Summary
פיתחנו מתודולוגיה יעילה לדגימה וניתוח של אותות ריח כדי להבין כיצד ניתן להשתמש בהם בתקשורת בין בעלי חיים. במיוחד, אנו משתמשים במיקרו-אינטרנצ'רציה מוצקה של מרחב הראש יחד עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה כדי לנתח את הרכיבים הנדיפים של ריחות בעלי חיים וסימוני ריח.
Abstract
פיתחנו מתודולוגיה יעילה לדגימה וניתוח של אותות ריח, באמצעות microextraction שלב מוצק headspace בשילוב עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה, כדי להבין כיצד הם עשויים לשמש בתקשורת בעלי חיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח חצי כמותי של הרכיבים הנדיפים של הפרשות ריח על ידי מתן אפשרות הפרדה וזיהוי זמני של הרכיבים במדגם, ואחריו ניתוח של יחסי אזור שיא לחפש מגמות שיכולות לסמן תרכובות שעשויות להיות מעורבות באיתות. נקודות החוזק העיקריות של גישה נוכחית זו הן טווח סוגי המדגמים שניתן לנתח; חוסר הצורך בהכנה או עקירות מדגם מורכבות; היכולת להפריד ולנתח את מרכיבי התערובת; זיהוי הרכיבים שזוהו; והיכולת לספק מידע חצי-כמותי ופוטנציאלי כמותי על הרכיבים שזוהו. המגבלה העיקרית למתודולוגיה מתייחסת לדגימות עצמן. מכיוון שמרכיבי הריבית הספציפית הם תנודתיים, ואלה עלולים בקלות ללכת לאיבוד, או שהריכוזים שלהם ישתנו, חשוב שהדגימות יאוחסנו ויעברו כראוי לאחר האיסוף שלהם. משמעות הדבר היא גם שתנאי האחסון וההובלה לדוגמה יקרים יחסית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של דגימות (כולל שתן, צואה, הפרשות ריח של שיער ובלוטת ריח). ריחות אלה מורכבים מתערובות מורכבות, המתרחשות במגוון מטריצות, ובכך מחייבות שימוש בטכניקות להפרדת הרכיבים הבודדים ולחילוץ תרכובות בעלי עניין ביולוגי.
Introduction
מעט מאוד ידוע על השינויים הכימיים העומדים ביסוד אותות הריח בבעליחיים 1, גם בגלל אתגרים מתודולוגיים בהקלטה וכימות פרופילים כימיים נדיפים של ריחות2. ישנן מספר מלכודות פוטנציאליות בעת עבודה עם מטריצות כימיות מורכבות ביותר; אלה כוללים בעת דגימה וניתוח דגימות ריח3.
במרכז המדע ע"ש רוזלינד פרנקלין, אוניברסיטת וולברהמפטון, אנו מבצעים ניתוח של ריחות וסימני ריח כדי להבין כיצד בעלי חיים יכולים להשתמש בהם. אנו משלבים סמיוכימיה עם אקולוגיה התנהגותית, אנדוקרינולוגיה וציטולוגיה כדי לשפר את הבנתנו את התפקיד שמילאו אותות חוש הריח בתקשורת בין בעלי חיים.
פיתחנו מתודולוגיה ולאחר מכן ניתחנו ריחות וסימונים ממגוון מינים כולל כמה פרימטים לא אנושיים (כלומר, למורים מוכתרים, למורים אדומי עור, קופי מקוק יפניים, בבונים זיתים, שימפנזים) ויונקים אחרים (כלומר, חתולים, פרות). אספנו וניתחנו מגוון דגימות, כולל שתן, צואה, הפרשות ריח של שיער ובלוטת ריח. ריחות וסימני ריח אלה מורכבים מתערובות מורכבות של תרכובות ולכן כל מתודולוגיה המשמשת לניתוח שלהם צריכה לכלול צורה כלשהי של טכניקה הפרדה. כפי שמודגם, הם מתרחשים גם במגוון מטריצות המחייב שימוש בטכניקות כדי לחלץ את מרכיבי העניין.
