이크로 피펫이 필요합니다. 여기에 제시된 것은 글라이딩 운동성 분석 (GMA)을위한 프로토콜이며, 대규모 LNT 네트워크는 키네신 구동 미세 소관 운동성을 사용하여 거대한 unilamellar vesicles (GUVs)에서 빠르게 생성됩니다. 이 방법을 사용하여, LNT 네트워크는 생물학적 LNT의 복잡성을 모방하는 광범위한 지질 제형으로 형성되어, 지질 생물물리학 및 막 관련 수송의 시험관내 연구에 점점 더 유용하게 된다. 또한이 방법은 일반적으로 사용되는 실험실 장비를 사용하여 단시간 (<30 분) 내에 LNT 네트워크를 안정적으로 생산할 수 있습니다. 길이, 폭 및 지질 분할과 같은 LNT 네트워크 특성도 네트워크 제조에 사용되는 GUV의 지질 구성을 변경하여 조정할 수 있습니다.
Introduction
지질 나노튜브(LNT) 네트워크의 제작은 비평형 지질 구조 1,2,3의 시험관내 검사에 대한 관심이 증가하고 있다. 세포는 단백질(4)과 핵산(5)의 확산 수송뿐만 아니라 세포-세포간 통신(6,7)을 위해 지질 세관을 사용한다. 소포체 및 골지 장치는 특히 흥미로운데, 이러한 막-결합된 소기관은 지질 및 단백질 합성을 위한 주요 위치일 뿐만 아니라 세포의 세포질 내에서 이들 필수적인 생체분자의 수송을 위한 주요 위치이기 때문이다8,9. 이들 소기관의 막은 궁극적으로 그들의 기능을 정의하는 데 도움이 되는 스핑고지질, 콜레스테롤 및 인지질(10)을 포함하는 다수의 지질 종으로 구성된다. 따라서, 이들 소기관을 보다 밀접하게 복제하고 연구하기 위해, 시험관내 LNT는 점점 더 복잡한 지질 제형(11)을 갖는 소포로부터 제조되어야 한다.
거대 유니라멜라 소포(GUVs)는 콜레스테롤, 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS) 및 포스파티딜이노시톨(PI)12,13을 포함하는 복잡한 제형으로 안정적으로 합성될 수 있기 때문에 지질막 거동을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 여기에 설명 된 것은 글라이딩 운동성 분석 (GMA)을 사용하여 다양한 지질 제형을 가진 GUVs에서 LNT를 제조하는 방법이며, LNT는 GUV에 작용하는 키네신 모터 및 미세 소관 필라멘트에 의해 수행 된 작업을 기반으로 압출됩니다. 이 시스템에서, 표면에 흡착된 키네신 모터 단백질은 비오티닐화된 미세소관을 추진하여, ATP의 가수분해로부터 화학 에너지를 유용한 작업(특히, 비오티닐화 소포로부터 LNT의 압출)으로 변환한다11. 생성된 LNT 네트워크는 LNT 형태학의 변화에 대한 지질 위상의 차이의 영향을 연구하기 위한 모델 플랫폼을 제공한다.
간략하게, 키네신 모터 단백질은 카제인을 함유하는 용액의 유동 챔버 내로 도입되며, 이는 챔버의 유리 표면 상으로의 모터의 흡착을 가능하게 한다. 다음으로, ATP를 함유하는 용액 중의 비오티닐화된 미세소관은 챔버를 통해 유동하고 키네신 모터에 결합하고 운동성을 시작하도록 허용된다. 그런 다음 스트렙타비딘 용액을 챔버 내로 도입하고 미세 소관에 비공유적으로 결합하도록 허용한다. 마지막으로, 비오티닐화 지질을 함유하는 GUVs를 챔버 내로 도입하고 스트렙타비딘 코팅된 미세소관에 결합시킨 다음, LNT를 압출하여 15-30분 동안 대규모 네트워크를 형성한다. 이 방법은 표준 실험실 장비 및 시약을 사용하여 대규모 분기 LNT 네트워크를 저렴한 비용으로 생산합니다11.
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Protocol
1. 재고 미세소관 용액의 제조
주의: 안전 고글, 장갑 및 실험실 코트는 항상 프로토콜 전체에서 착용해야 합니다.
- 5x BRB80 버퍼를 준비하십시오: 24.19 g의 파이프(피페라진-N,N'-비스[2-에탄설폰산])와 0.38g의 EGTA(에틸렌 글리콜-비스[β-아미노에틸 에테르]-N,N,N',N'-테트라아세트산)를 1L 유리 병에 넣으십시오. 1 mL의 1 MMgCl2 를 첨가하고, KOH로 pH를 6.9로 조정하였다. 탈이온수를 첨가하여 용액을 500 mL의 최종 부피로 가져온다.
- GTP 용액의 100 mM 스톡을 준비하십시오 : GTP 52mg을 칭량하고 증류수 1 mL에 현탁하십시오. 100 mM 용액을 20 μL 분취량으로 나누고 -20°C에서 보관한다.
- GPEM 용액을 준비하십시오: 200 μL의 5x BRB80, 100 mM GTP 용액 10 μL, 100 μL의 100% 글리세롤 및 600 μL의 탈이온수를 혼합한다. GPEM 용액을 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에 보관한다.
- 차가운 (4 °C) GPEM 용액에서 상업적으로 입수가능하고 동결 건조 된 튜불린 (비오티닐화, 형광 표지 및 비표지 된 바이알)의 바이알을 5 mg / mL의 스톡 농도로 재구성하여 미세 소관 용액을 준비하십시오.
- 4 μL의 비오티닐화 튜불린, 4 μL의 형광 표지된 튜불린 및 24 μL의 표지되지 않은 튜불린 (모두 5 mg/mL 농도에서)을 혼합하여 미세소관 중합을 수행하여 32 mL의 최종 부피에서 1:1:6의 비율을 생성한다. 얼음 위에 보관하십시오. 튜불린 혼합물을 2 μL 분취량으로 분할하고 필요할 때까지 -80°C에서 보관한다.
참고: 효율적인 중합을 위해서는 튜불린의 농도가 임계 농도(5mg/mL)14 이상이어야 합니다. 여기서, 튜불린 비율의 선택은 스트렙타비딘 및 GUVs에 효율적으로 결합하기에 충분한 농도의 비오티닐화 튜불린뿐만 아니라 현미경적 특성화를 위한 형광 튜불린의 충분한 농도에 대해 최적화된다.
2. 거대 유니라멜라 소포(GUV)의 제조
- 아가로스 필름 준비
참고: 이 프로토콜은 Greene et al.15에서 채택되었습니다.- 250 mL 삼각플라스크의 탈이온수 100 mL에 아가로스 1 g을 혼합하여 1% w/v 용액을 준비한다. 표준 전자 레인지를 사용하여 아가로스 용액을 1-2 분 동안 가열하십시오.
참고 : 아가로스가 완전히 용해되면 용액은 반투명 해집니다. 사용하기 전에 용액을 65-75 °C로 식히십시오. - 절단된 1,000μL 피펫 팁을 사용하여 300-400μL의 아가로스 용액을 25mm x 25mm 유리 커버슬립에 피펫으로 만듭니다. 장갑을 낀 손가락으로 커버슬립의 가장자리를 잡고 있는 동안 또 다른 1,000μL 피펫 팁을 사용하여 녹은 아가로스를 커버슬립 전체에 고르게 퍼뜨립니다.
참고: 아가로스를 65-75°C로 유지하면 커버슬립 표면에 효율적으로 퍼질 수 있습니다. - 아가로스 코팅된 커버슬립을 37°C 인큐베이터에서 적어도 2시간 동안 건조시키고, 이때 아가로스는 투명해질 것이다. 아가로스 코팅 표면을 위쪽을 향하도록 하여 커버슬립을 보풀이 없는 종이 또는 왁스계 필름과 같은 깨끗한 표면에 실온에서 보관하십시오(RT).
- 250 mL 삼각플라스크의 탈이온수 100 mL에 아가로스 1 g을 혼합하여 1% w/v 용액을 준비한다. 표준 전자 레인지를 사용하여 아가로스 용액을 1-2 분 동안 가열하십시오.
- 지질 제형
- 클로로포름에 용해된 지질을 -20°C 냉동고에서 회수하여 RT에 도달할 때까지 화학 흄 후드에 넣는다.
- 다음 공식을 사용하여 제제에 필요한 각 성분 지질의 지질 스톡의 부피를 계산하십시오.
