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Behavior

Campionamento e analisi dei segnali di profumo animale

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/60902
* These authors contributed equally

Summary

Abbiamo sviluppato una metodologia efficace per il campionamento e l'analisi dei segnali di odore al fine di capire come possono essere utilizzati nella comunicazione animale. In particolare, utilizziamo la microesezione a fase solida headspace abbinata alla spettrometria gascromatografia-massa per analizzare i componenti volatili degli odori animali e dei segni olfatto.

Abstract

Abbiamo sviluppato una metodologia efficace per il campionamento e l'analisi dei segnali di odore, utilizzando la microesezione in fase solida headspace accoppiata alla spettrometria gascromatografia-massa, per capire come possono essere utilizzati nella comunicazione animale. Questa tecnica consente l'analisi semi-quantitativa dei componenti volatili delle secrezioni di odori consentendo la separazione e l'identificazione provvisoria dei componenti nel campione, seguita dall'analisi dei rapporti di area di picco per cercare tendenze che potrebbero significare composti che possono essere coinvolti nella segnalazione. I punti di forza chiave di questo approccio attuale sono la gamma di tipi di campioni che possono essere analizzati; la mancanza di necessità di preparazione o estrazione di campioni complessi; la capacità di separare e analizzare i componenti di una miscela; l'identificazione dei componenti rilevati; e la capacità di fornire informazioni semi-quantitative e potenzialmente quantitative sui componenti rilevati. La limitazione principale alla metodologia riguarda i campioni stessi. Poiché i componenti di interesse specifico sono volatili, e questi potrebbero facilmente andare perduti, o le loro concentrazioni modificate, è importante che i campioni siano immagazzinati e trasportati in modo appropriato dopo la loro raccolta. Ciò significa anche che le condizioni di stoccaggio e trasporto dei campioni sono relativamente costose. Questo metodo può essere applicato a una varietà di campioni (tra cui urina, feci, capelli e secrezioni di odori di ghiandola profumata). Questi odori consistono in miscele complesse, che si verificano in una serie di matrici, e quindi richiedono l'uso di tecniche per separare i singoli componenti ed estrarre i composti di interesse biologico.

Introduction

Si sa molto poco dei cambiamenti chimici alla base dei segnali olfattivi negli animali1,anche a causa delle sfide metodologiche nella registrazione e quantificazione dei profili chimici volatili degli odori2. Ci sono diverse potenziali insidie quando si lavora con matrici chimiche altamente complesse; questi includono durante il campionamento e l'analisi dei campioni di odore3.

Al Rosalind Franklin Science Center, Università di Wolverhampton, stiamo intraprendendo l'analisi di odori e segni di profumo per capire come possono essere utilizzati dagli animali. Combiniamo la semiochimica con l'ecologia comportamentale, l'endocrinologia e la citologia per migliorare la nostra comprensione del ruolo svolto dai segnali olfattivi nella comunicazione animale.

Abbiamo sviluppato una metodologia e poi analizzato odori e marcature di una varietà di specie tra cui diversi primati non umani (cioè lemuri coronati, lemuri arruffati di rosso, macachi giapponesi, babbuini d'oliva, scimpanzé) e altri mammiferi (ad esempio gatti, mucche). Abbiamo raccolto e analizzato una varietà di campioni, tra cui urina, feci, capelli e secrezioni di odori di ghiandola profumata. Questi odori e segni di profumo consistono in miscele complesse di composti e quindi qualsiasi metodologia utilizzata per la loro analisi deve includere una qualche forma di tecnica separatoria. Come illustrato, si verificano anche in una serie di matrici che richiedono l'uso di tecniche per estrarre i componenti di interesse.

Studi precedenti di Vaglio et al. In particolare, il campionamento dinamico dello spazio di testa comporta l'eliminazione dello spazio della testa con un volume noto di gas inerte che alla fine rimuove tutti i composti volatili ad eccezione di quelli che mostrano una forte affinità per la matrice del campione (ad esempio, composti polari in campioni acquosi).

Per l'attuale metodologia, abbiamo adottato la tecnica della microesezione in fase solida headspace (HS-SPME) abbinata a GC-MS. In particolare, abbiamo sviluppato e migliorato la metodologia già utilizzata da Vaglioet al.

Le tecniche di estrazione senza solventi sono molto efficaci per analizzare composti piccoli e altamente volatili (che altrimenti possono essere persi facilmente da un campione) perché questi metodi immobilizzano i composti su un supporto di fase stabile e solido. L'HS-SPME utilizza una fibra rivestita con un polimero adsorbente per catturare composti volatili nello spazio della testa del campione o per estrarre composti disciolti per immersione in un fluido biologico acquoso11. Il rivestimento polimerico non lega fortemente i composti, quindi riscaldando nella porta di iniezione del GC possono essere rimossi. Questo metodo è più potente delle tecniche di estrazione dei solventi e anche più efficace del DHS.

Nell'approccio corrente i campioni sono contenuti all'interno di fiale di vetro. Queste fiale vengono riscaldate a una temperatura di 40 °C per simulare la temperatura corporea animale al fine di promuovere i componenti volatili del marchio di profumo per occupare lo spazio della testa del flaconcino. Una fibra SPME, rivestita con 65 μm di polidimetilsiloxano/divinilbenzene (PDMS/DVB) materiale assorbente, è esposta all'ambiente dello spazio della testa e i componenti volatili del campione vengono adsorbiti sulla fibra. Al riscaldamento della fibra nella porta di ingresso di un GC-MS, i componenti volatili vengono desorbiti dalla fibra e quindi separati dal GC. I modelli di frammentazione spettrale di massa sono ottenuti per ogni componente utilizzando la SM. Rispetto a questi spettri di massa rispetto ai database spettrali di massa, può essere possibile identificare provvisoriamente i componenti del marchio di profumo. Attraverso l'uso di un campionatore automatico, siamo in grado di analizzare più campioni in lotti in modo coerente.

Dato che ogni tipo di fibra SPME ha una diversa affinità con le sostanze chimiche polari, la fibra viene solitamente scelta a seconda della polarità e/o del peso molecolare dei composti chimici bersaglio. Inoltre, le condizioni gc vengono modificate a seconda del tipo di colonna GC e delle caratteristiche dei composti chimici bersaglio.

Questa tecnica consente l'analisi semi-quantitativa dei componenti volatili delle marcature olmografiche consentendo la separazione e l'identificazione provvisoria dei componenti nel campione, seguita dall'analisi dei rapporti di area di picco per cercare tendenze che potrebbero significare componenti della marcatura del profumo che possono essere coinvolte nella segnalazione.

I principali punti di forza di questo approccio attuale sono:

  • Intervallo di tipi di campione che possono essere analizzati.
  • Non sono richieste complesse preparazione o estrazioni del campione.
  • La capacità di analizzare componenti volatili.
  • La capacità di separare i componenti di una miscela.
  • Per essere in grado di identificare i componenti rilevati.
  • La capacità di fornire informazioni semi-quantitative e potenzialmente quantitative sui componenti rilevati.

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Protocol

1. Raccolta dei campioni

  1. Odori campione che sono uno dei seguenti:
    1. Raccogliere spontaneamente rilasciato da soggetti di studio abituati (ad esempio, primati dello zoo) attraverso la marcatura del profumo su carta filtrante sterile (ad esempio, secrezioni di odori di ghiandola profumata) o direttamente in fiale (ad esempio urina).
    2. Raccogliere strofinando tamponi di cotone sterili dopo aver allenato le materie di studio utilizzando un allenamento di rinforzo positivo.
    3. Raccogliere strofinando tamponi di cotone sterili dopo la sedazione di soggetti di studio.
  2. Posizionare i campioni in flaconcini di vetro trasparente sterili con cappuccio a vite da 10 mL e sigillare con tappi con viti con setti FTFE /silicone. Conservarli immediatamente a -20 °C.
    NOTA: È fondamentale utilizzare dispositivi di protezione individuale puliti, come guanti di nitrile; cambiarli frequentemente; evitare il contatto diretto della pelle con campioni e fiale. Si preferisce utilizzare fiale nuove di zecca; tuttavia, in caso di flaconcini usati, è fondamentale pre-pulire le fiale e quindi utilizzare lo stesso protocollo.
  3. Prendi gli spazi vuoti ambientali ogni volta che vengono raccolti segni di profumo. Ad esempio, raccogliere i mezzi di campionamento (ad esempio, carta da filtro o tampone) e una fiala headspace esposta all'ambiente durante il campionamento.

2. Preparazione del campione

  1. Preparare i campioni sul campo tagliando con una lama un quadrato di circa 10 mm da una carta da filtro marcata dal profumo, o la testa del tampone, e posizionandolo in un flaconcino head-space con punta a vite da 10 mL.
  2. Dopo aver preparato ciascun campione, smaltire o pulire la lama utilizzata per tagliare il supporto di campionamento utilizzando un'appropriata salvietta antibatterica e/o alcool e asciugare accuratamente.
  3. Conservare tutti i campioni a -20 °C.
    NOTA: Preferito a -20 °C o comunque il più basso possibile sul campo.

3. Preparazione all'analisi

  1. Rimuovere i campioni dal congelatore e lasciare riscaldare naturalmente a temperatura ambiente per almeno 1 h.
  2. Impostare il metodo analitico sul GC-MS come segue:
    1. Per le condizioni di analisi SPME, seguire le indicazioni del produttore per condizionare le fibre SPME prima del primo utilizzo: pre-condizione della fibra (260 °C per 5 minuti), incubazione del campione (40 °C per 2 min), tempo di estrazione (15 min), tempo di desorbimento (2 min) e post-condizione della fibra (260 °C per 20 min).
    2. Utilizzare le seguenti condizioni GC: colonna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura dell'iniettore (270 °C), portata (1 mL/min), modalità di iniezione (splitless), profilo del forno GC (45 °C per 2 min; da 4 °C/min a 170 °C; da 20 °C/min a 300 °C), linea di trasferimento MSD (280 °C).
      NOTA: per migliorare tra la coerenza del tempo di conservazione del campione, il metodo analitico è bloccato nel tempo di conservazione).
    3. Utilizzare le seguenti condizioni MSD: ritardo del solvente (2,5 min) e intervallo di scansione (da 29 a 400 amu).
      NOTA: Un intervallo da 10 a 400 è stato utilizzato nei protocolli precedenti4.
  3. Assicurarsi che l'alimentazione del gas di spurgo all'unità di condizionamento della fibra sia accesa.
    NOTA: È fondamentale che l'assieme SPME sia installato correttamente nel campionatore automatico e che sia allineato ai vassoi del campionatore automatico, all'unità di condizionamento della fibra e alla porta di ingresso GC. Un allineamento errato potrebbe causare danni o distruzione della fibra SPME.

4. Analisi

  1. Posizionare una fiala vuota dello spazio di teste (per fungere da vuoto di sistema) nella prima posizione del vassoio del campionatore automatico GC-MS. Posizionare il vuoto ambientale nella seconda posizione del vassoio del campionatore automatico. Posizionare i campioni per l'analisi nelle posizioni successive del vassoio del campione automatico.
  2. Creare una sequenza analitica per analizzare ogni campione all'interno del vassoio del campione.
    1. Nella schermata iniziale di MassHunter, selezionate Sequenza | Sequenza di carico.
    2. Completare la tabella delle sequenze per tutti gli spazi vuoti e i campioni inserendo le informazioni appropriate. Salvare la tabella delle sequenze completata.
      NOTA: Le informazioni esatte per la tabella di sequenza dipenderanno dalla formattazione dei laboratori per la tabella. Le informazioni minime includerebbero normalmente il tipo di campione, il nome del campione, la posizione e il numero del flaconcino, il metodo analitico e il percorso e il nome del file di dati (l'allocazione di un nome di file di dati corrispondente al nome del campione aiuta l'elaborazione futura dei dati). Ulteriori campioni possono essere aggiunti alla sequenza durante l'analisi.
  3. Eseguite la sequenza selezionando Sequenza (Sequence | Eseguire la sequenza.
  4. Dopo l'analisi, riportare i campioni nel congelatore il prima possibile.
    NOTA: può essere possibile rianalizzare i campioni, ma va notato che alcuni componenti volatili possono essere stati completamente estratti durante l'analisi iniziale e alcuni composti possono essere stati sottoposti a decomposizione termica e batterica a 40 °C, quindi il cromatogramma risultante potrebbe non essere completamente rappresentativo della marcatura olografica originale.

5. Analisi dei dati

NOTA: L'analisi iniziale dei dati include l'integrazione di cromatogrammi per ottenere il tempo di conservazione e i dati delle ore di picco insieme all'identificazione provvisoria dei picchi utilizzando il software ChemStation e i database spettrali di massa NIST (National Institute of Standards and Technology), versione MSD F.01.01.2317. L'analisi dei dati può essere effettuata manualmente o con un metodo semi-automatizzato. Se si utilizza il metodo semi-automatizzato, a volte è utile intraprendere un certo grado di analisi manuale dei dati per verificare le identificazioni provvisorie.

  1. Aprire il file di dati facendo clic sul file appropriato nella barra di spostamento sinistra. Il cromatogramma ionico totale (TIC) verrà visualizzato nella finestra superiore della schermata di analisi dei dati.
  2. Per integrare il TIC utilizzando l'integratore RTE, selezionare Chromatogram | Integrare.
  3. Regolare i parametri di integrazione in modo da integrare picchi superiori a 3 volte il rumore di base. Selezionare cromatogramma | Parametri di integrazione del segnale MS. Nella casella di uscita regolare l'area di picco minima in base alle esigenze (1.0 produce risultati accettabili nei nostri esempi).
  4. Per identificare i picchi e generare un report riepilogativo, selezionare Esporta report | Report dei risultati della ricerca nella libreria a XLS.
    NOTA: Le librerie spettrali da cercare insieme al numero di corrispondenze di libreria da visualizzare devono essere preimpostate all'interno del software prima di poter eseguire una ricerca in libreria.
  5. Il report foglio di calcolo risultante contiene i dati di integrazione per ogni picco e una corrispondenza provvisoria della libreria spettrale per assegnare l'identità. In genere, la corrispondenza qualità/libreria libreria deve essere >80 per accettare l'identificazione provvisoria. Salvare il foglio di calcolo.
  6. Identificare un picco direttamente dal TIC.
    1. Scegli il picco di interesse.
    2. Se il picco è piccolo, ingrandire disegnando una casella intorno al picco tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse, allungare la casella sul picco e rilasciarlo.
    3. Posizionare la linea del cursore in modo che si trova nel punto più alto del picco (o subito dopo).
    4. Fare doppio clic sul pulsante destro del mouse e lo spettro di massa per il picco apparirà nella finestra inferiore della schermata di analisi dei dati.
    5. Per cercare nella libreria spettrale, spostare il cursore in un punto qualsiasi della finestra spettrale e fare doppio clic con il pulsante destro del mouse. I risultati della ricerca nella raccolta verranno visualizzati in una nuova finestra.
    6. Per rimuovere il rumore di fondo da uno spettro di interesse, fare doppio clic con il pulsante destro del mouse sul picco in questione. Quindi fare doppio clic sul pulsante destro del mouse in un'area senza picchi immediatamente di fronte al picco di interesse. Selezionare cromatogramma | Sottrarre spettri. Lo spettro sottratto verrà visualizzato nella finestra inferiore della schermata di analisi dei dati e mostrerà '(-)' accanto ai dati SCAN nell'intestazione della finestra.

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Representative Results

A seguito di questo protocollo, abbiamo provvisoriamente identificato un totale di 32 composti chimici volatili dall'analisi di 14 segni di profumo ano-genitale rilasciati spontaneamente su carta filtrante da lemuri arruffati di rosso(Varecia variegata rubra)e confrontato i profili degli odori con le caratteristiche del segnalatore12. All'interno di questi profili erano presenti composti volatili presenti in natura, come idrocarburi, terpeni, alcoli terpenici e chetoni, che includevano composti che in precedenza erano stati trovati come feromoni sessuali e segnali di idoneità in altre specie animali. I composti che sono stati provvisoriamente identificati sono elencati nella tabella 1. I cromatogrammi rappresentativi (1 da un controllo e 1 da un segno di profumo del lemure) sono riportati nella figura 1. Il numero e l'abbondanza relativa dei componenti variavano da campione a campione tra diverse materie di studio. Tuttavia, sei composti (benzaldeide, 2-etile-1-esaanolo, p-cresolo, cis-p-mentha-2,8-dien-1-olo, 2-pinen-4-one, pentadecano) erano presenti in tutti i campioni.

I risultati di questo studio hanno suggerito che i lemuri arruffati di rosso usano la marcatura del profumo per trasmettere informazioni sul sesso e sull'età femminile, con la marcatura ano-genitale che gioca un ruolo nella comunicazione socio-sessuale.

Un altro risultato rappresentativo dopo l'uso di questo protocollo è stato il nostro studio della pubblicità della fertilità da parte di babbuini di olive femminili (Papio anubis) (Dati vaglio et al. inediti). Abbiamo identificato un totale di 74 composti volatili dall'analisi di 385 campioni di odore vaginale di babbuino femminile. Questi composti comprendevano una serie di composti volatili odorosi presenti in natura come chetoni, alcoli, aldeidi, terpeni, acidi grassi volatili e idrocarburi. I cromatogrammi tipici utilizzati per confrontare il controllo vuoto e i campioni di odori vaginali di babbuino femminile provenienti da periodi fertili e non fertili sono mostrati nella figura 2. Abbiamo esaminato le relazioni tra profili di odore vaginale e ricettività sessuale dei babbuini femminili. I nostri risultati hanno mostrato che la quantità totale di odore vaginale differisce con la fertilità suggerendo che l'odore potrebbe svolgere un ruolo nel segnalare la fertilità del babbuino femminile. Abbiamo anche trovato differenze nell'odore vaginale tra i tipi di gruppo, ma non siamo stati in grado di distinguere gli effetti della composizione di gruppo, dell'età femminile e della parità.

Figure 1
Figura 1. Cromatogrammi di esempio; (cromatogramma superiore -'controllo') il campione di controllo, che mostra contaminanti; (cromatogramma inferiore -'marchio profumo lemure') una femmina adulta di secrezioni di odori ano-genitali al lemure rosso-arruffato, che mostra contaminanti e composti biologici significativi. Le frecce rosse indicano i sei composti biologici significativi che sono stati trovati in tutti i campioni: (a) benzaldeide; b 2-etile-1 esanolo; c p-cresolo; d cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol; e 2-pinen-4-one; f pentadecano. Questa cifra è stata modificata da Janda etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Esempio di cromatogramma del campione di controllo (cromatogramma superiore -'controllo'), che mostra contaminanti; (cromatogramma medio -'babbuino odore non fertile') babbuino di oliva femmina, campione di odore vaginale di periodo non fertile; e (cromatogramma inferiore -'babbuino odore fertile') babbuino di oliva femmina, campione di odore vaginale di periodo fertile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tempo di conservazione (minuti) ID composto provvisorio peso molecolare
3.906 Esanale 100
6.057 5-metil-3-esanone 114
7.413 Alfa-pinena 136
8.077 1-isopropil-4-metilenebiciclo[3.1.0]esagono-2-uno 134
8.268 benzaldeide 106
8.623 3,7,7-trimetil-1,3,5-cicloeptatriene 134
9.096 fenolo 94
9.269 6-metossi-5-epten-2-one 126
10.72 2-etile-1-esaanolo 130
12.362 p-Cresolo 108
12.553 verbenolo 152
13.385 cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol 152
14.104 1,7,7-trimetilbiciclo[2.2.1]epta-2-one 152
14.536 L-Pinocarveolo 152
14.791 trans-verbenolo 152
15.605 p-etil-fenolo 122
15.928 Terpinen-4-ol 154
16.415 Alfa-Terpineolo 154
16.615 Myrtenolo 152
17.047 2-Pinen-4-one 150
18.252 Carvone 150
19.217 p-Mentha-1,8-dien-3-one 150
23.283 4,7,7-trimetilbiciclo[4.1.0]epto-3-ene-2-one 150
23.443 Tetradecano 198
25.094 Geranylatetone 194
25.899 Isometilionone 206
26.513 Pentadecano 212
30.871 2,6,10-trimetilpentadecano 254
32.208 Eptadecacane 240
32.372 2,6,10-trimetilhexadecano 268
34.446 n-tetracosano 338
34.591 2,6,10,14-Tetrametilhexadecano 282

La tabella 1. Composti volatili presenti in campioni di carta filtrante da secrezioni di odori ano-genitali di lemure rosso-arruffato di donne identificate provvisoriamente utilizzando il software ChemStation e database spettrali di massa NIST, versione MSD F.01.01.2317. Questa tabella è stata modificata a partire da Janda etal.

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Discussion

L'uso di campioni di controllo, sia controlli ambientali creati al momento della raccolta dei campioni che spazi vuoti del sistema, sono fondamentali per l'interpretazione dei campioni di marchio di profumo. Tutti i picchi attribuiti all'ambiente di campionamento o al sistema strumentale devono essere esclusi dai campioni di marchio di profumo in modo che solo i picchi di interesse siano inclusi in qualsiasi interpretazione. Questi controlli possono anche svolgere un ruolo nella valutazione e nel monitoraggio dello "stato" della strumentazione.

Il protocollo include passaggi per condizionare la fibra prima e dopo ogni estrazione. Ciò è facilitato dall'uso di un campionatore automatico e garantisce che non vi sia contaminazione incrociata da campione a campione.

La limitazione principale alla metodologia riguarda i campioni stessi. Dopo la raccolta, è importante che siano immagazzinati e trasportati in modo appropriato. Le componenti di interesse specifico sono volatili, e queste potrebbero facilmente andare perdute, o le loro concentrazioni alterate. Attualmente i campioni vengono immagazzinati e trasportati congelati, in genere a -20°C. Di conseguenza, vi è un costo significativo per lo stoccaggio e il trasporto di questi campioni. I ritardi nel trasporto dei campioni in laboratorio per l'analisi aumenteranno ulteriormente questi costi e potrebbero potenzialmente influire sui risultati ottenuti dai marchi olo-benefici. Sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere l'effetto del tempo e della conservazione sui risultati analitici ottenuti dai campioni. Poiché i componenti di particolare importanza sono i componenti più volatili dei segni di profumo, è possibile che i livelli di questi componenti possano alterare la raccolta post campione. Potrebbe anche essere necessario prendere in considerazione potenziali effetti batterici all'interno di alcuni tipi di campioni. Ad esempio, nell'alcol test dei campioni di urina, i batteri presenti nelle urine possono produrre alcol e quindi aumentare i livelli di alcol rilevati.

L'attuale metodologia soddisfa tutti i requisiti precedentemente delineati. Fornisce risultati di buona qualità da cui si ottengono ulteriori informazioni sulla composizione dei marchi olo-odori. Tuttavia, l'analisi è una tecnica basata sul laboratorio che dipende dal fatto che i campioni vengano sottoposti al laboratorio. Una potenziale soluzione a questa limitazione sarebbe l'uso di strumentazione GC-MS portatile, strumenti che potrebbero essere portati nel campo in cui vengono prelevati i campioni. Questo approccio allevierebbe la necessità di immagazzinare e trasportare campioni e consentirebbe l'analisi in tempo reale dei marchi olo-benefici potenzialmente fornendo maggiori informazioni sui componenti più volatili dei marchi. Sono disponibili diversi strumenti GC-MS portatili. Utilizzano una tecnologia diversa da quella presente nella strumentazione basata sul laboratorio, ma dovrebbero fornire risultati comparabili. L'uso della tecnica di estrazione HS-SPME è ancora applicabile. Tuttavia, a causa della loro portatile, gli strumenti non offrono la possibilità di introdurre automaticamente campioni; tuttavia, se i campioni vengono analizzati non appena vengono raccolti, è probabile che i numeri di campione giornalieri siano gestibili per l'iniezione manuale. Inoltre, in caso di estrazione sul campo, si dovrebbe fare attenzione che la fibra SPME non intrappola le sostanze chimiche ambientali prima dell'uso. Gli strumenti attualmente disponibili sono alimentati a batteria consentendo la portabilità totale, ma con la fornitura di una qualche forma di alimentazione (anche un piccolo generatore), questi strumenti potrebbero essere utilizzati per periodi di tempo più lunghi. Questi strumenti per loro natura sono spesso progettati per essere semplici da usare, con una formazione e una conoscenza minime richieste. Ciò significa che potrebbe non essere necessario che operatori altamente qualificati siano impiegati con lo strumento e che potrebbero essere gestiti da coloro che raccolgono i campioni. Un'interpretazione dettagliata dei risultati analitici potrebbe essere ottenuta da remoto o quando lo strumento torna alla base.

Un'altra importante limitazione con i metodi che utilizzano fibre SPME è che è possibile analizzare solo i composti chimici che esistono in abbondanza nei campioni. In particolare, quantità molto maggiori della sostanza chimica esistono nei campioni anche quando la quantità di molecole è sottosoglie per l'analisi utilizzando fibre SPME. Inoltre, nel contesto delle secrezioni di odori rilasciate dai segni olfattivi degli animali e da altri segnali chimici animali, i singoli animali tendono a utilizzare composti chimici in piccole quantità per comunicare con altri animali e/o rilevare segnali olfattivi dai materiali. In altre parole, le diverse prestazioni del naso animale e dell'estrazione delle SPME possono rappresentare una sfida importante per il successo di questa tecnica di campionamento.

Lo sviluppo futuro dell'attuale metodologia potrebbe basarsi sulla raccolta dei campioni con l'indagine sull'uso di materiali assorbenti alternativi o tubi assorbenti da utilizzare con sistemi di desorbimento termico. Tali sviluppi possono contribuire in qualche modo a creare campioni di stoccaggio e condizioni di trasporto.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Keith Holding per la sua assistenza alle analisi chimiche presso il Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton e Ben Mantle per la produzione del video. Siamo inoltre grati al Prof. Gloriano Moneti, al Dott. Giuseppe Pieraccini e ai membri del Mass Spectrometry Center dell'Università di Firenze, Firenze, e al Prof. Luca Calamai e al Dott. Marco Michelozzi dell'ARCA Lab del CNR di Firenze, per il loro aiuto nella messa a punto di questa metodologia. I progetti di ricerca che comprendevano i metodi di campionamento e di analisi descritti nel manoscritto sono stati sostenuti da due Borse intraeuropee Marie Skłodowska-Curie (ID accordo di sovvenzione: 327083, 703611), una piccola sovvenzione ('Il primate arricchito sensoriale') della Primate Society of Great Britain, e una piccola borsa di ricerca ('I cacciatori-raccoglitori hanno uno speciale senso dell'olfatto?') dalla British Academy/The Leverhulme Trust a S.V. Il lavoro di laboratorio necessario per impostare questa metodologia ha anche ricevuto finanziamenti dal Concorso annuale di finanziamento della Facoltà di Scienze e Ingegneria (Wolverhampton) a S.V.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL autosampler vials Agilent 5188-5392 10 ml screwtop vials with
18 mm vial caps Agilent 8010-0139 Magnetic with PTFE/silicone septa
Autosampler Agilent GC120 PAL autosampler
Capillary column Agilent HP5-MS 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm
Data analysis software Agilent - ChemStation
Gas Chromatograph Agilent 7890B
Inlet septa Agilent 5182-3442 Merlin microseal
Mass Selective Detector Agilent 5977A
Reporting software Microsoft - Excel
Spectral library NIST - NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library
Spectral library search program NIST - MS Search v.2.2
Splitless Inlet liner Agilent 5190-4048
SPME fibres Agilent SU57345U 65 µm PDMS/DVB fibre

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comportamento Numero 168 microesportazione in fase solida headspace spettrometria gascromatografia-massa comunicazione animale marcatura del profumo olfatto segnalazione
Campionamento e analisi dei segnali di profumo animale
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Walker, D., Vaglio, S. Sampling andMore

Walker, D., Vaglio, S. Sampling and Analysis of Animal Scent Signals. J. Vis. Exp. (168), e60902, doi:10.3791/60902 (2021).

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