Summary
لقد طورنا منهجية فعالة لأخذ العينات وتحليل إشارات الرائحة من أجل فهم كيفية استخدامها في الاتصالات الحيوانية. على وجه الخصوص ، نستخدم مساحة الرأس الصلبة المرحلة microextraction مقرونة قياس الطيف الكروماتوغرافيا كتلة الغاز لتحليل المكونات المتطايرة من الروائح الحيوانية وعلامات الرائحة.
Abstract
لقد طورنا منهجية فعالة لأخذ العينات وتحليل إشارات الرائحة ، باستخدام مساحة الرأس الصلبة المرحلة microextraction مقرونة قياس الطيف الكروماتوغرافيا الكتلية الغاز ، لفهم كيفية استخدامها في الاتصالات الحيوانية. تسمح هذه التقنية بإجراء تحليل شبه كمي للمكونات المتطايرة لإفرازات الرائحة من خلال تمكين الفصل وتحديد المكونات في العينة بشكل مؤقت ، يليه تحليل نسب منطقة الذروة للبحث عن الاتجاهات التي يمكن أن تدل على المركبات التي قد تشارك في الإشارات. نقاط القوة الرئيسية لهذا النهج الحالي هي مجموعة أنواع العينات التي يمكن تحليلها؛ عدم الحاجة إلى أي إعداد أو استخراج عينات معقدة؛ القدرة على فصل وتحليل مكونات خليط؛ تحديد المكونات المكتشفة؛ والقدرة على توفير معلومات شبه كمية وربما كمية عن المكونات المكتشفة. ويتعلق القيد الرئيسي للمنهجية بالعينات نفسها. وبما أن المكونات ذات الأهمية المحددة متقلبة، ويمكن أن تضيع بسهولة، أو تتغير تركيزاتها، فمن المهم تخزين العينات ونقلها على النحو المناسب بعد جمعها. وهذا يعني أيضا أن ظروف تخزين العينات ونقلها مكلفة نسبيا. يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من العينات (بما في ذلك البول والبراز والشعر وإفرازات رائحة الغدة الرائحة). تتكون هذه الروائح من خليط معقد ، يحدث في مجموعة من المصفوفات ، وبالتالي تتطلب استخدام تقنيات لفصل المكونات الفردية واستخراج المركبات ذات الأهمية البيولوجية.
Introduction
لا يعرف الكثير عن التغيرات الكيميائية التي تقوم عليها الإشارات الشمية فيالحيوانات 1، أيضا بسبب التحديات المنهجية في تسجيل وتحديد ملامح الكيميائية المتطايرة من الروائح2. هناك العديد من المزالق المحتملة عند العمل مع المصفوفات الكيميائية المعقدة للغاية؛ وتشمل هذه عند أخذ العينات وتحليل عينات رائحة3.
في مركز روزاليند فرانكلين للعلوم، جامعة ولفرهامبتون، نقوم بتحليل الروائح وعلامات الرائحة لفهم كيفية استخدامها من قبل الحيوانات. نحن نجمع بين القياس شبه الليمفاوي والبيئة السلوكية والغدد الصماء وعلم الخلايا لتحسين فهمنا للدور الذي تلعبه الإشارات الشمية في الاتصالات الحيوانية.
لقد طورنا منهجية ثم حللنا الروائح والعلامات من مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك العديد من الرئيسيات غير البشرية (أي الليمور المتوج ، الليمور الأحمر ، المكاك الياباني ، الزيتون ، الشمبانزي) والثدييات الأخرى (أي القطط والأبقار). لقد جمعنا وحللنا مجموعة متنوعة من العينات، بما في ذلك البول والبراز والشعر وإفرازات رائحة الغدة الرائحة. هذه الروائح وعلامات الرائحة تتكون من خليط معقد من المركبات، وبالتالي فإن أي منهجية تستخدم لتحليلها تحتاج إلى تضمين شكل من أشكال التقنية الانفصالية. كما هو موضح، فإنها تحدث أيضا في مجموعة من المصفوفات التي تتطلب استخدام تقنيات لاستخراج مكونات الفائدة.
استخدمت الدراسات السابقة التي أجراها Vaglio وآخرون4 ومؤلفون آخرون5 استخراج مساحة الرأس الديناميكية (DHS) مع قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافي للغاز (GC-MS) في حين تم استخدام استخراج المذيبات المباشر6 واستخراج المذيبات المعقدة7 أيضا. وعلى وجه الخصوص، ينطوي أخذ عينات مساحة الرأس الديناميكية على تطهير مساحة الرأس بحجم معروف من الغاز الخامل يزيل في نهاية المطاف جميع المركبات المتطايرة باستثناء تلك التي تظهر تقاربا قويا لمصفوفة العينة (على سبيل المثال، المركبات القطبية في عينات مائي).
بالنسبة للمنهجية الحالية ، اعتمدنا تقنية الميكروبسترات المرحلة الصلبة (HS-SPME) إلى جانب GC-MS. على وجه الخصوص، قمنا بتطوير وتعزيز المنهجية المستخدمة بالفعل من قبل Vaglio وآخرون في مختبر GC-MS السابق8و9و10.
تقنيات استخراج المذيبات فعالة جدا لتحليل المركبات الصغيرة، شديدة التقلب (والتي يمكن أن تضيع بسهولة من عينة) لأن هذه الأساليب شل المركبات على مستقرة، ودعم المرحلة الصلبة. يستخدم HS-SPME ألياف مغلفة ببوليمر مرصع لالتقاط المركبات المتطايرة في مساحة الرأس العينة أو لاستخراج المركبات الذائبة عن طريق الغمر في سائل بيولوجي مائي11. طلاء البوليمر لا تربط المركبات بقوة، وبالتالي عن طريق التدفئة في ميناء الحقن من GC أنها يمكن إزالتها. هذه الطريقة هي أكثر قوة من تقنيات استخراج المذيبات وأيضا أكثر فعالية من DHS.
في النهج الحالي يتم احتواء العينات داخل قوارير زجاجية. يتم تسخين هذه القنينات إلى درجة حرارة 40 درجة مئوية لمحاكاة درجة حرارة جسم الحيوان من أجل تعزيز المكونات المتطايرة لعلامة الرائحة لتحتل مساحة رأس القارورة. يتم عرض ألياف SPME ، المغلفة بمواد ماصة 65 ميكرومتر من البوليديمثيلسيل أوكسان / divinylbenzene (PDMS / DVB) ، إلى بيئة مساحة الرأس ويتم امتزاز المكونات المتطايرة من العينة على الألياف. على تسخين الألياف في مدخل منفذ GC-MS، يتم desorbed المكونات المتطايرة من الألياف ومن ثم فصلها من قبل GC. يتم الحصول على أنماط تجزئة طيفية الكتلة لكل مكون باستخدام MS. بالمقارنة مع هذه الأطياف الشاملة ضد قواعد البيانات الطيفية الشاملة، يمكن أن يكون من الممكن تحديد مؤقتا مكونات علامة رائحة. من خلال استخدام العينات التلقائية ، ونحن قادرون على تحليل عينات متعددة على دفعات بطريقة متسقة.
وبالنظر إلى أن كل نوع من ألياف SPME له صلة مختلفة مع المواد الكيميائية القطبية ، وعادة ما يتم اختيار الألياف اعتمادا على القطبية و / أو الوزن الجزيئي للمركبات الكيميائية المستهدفة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تغيير شروط GC اعتمادا على نوع العمود GC وخصائص المركبات الكيميائية المستهدفة.
وتسمح هذه التقنية بإجراء تحليل شبه كمي للمكونات المتطايرة لعلامات الرائحة من خلال تمكين الفصل وتحديد المكونات في العينة بشكل مؤقت، يليه تحليل نسب منطقة الذروة للبحث عن الاتجاهات التي يمكن أن تدل على مكونات وسم الرائحة التي قد تشارك في الإشارة.
ويتمثل مواطن القوة الرئيسية لهذا النهج الحالي فيما يلي:
- نطاق أنواع العينة التي يمكن تحليلها.
- لا يلزم إعداد عينات معقدة أو استخراجها.
- القدرة على تحليل المكونات المتطايرة.
- القدرة على فصل مكونات الخليط.
- لتكون قادرة على تحديد المكونات المكتشفة.
- القدرة على تقديم معلومات شبه كمية وربما كمية عن المكونات المكتشفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع العينات
- عينة الروائح التي هي واحدة من ما يلي:
- جمع تلقائيا صدر عن مواضيع الدراسة معتاد (على سبيل المثال، الرئيسيات حديقة الحيوان) عن طريق وضع علامات رائحة على ورقة مرشح معقمة (على سبيل المثال، إفرازات رائحة رائحة الغدة الرائحة) أو مباشرة في قوارير (مثل البول).
- جمع عن طريق فرك مسحات القطن المعقمة بعد تدريب مواضيع الدراسة باستخدام التدريب التعزيز الإيجابي.
- جمع عن طريق فرك مسحات القطن المعقمة بعد التخدير من المواضيع الدراسية.
- وضع عينات في العقيمة 10 مل المسمار توج قوارير زجاجية واضحة، وختم مع قبعات المسمار تصدرت دمج FTFE / سيليكون سيبتا. تخزينها على الفور في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: من الضروري استخدام معدات الحماية الشخصية النظيفة، مثل قفازات النتريل؛ تغييرها بشكل متكرر; تجنب ملامسة الجلد مباشرة مع العينات والقنينات. ويفضل استخدام قارورة العلامة التجارية الجديدة. ومع ذلك ، في حالة استخدام قوارير ، من الضروري تنظيف القنينات مسبقا ، ثم استخدام نفس البروتوكول. - خذ الفراغات البيئية في كل مرة يتم فيها جمع علامات الرائحة. على سبيل المثال، جمع وسائط أخذ العينات (مثل ورقة التصفية أو المسحة) وقارورة مساحة الرأس المعرضة للبيئة أثناء أخذ العينات.
2. إعداد العينة
- إعداد عينات في الميدان عن طريق قطع مع شفرة مربع 10 ملم تقريبا من ورقة تصفية رائحة ملحوظ، أو رئيس مسحة، ووضعها في قارورة رأس الفضاء المسمار 10 مل تصدرت.
- بعد إعداد كل عينة، قم بالتخلص من النصل المستخدم لقطع وسائط أخذ العينات أو تنظيفه باستخدام مسح مناسب مضاد للبكتيريا و/أو الكحول وتجفيفه جيدا.
- تخزين جميع العينات في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: يفضل عند -20 درجة مئوية أو على خلاف ذلك منخفضة قدر الإمكان عمليا في الميدان.
3. التحضير للتحليل
- إزالة عينات من الثلاجة والسماح لتدفئة بشكل طبيعي لدرجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
- إعداد الأسلوب التحليلي على GC-MS كما يلي:
- بالنسبة لظروف تحليل SPME، اتبع توجيهات الشركة المصنعة لحالة ألياف SPME قبل الاستخدام الأول: الألياف قبل الحالة (260 درجة مئوية لمدة 5 دقائق)، واحتضان العينة (40 درجة مئوية لمدة دقيقتين)، ووقت الاستخراج (15 دقيقة)، ووقت الامتصاص (دقيقتان)، والألياف بعد الحالة (260 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة).
- استخدم شروط GC التالية: العمود (HP5-MS 30 م × 0.25 مم؛ العمود 30 م × 0.25 مم؛ العمود 30 م × 0.25 مم؛ العمود 30 م × 0.25 مم؛ العمود 30 م × 25 مم؛ 0.25 ميكرومتر)، درجة حرارة المحقن (270 درجة مئوية)، معدل التدفق (1 مل/دقيقة)، وضع الحقن (بدون تقسيم)، ملف تعريف الفرن GC (45 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 4 درجات مئوية/دقيقة إلى 170 درجة مئوية؛ 20 درجة مئوية/دقيقة إلى 300 درجة مئوية)، خط نقل MSD (280 درجة مئوية).
ملاحظة: لتحسين بين تناسق وقت الاحتفاظ العينة الأسلوب التحليلي هو وقت الاستبقاء مؤمن). - استخدم شروط MSD التالية: تأخير المذيبات (2.5 دقيقة) ونطاق المسح الضوئي (29 إلى 400amu).
ملاحظة: تم استخدام نطاق من 10 إلى 400 في البروتوكولات السابقة4.
- تأكد من تشغيل إمدادات غاز التطهير لوحدة تكييف الألياف.
ملاحظة: من الضروري أن يتم تثبيت تجميع SPME بشكل صحيح في العينات التلقائية ومحاذاته إلى صواني العينات التلقائي وحدة تكييف الألياف ومنفذ مدخل GC. قد يؤدي المحاذاة غير صحيحة في تلف أو إتلاف الألياف SPME.
4. تحليل
- ضع قارورة مساحة رأس فارغة (لتكون بمثابة نظام فارغ) في الموضع الأول من علبة العينات التلقائي GC-MS. ضع البيئة فارغة في الموضع الثاني من علبة العينات التلقائي. ضع العينات للتحليل في المواضع اللاحقة لعلبة العينة التلقائية.
- إنشاء تسلسل تحليلي لتحليل كل عينة داخل علبة العينة.
- في الشاشة الرئيسية MassHunter، حدد تسلسل | تسلسل التحميل.
- أكمل جدول التسلسل لكافة الفراغات والعينات عن طريق إدراج المعلومات المناسبة. حفظ جدول التسلسل المكتمل.
ملاحظة: المعلومات الدقيقة لجدول التسلسل سوف تعتمد على المختبرات تنسيق الجدول. تتضمن المعلومات الدنيا عادة نوع العينة واسم العينة وموقع القارورة ورقمها وطريقة التحليل وموقع ملف البيانات واسمها (تخصيص اسم ملف بيانات يطابق اسم العينة يساعد على معالجة البيانات في المستقبل). يمكن إضافة عينات إضافية إلى التسلسل أثناء التحليل.
- تشغيل التسلسل عن طريق تحديد تسلسل | تشغيل تسلسل.
- بعد تحليل إعادة عينات إلى الثلاجة في أقرب وقت ممكن.
ملاحظة: قد يكون من الممكن إعادة تحليل العينات، ولكن تجدر الإشارة إلى أن بعض المكونات المتطايرة قد تكون استخرجت تماما أثناء التحليل الأولي وبعض المركبات قد تكون خضعت للتحلل الحراري والبكتيري عند 40 درجة مئوية، وبالتالي فإن اللونية الناتجة قد لا تكون ممثلة تماما لوضع علامات الرائحة الأصلية.
5. تحليل البيانات
ملاحظة: يتضمن تحليل البيانات الأولي تكامل الكروماتوجرامات للحصول على بيانات وقت الاحتفاظ ومساحة الذروة إلى جانب التحديد المؤقت للقمم باستخدام برنامج ChemStation وقواعد بيانات الطيف الكتلي NIST (المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا) ، الإصدار MSD F.01.01.2317. ويمكن إجراء تحليل البيانات إما يدويا أو بطريقة شبه آلية. إذا تم استخدام الأسلوب شبه الآلي ثم أنه من المفيد في بعض الأحيان لإجراء درجة من التحليل اليدوي للبيانات للتحقق من تحديد الهوية المؤقتة.
- افتح ملف البيانات بالنقر فوق الملف المناسب في شريط التنقل الأيسر. سيتم عرض الرسم اللوني الأيوني الكلي (TIC) في النافذة العلوية لشاشة تحليل البيانات.
- لدمج TIC باستخدام متكامل RTE، حدد الكروماتوجرام | دمج.
- ضبط معلمات التكامل بحيث تتكامل القمم التي تزيد عن 3 × ضجيج الأساس. حدد | الكروماتوجرام معلمات تكامل إشارة MS. في مربع الإخراج ضبط منطقة الذروة الحد الأدنى حسب الاقتضاء (1.0 تنتج نتائج مقبولة في الأمثلة لدينا).
- لتحديد القمم وإنشاء تقرير موجز، حدد تصدير التقارير | تقرير نتائج البحث في المكتبة إلى XLS.
ملاحظة: يجب أن تكون المكتبات الطيفية المطلوب البحث فيها مع عدد مطابقات المكتبة التي سيتم عرضها محددة مسبقا داخل البرنامج قبل إجراء بحث في المكتبة. - يحتوي تقرير جدول البيانات الناتج على بيانات تكامل لكل ذروة ومطابقة مكتبة طيفية مبدئية لتعيين الهوية. بشكل عام، يجب أن تكون مطابقة جودة المكتبة/المكتبة >80 لقبول التعريف المؤقت. حفظ جدول البيانات.
- تحديد الذروة مباشرة من TIC.
- اختر ذروة الاهتمام.
- إذا كانت الذروة صغيرة، قم بتكبير الصورة برسم مربع حول القمة عن طريق الضغط على زر الماوس الأيسر لأسفل، ثم قم بتمديد المربع فوق القمة وحرره.
- ضع خط المؤشر بحيث يكون عند أعلى نقطة في الذروة (أو بعد ذلك مباشرة).
- انقر نقرا مزدوجا فوق زر الماوس الأيمن وسيظهر طيف الكتلة للذروة في النافذة السفلية لشاشة تحليل البيانات.
- للبحث في المكتبة الطيفية، حرك المؤشر في أي مكان في النافذة الطيفية وانقر نقرا مزدوجا فوق زر الماوس الأيمن. ستظهر نتائج البحث في المكتبة في إطار جديد.
- لإزالة الضوضاء الخلفية من طيف من الاهتمام، انقر أولا مرتين على زر الماوس الأيمن على الذروة المعنية. ثم انقر نقرا مزدوجا فوق زر الماوس الأيمن في منطقة لا توجد فيها قمم مباشرة أمام ذروة الاهتمام. حدد | الكروماتوجرام طرح الأطياف. سيتم عرض الطيف المطروح في الإطار السفلي من شاشة تحليل البيانات وسيتم عرض '(-)' بجانب بيانات المسح الضوئي في رأس النافذة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد هذا البروتوكول، حددنا مبدئيا ما مجموعه 32 مركبا كيميائيا متطايرا من تحليل 14 علامة رائحة أنو-تناسلية تم إطلاقها تلقائيا على ورق التصفية بواسطة الليمور الأحمر(Varecia variegata rubra)وقارننا ملامح الرائحة مع ميزات signaler12. وكانت المركبات المتطايرة التي تحدث بشكل طبيعي، مثل الهيدروكربونات والتربينات والكحولات التيربين والكيتونات، موجودة ضمن هذه الملامح وشملت مركبات كان قد وجد سابقا أنها تعمل كفيرومونات جنسية وإشارات للياقة البدنية في أنواع حيوانية أخرى. يتم سرد المركبات التي تم تحديدها بشكل مؤقت في الجدول 1. تظهر الكروماتوجرامات التمثيلية (1 من عنصر تحكم و1 من علامة رائحة الليمور) في الشكل 1. وتباين عدد المكونات ووفرتها النسبية من عينة إلى عينة عبر مواضيع دراسية مختلفة. ومع ذلك، كانت ستة مركبات (البنزالدهيد، 2-إيثيل-1-هيكسانول، ف كريسول، cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol، 2-pinen-4-one، بنتاديكان) موجودة في جميع العينات.
وتشير نتائج هذه الدراسة إلى أن الليمور الأحمر يستخدم وسم الرائحة لنقل المعلومات عن الجنس وعمر الإناث، مع لعب وسم الأعضاء التناسلية للأنو دورا في التواصل الاجتماعي والجنسي.
وكانت النتيجة التمثيلية الأخرى بعد استخدام هذا البروتوكول دراستنا لإعلان الخصوبة من قبل الزيتون الأنثوية(Papio anubis)(Vaglio وآخرون. بيانات غير منشورة). حددنا ما مجموعه 74 مركبا متطايرا من تحليل 385 عينة رائحة مهبلية من البابون. وشملت هذه المركبات مجموعة من المركبات المتطايرة ذات الرائحة الطبيعية مثل الكيتونات والكحول والألدهيدات والتربينات والأحماض الدهنية المتطايرة والهيدروكربونات. تظهر الكروماتوجرامات النموذجية المستخدمة لمقارنة التحكم الفارغ وعينات رائحة البابون المهبلية الأنثوية من الفترات الخصبة وغير الخصبة في الشكل 2. فحصنا العلاقات بين ملامح رائحة المهبل والتقبل الجنسي للقرود الإناث. أظهرت نتائجنا أن الكمية الإجمالية للرائحة المهبلية تختلف مع الخصوبة مما يشير إلى أن الرائحة قد تلعب دورا في الإشارة إلى خصوبة البابون الأنثوي. وجدنا أيضا اختلافات في رائحة المهبل بين أنواع المجموعات ولكن لم نتمكن من التمييز بين آثار تكوين المجموعة وعمر الإناث والتكافؤ.
الشكل 1. مثال على الكروماتوجرامات؛ (أعلى اللوني -'control') عينة التحكم، وتبين الملوثات؛ (أسفل الكروماتوجرام -'الليمور رائحة علامة') واحدة من الإناث البالغين الحمراء ruffed الليمور أنو الأعضاء التناسلية رائحة إفرازات، والتي تظهر الملوثات والمركبات البيولوجية ذات مغزى. وتشير الأسهم الحمراء إلى المركبات البيولوجية الستة ذات المغزى التي وجدت في جميع العينات: (أ) البنزالدهيد؛ (ب) المركبات البيولوجية ذات الأهمية؛ (ج) المركبات البيولوجية ذات الأهمية؛ (ج) المركبات البيولوجية ذات الأهمية؛ (ج) المركبات البيولوجية ذات الأهمية؛ (ج) ال (ب) 2-إيثيل-1هيكسانول؛ (ج) ع كريسول؛ (د) رابطة الدول المستقلة - ف - منثا - 2،8 - dien - 1 - رأ ؛ (ه) 2-باين-4-واحد؛ (و) البنتادكان. وقد تم تعديل هذا الرقم من جاندا وآخرون12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مثال على ذلك الكروماتوجرام من (أعلى الكروماتوغرافي -'control') عينة التحكم، التي تبين الملوثات؛ (متوسط اللوني -'بابون رائحة غير خصبة') أنثى بابون الزيتون، عينة رائحة المهبل من فترة غير خصبة؛ و (أسفل الكروماتوغرام -'بابون رائحة خصبة') أنثى بابون الزيتون، عينة رائحة المهبل من فترة خصبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وقت الاستبقاء (دقائق) | معرف المركب المؤقت | وزن جزيئي |
| 3.906 | سداسية | 100 |
| 6.057 | 5-ميثيل-3-هيكسانون | 114 |
| 7.413 | ألفا باين | 136 |
| 8.077 | 1-ايزوبروبيل-4-ميثيلينبيسكلو[3.1.0]hex-2-one | 134 |
| 8.268 | بنزالدهيد | 106 |
| 8.623 | 3,7,7-تريميثيل-1,3,5-سيكلوهبتاتريتريسين | 134 |
| 9.096 | الفينول | 94 |
| 9.269 | 6-ميثوكسي-5-هيبتن-2-واحد | 126 |
| 10.72 | 2-إيثيل-1-هيكسانول | 130 |
| 12.362 | ف كريسول | 108 |
| 12.553 | رابطة الدول المستقلة فيربنول | 152 |
| 13.385 | رابطة الدول المستقلة ف منثا-2،8-dien-1-رأ | 152 |
| 14.104 | 1,7,7-تريميثيلبيكلو[2.2.1]هيبتا-2-واحد | 152 |
| 14.536 | ل بينوكارفيول | 152 |
| 14.791 | ترانس فيربنول | 152 |
| 15.605 | ع إيثيل فينول | 122 |
| 15.928 | تيربينين-4-رأ | 154 |
| 16.415 | ألفا تيربينول | 154 |
| 16.615 | ميرتينول | 152 |
| 17.047 | 2-بين-4-واحد | 150 |
| 18.252 | كارفون | 150 |
| 19.217 | ف منثا-1,8-دين-3-واحد | 150 |
| 23.283 | 4,7,7-تريميثيلبيكلو[4.1.0]hept-3-ene-2-one | 150 |
| 23.443 | تيتريدكان | 198 |
| 25.094 | جيرانيليستون | 194 |
| 25.899 | يسوميثيليون | 206 |
| 26.513 | بينتادكان | 212 |
| 30.871 | 2,6,10-تريميثيلبينتديكان | 254 |
| 32.208 | هيبتاديكان | 240 |
| 32.372 | 2,6,10-تريميثيلهيكساديكان | 268 |
| 34.446 | ن تتراكوسان | 338 |
| 34.591 | 2,6,10,14-تتراميتيلهيكساديكان | 282 |
الجدول 1 - الجداول المركبات المتطايرة الموجودة في عينات ورق التصفية من إفرازات رائحة الليمور الأنو التناسلية ذات الرافد الأحمر التي تم تحديدها بشكل مؤقت باستخدام برنامج ChemStation وقواعد بيانات الطيف الكتلي NIST ، الإصدار MSD F.01.01.2317. تم تعديل هذا الجدول من جاندا وآخرون12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واستخدام عينات المراقبة، سواء الضوابط البيئية التي أنشئت وقت جمع العينات أو فراغات النظام، أمر حاسم لتفسير عينات علامات الرائحة. وينبغي استبعاد أي قمم تعزى إلى بيئة أخذ العينات أو النظام الآلي من عينات علامات الرائحة بحيث لا يدرج في أي تفسير سوى ذروة الاهتمام. ويمكن لهذه الضوابط أيضا أن تلعب دورا في تقييم ورصد "صحة" الأجهزة.
يتضمن البروتوكول خطوات لحالة الألياف قبل وبعد كل عملية استخراج. يتم إجراء ذلك أسهل باستخدام العينات التلقائية ويضمن عدم وجود تلوث متقاطع من عينة إلى عينة.
ويتعلق القيد الرئيسي للمنهجية بالعينات نفسها. بعد جمع، من المهم أن يتم تخزينها ونقلها بشكل مناسب. فالمكونات ذات الاهتمام المحدد متقلبة، ويمكن أن تضيع بسهولة، أو تتغير تركيزاتها. حاليا يتم تخزين العينات ونقلها المجمدة، وعادة في -20 درجة مئوية. ونتيجة لذلك، هناك تكلفة كبيرة في تخزين ونقل هذه العينات. ومن المتوقع أن يؤدي التأخير في نقل العينات إلى المختبر لتحليلها إلى زيادة هذه التكاليف، وقد يؤثر على النتائج التي يتم الحصول عليها من علامات الرائحة. ويلزم إجراء مزيد من البحوث لفهم أثر الوقت والتخزين على النتائج التحليلية التي تم الحصول عليها من العينات. وبما أن المكونات ذات الأهمية الخاصة هي المكونات الأكثر تقلبا لعلامات الرائحة، فمن الممكن أن تغير مستويات هذه المكونات جمع عينات ما بعد. قد تحتاج أيضا إلى النظر في الآثار البكتيرية المحتملة داخل بعض أنواع العينة. على سبيل المثال، في اختبار الكحول لعينات البول، البكتيريا الموجودة في البول قد تنتج الكحول وبالتالي زيادة مستويات الكحول المكتشفة.
وتفي المنهجية الحالية بجميع المتطلبات المبينة سابقا. وهو يوفر نتائج ذات نوعية جيدة يتم من خلالها الحصول على مزيد من المعلومات حول تكوين علامات الرائحة. ومع ذلك، فإن التحليل هو تقنية مختبرية تعتمد على العينات التي يتم تقديمها إلى المختبر. ويتمثل أحد الحلول المحتملة لهذا القيد في استخدام أجهزة محمولة من نوع GC-MS، وهي أدوات يمكن أخذها إلى الميدان الذي تؤخذ فيه العينات. ومن شأن هذا النهج أن يخفف من الحاجة إلى تخزين العينات ونقلها، وأن يمكن من إجراء تحليل في الوقت الحقيقي لعلامات الروائح التي يحتمل أن توفر معلومات أكبر عن أكثر المكونات تقلبا في العلامات. تتوفر عدة أجهزة GC-MS محمولة. وهي تستخدم تكنولوجيا مختلفة عن تلك الموجودة في الأجهزة المختبرية، ولكن ينبغي أن توفر نتائج مماثلة. ولا يزال استخدام تقنية استخراج HS-SPME قابلا للتطبيق. غير أن هذه الأدوات، نتيجة لوقوعها في الأجهزة المحمولة، لا تتيح خيار إدخال العينة آليا؛ بل إنها تتيح إمكانية استخدامها في الأدوات التي يمكن استخدامها في استخدامها. ومع ذلك، إذا تم تحليل العينات بمجرد جمعها، فمن المرجح أن تكون أرقام العينات اليومية قابلة للإدارة للحقن اليدوي. أيضا، في حالة استخراج الحقل، ينبغي الحرص على أن الألياف SPME لا فخ المواد الكيميائية البيئية قبل الاستخدام. والأدوات المتاحة حاليا مزودة ببطارية تمكن من قابلية النقل الكلية، ولكن مع توفير شكل من أشكال الإمداد بالطاقة (حتى مولد صغير)، يمكن تشغيل هذه الأجهزة لفترات أطول من الزمن. وغالبا ما تصمم هذه الصكوك بطبيعتها بحيث تكون بسيطة التشغيل، مع الحد الأدنى من التدريب والمعرفة المطلوبة. وهذا يعني أنه قد لا يكون من الضروري نشر المشغلين المدربين تدريبا عاليا باستخدام الجهاز وأنه يمكن تشغيلها من قبل أولئك الذين يجمعون العينات. ويمكن تحقيق تفسير مفصل للنتائج التحليلية عن بعد أو عندما يعود الصك إلى القاعدة.
وهناك قيد رئيسي آخر مع أساليب استخدام ألياف SPME هو أنه من الممكن تحليل المركبات الكيميائية فقط الموجودة بوفرة في العينات. على وجه الخصوص ، توجد كميات أكبر بكثير من المادة الكيميائية في العينات حتى عندما تكون كمية الجزيئات تحت الحيازة للتحليل باستخدام ألياف SPME. وبالإضافة إلى ذلك، في سياق إفرازات الرائحة التي تطلقها علامات رائحة الحيوانات وغيرها من الإشارات الكيميائية الحيوانية، تميل الحيوانات الفردية إلى استخدام المركبات الكيميائية بكميات صغيرة للتواصل مع الحيوانات الأخرى و/أو الكشف عن الإشارات الشمية من المواد. وبعبارة أخرى، قد تمثل العروض المختلفة للأنوف الحيوانية واستخراج SPME تحديا كبيرا لنجاح تقنية أخذ العينات هذه.
ويمكن أن يستند تطوير المنهجية الحالية في المستقبل إلى جمع العينات مع التحقيق في استخدام مواد ماصة بديلة أو أنابيب ماصة لاستخدامها مع نظم الامتصاص الحراري. وقد تسهم هذه التطورات في المساعدة على تخزين العينات وظروف النقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر كيث القابضة لمساعدته في التحليلات الكيميائية في مركز روزاليند فرانكلين للعلوم، ولفرهامبتون، وبن مانتل لإنتاج الفيديو. كما أننا ممتنون للبروفيسور غلوريانو مونيتي والدكتور جوزيبي بيراكسيني وأعضاء مركز قياس الطيف الكتلي في جامعة فلورنسا، فلورنسا، وللبروفيسور لوكا كالاماي والدكتور ماركو ميشيلوزي من مختبر ARCA التابع للمجلس الوطني للمقاومة في فلورنسا، لمساعدتهم في وضع هذه المنهجية. تم دعم المشاريع البحثية التي شملت أساليب أخذ العينات والتحليل الموصوفة في المخطوطة من قبل زمالتين ماري Skłodowska-Curie Intra الأوروبية (معرفات اتفاقية المنح: 327083 ، 703611) ، ومنحة صغيرة ('الرئيسيات المخصب الحسية') من جمعية الرئيسيات في بريطانيا العظمى ، ومنحة بحثية صغيرة ('هل لدى الصيادين وجامعي الثمار حاسة شم خاصة؟') من الأكاديمية البريطانية / صندوق ليفرهولم إلى S.V. كما تلقى العمل المختبري اللازم لإعداد هذه المنهجية تمويلا من مسابقة التمويل السنوية لكلية العلوم والهندسة (ولفرهامبتون) إلى S.V.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | - | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | - | Excel |
| Spectral library | NIST | - | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | - | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