여기서: V 지질은 사용할 지질의 부피, 몰 %는 지질 성분의 몰 백분율, n은 제형에 사용된 지질의 총 몰 수, M은 몰 단위의 지질의 농도이다.
참고: 예를 들어, 45 몰% 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC)을 12.72 mM의 원액 농도 및 제형 내의 총 지질의 1 마이크로몰을 함유하는 제형을 사용하는 경우, 제형에 사용된 DOPC 스톡의 부피는 다음과 같다:
- 화학 흄 후드의 유리 바이알에 계산 된 비율로 지질을 함께 혼합하십시오.
- 30 μL의 지질 용액을 제형의 포화 지질 성분의 융점 이상으로 설정되는 예열된 핫플레이트 상의 아가로스 코팅된 커버슬립 상으로 피펫한다(예를 들어, 40°C의 Tm을 갖는 지질을 위한 50°C 핫플레이트).
- 클로로포름이 증발하고 지질의 균일한 층이 형성될 때까지 18 G 바늘의 긴 가장자리를 사용하여 원형 운동으로 아가로스 필름을 가로질러 용액을 퍼뜨린다. 이 단계를 수행하는 동안 장갑을 낀 손가락으로 커버 슬립의 가장자리를 잡으십시오.
참고 : 바늘로 아가로스 층을 손상시키지 않도록주의해야합니다. - 아가로스 층과 지질 필름이 있는 커버슬립을 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시에 넣고, 필름 면이 위쪽을 향하도록 하고, 페트리 접시를 진공 데시케이터에 2시간 이상 두어 잔류 용매를 제거한다.
- 그 동안 수크로오스 1.92g을 탈이온수 10mL와 혼합하여 560mM 수크로오스 용액을 제조하였다.
참고: 수크로오스 용액의 농도는 GUVs가 희석되는 완충액의 삼투압에 의존한다. 전형적으로, 수크로오스 용액의 삼투압은 GUVs가 희석될 완충액, 구체적으로는 운동성 완충액보다 10% 이상 크지 않아야 한다(단계 3.11 참조). - GUV 형성
- 지질 필름이 위쪽을 향하도록 지질 코팅된 커버슬립 상에 접착 챔버를 부드럽게 가압하여 지질 필름으로 코팅된 커버슬립에 접착 챔버를 부착하여, 타이트한 밀봉이 형성되도록 한다.
- 400 μL의 560 mM 수크로오스 용액 (단계 2.3에서 제조됨)을 챔버에 첨가한다.
- 커버 슬립을 습도 챔버에 넣고 뚜껑을 닫습니다.
- 조습 챔버를 제형의 포화 지질 성분의 융점 위에 놓인 예열된 핫플레이트 상에 놓는다.
- 회복하기 전에 소포가 ≥1 시간 동안 형성되도록하십시오.
참고: 베시클 형성은 40x 공기 대물 렌즈로 형광 현미경으로 확인할 수 있습니다.
3. 운동성 분석 스톡 및 시약의 제조
- 카제인 재고의 제조
- 건조 카제인 3g을 50mL 원뿔형 원심분리 튜브에 넣은 다음 30mL의 1x BRB80을 넣고 용액이 점성이 될 때까지 회전시킨다. 튜브를 15,000 x g 에서 30분 동안 원심분리한다.
- 상청액을 다른 50 mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮기고 펠렛을 버린다. 용액을 1 μm 시린지 필터를 통해 여과하고, 용액을 50 mL 원뿔형 바이알에 수집한다. 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 용액을 50 mL 원뿔형 바이알에 수집한다.
- UV-Vis 분광광도계 및 석영 큐벳을 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 결정한다.
- 다음 공식을 사용하여 mg/mL의 카제인 농도를 계산합니다.
- 용액을 1x BRB80에서 20 mg/mL로 희석하고, 100 μL 분취량으로 분할하고, -20°C에서 저장한다.
- 글루코스 옥시다아제 2mg과 1x BRB80 1mL를 혼합하여 글루코스 산화효소(2mg/mL) 원액을 준비합니다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.
- 카탈라아제 0.8mg과 1x BRB80 1mL를 혼합하여 카탈라아제(0.8mg/mL) 원액을 준비합니다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.
- 0.3 g의 D-글루코오스를 탈이온수 1 mL에 현탁시켜 2 M 글루코오스 용액을 제조하였다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.
