Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Bemonstering en analyse van geursignalen van dieren

Published: February 13, 2021 doi: 10.3791/60902
* These authors contributed equally

Summary

We hebben een effectieve methodologie ontwikkeld voor het bemonsteren en analyseren van geursignalen om te begrijpen hoe ze kunnen worden gebruikt in diercommunicatie. In het bijzonder gebruiken we headspace solid-phase microextractie in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie om de vluchtige componenten van dierlijke geuren en geurmarkeringen te analyseren.

Abstract

We hebben een effectieve methodologie ontwikkeld voor het bemonsteren en analyseren van geursignalen, door gebruik te maken van headspace solid-phase microextractie in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie, om te begrijpen hoe ze kunnen worden gebruikt in dierlijke communicatie. Deze techniek maakt de semi-kwantitatieve analyse van de vluchtige componenten van geurafscheidingen mogelijk door de scheiding en voorlopige identificatie van de componenten in het monster mogelijk te maken, gevolgd door de analyse van piekgebiedverhoudingen om te zoeken naar trends die verbindingen kunnen betekenen die betrokken kunnen zijn bij signalering. De belangrijkste sterke punten van deze huidige aanpak zijn het bereik van steekproeftypen die kunnen worden geanalyseerd; het ontbreken van een complexe monstervoorbereiding of extracties; het vermogen om de componenten van een mengsel te scheiden en te analyseren; de identificatie van de gedetecteerde componenten; en de mogelijkheid om semi-kwantitatieve en potentieel kwantitatieve informatie te verstrekken over de gedetecteerde componenten. De belangrijkste beperking van de methodologie heeft betrekking op de monsters zelf. Aangezien de componenten van specifiek belang volatiel zijn en deze gemakkelijk verloren kunnen gaan of hun concentraties kunnen worden gewijzigd, is het belangrijk dat de monsters na het verzamelen op de juiste manier worden opgeslagen en vervoerd. Dit betekent ook dat de opslag- en transportomstandigheden van monsters relatief duur zijn. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid aan monsters (waaronder urine, uitwerpselen, haar en geur-klier geur afscheidingen). Deze geuren bestaan uit complexe mengsels, die voorkomen in een reeks matrices, en vereisen dus het gebruik van technieken om de afzonderlijke componenten te scheiden en de verbindingen van biologisch belang te extraheren.

Introduction

Er is zeer weinig bekend over de chemische veranderingen die ten grondslag liggen aan de reuksignalen bij dieren1, ook vanwege methodologische uitdagingen bij het registreren en kwantificeren van vluchtige chemische profielen van geuren2. Er zijn verschillende mogelijke valkuilen bij het werken met zeer complexe, chemische matrices; deze omvatten bij het bemonsteren en analyseren van de geurmonsters3.

In het Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, zijn we bezig met de analyse van geuren en geurmerken om te begrijpen hoe ze door dieren kunnen worden gebruikt. We combineren semiochemie met gedragsecologie, endocrinologie en cytologie om ons begrip van de rol van reuksignalen in dierlijke communicatie te verbeteren.

We hebben een methodologie ontwikkeld en vervolgens geuren en markeringen geanalyseerd van verschillende soorten, waaronder verschillende niet-menselijke primaten (d.w.z. gekroonde maki's, roodharige maki's, Japanse makaken, olijfbavianen, chimpansees) en andere zoogdieren (d.w.z. katten, koeien). We hebben een verscheidenheid aan monsters verzameld en geanalyseerd, waaronder urine, uitwerpselen, haar en geur-klier geur afscheidingen. Deze geuren en geurmerken bestaan uit complexe mengsels van verbindingen en daarom moet elke methodologie die voor hun analyse wordt gebruikt, een vorm van separatorietechniek bevatten. Zoals geïllustreerd, komen ze ook voor in een reeks matrices die het gebruik van technieken vereisen om de componenten van belang te extraheren.

Eerdere studies van Vaglio et al.4 en andere auteurs5 gebruikten dynamische headspace-extractie (DHS) met gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), terwijl ook directe oplosmiddelextractie6 en complexe oplosmiddelextracties7 zijn gebruikt. Bij dynamische headspacebemonstering gaat het met name om het zuiveren van de headspace met een bekend volume inert gas dat uiteindelijk alle vluchtige stoffen verwijdert, met uitzondering van die welke een sterke affiniteit voor de monstermatrix vertonen (bijvoorbeeld polaire verbindingen in waterige monsters).