מחקריםקודמים על ידי Vaglio et al. 4 ומחברים אחרים5 השתמשו מיצוי מרחב ראש דינמי (DHS) עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה (GC-MS) בעוד מיצוי ממס ישיר6 עקירות ממס מורכבים7 שימשו גם. במיוחד, דגימת headspace דינמית כרוכה בטיהור מרחב הראש עם נפח ידוע של גז אינרטי שבסופו של דבר מסיר את כל התרכובות הנדיפות למעט אלה המראות זיקה חזקה למטריצה לדוגמה (לדוגמה, תרכובות קוטביות בדגימות מימיות).
עבור המתודולוגיה הנוכחית, אימצנו את הטכניקה של מרחב ראש מוצק שלב microextraction (HS-SPME) יחד עם GC-MS. בפרט, פיתחנו ושיפרנו את המתודולוגיה שכבר נעשה בה שימוש על ידי Vaglio et al. במעבדת GC-MS הקודמת שלה8,9,10.
טכניקות מיצוי ממס יעילים מאוד לניתוח תרכובות קטנות, נדיפות מאוד (אשר אחרת ניתן לאבד בקלות מדגם) כי שיטות אלה לשתק תרכובות על תמיכה יציבה, שלב מוצק. HS-SPME משתמש בסיבים מצופים פולימר סופח כדי ללכוד תרכובות נדיפות במרחב הראש מדגם או כדי לחלץ תרכובות מומסות על ידי טבילה בנוזל ביולוגימימית 11. ציפוי פולימר אינו קושר את התרכובות בחוזקה, ולכן על ידי חימום ביציאת ההזרקה של GC הם יכולים להיות מוסרים. שיטה זו היא חזקה יותר מאשר טכניקות מיצוי ממס וגם יעיל יותר מאשר DHS.
בגישה הנוכחית דגימות כלולות בתוך בקבוקוני זכוכית. בקבוקונים אלה מחוממים לטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לדמות את טמפרטורת הגוף של בעלי החיים על מנת לקדם את הרכיבים הנדיפים של סימן הריח כדי לכבוש את ראש החלל של הבקבוקון. סיב SPME, מצופה 65 מיקרומטר של חומר סורבנט polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB), נחשף לסביבת headspace ורכיבים נדיפים מהמדגם נספגים על הסיבים. על חימום הסיבים ביציאת הכניסה של GC-MS, הרכיבים הנדיפים הם desorbed מן הסיבים ולאחר מכן מופרדים על ידי GC. דפוסי פיצול ספקטרליים של מסה מתקבלים עבור כל רכיב באמצעות MS. בהשוואה של ספקטרום מסה אלה מול מסדי נתונים ספקטרליים המוניים, ניתן לזהות באופן לא סופי את מרכיבי סימן הריח. באמצעות דוגם אוטומטי, אנו מסוגלים לנתח דגימות מרובות בקבוצות באופן עקבי.
בהתחשב בכך שלכל סוג של סיבי SPME יש זיקה שונה לכימיקלים קוטביים, הסיבים נבחרים בדרך כלל בהתאם לקוטביות ו/או המשקל המולקולרי של התרכובות הכימיות המשמשות כיעד. בנוסף, תנאי GC משתנים בהתאם לסוג עמודת GC ואת המאפיינים של תרכובות כימיות היעד.
טכניקה זו מאפשרת ניתוח חצי-כמותי של הרכיבים הנדיפים של סימוני ריח על-ידי מתן אפשרות להפרדה וזיהוי זמני של הרכיבים במדגם, ולאחר מכן ניתוח יחסי אזור שיא כדי לחפש מגמות שיכולות לסמן רכיבים של סימון הריח שעשויים להיות מעורבים באיתות.
נקודות החוזק העיקריות של גישה נוכחית זו הן:
- טווח הסוגים לדוגמה שניתן לנתח.
- אין צורך בהכנה או עקירות מדגם מורכבות.
- היכולת לנתח רכיבים נדיפים.
- היכולת להפריד את מרכיבי התערובת.
- כדי שתוכל לזהות את הרכיבים שזוהו.
- היכולת לספק מידע חצי כמותי ופוטנציאלי כמותי על הרכיבים שזוהו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אוסף לדוגמה
- דוגמת ריחות שהם אחד מהבאים:
- לאסוף באופן ספונטני שוחרר על ידי נושאי מחקר רגילים (למשל, פרימטים גן החיות) באמצעות סימון ריח על נייר מסנן סטרילי (למשל, הפרשות ריח בלוטת ריח) או ישירות לתוך בקבוקונים (למשל, שתן).
- לאסוף על ידי שפשוף ספוגיות כותנה סטרילית לאחר אימון נושאי המחקר באמצעות אימון חיזוק חיובי.
- לאסוף על ידי שפשוף ספוגיות כותנה סטרילית לאחר הרדים של נושאי המחקר.
- מניחים דגימות בבקבוקוני זכוכית שקופים סטריליים של 10 מ"ל, וחותמים עם כובעי בורג עם כובעים המשלבים ספטה FTFE/סיליקון. מיד לאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
הערה: חיוני להשתמש בציוד מגן אישי נקי, כגון כפפות ניטריל; לשנות אותם לעתים קרובות; הימנע ממגע עור ישיר עם דגימות ובקבוקונים. עדיף להשתמש בבקבוקונים חדשים לגמרי; עם זאת, במקרה של בקבוקונים משומשים, חיוני לנקות מראש את הבקבוקונים, ולאחר מכן להשתמש באותו פרוטוקול. - קח כדורי סרק סביבתיים בכל פעם שסימני ריח נאספים. לדוגמה, לאסוף את מדיית הדגימה (למשל, נייר סינון או ספוגית) ואת בקבוקון headspace החשופים לסביבה בעת דגימה מתבצעת.
2. הכנה לדוגמה
- הכינו דגימות בשטח על ידי חיתוך עם להב ריבוע של כ-10 מ"מ מנייר סינון מסומן ריח, או ראש הספוגית, והצבתו בבקבוקון 10 מ"ל עם מרווח ראש.
- לאחר הכנת כל דגימה, יש להשליך או לנקות את הלהב המשמש לחיתוך מדיית הדגימה באמצעות מגבון אנטיבקטריאלי מתאים ו/או אלכוהול ויובש יסודי.
- אחסן את כל הדגימות ב- -20 °C (69 °F).
הערה: מועדף ב -20 °C (69 °F) או בכל דרך אחרת נמוך ככל האפשר בשדה.
3. הכנה לניתוח
- מוציאים דגימות מהמקפיא ומאפשרים להתחמם באופן טבעי לטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות.
- הגדר את השיטה האנליטית ב- GC-MS באופן הבא:
- עבור תנאי ניתוח SPME, בצע את הוראות היצרן כדי להתנות סיבי SPME לפני השימוש הראשון: תנאי מקדים סיבים (260 °C למשך 5 דקות), דגירה לדוגמה (40 °C (40 °C למשך 2 דקות), זמן החילוץ (15 דקות), זמן desorption (2 דקות), וסיבים לאחר התנאי (260 °C (260 °C למשך 20 דקות).
- השתמש בתנאי GC הבאים: עמודה (HP5-MS 30 m x 0.25 מ"מ; 0.25 מיקרומטר), טמפרטורת מזרק (270 מעלות צלזיוס), קצב זרימה (1 מ"ל / דקה), מצב הזרקה (ללא פיצול), פרופיל תנור GC (45 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 4 מעלות צלזיוס עד 170 מעלות צלזיוס; 20 °C /min עד 300 °C (300 °C), קו העברת MSD (280 °C (280 °C ).).
הערה: כדי לשפר בין עקביות זמן שמירה לדוגמה השיטה האנליטית נעולה בזמן שמירה). - השתמש בתנאי MSD הבאים: השהיית ממס (2.5 דקות) וטווח סריקה (29 עד 400 אמו).
הערה: נעשה שימוש בטווח של 10 עד 400 בפרוטוקוליםקודמים 4.
- ודא שאספקת גז הטיהור ליחידת מיזוג הסיבים מופעלת.
הערה: חיוני שהרכבת SPME תותקן כראוי בדוגמה האוטומטית ושהוא מיושר למגשי הדגימה האוטומטית, ליחידת מיזוג הסיבים וליציאת הכניסה של GC. יישור שגוי עלול לגרום לנזק או להרס של סיבי SPME.
4. ניתוח
- מקם בקבוקון רווח ראש ריק (כדי לפעול כריק מערכת) במיקום הראשון של מגש הדוגמל האוטומטי GC-MS. מקם את הריק הסביבתי במיקום השני של מגש הדוגמל האוטומטי. מקם את הדגימות לניתוח במיקומים הבאים של מגש הדגימה האוטומטית.
- צור רצף אנליטי כדי לנתח כל דגימה בתוך המגש לדוגמה.
- במסך הבית של MassHunter, בחר רצף | טען רצף.
- השלם את טבלת הרצף עבור כל המקומות הריקים והדוגמאות על-ידי הוספת המידע המתאים. שמור את טבלת הרצף שהושלמה.
הערה: המידע המדויק עבור טבלת הרצף יהיה תלוי בעיצוב המעבדות עבור הטבלה. מידע מינימלי יכלול בדרך כלל סוג לדוגמה, שם לדוגמה, מיקום ומספר בקבוקון, שיטה אנליטית ומיקום ושם של קובץ נתונים (הקצאה של שם קובץ נתונים התואם לשם לדוגמה מסייעת לעיבוד נתונים עתידי). ניתן להוסיף דגימות נוספות לרצף במהלך הניתוח.
- הפעל את הרצף על-ידי בחירה באפשרות רצף | הפעל רצף.
- לאחר ניתוח להחזיר דגימות למקפיא בהקדם האפשרי.
הערה: ייתכן שניתן יהיה לנתח מחדש דגימות, אך יש לציין כי ייתכן שחלק מהרכיבים הנדיפים חולצו לחלוטין במהלך הניתוח הראשוני וייתכן שתרכובות מסוימות עברו פירוק תרמי ובקטריאלי ב- 40 מעלות צלזיוס, ולכן ייתכן שהכרומטוגרמה שנוצרה אינה מייצגת ביסודיות את סימון הריח המקורי.
5. ניתוח נתונים
הערה: ניתוח נתונים ראשוני כולל שילוב של כרומטוגרמות כדי להשיג זמן שמירה ונתוני אזור שיא יחד עם זיהוי זמני של פסגות באמצעות תוכנת ChemStation ומסדי נתונים ספקטרליים המוניים של NIST (המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה), גרסה MSD F.01.01.2317. ניתוח נתונים יכול להתבצע באופן ידני או באמצעות שיטה אוטומטית למחצה. אם השיטה האוטומטית למחצה משמשת אז זה לפעמים מועיל לבצע מידה מסוימת של ניתוח נתונים ידני כדי לאמת זיהויים מהוססים.
- פתח את קובץ הנתונים על-ידי לחיצה על הקובץ המתאים בסרגל הניווט הימני. כרומטוגרמה היונית הכוללת (TIC) תוצג בחלון העליון של מסך ניתוח הנתונים.
- כדי לשלב את ה- TIC באמצעות אינטגרטור RTE, בחר כרומטוגרמה | שלב.
- התאם פרמטרי שילוב כך שפסגות הגדולות מרעש בסיסי של 3 x ישולבו. בחר | כרומטוגרמה פרמטרי שילוב אותות של MS. בתיבת הפלט להתאים את אזור השיא המינימלי לפי הצורך (1.0 מייצר תוצאות מקובלות בדוגמאות שלנו).
- כדי לזהות פסגות ולהפיק דוח סיכום, בחר יצא דוחות | תוצאות החיפוש בספריה מדווחות ל- XLS.
הערה: יש לערוך חיפוש בספריות הספקטרליות יחד עם מספר התאמות הספרייה שיוצגו לפני שניתן יהיה לבצע חיפוש בספריה. - דוח הגיליון האלקטרוני המתקבל מכיל נתוני שילוב עבור כל שיא והתאמה לא סופית של ספריה ספקטרלית להקצאת זהות. בדרך כלל, איכות הספריה /התאמת הספריה צריכה להיות >80 כדי לקבל את הזיהוי הלא סופי. שמור את הגיליון האלקטרוני.
- זהה שיא ישירות מהטי.איי.איי.
- בחר את שיא העניין.
- אם השיא קטן, הגדל את התצוגה על-ידי ציור תיבה מסביב לשיא על-ידי החזקת לחצן העכבר השמאלי כלפי מטה, מתיחת התיבה מעל הפסגה ושחרורה.
- מקם את קו הסמן כך שיהיה בנקודה הגבוהה ביותר של הפסגה (או מיד לאחר מכן).
- לחץ פעמיים על לחצן העכבר הימני וספקטרום המסה לשיא יופיע בחלון התחתון של מסך ניתוח הנתונים.
- כדי לחפש בספריה הספקטרלית, הזז את הסמן למקום כלשהו בחלון הספקטרלי ולחץ פעמיים על לחצן העכבר הימני. תוצאות החיפוש בספריה יופיעו בחלון חדש.
- כדי להסיר את רעשי הרקע ממגוון עניין, לחץ תחילה פעמיים על לחצן העכבר הימני בשיא המדובר. לאחר מכן לחץ פעמיים על לחצן העכבר הימני באזור ללא פסגות מיד מול שיא העניין. בחר | כרומטוגרמה הפחת ספקטרום. הספקטרום המצומצם יוצג בחלון התחתון של מסך ניתוח הנתונים ויציג את '(-)' לצד נתוני הסריקה בכותרת החלון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות פרוטוקול זה, זיהינו באופן זמני סך של 32 תרכובות כימיות נדיפות מניתוח של 14 סימני ריח של איברי המין האנו שפורסמו באופן ספונטני על נייר סינון על ידי למורים אדומי צווארון (Varecia variegata rubra) והשווינו פרופילי ריח עם תכונות של האות12. תרכובות נדיפות המתרחשות באופן טבעי, כגון פחמימנים, טרפנים, אלכוהול טרפן וקטונים, היו נוכחים בתוך פרופילים אלה וכללו תרכובות שנמצאו בעבר לשמש פרומונים מין רמזים כושר מינים אחרים של בעלי חיים. התרכובות שזוהו באופן לא סופי מפורטות בטבלה 1. כרומטוגרמות מייצגות (1 מבקרה ו-1 מסימן ריח למור) מוצגות באיור 1. מספרם ושפעם היחסי של הרכיבים נעו מדגם לדגימה על פני נושאי מחקר שונים. עם זאת, שש תרכובות (בנזלדהיד, 2-אתיל-1-hexanol, p-cresol, cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol, 2-פינן-4-אחד, pentadecane) היו נוכחים בכל הדגימות.
תוצאות מחקר זה הראו כי למורים אדומי וולאנים משתמשים בסימון ריחות כדי להעביר מידע על מין וגיל נשי, כאשר סימון אנו-איברי המין ממלא תפקיד בתקשורת החברתית-מינית.
תוצאה מייצגת נוספת בעקבות השימוש בפרוטוקול זה הייתה המחקר שלנו של פרסומת פוריות על ידי בבונים זית נקבה (Papio anubis) (Vaglio et al. נתונים שלא פורסמו). זיהינו בסך הכל 74 תרכובות נדיפות מהניתוח של 385 דגימות ריח בבון נקבה. תרכובות אלה כללו מגוון של תרכובות נדיפות ריח טבעי כגון קטונים, אלכוהול, אלדהידים, טרפנים, חומצות שומן נדיפות ופחמימנים. כרומטוגרמות טיפוסיות המשמשות להשוואת שליטה ריקה ודגימות ריח וגינאלי של בבון נקבה מתקופות פוריות ולא פוריות מוצגות באיור 2. בדקנו את היחסים בין פרופילי ריחות וגינאליים לבין קליטה מינית של בבונים נשיים. התוצאות שלנו הראו כי הכמות הכוללת של ריח הנרתיק שונה עם פוריות עולה כי ריח עשוי לשחק תפקיד איתות פוריות הבבון הנשי. מצאנו גם הבדלים בריח הנרתיק בין סוגי קבוצות, אך לא יכולנו להבחין בין ההשפעות של הרכב הקבוצה, הגיל הנשי והשוויון.
איור 1. כרומטוגרמות לדוגמה; (כרומטוגרמה עליונה -'בקרה') מדגם הבקרה, המציג מזהמים; (כרומטוגרמה תחתונה - 'למור ריח סימן') נקבה בוגרת אחת אדומת וולאנים למור פרוות ריח אנו-איברי המין הפרשות, מראה מזהמים ותרכובות ביולוגיות משמעותיות. חצים אדומים מציינים את ששת התרכובות הביולוגיות המשמעותיות שנמצאו בכל הדגימות: (א) בנזלדהיד; (ב) 2-אתיל-1הקסנול; (ג) p-cresol; (ד) ציס-פ-מנטה-2,8-דיין-1-אול; (ה) 2-פינן-4-אחד; (ו) פנטדקן. נתון זה שונה מ Janda ואח'12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. דוגמה לכרומטוגרמה מדגם בקרה (כרומטוגרמה עליונה -'בקרה'), המציג מזהמים; (כרומטוגרמה אמצעית -'בבון ריח לא פורה') בבון זיתים נקבי, דגימת ריח וגינאלי מתקופה לא פורייה; ו (כרומטוגרמה תחתונה - 'בבון ריח פורה') בבון זית נקבי, דגימת ריח וגינאלי מתקופה פורייה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| זמן שמירה (דקות) | מזהה מורכב לא סופי | משקל מולקולרי |
| 3.906 | הקסלתי | 100 |
| 6.057 | 5-מתיל-3-הקסנון | 114 |
| 7.413 | אלפא- Pinene | 136 |
| 8.077 | 1-איזופרופיל-4-מתילנביצ'ליקו[3.1.0]הקסוס-2-1 | 134 |
| 8.268 | בנזלדהיד | 106 |
| 8.623 | 3,7,7-טרימטיל-1,3,5-ציקלוהפטרין | 134 |
| 9.096 | פנול | 94 |
| 9.269 | 6-מתאקסי-5-הפטן-2-אחד | 126 |
| 10.72 | 2-אתיל-1-הקסנול | 130 |
| 12.362 | p-קרסולות | 108 |
| 12.553 | סיס-ורבנול | 152 |
| 13.385 | ציס-פ-מנטה-2,8-דיין-1-אול | 152 |
| 14.104 | 1,7,7-טרימתילביקלו[2.2.1]הפטה-2-1 | 152 |
| 14.536 | ל-פינוקארבול | 152 |
| 14.791 | טרנס ורבנול | 152 |
| 15.605 | פ-אתיל-פנול | 122 |
| 15.928 | טרפינן-4-אול | 154 |
| 16.415 | אלפא-טרפינול | 154 |
| 16.615 | מירטנול (מירטנול) | 152 |
| 17.047 | 2-פינן-4-אחד | 150 |
| 18.252 | גילוף (100 ק"מ) | 150 |
| 19.217 | p-מנטה-1,8-דיין-3-אחד | 150 |
| 23.283 | 4,7,7-טרימתילביקלו[4.1.0]הפט-3-ene-2-one | 150 |
| 23.443 | טטרדקן (לא כולל) | 198 |
| 25.094 | גרנילאצטון | 194 |
| 25.899 | איסומטיליון | 206 |
| 26.513 | פנטדקן (פנטדקן) | 212 |
| 30.871 | 2,6,10-טרימתילפנטדקן | 254 |
| 32.208 | הפטדקן (נפה) | 240 |
| 32.372 | 2,6,10-טרימתילהקסדקן | 268 |
| 34.446 | n-טטרוסאן | 338 |
| 34.591 | 2,6,10,14-טטרמתילהקסדקן | 282 |
שולחן 1. תרכובות נדיפות הנמצאות בדגימות נייר סינון מהפרשות ריח לנו-איברי המין של למור אדומות-וולאנים שזוהו באופן לא סופי באמצעות תוכנת ChemStation ומסדי נתונים ספקטרליים של מסה NIST, גרסה MSD F.01.01.2317. טבלה זו שונתה מ Janda ואח '12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש בדגימות בקרה, הן בקרות סביבתיות שנוצרו בזמן איסוף הדגימה והן כדורי סרק של המערכת, חיוניים לפרשנות דגימות סימן הריח. כל הפסגות המיוחסות לסביבת הדגימה או למערכת האינסטרומנטלית צריכות להיות מודרות מדגימות סימן ריח, כך שרק פסגות העניין נכללות בכל פרשנות. פקדים אלה יכולים גם לשחק תפקיד בהערכת וניטור 'בריאות' המכשור.
הפרוטוקול כולל שלבים כדי להתנות את הסיבים לפני ואחרי כל מיצוי. זה נעשה קל יותר על ידי שימוש במדגם אוטומטי ומבטיח כי אין זיהום צולב מדגם לדגימה.
המגבלה העיקרית למתודולוגיה מתייחסת לדגימות עצמן. לאחר האיסוף, חשוב שהם יאוחסנו ויעברו כראוי. מרכיבי הריבית הספציפית הם תנודתיים, ואלה עלולים בקלות ללכת לאיבוד, או שהריכוזים שלהם ישתנו. כיום דגימות מאוחסנות ומועברות קפואות, בדרך כלל ב- -20°C. כתוצאה מכך יש עלות משמעותית מעורב אחסון והובלה של דגימות אלה. עיכובים בהעברת דגימות למעבדה לניתוח יגדילו עלויות אלה עוד יותר ועלולים להשפיע על התוצאות המתקבלות מסימני הריח. דרוש מחקר נוסף כדי להבין את ההשפעה של זמן ואחסון על התוצאות האנליטיות המתקבלות מדגימות. מכיוון שהרכיבים בעלי המשמעות המסוימת הם הרכיבים הנדיפים יותר של סימני הריח, ייתכן שהרמות של רכיבים אלה עשויות לשנות את איסוף הדגימה שלאחר מכן. שיקול ייתכן גם צריך להינתן אפקטים חיידקיים פוטנציאליים בתוך סוגים מסוימים של מדגם. לדוגמה, בבדיקת אלכוהול של דגימות שתן, חיידקים הנמצאים בשתן עשויים לייצר אלכוהול ולכן להגדיל את רמות האלכוהול שזוהו.
המתודולוגיה הנוכחית עומדת בכל הדרישות שתוארו קודם לכן. הוא מספק תוצאות באיכות טובה שממנו מידע נוסף על הרכב של סימני ריח מתקבל. עם זאת, הניתוח הוא טכניקה מבוססת מעבדה התלויה בדגימות המוגשות למעבדה. פתרון אפשרי אחד למגבלה זו יהיה באמצעות מכשור GC-MS נייד, מכשירים שניתן לקחת לשדה שבו נלקחות הדגימות. גישה זו תקל על הצורך לאחסן ולהעביר דגימות ותאפשר ניתוח בזמן אמת של סימני ריח שעשויים לספק מידע רב יותר על הרכיבים הנדיפים ביותר של הסימנים. מספר מכשירי GC-MS ניידים זמינים. הם משתמשים בטכנולוגיה שונה לזו שנמצאה במכשור מבוסס המעבדה, אך אמורים לספק תוצאות דומות. השימוש בטכניקת החילוץ HS-SPME עדיין ישים. עם זאת, כתוצאה מלהיות נייד, המכשירים אינם מציעים את האפשרות של הקדמה מדגם אוטומטי; עם זאת, אם דגימות מנותחות ברגע שהם נאספים, מספרי מדגם יומיים צפויים להיות לניהול להזרקה ידנית. כמו כן, במקרה של מיצוי שדה, יש להקפיד כי סיבי SPME אינו לוכד כימיקלים סביבתיים לפני השימוש. מכשירים זמינים כעת מופעלים באמצעות סוללה המאפשרת ניידות מוחלטת, אך עם אספקת צורה כלשהי של ספק כוח (אפילו גנרטור קטן), מכשירים אלה יכולים להיות מופעלים לפרקי זמן ארוכים יותר. מכשירים אלה מטבעם נועדו לעתים קרובות להיות פשוטים לתפעול, עם הכשרה מינימלית וידע נדרש. משמעות הדבר היא כי ייתכן שלא יהיה צורך עבור מפעילים מאומנים מאוד לפרוס עם המכשיר וכי הם יכולים להיות מופעלים על ידי אלה שאוספים את הדגימות. פרשנות מפורטת של תוצאות אנליטיות יכולה להיות מושגת מרחוק או כאשר המכשיר חוזר לבסיס.
מגבלה מרכזית נוספת עם שיטות באמצעות סיבי SPME היא שניתן לנתח רק תרכובות כימיות הקיימות בשפע בדגימות. בפרט, כמויות גדולות בהרבה של הכימיקל קיימות בדגימות גם כאשר כמות המולקולות היא תת-תרשימים לניתוח באמצעות סיבי SPME. בנוסף, בהקשר של הפרשות ריח שפורסמו על ידי סימני ריח של בעלי חיים ואותות כימיים אחרים של בעלי חיים, בעלי חיים בודדים נוטים להשתמש בתרכובות כימיות בכמויות קטנות כדי לתקשר עם בעלי חיים אחרים ו / או לזהות אותות ריח מחומרים. במילים אחרות, הביצועים השונים של אפים של בעלי חיים ומיצוי SPME עשויים להוות אתגר גדול להצלחת טכניקת הדגימה הזו.
פיתוח עתידי של המתודולוגיה הנוכחית יכול להתבסס סביב איסוף מדגם עם חקירת השימוש בחומרים סורבנט חלופיים או צינורות sorbent לשימוש עם מערכות desorption תרמית. התפתחויות כאלה עשויות ללכת בדרך כלשהי כדי לעזור לדגום את תנאי האחסון וההובלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לקית' הולדינג על עזרתו בניתוחים כימיים במרכז המדע ע"ש רוזלינד פרנקלין, וולברהמפטון ובן מנטל על הפקת הסרטון. אנו מודים גם לפרופ' גלוריאנו מונטי, ד"ר ג'וזפה פייראצ'יני ולחברי המרכז לספקטרומטריית מסה באוניברסיטת פירנצה, פירנצה, ולפרופ' לוקה קלמאי וד"ר מרקו מיכאלוצי ממעבדת ARCA של CNR, פירנצה, על עזרתם בהקמת מתודולוגיה זו. פרויקטי המחקר שכללו את שיטות הדגימה והניתוח המתוארות בכתב היד נתמכו על ידי שתי מלגות מארי סקלודובסקי-קירי אינטרה אירופאיות (תעודות זהות של הסכם מענק: 327083, 703611), מענק קטן ('הפרימט המועשר החושי') מאגודת הפרימטים של בריטניה הגדולה, ומענק מחקר קטן ('האם לציידים-לקטים יש חוש ריח מיוחד?') מהאקדמיה הבריטית / קרן Leverhulme ל S.V. עבודת המעבדה הדרושה להקמת מתודולוגיה זו קיבלה גם מימון מתחרות המימון השנתית של הפקולטה למדעים והנדסה (וולברהמפטון) ל-S.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | - | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | - | Excel |
| Spectral library | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