- 0.015 g의 DTT를 1 mL의 탈이온수에 현탁시켜 100 mM DTT 스톡을 제조하였다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.
- 0.055 g의 디소듐 ATP를 100 mMMgCl2의 용액 1 mL에 현탁시켜 100 mM Mg-ATP 스톡을 제조하였다. 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.
- 0.055 g의 AMP-PNP를 100 mMMgCl2의 용액 1 mL에 현탁시켜 100 mM Mg-AMP-PNP 용액을 준비한 다음, 100 μL 분취량으로 분할하고 -20°C에서 보관한다.
- 메탄올 1 mL에 25.03 mg의 트롤록스를 첨가하여 100 mM 트롤록스 용액을 제조하고 -20°C에서 보관한다.
- BRB80 100μL에 스트렙타비딘 1mg을 첨가하여 10mg/mL 스트렙타비딘 용액을 준비한 다음, 2μL 분취량으로 나누어 -80ۛ°C에서 보관한다.
- 200 μL의 5x BRB80, 20 μL의 카제인 용액, 10 μL의 MgATP 용액, 10 μL의 트롤록스, 5 μL의 파클리탁셀 용액 및 765 μL의 DI 물을 혼합하여 BRB90CAT를 제조하였다. 4°C에서 보관한다.
- 192 μL의 BRB80CAT, 2 μL의 D-글루코스 용액, 2 μL의 글루코스 옥시다제 용액, 2 μL의 DTT 용액 및 2 μL의 카탈라아제 용액을 혼합하여 운동성 용액을 제조하였다. 4°C에서 보관한다.
- BRB80CAT의 스톡 키네신 용액 (예를 들어, BRB80CAT의 98 μL 중의 50 mM 키네신 용액 2 μL)을 희석하여 1 μM 키네신 용액을 제조하고, 4°C에서 저장한다.
- 10 μL의 안정화된 미세소관을 90 μL의 실온 BRB80CAT에 희석하여 10 μg/mL 미세소관 용액을 제조하였다. RT에 저장합니다.
- 99.9 μL의 운동성 용액에 10 mg/mL 스트렙타비딘 용액 0.1 μL를 첨가하여 10 μg/mL 스트렙타비딘 용액을 준비한다. 4°C에서 보관한다.
- 5 μL의 GUV 스톡을 55 μL의 운동성 용액으로 희석하여 12x GUV 용액을 제조하였다. 4°C에서 보관한다.
- 미세 소관으로의 튜불린 중합
- 미리 제조된 튜불린의 2 μL 분취량을 -80°C 냉동고(단계 1.5에서 제조)로부터 수집하고, 37°C 수조에 넣고 30분 동안 배치한다.
- 무수 DMSO 1 mL에 1.71 mg의 파클리탁셀을 첨가하고, 10 μL 분취량으로 분할하고, -20°C에서 저장함으로써 2 mM 파클리탁셀 용액을 제조하였다.
- 99.5 μL의 1x BRB80을 0.5 μL의 2 mM 파클리탁셀과 혼합하여 BRB80T를 신선하게 제조하였다. 100 μL의 BRB80T를 수조에서 37°C로 가온한다.
- 30분 후, 100 μL의 BRB80T를 튜불린 분취량에 첨가하여 미세소관을 안정화시킨다. RT에 저장합니다.
4. 글라이딩 운동성 분석 (GMA)
- 유리 슬라이드에 5mm로 분리된 양면 테이프 두 스트립을 부착하여 유동실을 준비합니다. 세 개의 테이프 레이어가 각 스트립을 구성할 때까지 이 과정을 반복합니다.
- 커버슬립을 테이프 위에 놓은 다음 핀셋이나 펜으로 커버슬립/테이프 인터페이스를 부드럽게 눌러 충분한 접착력을 확보하십시오.
참고: 채널은 너비 5mm, 길이 25mm, 높이 300mm여야 합니다. - 1 mm 키네신 용액 (단계 3.12에서 제조됨) 30 μL를 피펫 유동 세포에 넣고 5분 동안 인큐베이션시킨다.
참고: 카제인은 커버슬립/유리 슬라이드의 표면에 이중층을 형성하고 키네신 꼬리를 표면에 쉽게 부착할 수 있습니다. - 10 μg/mL 미세소관 용액 (단계 3.13에서 준비됨) 중 30 μL를 유동 셀로 피펫하고, 실험실 와이프를 사용하여 유동 채널의 반대쪽 끝에 부드럽게 눌러서 용액 교환을 용이하게 한다. 5 분 동안 배양하십시오.
- 유동 셀을 RT에서 1x 운동성 용액으로 1x-3x로 세척하십시오 (3.11 단계에서 준비).
참고: 이 시점에서 40x 공기 목표를 사용하는 형광 현미경을 사용하여 미세 소관 부착 및 운동성을 확인할 수 있습니다. 미세소관은 ~0.5μm/s에서 표면을 가로질러 이동(활공)하는 형광 필라멘트(길이 수십 미크론)로 나타납니다(그림 1). - 10 μg/mL 스트렙타비딘 용액 (단계 3.14에서 준비된) 30 μL를 실험실 세척을 사용하여 유동 셀에 넣고 용액 교환을 용이하게하기 위해 유동 채널의 반대쪽 끝에 부드럽게 압착하십시오. 10분 동안 인큐베이션한다.
- 30 μL의 12x GUV 용액(단계 3.15에서 제조됨)을 실험실 와이프를 사용하여 유동 채널 반대쪽 단부에 대해 부드럽게 압착하여 용액 교환을 용이하게 한다. 30분 동안 인큐베이션한다.
- 2 μL의 100 mM AMP-PNP 용액 (단계 3.7에서 제조됨)을 첨가하여 운동성을 정지시킨 다음, 챔버를 실란트로 밀봉하였다.
5. LNT 네트워크 특성화
- 이미징을 위해 유동 챔버를 반전 현미경으로 옮깁니다.
- 사용된 형광 지질 또는 튜불린의 파장에 따라 적절한 필터 세트를 선택하십시오. 예를 들어, 텍사스 레드 라벨이 붙은 지질을 사용하는 경우 560nm/25nm 여기 필터와 607nm/36nm 방출 필터를 사용합니다.
- 100x 오일 대물렌즈를 사용하여 커버슬립 표면에 초점을 맞춥니다.
- 형광 현미경을 사용하여 LNT 네트워크를 이미지화합니다.
참고: LNT는 더 큰 소포에서 압출되는 선형 구조입니다. LNT는 GUV보다 훨씬 작고 형광 신호가 약합니다. 따라서 노출 및 대비는 이미지 LNT에 따라 조정되어야 합니다. 이러한 조정은 또한 GUV의 과다 노출로 이어지므로 GUV의 라멜라리티 및 상 분리를 독립적으로 특성화하는 것이 좋습니다. - 현미경을 관심 네트워크에 초점을 맞추고 표준 또는 타일 이미지를 찍습니다.
- 노출 시간과 중립 밀도 필터를 조정하여 LNT를 이미지화하고 GUV의 포화 노출을 최소화합니다. 빨간색과 녹색 채널에서 이미지를 모두 가져옵니다.
참고: 여기서 적색 채널은 텍사스-적색 지질의 시각화를 허용하는 반면, 녹색 채널은 미세소관(예: 오레곤 그린 지질 및 HiLyte488 염료)의 시각화를 허용합니다. - 빨강 및 녹색 채널을 오버레이하여 합성 이미지를 만듭니다(그림 1).
- LNT 길이 측정을 통한 LNT 네트워크의 특성화
- ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 엽니다.
- 설정된 배율 피쳐를 사용하여 현미경의 배율을 보정하고 픽셀을 mm 변환 계수로 채운 다음 확인을 클릭합니다.
참고: 변환 계수는 현미경, 대물 렌즈 및 카메라에 따라 다르며 현미경 보정 슬라이드를 사용하여 얻을 수 있습니다. 일반적으로 픽셀 / mm로 표현됩니다. - 멀티포인트 라인 도구를 사용하여 모 GUV에서 시작하는 나노튜브의 길이를 측정합니다. Ctrl+M을 눌러 길이를 측정합니다.
- 위의 단계에 따라 개별 튜브의 길이를 계속 측정하십시오. 이미지 처리 도구는 각각의 새로운 측정을 결과 창에 저장합니다.
- 각 선을 그린 후 Ctrl + D를 눌러 측정 된 튜브를 추적하십시오.
- LNT 두께 측정(그림 2)
- ImageJ에서 이미지를 열고 이미지 탭에서 임계값 피쳐를 선택합니다.
- 적용을 클릭하여 임계값을 적용합니다.
- 원하는 튜브 위에 알려진 길이의 사각형을 그립니다(검은색 픽셀의 값은 0이고 빨간색 픽셀의 값은 255임).
- 영역의 통합 밀도를 측정합니다.
- 밀도를 LNT의 길이(픽셀 단위)로 나누어 두께(픽셀 단위)를 구합니다.
참고: 두께 측정은 이미징 설정과 임계값이 동일하게 설정된 경우에만 이미지 간에 비교할 수 있습니다.
- LNT 노드에서 지질 분할 결정(그림 3)
- ImageJ에서 이미지를 엽니다.
- 선 도구를 사용하여 원하는 노드 위에 선을 그립니다.
- 오레곤 그린 및 텍사스 레드 채널 모두에서 노드 강도를 측정합니다.
- 라인을 LNT로 이동하고 오레곤 그린 및 텍사스 레드 채널 모두에서 LNT 강도를 측정합니다.
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Representative Results
LNT 네트워크(그림 4)는 GUV로부터 LNT를 밀어내기 위해 미세소관의 키네신 수송에 의해 수행된 작업을 사용하는 설명된 프로토콜을 사용하여 제작되었다. 간략하게, GUVs는 수크로오스 용액을 사용하여 재수화된 아가로스 겔을 사용하여 제조되었고, 미세소관은 GPEM 용액에서 중합되고 BRB80T에서 안정화되었다. 다음으로, kinesin 모터를 유동 셀에 도입하여 커버슬립 표면에 모터의 활성 층을 형성했습니다. 그런 다음 미세소관을 도입하고 스트렙타비딘 용액을 첨가하여 비오티닐화 지질과 GUV (이후 도입됨) 간의 결합을 촉진시켰다.
유동 전지에 존재하는 모든 성분들과 함께, LNT들은 30분 동안 형성되도록 허용되었고, 이 시점에서 AMP-PNP는 운동성을 멈추기 위해 도입되었다. 이어서, LNTs를 100x 오일 목표를 사용하여 에피형광 현미경으로 이미지화하였다. LNT는 상당히 클 수 있습니다. 따라서, 더 낮은 동력의 목표가 또한 더 큰 LNT를 포획하는데 사용될 수 있다. LNT 네트워크는 GUV에서 확장되고 연결되는 얇은 웹형 돌출부가 특징입니다. LNT의 수 및 분지화는 표면 상의 미세소관의 밀도, 스트렙타비딘 농도 및 존재하는 GUV의 수를 포함하는 몇몇 인자에 의존한다.
이 방법은 고체, 액체 무질서 및 액체 순서 상으로 구성된 GUV 및 LNT뿐만 아니라 광범위한 다양한 조성물에 걸쳐 이러한 상이 공존하는 상 분리 소포를 생성할 수 있습니다(그림 4). 예를 들어, 45 % 포화 지질과 55 % 불포화 지질을 가진 소포를 합성하면 소포가 공존하는 액체 무질서 및 고체상으로 분리됩니다. 그러나 콜레스테롤이 포함되면 액체 - 액체 공존이 관찰 될 수 있습니다. 예를 들어, 50% 불포화 지질, 30% 콜레스테롤 및 20% 포화 지질로 구성된 혼합물은 공존하는 액체 주문(Lo) 및 액체 무질서(RD) 상으로 분리되는 GUV를 생성합니다. 이 제제에 콜레스테롤을 혼입하면 포화 지질이 유동화되어 액상의 형성이 가능합니다.
더욱이, 노드들(즉, LNT들보다 더 큰 둥근 구형 구조들)은 상으로 분리된 혼합물에서 형성되는 것으로 관찰되었다(도 4). 나노튜브 및 노드 내의 지질 유형의 분할은 노드의 최대 배경 뺀 피크 강도를 찾기 위해 라인 프로파일 도구를 사용하여 특성화될 수 있다. 노드와 LNT의 라인 프로파일이 결정되었고, 이들 프로파일의 배경 형광을 뺀 후 최대값을 결정하였다. 파티셔닝은 이어서 노드 내의 형광의 최대값을 LNT의 최대 형광 값으로 나눔으로써 계산된다. 이 접근법은 LNT뿐만 아니라 더 큰 네트워크에서 형성되는 노드 모두에서 지질의 분할을 가능하게합니다.
그림 1: GUV 및 미세소관으로 제작된 LNT의 합성 이미지. LNT는 키네신 모터 위에서 미끄러지는 운동성 미세 소관에 의해 GUV에서 압출됩니다. 스케일 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 두께를 얻기 위한 임계값 지정 프로세스. (A) 이미지 | 조정 탭에서 임계값을 선택합니다. (B) 임계값을 적용합니다. (C) 원하는 튜브 위에 알려진 길이의 사각형을 그립니다. 검정 픽셀의 값은 0이고 빨간색 픽셀의 값은 255입니다. (d) 영역의 집적 밀도를 측정한다. 튜브 폭을 계산하려면 통합 밀도를 255로 나눈 다음 이 출력을 (B)에서 생성된 사각형의 길이로 나눕니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 노드에서의 지질 분할 결정. (A) ImageJ에서 이미지를 열고 선 도구를 사용하여 원하는 노드 위에 선을 그립니다. (B) 오레곤 그린 채널에서 노드 강도를 측정한다. (c) 선을 LNT로 이동시키고 오레곤 그린 채널의 강도를 측정한다. (D, E, F) 텍사스 레드 채널에 대해 프로세스를 반복합니다. 배율 막대 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 상이한 GUV 지질 제형으로부터 제조된 LNTs. 액체 무질서 (LD) 상으로부터 압출된 LNT는 얇고 긴 반면, 액체 주문된(Lo) 상으로부터 압출된 LNT는 짧고 두껍다. 두 유형의 LNT는 GMA에서 Lo-LD 상 분리 소포가 사용될 때 관찰됩니다. 액체 고체상 GUV의 LNT는 LD GUV에서 압출된 LNT와 유사합니다. 액체 순서 제형은 포화 지질과 콜레스테롤의 조합을 사용하여 만들 수 있으며, 액체 무질서한 제형은 불포화 지질을 사용하여 만들어집니다. 배율 막대 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
LNT 네트워크는 막횡단 단백질과 같은 생체분자의 특성 및 수송에 대한 시험관내 연구에 유용한 도구이다. 또한, LNT 네트워크를 제조하기 위해 복잡한 지질 제제를 사용하는 것은 생물학적으로 더 관련성이 높은 연구를 가능하게 한다. 다른 제조 연구는 1) 단순 지질 제제 및 다중 라멜라 소포 또는 2) 복잡한 지질 제형으로 구성된 GUV의 네트워크를 제조하기 위해보다 성가신 운동성 기술을 사용했습니다. 여기에 설명 된 방법은 복잡한 지질 제제 및 GUV에서 대규모 LNT 네트워크를 효율적으로 제작하고 저렴한 시약 및 장비를 사용하여 가능하게합니다. 따라서이 방법론은 상 분리 및 막 단백질 수송을 포함한 다양한 생물학적 과정을 연구 할 수있는 능력을 제공합니다. 상기 프로토콜은 LNT들의 조성이 그들의 생물학적 유사체들(예를 들어, 골지 장치)에 근사하도록 최적으로 조정될 수 있는 시험관내 모델을 사용한다.
여기에 설명된 방법에서 LNT 네트워크의 형성은 수많은 이점을 갖는다. 예를 들어, 미세소관은 동결건조된 튜불린을 사용하여 쉽고 빠르게 중합되며, 파클리탁셀16으로 안정화될 때 적어도 1-2주 동안 RT에서 안정하게 유지된다. 이와 같이, 이들은 LNT의 압출을 구동하고 대규모 네트워크(1,2)의 형성을 용이하게 구현한다. 추가적으로, 다수의 지질 성분(즉, 불포화 및 포화 지질 및 콜레스테롤)으로 구성된 GUV는 약간의 변형을 갖는 이전의 프로토콜에 기초하여 신속하게 형성될 수 있다. 이러한 변형은 막 상 분리의 물리적 화학적 과정을 겪을 수 있는 GUV의 합성을 가능하게 한다. 일단 준비되면 GUV는 보관 조건에 따라 몇 주에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 그러나 새 배치를 준비하기 전에 최대 1개월 동안 GUVS를 사용하는 것이 좋습니다. 지질 용액은 수개월 동안 -20°C 또는 -80°C에서 저장될 수 있고, 아가로스 겔 및 코팅된 커버슬립뿐만 아니라, 수개월 동안 RT에서 저장될 수 있다. 아가로스 코팅 커버슬립의 지질 필름은 진공 하에 보관하고 48시간 이내에 재수화해야 합니다.
이 기술을 사용하여 GUV에서 LNT를 형성하는 한 가지 과제는 유동 세포에서 GUV, 스트렙타비딘 및 미세 소관의 농도를 균형있게 조정하는 것입니다. 예를 들어, LNT 형성은 미세소관과 GUV 사이의 비율이 정확하지 않은 경우 제한될 것이다. GUV의 농도가 너무 낮 으면 응집체가 형성되지 않으며, 이는 LNT 형성의 첫 번째 단계입니다. 이 프로토콜에 기술된 미세소관 및 GUV의 농도에 대해, 미세소관 스톡의 10x 희석 및 GUV 스톡의 12x 희석은 일반적으로 양호한 LNT 네트워크를 가져왔다. 각각 5x와 6x의 희석은 또한 좋은 네트워크를 산출했습니다.
또 다른 과제는 GUV 용액이 미세 소관 용액과 삼투압 균형을 이루도록 보장하는 것입니다. 두 용액 사이의 삼투압 차이가 너무 크면 GUV가 불안정해지고 파열될 수 있습니다. 용액이 삼투압 평형이 아닌 경우(예를 들어, 두 용액 사이의 측정된 삼투압 사이의 10% 차이), 농축된(예를 들어, 2 M) 수크로오스 용액이 더 낮은 측정된 삼투압을 갖는 용액의 삼투압을 증가시키기 위해 사용되어야 한다. 이 시스템의 또 다른 한계는 생성된 LNT 네트워크의 안정성이며, 이는 시간 단위로 안정하고 지속적으로 수화되는 유동 챔버(또는 실란트로 챔버를 밀봉)에 크게 의존한다. 일단 용액이 유동 챔버로부터 증발되면, LNT는 증발 후에도 몇 개의 잔류 LNT의 존재가 지속될 수 있음에도 불구하고 더 이상 유용하지 않을 것이다.
이들 글라이딩 미세소관 및 GUVs로부터 생성된 LNT 네트워크는 지질 이중층 역학 뿐만 아니라 막 표면 상의 단백질(예를 들어, 막횡단 단백질) 확산을 이해하는데 유용할 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜은 생물학적 LNT형 터널링 나노튜브뿐만 아니라 멤브레인 결합된 소기관(즉, 소포체 및 골지 장치)에서 발견되는 나노튜브를 보다 쉽게 모방하는 다양한 지질 제형으로 구성된 LNT 네트워크를 신속하게 생성할 수 있다. 대규모 LNT 네트워크를 형성하는 능력은 세포 통신을 연구하고, 나노 유체 생체 분자 수송을 연구하고, 합성 신경 네트워크를 개발하기위한 핵심 첫 번째 단계입니다. 이 프로토콜은 LNT의 조성이 자연 세포 구조를 모방하도록 쉽게 변형 될 수있는 최소한의 시험관 내 모델 시스템을 사용하여 LNT의 물리 화학적 특성에 대한 광범위한 연구의 문을 열어줍니다.
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Disclosures
Sandia National Laboratories는 DE-NA-0003525 계약에 따라 미국 DOE의 국가 핵 안보국을 위해 Honeywell International, Inc.의 전액 출자 자회사 인 Sandia, LLC.의 National Technology & Engineering Solutions가 관리하고 운영하는 다중 임무 실험실입니다. 이 백서에서는 객관적인 기술적 결과 및 분석에 대해 설명합니다. 논문에서 표현 될 수있는 주관적인 견해 나 의견이 반드시 미국 에너지부 또는 미국 정부의 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Acknowledgments
이 작업은 미국 에너지부, 기본 에너지 과학 사무소, 재료 과학 및 엔지니어링 부서 (BES-MSE)의 지원을 받았습니다. Kinesin 합성 및 형광 현미경 검사는 미국 에너지부 (DOE) 과학 사무소에서 운영되는 과학 사용자 시설 인 통합 나노 기술 센터 (Center for Integrated Nanotechnologies)의 사용자 프로젝트 (ZIM)를 통해 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
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