Voor de huidige methodologie hebben we de techniek van headspace solid-phase microextractie (HS-SPME) in combinatie met GC-MS overgenomen. In het bijzonder hebben we de methodologie ontwikkeld en verbeterd die al door Vaglio et al. werd gebruikt in zijn vorige GC-MS-laboratorium8,9,10.

Oplosmiddelloze extractietechnieken zijn zeer effectief voor het analyseren van kleine, zeer vluchtige verbindingen (die anders gemakkelijk uit een monster kunnen worden verloren) omdat deze methoden verbindingen immobiliseren op een stabiele, solide faseondersteuning. De HS-SPME maakt gebruik van een vezel bedekt met een adsorberend polymeer om vluchtige stoffen in de monsterhoofdruimte op te vangen of om opgeloste verbindingen te extraheren door onderdompeling in een waterige biologische vloeistof11. De polymeercoating bindt de verbindingen niet sterk, daarom kunnen ze door verhitting in de injectiepoort van de GC worden verwijderd. Deze methode is krachtiger dan oplosmiddelextractietechnieken en ook effectiever dan DHS.

In de huidige aanpak zitten monsters in glazen flacons. Deze flacons worden opgewarmd tot een temperatuur van 40 °C om de lichaamstemperatuur van de dieren te simuleren om de vluchtige componenten van de geurmarkering te bevorderen om de hoofdruimte van de flacon in te nemen. Een SPME-vezel, bedekt met 65 μm polydimethylsiloxaan/divinylbenzeen (PDMS/DVB) sorbentmateriaal, wordt blootgesteld aan de headspace-omgeving en vluchtige componenten uit het monster worden op de vezel geadsorbeerd. Bij het verwarmen van de vezel in de inlaatpoort van een GC-MS worden de vluchtige componenten uit de vezel gedesorbeerd en vervolgens gescheiden door de GC. Massaspectrale fragmentatiepatronen worden verkregen voor elk onderdeel met behulp van de MS. Door deze massaspectra te vergelijken met massaspectraal databases, kan het mogelijk zijn om voorlopig de componenten van het geurmerk te identificeren. Door het gebruik van een auto-sampler zijn we in staat om meerdere samples in batches op een consistente manier te analyseren.

Aangezien elk type SPME-vezel een andere affiniteit heeft met polaire chemicaliën, wordt de vezel meestal gekozen afhankelijk van de polariteit en/ of het molecuulgewicht van de doelchemische verbindingen. Bovendien worden de GC-omstandigheden gewijzigd afhankelijk van het type GC-kolom en de kenmerken van de doelchemische verbindingen.

Deze techniek maakt de semi-kwantitatieve analyse van de vluchtige componenten van geurmarkeringen mogelijk door de scheiding en voorlopige identificatie van de componenten in het monster mogelijk te maken, gevolgd door de analyse van piekgebiedverhoudingen om te zoeken naar trends die componenten van de geurmarkering kunnen betekenen die betrokken kunnen zijn bij signalering.

De belangrijkste sterke punten van deze huidige aanpak zijn:

  • Het bereik van voorbeeldtypen die kunnen worden geanalyseerd.
  • Er zijn geen complexe monstervoorbereidingen of extracties nodig.
  • Het vermogen om vluchtige componenten te analyseren.
  • De mogelijkheid om de componenten van een mengsel te scheiden.
  • Om de gedetecteerde componenten te kunnen identificeren.
  • De mogelijkheid om semi-kwantitatieve en potentieel kwantitatieve informatie te verstrekken over de gedetecteerde componenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Monsterverzameling

  1. Monstergeuren die een van de volgende zijn:
    1. Verzamel spontaan vrijgegeven door gewennende proefpersonen (bijv. dierentuin primaten) via geurmarkering op steriel filterpapier (bijv. geur-kliergeurafscheidingen) of rechtstreeks in flacons (bijv. urine).
    2. Verzamel door steriele wattenstaafjes te wrijven na de training van proefpersonen met behulp van positieve versterkingstraining.
    3. Verzamelen door steriele wattenstaafjes te wrijven na sedatie van proefpersonen.
  2. Plaats monsters in steriele 10 ml schroefgedoppen doorzichtige glazen flacons en sluit af met schroefdoppen met FTFE/siliconen septa. Bewaar ze onmiddellijk bij -20 °C.
    OPMERKING: Het is van vitaal belang om schone persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken, zoals nitrilhandschoenen; ze regelmatig te wijzigen; vermijd direct huidcontact met monsters en flacons. Het verdient de voorkeur om gloednieuwe flacons te gebruiken; in het geval van gebruikte flacons is het echter van vitaal belang om de flacons vooraf schoon te maken en vervolgens hetzelfde protocol te gebruiken.
  3. Neem omgevingsvlekken elke keer dat geurvlekken worden verzameld. Verzamel bijvoorbeeld de bemonsteringsmedia (bijv. filterpapier of wattenstaafje) en een flacon met hoofdruimte die tijdens de bemonstering aan de omgeving worden blootgesteld.

