Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Hayvan Kokusu Sinyallerinin Örneklemesi ve Analizi

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/60902
* These authors contributed equally

Summary

Koku sinyallerinin hayvan iletişiminde nasıl kullanılabileceğini anlamak için örnekleme ve analiz için etkili bir metodoloji geliştirdik. Özellikle, hayvan kokularının ve koku işaretlerinin uçucu bileşenlerini analiz etmek için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birleştiğinde kafa boşluğu katı faz mikrokstrasyonu kullanıyoruz.

Abstract

Hayvan iletişiminde nasıl kullanılabileceğini anlamak için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birleştiğinde kafa boşluğu katı faz mikroextraction kullanarak koku sinyallerinin örneklemesi ve analizi için etkili bir metodoloji geliştirdik. Bu teknik, numunedeki bileşenlerin ayrılmasını ve belirsiz bir şekilde tanımlanmasını sağlayarak koku salgılarının uçucu bileşenlerinin yarı nicel analizine ve ardından sinyalizasyonda yer alabileceği bileşikleri işaret edebilecek eğilimleri aramak için tepe alan oranlarının analizine olanak tanır. Bu mevcut yaklaşımın temel güçlü yönleri, analiz edilebilen örnek türlerin aralığıdır; herhangi bir karmaşık numune hazırlama veya ekstraksiyona ihtiyaç duymaması; bir karışımın bileşenlerini ayırma ve analiz etme yeteneği; algılanan bileşenlerin tanımlanması; ve tespit edilen bileşenler hakkında yarı nicel ve potansiyel olarak nicel bilgi sağlama yeteneği. Metodolojinin ana sınırlaması örneklerin kendisiyle ilgilidir. Belirli ilgi bileşenleri uçucu olduğundan ve bunlar kolayca kaybolabileceğinden veya konsantrasyonları değiştirilebileceğinden, numunelerin toplanmasından sonra uygun şekilde depolanıp taşınması önemlidir. Bu aynı zamanda örnek depolama ve taşıma koşullarının nispeten maliyetli olduğu anlamına gelir. Bu yöntem çeşitli örneklere (idrar, dışkı, saç ve koku bezi koku salgıları dahil) uygulanabilir. Bu kokular, bir dizi matriste meydana gelen karmaşık karışımlardan oluşur ve böylece bireysel bileşenleri ayırmak ve biyolojik ilgi bileşiklerini çıkarmak için tekniklerin kullanılmasını gerektirir.

Introduction

Hayvanlardaki koku sinyallerini destekleyen kimyasal değişiklikler hakkında çok az şey bilinmektedir1, ayrıca kokuların uçucu kimyasal profillerinin kaydedilmesi ve ölçülmese metodolojik zorluklar nedeniyle2. Son derece karmaşık, kimyasal matrislerle çalışırken birkaç potansiyel tuzak vardır; bunlar koku örneklerini örnekleme ve analiz ederkeniçerir 3.

Wolverhampton Üniversitesi Rosalind Franklin Bilim Merkezi'nde, kokuların ve koku izlerinin hayvanlar tarafından nasıl kullanılabileceğini anlamak için analizini yapıyoruz. Yarı-biyoseksiktriyi davranışsal ekoloji, endokrinoloji ve sitoloji ile birleştirerek koku sinyallerinin hayvan iletişiminde oynadığı rolü anlamamızı geliştiriyoruz.

Bir metodoloji geliştirdik ve daha sonra birkaç insan dışı primat (yani taçlı lemurlar, kırmızı-fırfırlı lemurlar, Japon makaklar, zeytin babunları, şempanzeler) ve diğer memeliler (örneğin kediler, inekler) dahil olmak üzere çeşitli türlerin kokularını ve işaretlerini analiz ettik. İdrar, dışkı, saç ve koku bezi koku salgıları da dahil olmak üzere çeşitli örnekleri topladık ve analiz ettik. Bu kokular ve koku işaretleri karmaşık bileşik karışımlarından oluşur ve bu nedenle analizleri için kullanılan herhangi bir metodolojinin bir tür ayırıcı teknik içermesi gerekir. Gösterildiği gibi, ilgi çekici bileşenleri çıkarmak için tekniklerin kullanılmasını gerektiren bir dizi matriste de ortaya çıkarlar.

Vaglio ve ark.4 ve diğer yazarlar tarafından yapılan önceki çalışmalar5 gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile dinamik kafa boşluğu ekstraksiyonu (DHS) kullanılırken, doğrudan solvent ekstraksiyonu6 ve karmaşık solvent ekstraksiyonları7 de kullanılmıştır. Özellikle, dinamik kafa boşluğu örneklemesi, numune matrisi için güçlü bir yakınlık gösterenler (örneğin, sulu numunelerdeki kutup bileşikleri) hariç, sonuçta tüm uçucu bileşikleri kaldıran bilinen bir inert gaz hacmi ile kafa boşluğunun temizlenmesini içerir.

Mevcut metodoloji için, GC-MS ile birlikte headspace katı faz mikroextraction (HS-SPME) tekniğini benimsedik. Özellikle, Vaglio ve arkadaşları tarafından önceki GC-MS laboratuvarında 8 ,9,10'dazaten kullanılan metodolojiyi geliştirdik ve geliştirdik.

Solventsiz ekstraksiyon teknikleri, küçük, yüksek uçucu bileşikleri analiz etmek için çok etkilidir (aksi takdirde bir numuneden kolayca kaybolabilir) çünkü bu yöntemler bileşikleri kararlı, katı faz desteği üzerinde hareketsiz hale getirebilir. HS-SPME, numune kafa boşluğundaki uçucu bileşikleri yakalamak veya sulu bir biyolojik sıvıya daldırarak çözünmüş bileşikleri çıkarmak için adsorbent polimer ile kaplanmış bir elyaf kullanır11. Polimer kaplama bileşikleri güçlü bir şekilde bağlamaz, bu nedenle GC'nin enjeksiyon portunda ısıtarak çıkarılabilirler. Bu yöntem solvent ekstraksiyon tekniklerinden daha güçlüdür ve dhs'den daha etkilidir.

Mevcut yaklaşımda numuneler cam şişeler içinde bulunur. Bu şişeler, şişenin baş boşluğunda yer kaplamak için koku işaretinin uçucu bileşenlerini teşvik etmek için hayvan vücut sıcaklığını simüle etmek için 40 ° C sıcaklığa ısıtılır. 65 μm polidimetilsiloksisan/divinylbenzene (PDMS/DVB) sorbent malzeme ile kaplanmış bir SPME elyafı kafa boşluğu ortamına maruz kalır ve numuneden uçucu bileşenler fiberin üzerine adsorbe edilir. Bir GC-MS'in giriş portunda fiberin ısıtılmasında, uçucu bileşenler fiberden desorbe edilir ve daha sonra GC ile ayrılır. MS kullanılarak her bileşen için kütle spektral parçalanma desenleri elde edilir. Bu kütle spektrumlarının kütle spektral veritabanları ile karşılaştırılmasıyla, koku işaretinin bileşenlerini belirsiz bir şekilde tanımlamak mümkün olabilir. Otomatik örnekleyici kullanarak, birden fazla örneği toplu olarak tutarlı bir şekilde analiz edebiliyoruz.

Her bir SPME lifi türünün kutup kimyasalları ile farklı bir yakınlığı olduğu göz önüne alındığında, lif genellikle hedef kimyasal bileşiklerin polaritesine ve / veya moleküler ağırlığına bağlı olarak seçilir. Ek olarak, GC koşulları GC sütununun türüne ve hedef kimyasal bileşiklerin özelliklerine bağlı olarak değiştirilir.

Bu teknik, numunedeki bileşenlerin ayrılmasını ve belirsiz tanımlanmasını sağlayarak koku işaretlerinin uçucu bileşenlerinin yarı nicel analizine ve ardından sinyalizasyonda yer alabileceğini belirten koku işaretleme bileşenlerini işaretleyebilecek eğilimleri aramak için tepe alanı oranlarının analizine olanak tanır.

Bu mevcut yaklaşımın temel güçlü yönleri şunlardır:

  • Analiz edilebilen örnek türleri aralığı.
  • Karmaşık numune hazırlama veya ekstraksiyon gerekmez.
  • Uçucu bileşenleri analiz etme yeteneği.
  • Bir karışımın bileşenlerini ayırma yeteneği.
  • Algılanan bileşenleri tanımlayabilmek.
  • Tespit edilen bileşenler hakkında yarı nicel ve potansiyel olarak nicel bilgi sağlama yeteneği.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Örnek toplama

  1. Aşağıdakilerden biri olan örnek kokular:
    1. Alışılmış çalışma denekleri (örneğin, hayvanat bahçesi primatları) tarafından steril filtre kağıdında (örneğin, koku bezi koku salgıları) veya doğrudan şişelere (örneğin idrar) koku işareti yoluyla kendiliğinden salınanları toplayın.
    2. Eğitim çalışma deneklerinden sonra pozitif takviye eğitimi kullanarak steril pamuklu çubukları ovalayarak toplayın.
    3. Çalışma deneklerinin sedasyonundan sonra steril pamuklu çubukları ovalayarak toplayın.
  2. Numuneleri steril 10 mL vidalı şeffaf cam şişelere yerleştirin ve FTFE/ silikon septa içeren vidalı kapaklarla kapatın. Hemen -20 °C'de saklayın.
    NOT: Nitril eldivenler gibi temiz kişisel koruyucu ekipman kullanmak hayati önem taşır; sık sık değiştirin; numuneler ve şişelerle doğrudan cilt temasından kaçının. Yepyeni şişelerin kullanılması tercih edilir; ancak, kullanılmış şişeler durumunda, şişeleri önceden temizlemek ve ardından aynı protokolü kullanmak çok önemlidir.
  3. Koku işaretleri her toplandığı zaman çevresel boşluklar alın. Örneğin, örnekleme ortamı (örneğin, filtre kağıdı veya çubuk) ve örnekleme yapılırken ortama maruz kalan bir kafa boşluğu şişesini toplayın.

2. Numune hazırlama

  1. Koku işaretli bir filtre kağıdından veya çubuğun başından yaklaşık 10 mm karelik bir bıçakla keserek ve 10 mL vidalı kafa boşluğu şişesine yerleştirerek alandaki örnekleri hazırlayın.
  2. Her numune hazırlandıktan sonra, numune alma ortamını kesmek için kullanılan bıçağı uygun bir antibakteriyel mendil ve/veya alkol kullanarak atın veya temizleyin ve iyice kurulayın.
  3. Tüm numuneleri -20 °C'de saklayın.
    NOT: -20 °C'de veya sahada mümkün olduğunca düşük bir alanda tercih edilir.

3. Analize hazırlık

  1. Numuneleri dondurucudan çıkarın ve en az 1 saat boyunca doğal olarak oda sıcaklığına ısınmaya bırakın.
  2. GC-MS'deki analitik yöntemi aşağıdaki gibi ayarlayın:
    1. SPME analiz koşulları için, ilk kullanımdan önce SPME liflerini koşullandırmak için üreticinin talimatlarını izleyin: fiber ön koşulu (5 dakika için 260 °C), numune inkübasyonu (2 dakika için 40 °C), ekstraksiyon süresi (15 dk), desorpsiyon süresi (2 dk) ve fiber sonrası durumu (20 dakika için 260 °C).
    2. Aşağıdaki GC koşullarını kullanın: sütun (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), enjektör sıcaklığı (270 °C), debi (1 mL/dk), enjeksiyon modu (bölünmez), GC fırın profili (2 dakika için 45 °C; 4 °C/dk ila 170 °C; 20 °C/dk ila 300 °C), MSD transfer hattı (280 °C).
      NOT: Örnek saklama süresi tutarlılığı arasında iyileştirme yapmak için analitik yöntem saklama süresi kilitlidir).
    3. Aşağıdaki MSD koşullarını kullanın: solvent gecikmesi (2,5 dk) ve tarama aralığı (29 ila 400 amu).
      NOT: Önceki protokollerde 10 ila 400 arasında bir aralık kullanılmıştır4.
  3. Fiber şartlandırma ünitesine giden temizleme gazı kaynağının açık olduğundan emin olun.
    NOT: SPME tertibatın otomatik örnekleyiciye doğru şekilde takılması ve otomatik numune alma tepsilerine, fiber şartlandırma ünitesine ve GC giriş portuna hizalanmış olması çok önemlidir. Yanlış hizalama SPME fiberinin hasar görmesine veya tahrip olmasına neden olabilir.

4. Analiz

  1. GC-MS otomatik örnekleyici tepsisinin ilk konumuna boş bir kafa boşluğu şişesi (sistem boş olarak hareket etmek için) yerleştirin. Çevresel boşluğu otomatik örnekleyici tepsisinin ikinci konumuna yerleştirin. Analiz için numuneleri otomatik numune tepsisinin sonraki konumlarına yerleştirin.
  2. Örnek tepsisteki her örneği analiz etmek için analitik bir sıra oluşturun.
    1. MassHunter giriş ekranında Sıralı | Yükleme sırası.
    2. Uygun bilgileri ekleyerek tüm boşluklar ve örnekler için sıra tablosunu tamamlayın. Tamamlanan sıra tablosunu kaydedin.
      NOT: Sıra tablosu için kesin bilgiler, tablo için laboratuvar biçimlendirmeye bağlı olacaktır. Minimum bilgiler normalde örnek türü, örnek adı, şişe konumu ve numarası, analitik yöntem ve veri dosyası konumu ve adını içerir (örnek adla eşleşen bir veri dosyası adının ayrılması gelecekteki veri işlemeye yardımcı olur). Analiz sırasında sıraya ek örnekler eklenebilir.
  3. Sıra | seçerek sırayı çalıştırma Sırayı çalıştır.
  4. Analizden sonra numuneleri mümkün olan en kısa sürede dondurucuya iade edin.
    NOT: Örneklerin yeniden analiz edilmesi mümkün olabilir, ancak bazı uçucu bileşenlerin ilk analiz sırasında tamamen çıkarılmış olabileceği ve bazı bileşiklerin 40 ° C'de termal ve bakteriyel ayrışmaya uğramış olabileceği unutulmamalıdır, bu nedenle ortaya çıkan kromatogram orijinal koku işaretini tamamen temsil etmeyebilir.

5. Veri analizi

NOT: İlk veri analizi, kromatogramların saklama süresi ve pik alan verilerini elde etmek için entegrasyonunu ve ChemStation yazılımı ve NIST (Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü) kütle spektral veritabanlarını, MSD F.01.01.2317 sürümünü kullanarak zirvelerin belirsiz bir şekilde tanımlanmasını içerir. Veri analizi manuel olarak veya yarı otomatik bir yöntemle gerçekleştirilebilir. Yarı otomatik yöntem kullanılırsa, belirsiz tanımlamaları doğrulamak için bir dereceye kadar manuel veri analizi yapmak bazen faydalıdır.

  1. Sol gezinti çubuğunda uygun dosyayı tıklatarak veri dosyasını açın. Toplam iyon kromatogramı (TIC) veri analizi ekranının üst penceresinde görüntülenir.
  2. RTE entegratörini kullanarak TIC'yi tümleştirmek için Kromatogram | Tümleştirme.
  3. Tümleştirme parametrelerini, 3 x taban çizgisi gürültüsünden büyük tepeler entegre olacak şekilde ayarlayın. Kromatogram | Seç MS Sinyal Tümleştirme Parametreleri. Çıkış kutusunda minimum tepe alanını uygun şekilde ayarlayın (1.0 örneklerimizde kabul edilebilir sonuçlar üretir).
  4. Zirveleri tanımlamak ve özet rapor oluşturmak için Raporları Dışarı Aktar | XLS'ye kitaplık arama sonuçları raporu.
    NOT: Bir kütüphane araması yapılmadan önce, görüntülenecek kitaplık eşleşmelerinin sayısı ile birlikte aranacak spektral kütüphanelerin yazılım içinde önceden ayarlanabilmesi gerekir.
  5. Elde edilen elektronik tablo raporu, her tepe noktası için tümleştirme verileri ve kimlik atamak için belirsiz bir spektral kitaplık eşleşmesi içerir. Genellikle, kitaplık kalitesi/kitaplık eşleşmesi belirsiz tanımlamayı kabul etmek için >80 olmalıdır. Elektronik tabloyu kaydedin.
  6. Doğrudan TIC'den bir tepe tanımlayın.
    1. İlginin zirvesini seçin.
    2. Tepe küçükse, sol el fare düğmesini basılı tutarak tepenin etrafına bir kutu çizerek yakınlaştırın, kutuyu tepenin üzerine uzatın ve bırakın.
    3. İmleç çizgisini tepenin en yüksek noktasına (veya hemen sonrasına) yerleşecek şekilde yerleştirin.
    4. Sağ fare düğmesini çift tıklatın ve tepe için kütle spektrumu veri analizi ekranının alt penceresinde görünecektir.
    5. Spektral kitaplıkta arama yapmak için imleci spektral pencerede herhangi bir yere taşıyın ve sağ fare düğmesini çift tıklatın. Kitaplık arama sonuçları yeni bir pencerede görünecektir.
    6. Arka plan gürültüsünü ilgi çekici bir spektrumdan kaldırmak için, önce söz konusu tepedeki sağ fare düğmesini çift tıklatın. Ardından, ilgi zirvesinin hemen önünde zirve olmayan bir alanda sağ fare düğmesini çift tıklatın. Kromatogram | Seç Spectra'ı çıkarın. Çıkarılan spektrum, veri çözümleme ekranının alt penceresinde görüntülenir ve pencere üstbilgislerindeki SCAN verilerinin yanında '(-)' görüntüler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolün ardından, kırmızı-fırfırlı lemurlar (Varecia variegata rubra) tarafından filtre kağıdına kendiliğinden salınan 14 ano-genital koku işaretinin analizinden toplam 32 uçucu kimyasal bileşik belirledik ve koku profillerini sinyalcinin özellikleriyle karşılaştırdık12. Hidrokarbonlar, terpenler, terpene alkolleri ve ketonlar gibi doğal olarak meydana gelen uçucu bileşikler bu profillerde mevcuttu ve daha önce seks feromonları ve diğer hayvan türlerinde fitness ipuçları olarak işlev gören bileşikleri içeriyordu. Belirsiz bir şekilde tanımlanan bileşikler Tablo 1'de listelenmiştir. Temsili kromatogramlar (kontrolden 1 ve lemur kokusu işaretinden 1) Şekil 1'degösterilmiştir. Bileşenlerin sayısı ve göreceli bolluğu, farklı çalışma konularında numuneden örneğe değişmektedir. Bununla birlikte, tüm örneklerde altı bileşik (benzaldehit, 2-etil-1-heksanol, p-cresol, cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol, 2-pinen-4-one, pentadecane) mevcuttu.

Bu çalışmanın sonuçları, kırmızı-büzülmış lemurların seks ve kadın yaşı hakkında bilgi aktarmak için koku işareti kullandığını ve ano-genital işaretlemenin sosyo-cinsel iletişimde rol oynadığını öne sürmektedir.

Bu protokolün kullanılmasını takip eden bir başka temsili sonuç, dişi zeytin babunları (Papio anubis) (Vaglio ve ark. yayınlanmamış veriler) tarafından doğurganlık reklamı çalışmamızdı. 385 kadın babun vajinal koku örneğinin analizinden toplam 74 uçucu bileşik tespit ettik. Bu bileşikler ketonlar, alkoller, aldehitler, terpenler, uçucu yağ asitleri ve hidrokarbonlar gibi doğal olarak oluşan bir dizi kokulu uçucu bileşik içeriyordu. Boş kontrolü ve doğurgan ve doğurgan olmayan dönemlerden kadın babun vajinal koku örneklerini karşılaştırmak için kullanılan tipik kromatogramlar Şekil 2'degösterilmiştir. Vajinal koku profilleri ile kadın babunların cinsel duyarlılığı arasındaki ilişkileri inceledik. Sonuçlarımız, toplam vajinal koku miktarının doğurganlıkla farklılık gösterdiğini ve kokunun kadın babun doğurganlığının sinyalini vermede rol oynayabileceğini gösterdi. Ayrıca grup tipleri arasında vajinal koku farklılıkları bulduk ancak grup kompozisyonu, kadın yaşı ve paritesinin etkilerini ayırt edemedik.

Figure 1
Şekil 1. Örnek kromatogramlar; (üst kromatogram -'kontrol') kontrol örneği, kirleticileri gösterir; (alt kromatogram -'lemur kokusu-işareti') bir yetişkin dişi kırmızı-fırfırlı lemur ano-genital koku salgıları, kirleticiler ve anlamlı biyolojik bileşikler gösteren. Kırmızı oklar, tüm örneklerde bulunan altı anlamlı biyolojik bileşiği gösterir: (a) benzaldehit; (b) 2-etil-1hexanol; (c) p-cresol; (d) cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol; (e) 2-pinen-4-bir; (f) pentadecane. Bu rakam Janda ve ark.12'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. Kirleticileri gösteren örnek kromatogram (üst kromatogram -'kontrol') kontrol örneğinden; (orta kromatogram -'babun verimli olmayan koku') dişi zeytin babun, doğurgan olmayan dönemden vajinal koku örneği; ve (alt kromatogram -'babun verimli koku') dişi zeytin babun, verimli dönemden vajinal koku örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Saklama Süresi (dakika) Belirsiz Bileşik Kimlik Moleküler Ağırlık
3.906 Altıgen 100
6.057 5-metil-3-altıgen 114
7.413 Alfa-çam 136
8.077 1-izopropil-4-metilenbibikclo[3.1.0]hex-2-bir 134
8.268 Benzaldehit 106
8.623 3,7,7-trimetil-1,3,5-cycloheptatriene 134
9.096 Fenol 94
9.269 6-metoksi-5-hepten-2-bir 126
10.72 2-etil-1-altıgen 130
12.362 p-Cresol 108
12.553 cis-Verbenol 152
13.385 cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol 152
14.104 1,7,7-Trimetilbicyclo[2.2.1]hepta-2-bir 152
14.536 L-Pinocarveol 152
14.791 trans-Verbenol 152
15.605 p-Etil-fenol 122
15.928 Terpinen-4-ol 154
16.415 Alfa-Terpineol 154
16.615 Myrtenol 152
17.047 2-Pinen-4-bir 150
18.252 Carvone 150
19.217 p-Mentha-1,8-dien-3-bir 150
23.283 4,7,7-Trimetilbicyclo[4.1.0]hept-3-ene-2-bir 150
23.443 Tetradecane 198
25.094 Geranylacetone 194
25.899 Isomethylionone 206
26.513 Pentadecane 212
30.871 2,6,10-Trimetilpentadecane 254
32.208 Heptadecane 240
32.372 2,6,10-Trimetilhexadecane 268
34.446 n-Tetrasosane 338
34.591 2,6,10,14-Tetramethylhexadecane 282

Tablo 1. ChemStation yazılımı ve NIST kütle spektral veritabanları, msd F.01.01.2317 sürümü kullanılarak belirsiz olarak tanımlanan kadın kırmızı-fırfırlı lemur ano-genital koku salgılarından filtre kağıdı örneklerinde bulunan uçucu bileşikler. Bu tablo Janda ve ark.12'den değiştirilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kontrol örneklerinin kullanımı, hem numune toplama sırasında oluşturulan çevresel kontroller hem de sistem boşlukları, koku işareti örneklerinin yorumlanması için çok önemlidir. Örnekleme ortamına veya enstrümantal sisteme atfedilen tüm zirvelerin koku işareti örneklerinden dışlanması gerekir, böylece herhangi bir yoruma yalnızca ilginin zirveleri dahil edilir. Bu kontroller, enstrümantasyonun 'sağlığının' değerlendirilmesinde ve izlenmesinde de rol oynayabilir.

Protokol, her ekstraksiyondan önce ve sonra fiberi koşullamak için adımlar içerir. Bu, otomatik numune alma uzmanının kullanılmasıyla daha kolay hale getirilir ve numuneden numuneye çapraz kontaminasyon olmamasını sağlar.

Metodolojinin ana sınırlaması örneklerin kendisiyle ilgilidir. Koleksiyonun ardından, uygun şekilde depolanmaları ve taşınmaları önemlidir. Belirli ilgi bileşenleri uçucudur ve bunlar kolayca kaybolabilir veya konsantrasyonları değiştirilebilir. Şu anda numuneler genellikle -20°C'de dondurularak saklanır ve taşınır. Sonuç olarak, bu örneklerin depolanmasının ve taşınmasında önemli bir maliyet söz konusudur. Numunelerin analiz için laboratuvara taşınmasındaki gecikmeler bu maliyetleri daha da artıracak ve koku işaretlerinden elde edilen sonuçları potansiyel olarak etkileyebilir. Zaman ve depolamanın örneklerden elde edilen analitik sonuçlar üzerindeki etkisini anlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Özel öneme sahip bileşenler koku işaretlerinin daha uçucu bileşenleri olduğundan, bu bileşenlerin düzeylerinin numune sonrası koleksiyonu değiştirmesi mümkündür. Bazı numune tiplerinde olası bakteri etkilerine de dikkat edilmesi gerekebilir. Örneğin, idrar örneklerinin alkol testinde, idrarda bulunan bakteriler alkol üretebilir ve bu nedenle tespit edilen alkol seviyelerini artırabilir.

Geçerli metodoloji, daha önce özetlenen tüm gereksinimleri karşılar. Koku izlerinin bileşimi hakkında daha fazla bilgi elde edilen kaliteli sonuçlar sağlar. Ancak analiz, laboratuvara gönderilen örneklere bağlı laboratuvar tabanlı bir tekniktir. Bu sınırlamanın potansiyel çözümlerinden biri, taşınabilir GC-MS enstrümantasyonunun, numunelerin alındığı alana alınabilecek aletlerin kullanılması olacaktır. Bu yaklaşım, numunelerin depolanmasını ve taşınması ihtiyacını hafifletecek ve işaretlerin en uçucu bileşenleri hakkında daha fazla bilgi sağlama potansiyeline sahip koku işaretlerinin gerçek zamanlı analizini sağlayacaktır. Çeşitli taşınabilir GC-MS cihazları mevcuttur. Laboratuvar tabanlı enstrümantasyonda bulunana farklı teknolojiler kullanırlar, ancak karşılaştırılabilir sonuçlar sağlamalıdırlar. HS-SPME çıkarma tekniğinin kullanımı hala geçerlidir. Ancak, taşınabilir olmasının bir sonucu olarak, cihazlar otomatik numune girişi seçeneği sunmaz; bununla birlikte, numuneler toplanır toplanmaz analiz edilirse, günlük numune numaralarının manuel enjeksiyon için yönetilebilir olması muhtemeldir. Ayrıca, alan ekstraksiyonu durumunda, SPME lifinin kullanımdan önce çevresel kimyasalları hapsetmediğine dikkat edilmelidir. Şu anda mevcut olan cihazlar pille çalışır ve toplam taşınabilirlik sağlar, ancak bir tür güç kaynağının (hatta küçük bir jeneratörün) sağlanmasıyla, bu cihazlar daha uzun süre çalıştırılabilir. Bu aletler doğası gereği genellikle minimum eğitim ve bilgi gerektiren, kullanımı basit olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu, yüksek eğitimli operatörlerin cihazla birlikte dağıtılmasının gerekli olmayabileceği ve örnekleri toplayanlar tarafından çalıştırılabilirleri anlamına gelir. Analitik sonuçların ayrıntılı yorumu uzaktan veya cihaz tabana döndüğünde elde edilebilir.

SPME liflerini kullanan yöntemlerle ilgili bir diğer önemli sınırlama, sadece numunelerde bolca bulunan kimyasal bileşikleri analiz etmenin mümkün olmasıdır. Özellikle, SPME lifleri kullanılarak analiz için molekül miktarı alt dayanak olsa bile, numunelerde çok daha büyük miktarlarda kimyasal bulunur. Ek olarak, hayvan kokusu işaretleri ve diğer hayvan kimyasal sinyalleri tarafından salınan koku salgıları bağlamında, bireysel hayvanlar diğer hayvanlarla iletişim kurmak ve / veya malzemelerden gelen koku sinyallerini tespit etmek için kimyasal bileşikleri az miktarda kullanma eğilimindedir. Başka bir deyişle, hayvan burunlarının farklı performansları ve SPME ekstraksiyonu, bu örnekleme tekniğinin başarısı için büyük bir zorluk teşkil edebilir.

Mevcut metodolojinin gelecekteki gelişimi, termal desorpsiyon sistemleri ile kullanılmak üzere alternatif sorbent malzemelerin veya sorbent tüplerin kullanımına yönelik araştırma ile numune toplanmasına dayanabilir. Bu tür gelişmeler, numune depolama ve taşıma koşullarına yardımcı olmak için bir yol olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Keith Holding'e Rosalind Franklin Bilim Merkezi, Wolverhampton ve Ben Mantle'daki kimyasal analizlere yaptığı yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Prof. Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini ve Floransa Üniversitesi Kütle Spektrometre merkezi üyelerine ve CNR'nin ARCA Lab, Floransa'dan Prof. Luca Calamai ve Dr. Marco Michelozzi'ye bu metodolojinin kurulmasına yardımcı oldukları için minnettarız. Makalenin örneklemesi ve analiz yöntemlerini içeren araştırma projeleri, iki Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), Büyük Britanya Primat Derneği'nden küçük bir hibe ('Duyusal zenginleştirilmiş primat') ve küçük bir araştırma hibesi ('Avcı-toplayıcıların özel bir koku alma duyusu var mı?') İngiliz Akademisi/Leverhulme Vakfı'ndan S.V. Bu metodolojiyi kurmak için gereken laboratuvar çalışmaları, Fen Ve Mühendislik Fakültesi Yıllık Finansman Yarışması'ndan (Wolverhampton) S.V.'ye de finansman sağladı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL autosampler vials Agilent 5188-5392 10 ml screwtop vials with
18 mm vial caps Agilent 8010-0139 Magnetic with PTFE/silicone septa
Autosampler Agilent GC120 PAL autosampler
Capillary column Agilent HP5-MS 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm
Data analysis software Agilent - ChemStation
Gas Chromatograph Agilent 7890B
Inlet septa Agilent 5182-3442 Merlin microseal
Mass Selective Detector Agilent 5977A
Reporting software Microsoft - Excel
Spectral library NIST - NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library
Spectral library search program NIST - MS Search v.2.2
Splitless Inlet liner Agilent 5190-4048
SPME fibres Agilent SU57345U 65 µm PDMS/DVB fibre

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
  3. Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
  4. Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
  5. Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
  6. Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
  7. Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
  8. Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
  9. Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
  10. Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
  11. Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
  12. Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).

Tags

Davranış Sayı 168 headspace katı faz mikroextraction gaz kromatografisi-kütle spektrometresi hayvan iletişimi koku işaretleme olfaksiyon sinyalizasyon
Hayvan Kokusu Sinyallerinin Örneklemesi ve Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walker, D., Vaglio, S. Sampling andMore

Walker, D., Vaglio, S. Sampling and Analysis of Animal Scent Signals. J. Vis. Exp. (168), e60902, doi:10.3791/60902 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter