Summary
Bu protokol, dev unilamellar lipid vezikülleri ile birlikte kayan kinesin motilitesini kullanarak lipid nanotüp ağlarının üretilmesi için bir süreci açıklamaktadır.
Abstract
Lipid nanotüp (LNT) ağları, ökaryotik hücrelerde bulunan her yerde bulunan lipit tübülleriyle ilgili moleküler taşıma ve lipit biyofiziğini incelemek için in vitro bir model sistemini temsil eder. Bununla birlikte, in vivo LNT'ler, kimyasal enerji ve moleküler motorların monte edilmesini, korunmasını ve yeniden düzenlenmesini gerektiren dengesiz yapılardır. Ayrıca, in vivo LNT'lerin bileşimi, birden fazla farklı lipit türünden oluşan karmaşıktır. LNT'leri ekstrüzyon yapmak için tipik yöntemler hem zaman hem de emek yoğundur ve nanotüpleri dev lipit veziküllerinden zorla çekmek için optik cımbız, mikro boncuk ve mikropipetler gerektirir. Burada, büyük ölçekli LNT ağlarının kinesin ile çalışan mikrotübül motilitesi kullanılarak dev unilamellar veziküllerden (GUV'ler) hızla üretildiği kayma hareketliliği testi (GMA) için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, LNT ağları, biyolojik LNT'lerin karmaşıklığını taklit eden çok çeşitli lipit formülasyonlarından oluşur ve bu da onları lipid biyofiziği ve membranla ilişkili transportun in vitro çalışmaları için giderek daha yararlı hale getirir. Ek olarak, bu yöntem yaygın olarak kullanılan laboratuvar ekipmanlarını kullanarak LNT ağlarını kısa sürede (<30 dakika) güvenilir bir şekilde üretebilir. Uzunluk, genişlik ve lipit bölümleme gibi LNT ağ özellikleri, ağları imal etmek için kullanılan GUV'ların lipit bileşimini değiştirerek de ayarlanabilir.
Introduction
Lipid nanotüp (LNT) ağlarının imalatı, dengesiz lipid yapılarının in vitro incelenmesi için artan bir ilgi alanıdır 1,2,3. Hücreler, proteinlerin 4 ve nükleik asitlerin5'in difüzyon taşınması ve hücreden hücreye iletişim 6,7 için lipit tübülleri kullanır. Endoplazmik retikulum ve Golgi aparatı özellikle ilginçtir, çünkü bu zara bağlı organeller lipit ve protein sentezinin yanı sıra bu integral biyomoleküllerin bir hücrenin sitoplazması içinde taşınması için birincil yerlerdir 8,9. Bu organellerin zarları, sonuçta işlevselliklerini tanımlamaya yardımcı olan sfingolipidler, kolesterol ve fosfolipitler10 dahil olmak üzere çoklu lipit türlerinden oluşur. Bu nedenle, bu organelleri daha yakından çoğaltmak ve incelemek için, in vitro LNT'ler giderek daha karmaşık lipit formülasyonlarına sahip veziküllerden imal edilmelidir11.
Dev unilamellar veziküller (GUV'ler), lipid membran davranışını incelemek için yaygın olarak kullanılır, çünkü kolesterol, fosfatidilkolin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilserin (PS) ve fosfatidilinositol (PI) 12,13 içeren karmaşık formülasyonlarla güvenilir bir şekilde sentezlenebilirler. Burada açıklanan, LNT'lerin kinesin motorları ve GUV'lara etki eden mikrotübül filamentleri tarafından gerçekleştirilen çalışmalara dayanarak ekstrüde edildiği kayma hareketlilik testi (GMA) kullanılarak değişen lipit formülasyonlarına sahip GUV'lerden LNT'ler üretmek için bir yöntemdir. Bu sistemde, kinesin motor proteinleri, biyotinillenmiş mikrotübülleri bir yüzeye adsorbe ederek, ATP'nin hidrolizinden kimyasal enerjiyi yararlı bir işe dönüştürerek (özellikle, LNT'lerin biyotinillenmiş veziküllerden ekstrüzyonu)11. Ortaya çıkan LNT ağı, lipit fazlarındaki farklılıkların LNT morfolojisindeki değişiklikler üzerindeki etkilerini incelemek için bir model platform sağlar.
Kısaca, kinesin motor proteinleri, motorların odanın cam yüzeyine adsorpsiyonunu sağlayan kazein içeren bir çözelti içindeki bir akış odasına sokulmuştur. Daha sonra, ATP içeren bir çözeltideki biyotinile mikrotübüller odadan akar ve kinesin motorlarına bağlanmasına ve hareketliliğe başlamasına izin verilir. Daha sonra odaya bir streptavidin çözeltisi verilir ve mikrotübüllere kovalent olmayan bir şekilde bağlanmasına izin verilir. Son olarak, biyotinile edilmiş bir lipit içeren GUV'lar odaya sokulur ve streptavidin kaplı mikrotübüllere bağlanır, daha sonra 15-30 dakika boyunca büyük ölçekli ağlar oluşturmak için LNT'leri ekstrüzyon yapar. Bu yöntem, standart laboratuvar ekipmanlarını ve reaktifleri kullanarak düşük maliyetle büyük, dallanmış LNT ağları üretir11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stok mikrotübül çözeltilerinin hazırlanması
DİKKAT: Güvenlik gözlükleri, eldivenler ve laboratuvar önlüğü protokol boyunca her zaman giyilmelidir.
- 5x BRB80 tamponu hazırlayın: 1 L'lik bir cam şişeye 24.19 g PIPES (piperazin-N, N′-bis [2-etansülfonik asit]) ve 0.38 g EGTA (etilen glikol-bis [β-aminoetil eter]-N, N, N′, N′-tetraasetik asit) ekleyin. 1 mL'lik 1 M MgCl2 ekleyin ve pH'ı KOH ile 6,9'a ayarlayın. Çözeltiyi 500 mL'lik bir son hacme getirmek için deiyonize su ekleyin.
- 100 mM GTP çözeltisi stoğu hazırlayın: 52 mg GTP tartın ve 1 mL damıtılmış suda askıya alın. 100 mM solüsyonu 20 μL alikotlara bölün ve -20 °C'de saklayın.
- GPEM çözeltisini hazırlayın: 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP çözeltisi, 100 μL% 100 gliserol ve 600 μL deiyonize su karıştırın. GPEM çözeltisini 100 μL alikotlara bölün ve -20 °C'de saklayın.
- Ticari olarak temin edilebilen, liyofilize tübülin şişelerini (biyotinillenmiş, floresan olarak etiketlenmiş ve etiketlenmemiş her biri bir şişe) soğuk (4 ° C) GPEM çözeltisinde 5 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonuna yeniden yapılandırarak mikrotübül çözeltisi hazırlayın.
- 32 mL'lik bir son hacimde 1:1:6'lık bir oran oluşturmak için 4 μL biyotinile tübülin, 4 μL floresan etiketli tübülin ve 24 μL etiketlenmemiş tübülin (hepsi 5 mg / mL konsantrasyonlarında) karıştırarak mikrotübül polimerizasyonu gerçekleştirin. Buz üzerinde tutun. Tübülin karışımını 2 μL alikotlara bölün ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C'de saklayın.
NOT: Verimli polimerizasyon, tübülin konsantrasyonunun kritik konsantrasyona (5 mg / mL) eşit veya üzerinde olmasını gerektirir14. Burada, tübülin oranının seçimi, streptavidin ve GUV'ları verimli bir şekilde bağlamak için yeterli konsantrasyonda biyotinillenmiş tübülin ve mikroskobik karakterizasyon için yeterli konsantrasyonda floresan tübülin için optimize edilmiştir.
2. Dev unilamellar veziküllerin (GUV'lar) hazırlanması
- Agarose film hazırlığı
NOT: Bu protokol Greene ve ark.15'ten uyarlanmıştır.- 250 mL Erlenmeyer şişesinde 100 mL deiyonize suda 1 g agaroz karıştırarak% 1'lik bir w / v çözeltisi hazırlayın. Agaroz çözeltisini 1-2 dakika ısıtmak için standart bir mikrodalga kullanın.
NOT: Agaroz tamamen çözündükten sonra çözelti yarı saydam hale gelecektir. Kullanmadan önce çözeltinin 65–75 °C'ye soğumasını bekleyin. - 25 mm x 25 mm'lik bir cam kapak kapağı üzerine 300-400 μL agaroz çözeltisi pipetlemek için kesilmiş 1.000 μL pipet ucu kullanın. Kapak kapağının kenarını eldivenli parmaklarla tutarken, erimiş agarozu kapak kapağı boyunca eşit şekilde yaymak için başka bir 1.000 μL pipet ucu kullanın.
NOT: Agarozun 65–75 °C'de tutulması, kapak kayma yüzeyinde etkili bir şekilde yayılmaya izin verecektir. - Agaroz kaplı örtüleri 37 ° C'lik bir inkübatörde en az 2 saat kurutun, bu noktada agaroz şeffaf hale gelecektir. Agaroz kaplı yüzeyi yukarı bakacak şekilde oda sıcaklığında (RT) tüy bırakmayan kağıt veya balmumu bazlı film gibi temiz bir yüzeye yerleştirerek kapak kapaklarını saklayın.
- 250 mL Erlenmeyer şişesinde 100 mL deiyonize suda 1 g agaroz karıştırarak% 1'lik bir w / v çözeltisi hazırlayın. Agaroz çözeltisini 1-2 dakika ısıtmak için standart bir mikrodalga kullanın.
- Lipid formülasyonu
- Kloroform içinde çözünmüş lipitleri -20 °C'lik bir dondurucudan alın ve RT'ye ulaşana kadar kimyasal bir duman başlığına yerleştirin.
- Aşağıdaki formülü kullanarak formülasyon için gerekli olan her bir bileşen lipitinin lipit stoğunun hacmini hesaplayın:
Nerede: V lipid kullanılacak lipid hacmidir, mol% lipit bileşeninin molar yüzdesidir, n formülasyonda kullanılan toplam lipid mol sayısıdır ve M, molar birimlerdeki lipit konsantrasyonudur.
NOT: Örneğin, 12,72 mM'lik bir stok çözeltisi konsantrasyonuna sahip %45 mol 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) içeren bir formülasyon ve formülasyonda 1 mikromol toplam lipit kullanılıyorsa, formülasyonda kullanılan DOPC stoğunun hacmi şöyle olacaktır:
- Lipitleri, kimyasal duman davlumbazındaki bir cam şişede hesaplanan oranda karıştırın.
- Agaroz kaplı kapaklar üzerine 30 μL lipit çözeltisi pipeti, formülasyonun doymuş lipit bileşeninin erime noktasının üzerine yerleştirilmiş önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerinde kayar (örneğin; Tm 40 °C olan bir lipit için 50 °C sıcak plaka).
- Çözeltiyi, kloroform buharlaşana ve düzgün bir lipit tabakası oluşana kadar 18 G'lik bir iğnenin uzun kenarını kullanarak dairesel bir hareketle agaroz filmi boyunca yayın. Bu adımı gerçekleştirirken kapak kapağının kenarını eldivenli parmaklarınızla tutun.
NOT: İğne ile agaroz tabakasına zarar vermemeye özen gösterilmelidir. - Agaroz tabakası ve lipit filmi içeren kapak kapağını alüminyum folyo kaplı Petri kabına, film tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve artık çözücüyü çıkarmak için Petri kabını en az 2 saat boyunca vakumlu bir kurutucuya yerleştirin.
- Bu arada, 1.92 g sakkarozu 10 mL deiyonize su ile karıştırarak 560 mM sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
NOT: Sakkaroz çözeltisinin konsantrasyonu, tampon GUV'ların seyreltildiği ozmolariteye bağlıdır. Tipik olarak, sakkaroz çözeltisinin ozmolaritesi, GUV'ların seyreltileceği tampondan, özellikle de hareketlilik tamponundan% 10'dan fazla olmamalıdır (bkz. adım 3.11). - GUV oluşumu
- Yapışkan odacığı, lipit filmi yukarı bakacak şekilde lipit kaplı kapak kapağının üzerine hafifçe bastırarak lipit filmi ile kaplanmış bir kapak kapağına yapışkan bir oda yapıştırın ve sıkı bir conta oluştuğundan emin olun.
- Odaya 400 μL 560 mM sakkaroz çözeltisi (adım 2.3'te hazırlanmış) ekleyin.
- Kapak kapağını nem odasına yerleştirin ve kapağı kapatın.
- Nem odasını, formülasyonun doymuş lipit bileşeninin erime noktasının üzerine yerleştirilmiş önceden ısıtılmış bir sıcak plaka üzerine yerleştirin.
- İyileşmeden önce veziküllerin ≥1 saat boyunca oluşmasına izin verin.
NOT: Vezikül oluşumu, 40x hava objektif lens ile floresan mikroskopi ile kontrol edilebilir.
3. Motiliteli test stoklarının ve reaktiflerinin hazırlanması
- Kazein stoğunun hazırlanması
- 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne 3 g kuru kazein ekleyin, ardından 30 mL 1x BRB80 ekleyin ve çözelti viskoz hale gelene kadar döndürün. Tüpü 30 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı başka bir 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın ve peleti atın. Çözeltiyi 1 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve çözeltiyi 50 mL'lik bir konik şişede toplayın. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden geçirerek çözeltiyi 50 mL'lik bir konik şişede toplayın.
- Bir UV-Vis spektrofotometresi ve kuvars küvet kullanarak absorbansı 280 nm'de ölçerek protein konsantrasyonunu belirleyin.
- Aşağıdaki formülü kullanarak mg / mL cinsinden kazein konsantrasyonunu hesaplayın:
- Çözeltiyi 1x BRB80'de 20 mg / mL'ye kadar seyreltin, 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
- 2 mg glikoz oksidazı 1 mL 1x BRB80 ile karıştırarak glikoz oksidaz (2 mg / mL) stok çözeltisi hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
- 0.8 mg katalazı 1 mL 1x BRB80 ile karıştırarak katalaz (0.8 mg / mL) stok çözeltisi hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
- 1 mL deiyonize suda 0.3 g D-glikozu askıya alarak 2 M glikoz çözeltisi hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
- 1 mL deiyonize suda 0,015 g DTT'yi askıya alarak 100 mM DTT stoğu hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
- 100 mM MgCl2'lik 1 mL çözeltide 0.055 g disodyum ATP'yi askıya alarak 100 mM Mg-ATP stoğu hazırlayın. 100 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
- 100 mM MgCl2'lik 1 mL'lik bir çözeltide 0,055 g AMP-PNP'yi askıya alarak 100 mM Mg-AMP-PNP çözeltisi hazırlayın, ardından 100 μL alikotlara bölün ve -20 °C'de saklayın.
- 1 mL metanole 25.03 mg Trolox ekleyerek 100 mM Trolox çözeltisi hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
- 100 μL BRB80'e 1 mg streptavidin ekleyerek 10 mg / mL streptavidin çözeltisi hazırlayın, ardından 2 μL alikotlara bölün ve -80ۛ ° C'de saklayın.
- 200 μL 5x BRB80, 20 μL kazein çözeltisi, 10 μL MgATP çözeltisi, 10 μL Trolox, 5 μL paklitaksel çözeltisi ve 765 μL DI suyu karıştırarak BRB90CAT hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-glikoz çözeltisi, 2 μL glikoz oksidaz çözeltisi, 2 μL DTT çözeltisi ve 2 μL katalaz çözeltisini karıştırarak hareketlilik çözeltisini hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- BRB80CAT'teki stok kinesin çözeltisini seyrelterek 1 μM kinesin çözeltisi hazırlayın (örneğin, BRB80CAT'in 98 μL'sinde 2 μL 50 mM kinesin çözeltisi) ve 4 °C'de saklayın.
- 90 μL oda sıcaklığında 10 μL stabilize mikrotübülleri seyrelterek 10 μg / mL mikrotübül çözeltisi hazırlayın BRB80CAT. RT'de depolayın.
- 99.9 μL hareketlilik çözeltisine 0.1 μL 10 mg / mL streptavidin çözeltisi ekleyerek 10 μg / mL'lik bir streptavidin çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- 5 μL GUV stoğunu 55 μL hareketlilik çözeltisine seyrelterek 12x GUV çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- Tübülinin mikrotübüllere polimerizasyonu
- Önceden hazırlanmış 2 μL tübülin alikotunu -80 °C dondurucudan (adım 1.5'te hazırlanmış) toplayın ve 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- 1 mL susuz DMSO'ya 1.71 mg paklitaksel ekleyerek 2 mM'lik bir paklitaksel çözeltisi hazırlayın, 10 μL alikotlara bölün ve -20 ° C'de saklayın.
- BRB80T'yi 99,5 μL 1x BRB80 ile 0,5 μL 2 mM paklitaksel karıştırarak taze olarak hazırlayın. Su banyosunda 100 μL BRB80T ila 37 °C ısıtın.
- 30 dakika sonra, mikrotübülleri stabilize etmek için tübülin aliquotuna 100 μL BRB80T ekleyin. RT'de depolayın.
4. Kayan hareketlilik testi (GMA)
- Bir cam kızağa 5 mm ile ayrılmış iki çift taraflı bant şeridi yapıştırarak bir akış odası hazırlayın. Her şeridi üç bant katmanı oluşturana kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Bandın üstüne bir kapak kayması yerleştirin, ardından yeterli yapışmayı sağlamak için bir cımbız veya kalemle kapak kayması/bant arayüzüne hafifçe bastırın.
NOT: Kanal 5 mm genişliğinde 25 mm uzunluğunda ve 300 mm yüksekliğinde olmalıdır. - Pipet, akış hücresine 30 μL 1 mm kinesin çözeltisi (adım 3.12'de hazırlanmış) ve 5 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin.
NOT: Kazein, kapak kayması/cam sürgü yüzeyinde bir çift katman oluşturur ve kinesin kuyruğunun yüzeye tutturulmasını kolaylaştırır. - Pipet, çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırılmış bir laboratuvar mendili kullanılarak akış hücresine 10 μg/mL mikrotübül çözeltisinden (adım 3.13'te hazırlanmıştır) 30 μL'dir. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- 1x–3x akış hücresini RT'de 1x hareketlilik çözeltisi ile yıkayın (adım 3.11'de hazırlanır).
NOT: Bu noktada mikrotübül bağlantısını ve hareketliliğini doğrulamak için 40x hava hedefi kullanan floresan mikroskobu kullanılabilir. Mikrotübüller, yüzey boyunca ~ 0.5 μm / s'de hareket eden (süzülen) floresan filamentler (onlarca mikron uzunluğunda) olarak ortaya çıkar (Şekil 1). - Pipet, çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırılmış bir laboratuvar mendili kullanılarak akış hücresine 10 μg/mL streptavidin çözeltisinden (adım 3.14'te hazırlanmıştır) 30 μL'dir. 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- 30 μL 12x GUV çözeltisini (adım 3.15'te hazırlanmıştır), çözelti değişimini kolaylaştırmak için akış kanalının karşı ucuna hafifçe bastırılmış bir laboratuvar mendili kullanarak akışa aktarın. 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Hareketliliği durdurmak için 2 μL 100 mM AMP-PNP çözeltisi (adım 3.7'de hazırlanmış) ekleyin, ardından odayı sızdırmazlık maddesi ile kapatın.
5. LNT ağ karakterizasyonu
- Görüntüleme için akış odasını ters çevrilmiş bir mikroskopa aktarın.
- Kullanılan floresan lipitlerin veya tübülinin dalga boylarına göre uygun filtre setini seçin. Örneğin, Texas Red etiketli lipitleri kullanırken, 560 nm / 25 nm uyarma filtresi ve 607 nm / 36 nm emisyon filtresi kullanın.
- Kapak kapağının yüzeyine odaklanmak için 100x yağ hedefi kullanın.
- Floresan mikroskobu kullanarak LNT ağlarını görüntüleyin.
NOT: LNT'ler daha büyük veziküllerden ekstrüzyon yapan doğrusal yapılardır. LNT'ler GUV'lardan çok daha küçüktür ve daha zayıf floresan sinyallerine sahiptir. Bu nedenle, pozlama ve kontrast görüntü LNT'lerine göre ayarlanmalıdır. Bu ayarlamalar aynı zamanda GUV'ların aşırı maruz kalmasına da yol açar ve bu nedenle GUV'lardaki lamellerliğin ve faz ayrımının bağımsız olarak karakterize edilmesi önerilir. - Mikroskopu bir ilgi alanına odaklayın ve standart veya döşenmiş bir görüntü alın.
- LNT'leri görüntülemek ve GUV'lerin doymuş pozlamasını en aza indirmek için pozlama süresini ve nötr yoğunluk filtrelerini ayarlayın. Hem kırmızı hem de yeşil kanallarda görüntüler alın.
NOT: Burada, kırmızı kanal Teksas-Kırmızı lipitlerin görselleştirilmesine izin verirken, yeşil kanal mikrotübüllerin (örneğin, Oregon Green lipitleri ve HiLyte488 boyaları) görselleştirilmesine izin verir. - Kırmızı ve yeşil kanalları üst üste bekleyerek bileşik bir görüntü oluşturun (Şekil 1).
- LNT uzunluğunun ölçülmesiyle LNT ağlarının karakterizasyonu
- ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak alınan görüntüleri açın.
- Ölçek ayarla özelliğini kullanarak mikroskop için teraziyi kalibre edin, pikselleri mm dönüştürme faktörüne doldurun ve Tamam'ı tıklatın.
NOT: Dönüştürme faktörü mikroskop, objektif lens ve kameraya bağlıdır ve mikroskop kalibrasyon slaytı kullanılarak elde edilebilir. Genellikle piksel/mm cinsinden ifade edilir. - Ana GUV'den başlayan nanotüplerin uzunluğunu ölçmek için Çok Noktalı çizgi aracını kullanın. Uzunluğu ölçmek için Ctrl + M tuşlarını basılı tutun.
- Yukarıdaki adımları izleyerek tek tek tüplerin uzunluklarını ölçmeye devam edin. Görüntü işleme aracı, her yeni ölçümü sonuçlar penceresine kaydeder.
- Hangi tüplerin ölçüldüğünü takip etmek için her çizgiyi çizdikten sonra Ctrl + D tuşlarını basılı tutun.
- LNT kalınlığının ölçülmesi (Şekil 2)
- Görüntüyü ImageJ'de açın ve Görüntü sekmesinin altındaki Eşik özelliğini seçin.
- Eşiği uygulamak için Uygula'yı tıklayın.
- İstediğiniz tüpün üzerine bilinen uzunlukta bir dikdörtgen çizin (siyah piksellerin değeri 0, kırmızı piksellerin değeri ise 255'tir).
- Alanın entegre yoğunluğunu ölçün.
- Kalınlığı (piksel cinsinden) elde etmek için yoğunluğu LNT'nin uzunluğuna (piksel cinsinden) bölün.
NOT: Kalınlık ölçümleri yalnızca görüntüleme ayarları ve eşik aynı şekilde ayarlandığında görüntüler arasında karşılaştırılabilir.
- LNT'lerin düğümlerinde lipid bölümlemesinin belirlenmesi (Şekil 3)
- Görüntüyü ImageJ'de açın.
- İstediğiniz düğümün üzerine çizgi çizmek için Çizgi aracını kullanın.
- Hem Oregon Green hem de Texas Red kanallarındaki düğüm yoğunluğunu ölçün.
- Çizgiyi LNT'ye taşıyın ve hem Oregon Green hem de Texas Red kanallarındaki LNT yoğunluğunu ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LNT ağları (Şekil 4), LNT'leri GUV'lardan ekstrüde etmek için mikrotübüllerin kinesin taşınması tarafından gerçekleştirilen işi kullanan tarif edilen protokol kullanılarak üretilmiştir. Kısaca GUV'lar sakkaroz çözeltisi kullanılarak agaroz jel rehidrasyonu kullanılarak hazırlandı ve mikrotübüller GPEM çözeltisinde polimerize edilerek BRB80T'de stabilize edildi. Daha sonra, kinesin motorları, kapak kaymasının yüzeyinde aktif bir motor tabakası oluşturan bir akış hücresine sokuldu. Daha sonra mikrotübüller tanıtıldı ve biyotinile lipitler ve GUV'lar (daha sonra tanıtılan) arasında bağlanmayı kolaylaştıran bir streptavidin çözeltisi eklendi.
Akış hücresinde bulunan tüm bileşenlerle, LNT'lerin 30 dakika boyunca oluşmasına izin verildi, bu noktada hareketliliği durdurmak için AMP-PNP tanıtıldı. Daha sonra, LNT'ler 100x yağ hedefi kullanılarak bir epifloresan mikroskobu altında görüntülendi. LNT'ler oldukça büyük olabilir; bu nedenle, daha büyük LNT'leri yakalamak için daha düşük güçlü bir hedef de kullanılabilir. LNT ağları, GUV'lardan uzanan ve bağlanan ince, web benzeri çıkıntılar ile karakterize edilir. LNT'lerin sayısı ve dallanması, yüzeydeki mikrotübüllerin yoğunluğu, streptavidin konsantrasyonu ve mevcut GUV'lerin sayısı dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır.
Bu yöntem, katı, sıvı düzensiz ve sıvı sıralı fazlardan oluşan GUV'ler ve LNT'lerin yanı sıra, bu fazların çok çeşitli farklı bileşimler üzerinde bir arada varlığını gösteren faz ayrılmış veziküller üretebilir (Şekil 4). Örneğin,% 45 doymuş lipit ve% 55 doymamış lipit ile veziküllerin sentezlenmesi, birlikte var olan sıvı düzensiz ve katı fazlara ayrılan veziküllerle sonuçlanır. Bununla birlikte, kolesterol dahil edilirse, sıvı-sıvı birlikteliği gözlenebilir. Örneğin,% 50 doymamış lipitler,% 30 kolesterol ve% 20 doymuş lipitlerden oluşan bir karışım, birlikte var olan sıvı sıralı (Lo) ve sıvı düzensiz (LD) fazlara ayrılan GUV'ler oluşturacaktır. Kolesterolün bu formülasyona dahil edilmesi, doymuş lipitleri akışkanlaştırır ve sıvı bir fazın oluşumunu sağlar.
Ayrıca, fazdan ayrılmış karışımlarda düğümlerin (yani, LNT'lerden daha büyük yuvarlak küresel yapılar) oluştuğu gözlenmiştir (Şekil 4). Lipid tiplerinin nanotüpler ve düğümler içinde bölümlenmesi, bir düğümün maksimum arka plan çıkarılmış tepe yoğunluğunu bulmak için çizgi profili aracı kullanılarak karakterize edilebilir. Düğümün ve LNT'nin çizgi profilleri belirlendi ve maksimum değeri belirlemek için bu profillerin arka plan floresansı çıkarıldı. Bölümleme daha sonra düğümdeki floresanın maksimum değerinin LNT'nin maksimum floresan değerine bölünmesiyle hesaplanır. Bu yaklaşım, lipitlerin hem LNT'de hem de daha büyük ağlarda oluşan düğümlerde bölümlenmesini sağlar.
Resim 1: GUV'lardan ve mikrotübüllerden imal edilen LNT'lerin kompozit görüntüsü. LNT'ler, kinesin motorlarının üzerinde kayan hareketli mikrotübüller tarafından GUV'lerden ekstrüde edilir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kalınlık elde etmek için eşik oluşturma işlemi. (A) Image | Adjust sekmesinin altında Threshold (Eşik) öğesini seçin. (B) Eşiği uygulayın. (C) İstenilen tüpün üzerine bilinen uzunlukta bir dikdörtgen çizin. Siyah piksellerin değeri 0 ve kırmızı piksellerin değeri 255'tir. (D) Alanın entegre yoğunluğunu ölçmek. Tüp genişliğini hesaplamak için, tümleşik yoğunluğu 255'e bölün, ardından bu çıktıyı (B) içinde oluşturulan dikdörtgenin uzunluğuna bölün. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Düğümlerde lipid bölümlemesinin belirlenmesi. (A) Görüntüyü ImageJ'de açın ve istenen düğüm üzerine bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. (B) Oregon Green kanalındaki düğüm yoğunluğunu ölçün. (C) Hattı LNT'ye taşıyın ve Oregon Green kanalındaki yoğunluğu ölçün. (D,E,F) Texas Red kanalı için işlemi tekrarlayın. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı GUV lipid formülasyonlarından imal edilen LNT'ler. Sıvı düzensiz (LD) fazından ekstrüde edilen LNT'ler ince ve uzunken, sıvı sıralı (Lo) fazdan ekstrüde edilen LNT'ler kısa ve kalındır. Her iki tipteki LNT'ler, GMA'da Lo-L D fazına ayrılmış veziküller kullanıldığında gözlenir. Sıvı-katı faz GUV'larından elde edilen LNT'ler, LD GUV'lardan ekstrüde edilenlere benzer. Sıvı sıralı formülasyonlar, doymuş lipitler ve kolesterolün bir kombinasyonu kullanılarak oluşturulabilirken, sıvı düzensiz formülasyonlar doymamış lipitler kullanılarak oluşturulur. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LNT ağları, membran özelliklerine ve transmembran proteinleri gibi biyomoleküllerin taşınmasına yönelik in vitro çalışmalar için yararlı bir araçtır. Ayrıca, LNT ağlarını üretmek için karmaşık lipit formülasyonlarının kullanılması, biyolojik olarak daha ilgili çalışmalara olanak tanır. Diğer imalat çalışmaları ya 1) basit lipit formülasyonları ve çok katmanlı veziküller ya da 2) karmaşık lipit formülasyonlarından oluşan GUV'lardan ağlar üretmek için daha hantal hareketlilik teknikleri kullanmıştır. Burada açıklanan yöntem, karmaşık lipit formülasyonlarından ve GUV'lardan büyük ölçekli LNT ağlarının verimli bir şekilde üretilmesini ve ucuz reaktifler ve ekipmanlar kullanılmasını sağlar. Bu nedenle, bu metodoloji, faz ayırma ve membran protein taşınması dahil olmak üzere bir dizi biyolojik süreci inceleme yeteneği sunar. Protokol, LNT'lerin bileşiminin biyolojik analoglarına (örneğin, Golgi aparatı) yaklaşmak için en uygun şekilde ayarlanabileceği bir in vitro model kullanır.
Burada açıklanan yöntemde LNT ağlarının oluşumunun sayısız avantajı vardır. Örneğin, mikrotübüller liyofilize tübülin kullanılarak kolayca ve hızlı bir şekilde polimerize edilir ve paklitaksel16 ile stabilize edildiğinde RT'de en az 1-2 hafta stabil kalırlar. Bu nedenle, LNT'lerin ekstrüzyonunu ve büyük ölçekli ağların oluşumunu sağlamak için kolayca uygulanırlar 1,2. Ek olarak, çoklu lipit bileşenlerinden (yani, doymamış ve doymuş lipitler ve kolesterol) oluşan GUV'lar, küçük değişikliklerle önceki bir protokole dayanarak hızlı bir şekilde oluşturulabilir. Bu modifikasyonlar, membran faz ayrımının fiziksel kimyasal işleminden geçebilen GUV'ların sentezini sağlar. Hazırlandıktan sonra, GUV'lar depolama koşullarına bağlı olarak haftalarca veya aylarca saklanabilir. Bununla birlikte, yeni bir parti hazırlamadan önce GUVS'nin 1 aya kadar kullanılması önerilir. Lipid çözeltileri birkaç ay boyunca -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir, ayrıca aylarca RT'de saklanabilen agaroz jeli ve kaplamalı örtüler de saklanabilir. Agaroz kaplı kapaklar üzerindeki lipit filmler vakum altında saklanmalı ve 48 saat içinde yeniden hidre edilmelidir.
GUV'lardan LNT'ler oluşturmak için bu tekniği kullanmanın bir zorluğu, akış hücresindeki GUV'ların, streptavidin ve mikrotübüllerin konsantrasyonunu dengelemektir. Örneğin, mikrotübüller ile GUV'lar arasındaki oran doğru değilse, LNT oluşumu sınırlı olacaktır. GUV'lerin konsantrasyonu çok düşükse, LNT oluşumunda ilk adım olan agregalar oluşmaz. Bu protokolde açıklanan mikrotübül ve GUV konsantrasyonları için, mikrotübül stokunun 10x seyreltilmesi ve GUV stoğunun 12x seyreltilmesi genellikle iyi LNT ağları ile sonuçlanmıştır. Sırasıyla 5x ve 6x'lik seyreltmeler de iyi ağlar sağlamıştır.
Diğer bir zorluk, GUV çözeltisinin mikrotübül çözeltisi ile ozmotik olarak dengelenmesini sağlamaktır. İki çözelti arasındaki ozmolarite farkı çok büyükse, GUV'lar kararsız hale gelir ve potansiyel olarak patlar. Çözeltiler ozmotik olarak dengeli değilse (örneğin, iki çözelti arasında ölçülen ozmolarite arasında% 10'luk bir fark), daha düşük ölçülen ozmolarite ile çözeltinin ozmolaritesini arttırmak için konsantre (örneğin, 2 M) bir sakkaroz çözeltisi kullanılmalıdır. Bu sistemin bir başka sınırlaması, saatler boyunca stabil olan ve akış odasının sürekli olarak hidratlanmasına (veya odayı sızdırmazlık maddesi ile kapatılmasına) büyük ölçüde bağlı olan ortaya çıkan LNT ağlarının stabilitesidir. Çözelti akış odasından buharlaştıktan sonra, birkaç artık LNT'nin varlığının buharlaşmadan sonra devam etmesine rağmen, LNT'ler artık yararlı olmayacaktır.
Bu kayan mikrotübüllerden ve GUV'lardan oluşturulan LNT ağları, lipit çift katmanlı dinamiklerin yanı sıra membran yüzeylerindeki protein (örneğin, transmembran proteinleri) difüzyonunu anlamada yararlı olabilir. Burada açıklanan protokol, biyolojik LNT benzeri tünelleme nanotüplerini ve membrana bağlı organellerde (yani, endoplazmik retikulum ve Golgi aparatı) bulunan nanotüpleri daha kolay taklit eden çeşitli lipit formülasyonlarından oluşan LNT ağlarını hızlı bir şekilde oluşturabilir. Büyük ölçekli LNT ağları oluşturma yeteneği, hücre iletişimini incelemek, nanoakışkan biyomolekül taşınımını incelemek ve sentetik nöronal ağlar geliştirmek için önemli bir ilk adımdır. Bu protokol, LNT'lerin bileşiminin doğal hücresel yapıları taklit etmek için kolayca değiştirilebildiği minimal, in vitro bir model sistemi kullanarak LNT'lerin fizyokimyasal özellikleri hakkında daha geniş çalışmalara kapı açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sandia Ulusal Laboratuvarları, DE-NA-0003525 sözleşmesi kapsamında ABD DOE'nin Ulusal Nükleer Güvenlik İdaresi için Honeywell International, Inc.'in tamamına sahip olduğu bir yan kuruluşu olan Sandia, LLC.'nin Ulusal Teknoloji ve Mühendislik Çözümleri tarafından yönetilen ve işletilen çok misyonlu bir laboratuvardır. Bu yazıda objektif teknik sonuçlar ve analizler açıklanmaktadır. Makalede ifade edilebilecek herhangi bir öznel görüş veya görüş, ABD Enerji Bakanlığı veya ABD Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Acknowledgments
Bu çalışma ABD Enerji Bakanlığı, Temel Enerji Bilimleri Ofisi, Malzeme Bilimleri ve Mühendisliği Bölümü (BES-MSE) tarafından desteklenmiştir. Kinesin sentezi ve floresan mikroskobu, ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Bilim Ofisi için işletilen bir Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan Entegre Nanoteknolojiler Merkezi'ndeki bir kullanıcı projesi (ZIM) aracılığıyla gerçekleştirildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective | Olympus | 1-U2B836 | Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Working Distance 0.12mm |
| 3.0 ND Filter | Olympus | Neutral Density Filter | |
| AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 | (β,γ-imidoadenosine 5′-triphosphate) |
| ATP | Sigma-Aldrich | A7699 | Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra |
| Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set | Semrock | LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000 | BrightLine Pinkel filter set, optimized for DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 and other like fluorophores, illuminated with LED-based light sources |
| Casein | Sigma-Aldrich | 22090 | Casein hydrolysate for microbiology |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Catalase from Bovine Liver |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Chloroform anhydrous contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer |
| Cholesterol | Avanti | 700000P | cholesterol (ovine wool, >98%) (powder) |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | D-(+)-Glucose powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| DOPC | Avanti | 850375C | 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (in chloroform) |
| DOPE-Biotin | Avanti | 870282C | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DPPC | Avanti | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (powder) |
| DPPE-Biotin | Avanti | 870285P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl) (sodium salt) |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43816 | DL-Dithiothreitol solution 1 M |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G6125 | Glucose Oxidase from Aspergillus niger Type II, ≥10,000 units/g solid (without added oxygen) |
| Glycerol | Fisher | G33 | Glycerol (Certified ACS), Fisher Chemical |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate |
| IX-81 Olympus Microscope | Olympus | N/A | IX81 Inverted Microscope from Olympus |
| KOH | Sigma-Aldrich | 1050121000 | Potassium Hydroxide |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M1028 | 1.00 M magnesium chloride solution |
| Orca Flash 4.0 Digital Camera | Hamamatsu | C13440-20CU | ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera |
| Oregon Green-DHPE | Invitrogen | O12650 | Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine |
| Paclitaxel | ThermoFisher | P3456 | Paclitaxel (Taxol Equivalent) - for use in research only |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) |
| Texas Red-DHPE | Invitrogen | T1395MP | Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid |
| Tubulin, Biotin | Cytoskeleton | T333P | Tubulin protein (biotin) porcine brain |
| Tubulin, Hy-Lite 488 | Cytoskeleton | TL488M | Tubulin protein (fluorescent HiLyte 488) porcine brain |
| Tubulin, Unlabeled | Cytoskeleton | T240 | Tubulin protein porcine brain |
References
- Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
- Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
- Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
- Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
- Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
- Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
- Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
- Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
- Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
- Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
- Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
- Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579 (1994).
- Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).