2. Monstervoorbereiding

  1. Bereid monsters in het veld voor door met een mes een vierkant van ongeveer 10 mm van een met geur gemarkeerd filterpapier of de kop van het wattenstaafje te snijden en in een flacon met schroefruimte van 10 ml te plaatsen.
  2. Nadat elk monster is bereid, verwijdert of reinigt u het mes dat wordt gebruikt om de bemonsteringsmedia te snijden met een geschikt antibacterieel doekje en/of alcohol en droogt u het grondig.
  3. Bewaar alle monsters bij -20 °C.
    OPMERKING: Voorkeur bij -20 °C of anderszins zo laag mogelijk in het veld.

3. Voorbereiding op de analyse

  1. Haal de monsters uit de vriezer en laat het op natuurlijke wijze opwarmen tot kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
  2. Stel de analysemethode op de GC-MS als volgt in:
    1. Volg voor SPME-analyseomstandigheden de aanwijzingen van de fabrikant om SPME-vezels voor het eerste gebruik te conditioneren: vezelvoorconditionering (260 °C gedurende 5 min), monster incubatie (40 °C gedurende 2 min), extractietijd (15 min), desorptietijd (2 min) en vezel na de conditie (260 °C gedurende 20 min).
    2. Gebruik de volgende GC-omstandigheden: kolom (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), injectortemperatuur (270 °C), debiet (1 ml/min), injectiemodus (splitless), GC-ovenprofiel (45 °C gedurende 2 min; 4 °C/min tot 170 °C; 20 °C/min tot 300 °C), MSD-overdrachtsleiding (2°C).
      OPMERKING: Om de consistentie van de bewaartijd van het monster te verbeteren, is de analysemethode retentietijd vergrendeld).
    3. Gebruik de volgende MSD-omstandigheden: oplosmiddelvertraging (2,5 min) en scanbereik (29 tot 400 amu).
      OPMERKING: In de vorige protocollen4werd een bereik van 10 tot 400 gebruikt.
  3. Zorg ervoor dat de spoelgastoevoer naar de vezelconditioneringseenheid is ingeschakeld.
    OPMERKING: Het is van vitaal belang dat de SPME-assemblage correct in de auto-sampler is geïnstalleerd en dat deze is uitgelijnd op de auto-sampler trays, fiber conditioning unit en GC inlaatpoort. Onjuiste uitlijning kan leiden tot beschadiging of vernietiging van de SPME-vezel.

4. Analyse

  1. Plaats een lege flacon met hoofdruimte (om als systeem leeg te fungeren) in de eerste positie van de GC-MS auto-sampler lade. Plaats de milieu blank in de tweede positie van de auto-sampler tray. Plaats de monsters voor analyse in de volgende posities van de lade voor automatisch monster.
  2. Maak een analytische volgorde om elk monster in de monsterlade te analyseren.
    1. Selecteer In het startscherm van MassHunter Sequence | Laadvolgorde.
    2. Vul de volgtabel voor alle spaties en monsters in door de juiste informatie in te voegen. Sla de voltooide volgtabel op.
      OPMERKING: De exacte informatie voor de volgtabel is afhankelijk van de opmaak van de laboratoria voor de tabel. Minimale informatie omvat normaal gesproken het monstertype, de monsternaam, de locatie en het nummer van de flacon, de analysemethode en de locatie en naam van het gegevensbestand (toewijzing van een gegevensbestandnaam die overeenkomt met de voorbeeldnaam helpt toekomstige gegevensverwerking). Tijdens de analyse kunnen extra monsters aan de reeks worden toegevoegd.
  3. Voer de reeks uit door | Reeks uitvoeren.
  4. Breng na analyse de monsters zo snel mogelijk terug in de vriezer.
    OPMERKING: het is mogelijk om monsters opnieuw te analyseren, maar er moet worden opgemerkt dat sommige vluchtige componenten tijdens de eerste analyse volledig zijn geëxtraheerd en dat sommige verbindingen thermische en bacteriële afbraak bij 40 °C hebben ondergaan, zodat het resulterende chromatogram mogelijk niet grondig representatief is voor de oorspronkelijke geurmarkering.

5. Gegevensanalyse

OPMERKING: De eerste gegevensanalyse omvat de integratie van chromatogrammen om retentietijd- en piekgebiedgegevens te verkrijgen, samen met voorlopige identificatie van pieken met behulp van ChemStation-software en NIST (National Institute of Standards and Technology) massaspectraal databases, versie MSD F.01.01.2317. Data-analyse kan handmatig of via een semi-geautomatiseerde methode worden uitgevoerd. Als de semi-geautomatiseerde methode wordt gebruikt, is het soms nuttig om een zekere mate van handmatige gegevensanalyse uit te voeren om voorlopige identificaties te verifiëren.

  1. Open het gegevensbestand door op het juiste bestand in de linkernavigatiebalk te klikken. Het totale ionenchromatogram (TIC) wordt weergegeven in het bovenste venster van het scherm voor gegevensanalyse.
  2. Als u de TIC wilt integreren met behulp van de RTE-integrator, selecteert u Chromatogram | Integreren.
  3. Pas integratieparameters aan zodat pieken die groter zijn dan 3 x basislijnruis worden geïntegreerd. Selecteer Chromatogram | MS-signaalintegratieparameters. Pas in het uitvoervak het minimale piekgebied aan indien van toepassing (1.0 levert in onze voorbeelden acceptabele resultaten op).
  4. Als u pieken wilt identificeren en een overzichtsrapport wilt genereren, selecteert u Rapporten exporteren | Zoekresultaten bibliotheek rapporteren aan XLS.
    OPMERKING: De spectrale bibliotheken die moeten worden doorzocht, samen met het aantal bibliotheekmatches dat moet worden weergegeven, moeten in de software worden ingesteld voordat een bibliotheekzoekopdracht kan worden uitgevoerd.
  5. Het resulterende spreadsheetrapport bevat integratiegegevens voor elke piek en een voorlopige spectrale bibliotheekmatch om identiteit toe te wijzen. Normaal gesproken moet de overeenkomst tussen bibliotheekkwaliteit en bibliotheek worden >80 om de voorlopige identificatie te accepteren. Sla de spreadsheet op.
  6. Identificeer een piek rechtstreeks vanuit de TIC.
    1. Kies de piek van interesse.
    2. Als de piek klein is, zoomt u in door een vak rond de piek te tekenen door de linkermuisknop ingedrukt te houden, het vak over de piek te strekken en los te laten.
    3. Plaats de cursorlijn zo dat deze zich op het hoogste punt van de piek (of net erna) bevindt.
    4. Dubbelklik op de rechtermuisknop en het massaspectrum voor de piek verschijnt in het onderste venster van het gegevensanalysescherm.
    5. Als u de spectrale bibliotheek wilt doorzoeken, verplaatst u de cursor ergens in het spectrale venster en dubbelklikt u op de rechtermuisknop. De zoekresultaten van de bibliotheek worden in een nieuw venster weergegeven.
    6. Om de achtergrondruis uit een interessant spectrum te verwijderen, dubbelklikt u eerst op de rechtermuisknop op de betreffende piek. Dubbelklik vervolgens op de rechtermuisknop in een gebied zonder pieken direct voor de piek van interesse. Selecteer Chromatogram | Trek spectra af. Het afgetrokken spectrum wordt weergegeven in het onderste venster van het gegevensanalysescherm en geeft '(-)' weer naast de SCAN-gegevens in de vensterkop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Volgens dit protocol identificeerden we voorlopig in totaal 32 vluchtige chemische stoffen uit de analyse van 14 ano-genitale geursporen die spontaan op filterpapier werden vrijgegeven door rood-ruches maki's (Varecia variegata rubra) en vergeleken geurprofielen met kenmerken van de signaalgever12. Natuurlijk voorkomende vluchtige stoffen, zoals koolwaterstoffen, terpenen, terpeenalcoholen en ketonen, waren aanwezig in deze profielen en omvatten verbindingen die eerder waren gevonden als geslachtsferomonen en aanwijzingen voor fitheid bij andere diersoorten. De voorlopig geïdentificeerde verbindingen zijn opgenomen in tabel 1. Representatieve chromatogrammen (1 van een controle en 1 van een makigeurmerk) zijn weergegeven in figuur 1. Het aantal en de relatieve overvloed van de componenten varieerden van steekproef tot steekproef over verschillende studieonderwerpen. In alle monsters waren echter zes verbindingen (benzaldehyde, 2-ethyl-1-hexanol, p-cresol, cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol, 2-pinen-4-one, pentadecane) aanwezig.

De resultaten van deze studie suggereerden dat roodharige maki's geurmarkering gebruiken om informatie over seks en vrouwelijke leeftijd over te brengen, waarbij ano-genitale markering een rol speelt in sociaal-seksuele communicatie.

Een ander representatief resultaat na het gebruik van dit protocol was onze studie van vruchtbaarheidsreclame door vrouwelijke olijfbavianen (Papio anubis) (Vaglio et al. niet-gepubliceerde gegevens). We identificeerden in totaal 74 vluchtige stoffen uit de analyse van 385 vrouwelijke bavianen vaginale geurmonsters. Deze verbindingen omvatten een reeks natuurlijk voorkomende geurige vluchtige stoffen zoals ketonen, alcoholen, aldehyden, terpenen, vluchtige vetzuren en koolwaterstoffen. Typische chromatogrammen die worden gebruikt om blanco controle en vrouwelijke baviaan vaginale geurmonsters uit vruchtbare en niet-vruchtbare perioden te vergelijken, worden weergegeven in figuur 2. We onderzochten de relaties tussen vaginale geurprofielen en seksuele ontvankelijkheid van vrouwelijke bavianen. Onze resultaten toonden aan dat de totale hoeveelheid vaginale geur verschilt met vruchtbaarheid, wat suggereert dat geur een rol kan spelen bij het signaleren van vrouwelijke bavianenvruchtbaarheid. We vonden ook verschillen in vaginale geur tussen groepstypen, maar we konden de effecten van groepssamenstelling, vrouwelijke leeftijd en pariteit niet onderscheiden.

Figure 1
Figuur 1. Voorbeeldchromatogrammen; (bovenste chromatogram -'controle') het controlemonster, met verontreinigingen; (onderste chromatogram -'maki geurmerk') een volwassen vrouwelijke rood-ruches maki ano-genitale geur afscheidingen, met verontreinigingen en betekenisvolle biologische verbindingen. Rode pijlen geven de zes betekenisvolle biologische verbindingen aan die in alle monsters zijn aangetroffen: a) benzaldehyde; b) 2-ethyl-1hexanol; c) p-cresol; d) cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol; e) 2-pinen-4-1; f) pentadecane. Dit cijfer is gewijzigd van Janda et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Voorbeeldchromatogram van (bovenste chromatogram -'controle') controlemonster, met verontreinigingen; (middenchromatogram -'baviaan niet-vruchtbare geur') vrouwelijke olijfbaviaan, vaginaal geurmonster uit niet-vruchtbare periode; en (bodemchromatogram -'baviaanvruchtbare geur') vrouwelijke olijfbaviaan, vaginaal geurmonster uit vruchtbare periode. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Bewaartijd (min.) Voorlopige samengestelde ID Molecuulgewicht
3.906 Hexanal 100
6.057 5-methyl-3-hexanone 114
7.413 Alfa-pineen 136
8.077 1-isopropyl-4-methyleenbicyclo[3.1.0]hex-2-one 134
8.268 Benzaldehyde 106
8.623 3,7,7-trimethyl-1,3,5-cycloheptatrieen 134
9.096 fenol 94
9.269 6-methoxy-5-hepten-2-één 126
10.72 2-ethyl-1-hexanol 130
12.362 p-Cresol 108
12.553 cis-Verbenol 152
13.385 cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol 152
14.104 1,7,7-Trimethylbicyclo[2.2.1]hepta-2-één 152
14.536 L-Pinocarveol 152
14.791 trans-Verbenol 152
15.605 p-Ethylfenol 122
15.928 Terpinen-4-ol 154
16.415 Alfa-Terpineol 154
16.615 Myrtenol 152
17.047 2-Pinen-4-één 150
18.252 Carvone 150
19.217 p-Mentha-1,8-dien-3-een 150
23.283 4,7,7-Trimethylbicyclo[4.1.0]hept-3-ene-2-één 150
23.443 Tetradecane 198
25.094 Geranylacetone 194
25.899 Isomethylionon 206
26.513 Pentadecane 212
30.871 2,6,10-Trimethylpentadecane 254
32.208 Heptadecane 240
32.372 2,6,10-Trimethylhexadecane 268
34.446 n-Tetracosaan 338
34.591 2,6,10,14-Tetramethylhexadecane 282

Tabel 1. Vluchtige stoffen aanwezig in filterpapiermonsters van vrouwelijke roodgerukte maki ano-genitale geurafscheidingen die voorlopig zijn geïdentificeerd met behulp van ChemStation-software en NIST-massaspectraaldatabases, versie MSD F.01.01.2317. Deze tabel is gewijzigd van Janda et al.12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het gebruik van controlemonsters, zowel milieucontroles die zijn gemaakt op het moment van monsterverzameling als systeem blanks, zijn cruciaal voor de interpretatie van de geurmerkmonsters. Pieken die worden toegeschreven aan de bemonsteringsomgeving of het instrumentele systeem moeten worden uitgesloten van geursponsmonsters, zodat alleen de pieken van belang in elke interpretatie worden opgenomen. Deze controles kunnen ook een rol spelen bij het beoordelen en monitoren van de "gezondheid" van de instrumentatie.

Het protocol bevat stappen om de vezel voor en na elke extractie te conditioneren. Dit wordt vergemakkelijkt door het gebruik van een automatische monsternemer en zorgt ervoor dat er geen kruisbesmetting van monster naar monster is.

De belangrijkste beperking van de methodologie heeft betrekking op de monsters zelf. Na het ophalen is het belangrijk dat ze op de juiste manier worden opgeslagen en vervoerd. De componenten van specifiek belang zijn volatiel, en deze kunnen gemakkelijk verloren gaan, of hun concentraties veranderen. Momenteel worden monsters bevroren opgeslagen en vervoerd, meestal bij -20°C. Als gevolg hiervan zijn er aanzienlijke kosten verbonden aan de opslag en het vervoer van deze monsters. Vertragingen bij het vervoer van monsters naar het laboratorium voor analyse zullen deze kosten verder verhogen en kunnen mogelijk van invloed zijn op de resultaten van de geurvlekken. Verder onderzoek is nodig om inzicht te krijgen in het effect van tijd en opslag op de analyseresultaten die uit monsters worden verkregen. Aangezien de componenten van bijzonder belang de meer vluchtige componenten van de geurmerken zijn, is het mogelijk dat de niveaus van deze componenten de namonsterverzameling kunnen veranderen. Mogelijk moet ook rekening worden gehouden met mogelijke bacteriële effecten binnen sommige monstertypen. Bij het testen van alcohol op urinemonsters kunnen bacteriën in de urine bijvoorbeeld alcohol produceren en daardoor het gedetecteerde alcoholgehalte verhogen.

De huidige methodologie voldoet aan alle eerder beschreven vereisten. Het levert resultaten van goede kwaliteit op waaruit meer informatie over de samenstelling van geurmerken wordt verkregen. De analyse is echter een laboratoriumgebaseerde techniek die afhankelijk is van de monsters die aan het laboratorium worden voorgelegd. Een mogelijke oplossing voor deze beperking zou zijn het gebruik van draagbare GC-MS-instrumenten, instrumenten die kunnen worden genomen in het veld waar de monsters worden genomen. Deze aanpak zou de noodzaak om monsters op te slaan en te vervoeren verlichten en zou de real-time analyse van geurmerken mogelijk maken, waardoor meer informatie over de meest vluchtige componenten van de merken kan worden verzacht. Er zijn verschillende draagbare GC-MS-instrumenten beschikbaar. Ze maken gebruik van andere technologie dan die in de laboratoriumgebaseerde instrumentatie, maar moeten vergelijkbare resultaten opleveren. Het gebruik van de HS-SPME extractietechniek is nog steeds van toepassing. Als gevolg van de draagbaar zijn bieden de instrumenten echter niet de mogelijkheid om geautomatiseerde monsterintroductie te bieden; niettemin, als monsters worden geanalyseerd zodra ze worden verzameld, zijn dagelijkse monsternummers waarschijnlijk beheersbaar voor handmatige injectie. Ook moet er in het geval van veldextractie op worden gelet dat de SPME-vezel geen milieuchemicaliën vangt voor gebruik. Momenteel beschikbare instrumenten werken op batterijen, waardoor de totale draagbaarheid mogelijk is, maar met de levering van een vorm van stroomvoorziening (zelfs een kleine generator) kunnen deze instrumenten voor langere tijd worden gebruikt. Deze instrumenten zijn van nature vaak ontworpen om eenvoudig te bedienen zijn, met minimale training en kennis vereist. Dit betekent dat hoogopgeleide exploitanten mogelijk niet met het instrument moeten worden ingezet en dat zij kunnen worden bediend door degenen die de monsters verzamelen. Gedetailleerde interpretatie van analytische resultaten kan op afstand worden bereikt of wanneer het instrument terugkeert naar de basis.

Een andere belangrijke beperking met methoden met BEHULP VAN SPME vezels is dat het mogelijk is om alleen chemische verbindingen die in overvloed bestaan in de monsters te analyseren. In het bijzonder bestaan er veel grotere hoeveelheden van de chemische stof in de monsters, zelfs wanneer de hoeveelheid moleculen subthreshold is voor de analyse met BEHULP VAN SPME-vezels. Bovendien hebben individuele dieren in de context van geurafscheidingen die vrijkomen door geurafscheidingen van dieren en andere chemische signalen van dieren de neiging om in kleine hoeveelheden chemische verbindingen te gebruiken om met andere dieren te communiceren en/of reuksignalen van materialen te detecteren. Met andere woorden, de verschillende prestaties van dierlijke neuzen en SPME-extractie kunnen een grote uitdaging vormen voor het succes van deze bemonsteringstechniek.

De toekomstige ontwikkeling van de huidige methode zou kunnen worden gebaseerd op het verzamelen van monsters met het onderzoek naar het gebruik van alternatieve sorbentmaterialen of sorbentbuizen voor gebruik met thermische desorptiesystemen. Dergelijke ontwikkelingen kunnen een manier zijn om de opslag- en transportomstandigheden te helpen bemonsteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

We danken Keith Holding voor zijn hulp bij chemische analyses in het Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, en Ben Mantle voor de productie van de video. We zijn ook prof. Gloriano Moneti, dr. Giuseppe Pieraccini en de leden van het Mass Spectrometry Center van de Universiteit van Florence, Florence, en prof. Luca Calamai en dr. Marco Michelozzi van het ARCA Lab van de CNR, Florence, dankbaar voor hun hulp bij het opzetten van deze methodologie. De onderzoeksprojecten die de in het manuscript beschreven bemonsterings- en analysemethoden omvatten, werden ondersteund door twee Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement ID's: 327083, 703611), een kleine beurs ('The sensory enriched primate') van de Primate Society of Great Britain en een kleine onderzoeksbeurs ('Hebben jager-verzamelaars een speciaal reukvermogen?') van de British Academy/The Leverhulme Trust aan S.V. Het laboratoriumwerk dat nodig was om deze methodologie op te zetten, ontving ook financiering van de Jaarlijkse Financieringswedstrijd van de Faculteit Bètawetenschappen en Ingenieurs (Wolverhampton) aan S.V.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL autosampler vials Agilent 5188-5392 10 ml screwtop vials with
18 mm vial caps Agilent 8010-0139 Magnetic with PTFE/silicone septa
Autosampler Agilent GC120 PAL autosampler
Capillary column Agilent HP5-MS 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm
Data analysis software Agilent - ChemStation
Gas Chromatograph Agilent 7890B
Inlet septa Agilent 5182-3442 Merlin microseal
Mass Selective Detector Agilent 5977A
Reporting software Microsoft - Excel
Spectral library NIST - NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library
Spectral library search program NIST - MS Search v.2.2
Splitless Inlet liner Agilent 5190-4048
SPME fibres Agilent SU57345U 65 µm PDMS/DVB fibre

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
  3. Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
  4. Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
  5. Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
  6. Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
  7. Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
  8. Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
  9. Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
  10. Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
  11. Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).
  12. Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).

Tags

Gedrag headspace solid-phase microextractie gaschromatografie-massaspectrometrie dierlijke communicatie geurmarkering olfactie signalering
Bemonstering en analyse van geursignalen van dieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walker, D., Vaglio, S. Sampling andMore

Walker, D., Vaglio, S. Sampling and Analysis of Animal Scent Signals. J. Vis. Exp. (168), e60902, doi:10.3791/60902 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter