Summary
Aquí describimos un método para el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae en medio líquido restringido por metal para facilitar la expresión de genes para la toma de metales. También delineamos experimentos aguas abajo para caracterizar el fenotipo de gonococci cultivados en estas condiciones. Estos métodos pueden adaptarse para ser adecuados para la caracterización de genes sensibles al metal en otras bacterias.
Abstract
Los metales traza como el hierro y el zinc son nutrientes vitales que se sabe que desempeñan un papel clave en los procesos procasinoticos, como la regulación genética, la catálisis y la estructura proteica. El secuestro de metales por parte de los huéspedes a menudo conduce a la limitación del metal para la bacteria. Esta limitación induce la expresión génica bacteriana cuyos productos proteicos permiten a las bacterias superar su entorno limitado por metales. La caracterización de estos genes es un reto. Las bacterias deben cultivarse en medios meticulosamente preparados que permitan un acceso suficiente a los metales nutricionales para permitir el crecimiento bacteriano manteniendo al mismo tiempo un perfil metálico propicio para lograr la expresión de los genes antes mencionados. Como tal, debe establecerse un equilibrio delicado para las concentraciones de estos metales. El cultivo de un organismo nutricionalmente fastidioso como Neisseria gonorrhoeae,que ha evolucionado para sobrevivir sólo en el huésped humano, añade un nivel adicional de complejidad. Aquí, describimos la preparación de un medio definido limitado por metales suficiente para permitir el crecimiento gonocócico y la expresión génica deseada. Este método permite al investigador quelar hierro y zinc de fuentes no deseadas mientras complementa los medios con fuentes definidas de hierro o zinc, cuya preparación también se describe. Por último, esbozamos tres experimentos que utilizan este medio para ayudar a caracterizar los productos proteicos de los genes gonocócicos regulados por metales.
Introduction
Neisseria gonorrhoeae causa la gonorrea de infección de transmisión sexual común. Durante la infección, la patógena Neisseria expresa un repertorio de genes sensibles al metal que permiten a las bacterias superar los esfuerzos de restricción de metales del huésped humano1,2,3. Los metales traza como el hierro y el zinc desempeñan un papel clave en muchos procesos celulares, como la unión a enzimas en sitios catalíticos, la participación en reacciones redox, y como factores estructurales en varias proteínas4,5. En condiciones limitadas por metales, los loci sensibles al metal están deprimidos y sus proteínas resultantes pueden ayudar a la adquisición de estos nutrientes. La caracterización de estos genes y proteínas presenta un desafío técnico único para el investigador. Los iones metálicos deben ser retenidos de las bacterias con el fin de inducir la transcripción de estos genes de sus loci nativos, pero la quelación efectiva de estos iones de medios cargados de metal puede ser difícil de optimizar. Los diferentes perfiles metálicos del agua de origen y la variación inherente de lote a lote6 de ingredientes en polvo significa que la cantidad de quelante necesaria para eliminar un metal específico de un medio rico variará entre diferentes ubicaciones, proveedores de ingredientes, e incluso con el tiempo dentro de un solo laboratorio como inventario químico se reemplaza.
Para evitar este desafío, describimos la preparación de un medio definido que se trata con resina Chelex-100 durante la preparación para eliminar los metales traza de la solución. Este medio es lo suficientemente denso como para permitir el crecimiento del gonococo, que es difícil de cultivar fuera del huésped humano, y permite al investigador introducir un perfil de metal específico mediante la adición de sus propias fuentes definidas y concentraciones de Metales. El método de adición controlada de metales deseados al medio agotado aumenta la consistencia experimental y permite experimentos robustos y replicables independientemente de factores como la fuente de agua y el número de lote químico. Además, este medio se puede desplegar como líquido o sólido con sólo pequeñas modificaciones, por lo que es bastante versátil.
Con el fin de demostrar la utilidad de este medio, delineamos un protocolo para su uso para el crecimiento gonococo y describimos tres experimentos exitosos para caracterizar los genes Neisseria sensibles a los metales. En primer lugar, preparamos lisiados de células enteras gonocócicas a partir de cultivos agotados por metales o suplementados y demostramos niveles variables de producción de proteínas a partir de loci sensibles al metal. A continuación, delineamos un ensayo de crecimiento restringido por zinc en el que el crecimiento gonocócico se controla mediante la suplementación de fuentes específicas de zinc útiles. Por último, mostramos ensayos de unión que demuestran células gonocócicas enteras que expresan la unión de receptores de superficie sensibles al metal a sus respectivos ligandos que contienen metal. La presentación superficial exitosa de estos receptores requiere un crecimiento en un medio agotado por metales.
El presente protocolo fue optimizado específicamente para Neisseria gonorrhoeae,pero muchos otros patógenos bacterianos emplean estrategias de adquisición de metales durante la infección7,por lo que este protocolo puede ser adaptado para el estudio de la homeostasis metálica en otras bacterias. Optimizar este medio y estos protocolos experimentales para su uso en otras bacterias probablemente requerirá una ligera modificación de las concentraciones de quelador de metal y / o tiempo de tratamiento con Chelex-100, ya que otras bacterias pueden tener requisitos de metal ligeramente diferentes que el gonococo. El hierro y el zinc son los principales metales de preocupación para las investigaciones descritas, pero otros metales (por ejemplo, manganeso) se han demostrado como críticos para las bacterias, incluyendo Neisseria8,9,10,11,12. Además, se han descrito métodos similares para caracterizaciones metálicas en el trabajo de cultivo celular eucariota, que también pueden ser considerados. 13
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Protocol
1. Preparación de soluciones de stock de medios definidos tratados con Chelex (CDM)
- Solución de stock I
- Combine NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) y KH2PO4 (10,9 g) en agua desionizada a un volumen final de 1 L.
- Filtrar esterilizar la solución y la alícuota en tubos cónicos de 50 ml.
- Conservar a -20oC.
- Solución de stock II
- Combinar tiamina HCl (0,2 g), pirofosfato de tiamina-Cl (0,05 g), pantotenato de calcio (0,19 g) y biotina (0,3 g) en etanol al 50% (vol/vol) a un volumen final de 1 L.
- Aliquot en tubos cónicos de 50 ml y almacenar a -20 oC.
- Solución de stock III
- Combinar L-aspartato (4,0 g), L-glutamato (10,4 g), L-arginina (1,2 g), glicina (0,2 g), L-serina (0,4 g), L-leucina (0,72 g L-isoleucina (0,24 g), L-valina (0,48 g), L tirosina (0,56 g), L-prolina (0,4 g), L triptófano (0,64 g), L -treonina (0,4 g), L-fenilalanina (0,2 g), L-asparagina-H2O (0,2 g), L-glutamina (0,4 g), L-histidina-HCl (0,2 g), L-metionina (0,12 g), L-alanina (0,8 g), L-lisina (0,4 g), y glutatión reducido (0,36 g) en agua desionizada de 500 ml.
- Disolver L-cisteína (0,44 g) y L-cistina (0,28 g) en un volumen mínimo (1 ml) de 1 M HCl y añadir a la solución de aminoácidos anterior.
- Ajuste el pH de la solución con 10 N NaOH hasta que se disuelvan todas las partículas. El pH final será de 10,0 a 11,0.
- Lleve el volumen final a 1 L con agua desionizada.
- Filtrar esterilizar la solución y la alícuota en volúmenes de 250 ml.
- Conservar a -20oC.
- Solución de stock IV
- Disolver la glucosa (200 g) en agua desionizada a un volumen final de 1 L.
NOTA: Es posible que la solución tenga que calentarse para disolver la glucosa. - Filtrar esterilizar y alícuotar la solución en tubos cónicos de 50 ml.
- Conservar a -20oC.
- Disolver la glucosa (200 g) en agua desionizada a un volumen final de 1 L.
- Solución de stock V
- Combine la hipoxantina (5,0 g), el uracilo (5,0 g) y el NaOH (4,0 g) en agua desionizada a un volumen final de 1 L.
- Filtrar esterilizar y alícuota en tubos cónicos de 50 ml.
- Conservar a -20oC.
- Solución VI
- Preparar una solución de 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) en agua desionizada. Filtrar esterilizar y almacenar a temperatura ambiente (RT).
- Solución de stock VII
- Preparar una solución de 1 M anhidro MgSO4 en agua desionizada. Filtrar esterilizar y almacenar en RT.
- Solución de stock VIII
- Preparar una solución de 1 M NaHCO3 en agua desionizada. Filtrar esterilizar y almacenar en RT.
2. Preparación de 4concentrados estériles y 1x CdM
NOTA: Este procedimiento debe realizarse en cristalería estéril tratada con ácido o plástico para evitar la lixiviación de metales en las soluciones.
- Combine las soluciones de stock I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) y V (20 mL) con 20,0 g de HEPES y revuelva para mezclar.
- Ajuste el pH a 7.4, luego lleve el volumen final a 500 ml con agua desionizada.
- Lavar la resina Chelex-100 en agua desionizada de 1 L para eliminar los conservantes antes de añadirla al concentrado estéril 4x. Haga esto añadiendo 50 g de resina a 1 L de agua desionizada y revolviendo durante al menos 1 h. Retire el agua por filtración al vacío y utilice esta resina lavada para el paso 2.4.
- Agregue 50 g de resina y revuelva lentamente durante exactamente 90 min.
- Retirar la resina por esterilización por filtro y almacenar el concentrado estéril 4x a 4oC.
- Para preparar una concentración de trabajo 1x de MCD, primero diluir el concentrado 4x con agua desionizada estéril, luego añadir la solución VI (125 l por 500 ml de solución 1x), la solución VII (535 ml por 500 ml) y la solución VIII (10 ml por 500 ml).
NOTA: Aunque todas las soluciones de stock ya han sido esterilizadas, se recomienda filtrar la solución 1x de nuevo después de la preparación.
3. Preparación de placas CDM
NOTA: La siguiente receta hace 1 L medios para platos, pero es mejor prepararlos en volúmenes más pequeños. Todo se reduce proporcionalmente.
- Agarosa lavada
- Disolver 50 g de agarosa en 1 L de agua desionizada, revolviendo durante 1 h.
- Transfiera la solución a una botella de centrífuga y centrífuga a 1.200 x g durante 15 minutos a RT. Vierta cuidadosamente el sobrenadante y deseche.
- Agregue suficiente agua desionizada para resuspender el pellet de agarosa y, a continuación, transfiera a un matraz de 1 L. Llevar a un volumen final de 1 L con agua desionizada y luego remover y centrifugar como en el paso 3.1.2. Descarta el sobrenadante.
- Añadir suficiente 100% etanol para resuspender el pellet, luego transferir a un nuevo matraz de 1 L. Llevar a un volumen final de 1 L con etanol. Revuelva y centrifugar como en el paso 3.1.2.
- Repita el paso 3.1.4.
- Añadir metanol al pellet de agarosa para resuspender, luego transferir a un matraz de 1 L. Llevar a un volumen final de 1 L con metanol. Revuelva y centrifugar como en el paso 3.1.2.
- Repita el paso 3.1.6.
- Transfiera la agarosa lavada a una bandeja forrada con papel de aluminio y deje secar en una campana de humo. Cuando esté seco, transfiera a un recipiente sin metalpara su almacenamiento a largo plazo.
- Añadir 10 g de agarosa lavada y 5 g de almidón de patata a 750 ml de agua desionizada.
- Autoclave para 30 min a 121oC, 100 kPa por encima de la presión atmosférica.
- Deje que los medios se enfríen a 65 oC y, a continuación, añada 250 ml de CDM 4X, 250 ml de solución VI, 1,07 ml de solución VII y 20 ml de solución VIII.
- Si lo desea, añada los metales de su elección antes de verter las placas. La adición de queladores no es necesaria para mantener condiciones libres de metales.
- Vierta en los platos de Petri y deje solidificar.
4. Crecimiento limitado de metal de Neisseria gonorrhoeae
NOTA: Para la mayoría de las aplicaciones, no es necesario hacer estresar las bacterias antes de la inoculación del MCD. El paso inicial de duplicación en el MDC y la dilución posterior es suficiente para agotar los gonococos de sus reservas internas de hierro y zinc. Como tal, los dos primeros pasos del siguiente procedimiento se llevan a cabo utilizando placas de agar hechas de base media GC que se han complementado con el suplemento de Kellogg I14 y 12,5 éM Fe(NO3)3. Si se desea una tensión metálica temprana, se recomienda preparar placas base medias GC sin Fe(NO3)3 y con 5 M TPEN (N,N,N',N'-tetrakis (2-piriilmetil) etildiamina) para la quelación de zinc o 10 M de feroxamina para la quelación de hierro. Toda incubación se lleva a cabo a 37oC con 5% deCO2.
- Dos días antes del experimento, el día -2, gonococos de rayas de las existencias del congelador en placas medianas GC e incubar durante no más de 24 h.
- En el día -1, rayar colonias individuales en platos medianos DE GC frescos. Trate de hacer esto 14-16 h antes del experimento de crecimiento.
- El día del experimento, agregue 5-10 mL 1 cdM a un matraz de brazo desconcertado de 125 ml lavado con ácido (Figura suplementaria 1) y utilícelo para dejar en blanco un colorímetro Klett.
- Use un hisopo estéril con punta de algodón para inocular el MDC de colonias sanas y únicas. Apunta a 20 unidades Klett.
NOTA: Si un colorímetro Klett no está disponible, un espectrofotómetro también es adecuado. No hay una fórmula de conversión universal para las unidades Klett a OD, pero hay una guía aproximada disponible (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - Incubar con agitación a 250 rpm hasta duplicar aproximadamente una masa (40 unidades Klett). Esto debe tomar entre 1–2 h.
- En este punto, los cultivos se diluyen de nuevo mediante la adición de un volumen suficiente de MDC para alcanzar la mitad de la densidad de cultivo inicial (por ejemplo, si 5 ml de cultivo ha pasado de 20 a 40 unidades Klett, 15 ml de MDC lo reducirá a 10 unidades de Klett) y el crecimiento continuará como en el paso 4.5. La cantidad específica de dilución posterior, tratamientos metálicos, etc. dependen de aplicaciones posteriores. A continuación damos tres ejemplos (secciones 5, 6 o 7).
5. Análisis occidental de productos genéticos metálicos sensibles
- A partir del paso 4.6, la espalda diluye los cultivos con tres volúmenes de MDC (por ejemplo, 15 ml de CDM si comienza con 5 ml). En este punto, añada tratamientos metálicos si lo desea.
- Los genes de la estención de hierro se pueden deprimir con 12,5 m de fe(NO3)3. Los genes sensibles al zinc pueden ser desprehencidos con 10 M ZnSO4.
- No es necesario estrés adicional en hierro o zinc, ya que los medios ya están agotados, por lo que los genes sensibles ya se expresarán. Si se desea más estrés, recomendamos no más de 1-2 M de deferoxamina o TPEN, ya que el estrés excesivo evitará que los cultivos crezcan.
- Cultivar cultivos como en el paso 4.5 durante 4 h y registrar la densidad celular final de las muestras. Los cultivos menos estresados por metales crecerán a densidades finales más altas.
- Estandarizar los cultivos a una densidad adecuada y preparar los lysates.
- Estandarizar los lysates de células enteras a una densidad equivalente a 100 unidades Klett en 1 ml de cultivo. Para lograr esto, divida 100 por la densidad de la unidad Klett de su muestra. El número que se obtiene es el volumen, en mL, de cultivo que se utilizará para hacer el pellet celular.
- Siga los procedimientos estándar SDS-PAGE y Western blotting15 para sondear las proteínas de interés.
6. Ensayos de crecimiento limitados por metales
NOTA: Estos ensayos describen premezclas de crecimiento prefabricadas. La preparación de estas mezclas se describe en la sección 8.
- Durante la duplicación de masa en el paso 4.5, pretratar los pozos de una microplaca de 96 pozos con premezclas de 10x. Además, designe tres pozos para que sirvan como espacios en blanco. A estos pozos, añadir 10 s de premezcla de 10x y 90 l de CDM.
- Una vez que los cultivos en los matraces de las armas laterales se hayan duplicado, agregue 100 ml de cada cultivo a un pozo no utilizado en la microplaca y mida la densidad óptica a 600 nm (OD600). Esto se puede hacer con cubetas en un espectrofotómetro, pero con un mayor número de cepas dentro de un ensayo esto puede llegar a ser engorroso y generalmente no se recomienda a menos que su espectrofotómetro pueda medir directamente desde el brazo del matraz del brazo lateral(Figura Suplementaria 2).
- Mientras mide la DO, coloque los matraces de nuevo en la incubadora para asegurarse de que los gonococci sigan siendo viables.
- Calcule la cantidad correcta de dilución necesaria para llevar los cultivos a OD600 a 0,02. Las premezclas 10x tienen un efecto insignificante en la OD y se pueden omitir del cálculo.
- Diluir los cultivos con MDC en pequeños tubos de cultivo y añadir volumen suficiente para diluir las premezclas 10x a 1x en la placa. Si hay un calentador de placas disponible, mantenga la placa a 37 oC mientras trabaja.
- Incubar la placa durante 8-12 h con agitación en un lector de placas, tomando OD600 medidas a los intervalos deseados.
7. Detección de la unión de ligandos por transportadores de metales de membrana exterior
- Tratar los cultivos como se desea como en el paso 5.1, luego incubar con agitación durante 4 h.
- Poco antes de la marca 4 h, cortar tres trozos de papel de filtro y un pedazo de nitrocelulosa al tamaño aproximado necesario para caber en un aparato de manchas de puntos(Figura suplementaria 3). Remoje previamente la nitrocelulosa en agua desionizada, luego ensamble el aparato con papel de filtro debajo de la nitrocelulosa.
- A 4 h, registre las densidades celulares y estandarice a una densidad final apropiada. Se recomienda utilizar el 10 % de la densidad utilizada para la preparación de los lysates celulares en el paso 5. Por ejemplo, si se utiliza 100 KU en 1 ml para los lysates, esto significa 10 KU en 1 mL para estas manchas. De lo contrario, el cálculo es el mismo que se describe en 5.3.1, y los cultivos se añaden directamente a la nitrocelulosa en los volúmenes calculados en lugar de convertirlos en lisatos.
- Cultivos de células de pipeta en la nitrocelulosa y deje tiempo suficiente para que el papel filtrante absorba todo el líquido.
- Desmontar el aparato, dejar que la mancha se seque y bloquear la membrana de nitrocelulosa durante 1 h en albúmina sérica bovina al 5% o leche sin grasa (p/v) en solución salina tamponada de Tris.
- Vuelva a montar el aparato de manchas de puntos, reemplazando el papel de filtro con película de parafina para crear un sello a prueba de fugas debajo de la nitrocelulosa.
- Diluir el ligando de unión de metal de interés a 0,2 m en las células de bloqueador y sonda durante 1 h.
- Sifón fuera del líquido con un vacío, lavar la mancha, a continuación, seguir los procedimientos inmunológicos estándar para desarrollar la señal16. Los pasos de lavado se pueden realizar dentro o fuera del aparato.
8. Carga de metal de Transferin, S100A7 y Calprotectin, y preparación de 10x Premixes
NOTA: Al igual que con la preparación de MCD, utilice vidrio lavado con ácido o plástico para la preparación de la solución.
- Disolver la transferrina humana a 10 mg/ml (125 m) en el tampón inicial (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH a 8,4). S100A7 y calprotectin se suspenden en tampón compuesto por Tris de 20 mM, 100 mM de NaCl, 10 mM 2-Mercaptoetanol y 1 mM CaCl2,pH a 8,0).
- Añadir solución de ferración (100 mM de citrato de sodio, 100 mM de NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH a 8,4) a la solución de transferrina para lograr un 30% de saturación de hierro (por ejemplo, 75 ml de solución de ferración es adecuado para 5 ml de transferrina si se hace a 10 mg/ml).
- Añadir ZnSO4 a S100A7 o calprotectina en una proporción molar del 50% a la proteína para crear 25% de saturación (cada molécula de proteína tiene dos sitios de unión de metales). Se pueden utilizar preparaciones de 100 M S100A7 o calprotectina con 50 OM ZnSO4.
- Para ambos casos, permita la mezcla de extremo sobre extremo durante al menos 1 h para la carga de metal.
- Preparar 4 L de tampón de diálisis (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH a 7,4). Divida esto en dos volúmenes separados de 2 L y coloque uno a 4 oC.
- Agregue las proteínas cargadas de metal a un casete de diálisis utilizando una jeringa y marque contra el primer volumen tampón durante 4 horas a RT.
- Mueva el cassette al segundo volumen del búfer y marque durante la noche a 4 oC. Después de estos pasos, se deben quitar los metales no unidos.
NOTA: Aconsejamos un ensayo de ácido bicincino para determinar las concentraciones de proteínas después de la diálisis. - Utilice una premezcla de transferencia 10x para la utilización de la transferrina como única fuente de hierro.
- Preparar esta premezcla diluyendo 30% fe-transferrina humana y apo-transferrina bovina (preparada a 125 m como se describe para la transferrina humana, sin el paso de carga de hierro) a 75 m y 30 m, respectivamente, en PBS. Una premezcla de control positivo reemplaza el 30% de fe-transferrina por 75 oM de fe(NO3)3, y una premezcla de control negativo omite cualquier hierro añadido, conservando sólo la apo-transferrina bovina. En el ensayo de crecimiento, diluir 10 ml de estos concentrados con 90 ml de cultivo. Las concentraciones finales son 7,5 m 30% de fe-transferrina humana y 3 m de apo-transferrina bovina.
- Utilice una versión modificada de la premezcla de transferrina 10x para la utilización de S100A7 o calprotectina como única fuente de zinc.
- Para una premezcla de control positivo, incorpore 50 M ZnSO4 en la premezcla de transferrina. Para un control negativo, incorpore 50 m de TPEN y omita el zinc. A continuación, tome 10 ml de cada uno de estos para cada muestra bien necesaria, y mueva ese volumen a un tubo nuevo. Añadir a esta mitad tanto volumen de PBS estéril. Por ejemplo, si 10 pozos recibirán la premezcla de control positivo, tome 100 ml de premezcla, muévalo a un tubo nuevo y agregue 50 ml de PBS. Haga lo mismo con el control negativo.
- Para hacer la premezcla S100A7 o calprotectin, tome 10 ml de la premezcla de control negativo por pozo necesario, muévase a un tubo nuevo y agregue la mitad de ese volumen del 25% Zn-S100A7 o calprotectin. En el ensayo de crecimiento, utilice 15 ml de premezcla y diluya con 85 ml de cultivo. Las concentraciones finales de las transferrinas siguen siendo las mismas que en el paso 8.5, con un añadido de 5 M de Zn, TPEN o S100A7/calprotectin.
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Representative Results
Se desarrolló e implementó un medio específico definido en ausencia de trazas metálicas para el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a los metales y sus productos genéticos. En el protocolo optimizado, el perfil metálico de los medios se controla mediante la adición de metales a discreción del investigador, en lugar de mediante la quelación valorada de un objetivo metálico, lo que permite un mayor control y consistencia desde el laboratorio hasta el laboratorio y experimentar para experimentar. Este medio se puede emplear tanto en estado líquido como sólido, por lo que es versátil en muchas configuraciones experimentales.
La producción diferencial de proteínas en concentraciones metálicas variables se puede ver en las manchas occidentales representativas incluidas(Figura 1). La imagen muestra los transportadores de membrana exterior sensibles al zinc TdfJ y TdfH, que fueron regulados en respuesta a la quelación de zinc por TPEN. TdfJ era esencialmente indetectable cuando el zinc se añadió de nuevo a los medios de comunicación, y TdfH era escaso. Además, se sabe que el promotor tdfJ es inducido, en lugar de reprimido, por hierro. Esto también es visible en la mancha. Estas manchas utilizaron la lipoproteína tbpB2 con respuesta al hierro como control de carga. En condiciones de adición de hierro, la producción de TbpB se redujo.
Los ensayos de crecimiento restringido por metales demuestran la utilización de fuentes específicas de zinc definidas por el gonococo(Figura 2). La Figura 2A muestra N. gonorrhoeae creciendo en presencia de calprotectina cargada de Zn (CP), que requiere la acción del TdfH17sensible alzinc,18. Cuando no se dishacía ninguna fuente de zinc útil, ya sea a través de ningún add-back de zinc o por la ausencia de TdfH, el crecimiento estaba restringido. La Figura 2B muestra resultados similares en presencia de S100A7, que puede servir como única fuente de zinc cuando se produce el transportador de membrana exterior TdfJ19. En presencia de TPEN solo o cuando TdfJ estaba ausente, el crecimiento se vio obstaculizado, pero la adición de Zn-S100A7 recuperó el crecimiento de una manera dependiente de TdfJ. Por último, la Figura 2C muestra un error experimental. En este ejemplo, el paso de dilución de los cultivos gonococos no fue suficiente para agotar las bacterias de las piscinas internas de zinc en relación con el volumen de cultivo total en la microplaca. Como tal, el crecimiento en el control negativo superó el OD deseado.
La unión específica de células gonocócicas enteras a sus respectivos ligandos se demuestra mediante manchas de puntos de cultivos preparados en condiciones de limitación de metales y repletos metálicos(Figura 3). La Figura 3A,B muestra que los gonococos cultivados en CDM fueron capaces de unir CP y S100A7 al producir TdfH y TdfJ, respectivamente, como resultado de la escasez de zinc. La Figura 3C compara la unión a la transferrina, que se logra mediante las proteínas cognadas hechas a partir de los genes de sirena de hierro tbpA y tbpB20,cuando los gonococos se cultivan solo en CDM frente al caldo medio GC tratado con la deferoxamina quelante de hierro. Esta cifra muestra un aumento de la unión de la transferrina por cultivos cultivados en el MDC, lo que indica mayores niveles de expresión de proteínas debido a la naturaleza más agotada por el hierro del MDC en comparación con el caldo GC quelado.
Figura 1: Mancha occidental representativa que muestra la producción diferencial de proteínas metálicas sensibles. (A) La cepa de tipo silvestre FA19 de Neisseria gonorrhoeae se cultiva en CDM complementado con ZnSO4,Fe(NO3)3o TPEN en las concentraciones indicadas. Después del tratamiento, los cultivos se cultivaron durante 4 horas antes de que se produjeran lisatos de células enteras de densidad estandarizada y se sometieron a SDS-PAGE y a la hincha occidental. Los niveles diferenciales de producción de TdfJ, que es reprimido por zinc e inducidos por el hierro, se pueden ver claramente en respuesta a la adición/agotamiento de zinc y la adición de hierro. (B) Las intensidades de señal relativas para la mancha occidental se cuantificaron a través de la densitometría. Esta figura está adaptada de Maurakis et al19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Crecimiento restringido de zinc de gonococos. La cepa de tipo silvestre FA19, o mutantes isogénicos de esta cepa que no producen tdfJ o tdfH, se cultivaron en (A) CDM no tratado hasta que se alcanzó la fase exponencial, (B) y luego se diluyó de nuevo a OD600 a 0,02 y (C) OD600 a 0,1. Las muestras en A se trataron con premezcla que contiene calprotectina (arriba) o sin zinc añadido (abajo) y se cultivaron durante 8 h. Las muestras en B y C se complementaron con premezcla que contenía zinc libre, no zinc (5 M TPEN), o S100A7, y se cultivaron durante 6 h. El crecimiento en estas condiciones sólo se recuperó con la suplementación de medios con una fuente de zinc útil, como CP, S100A7, o zinc libre en A y B,mientras que C no se diluyó lo suficiente para agotar las piscinas internas de zinc celular. 17Figura 2B está adaptada de Maurakis et al19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los ensayos de unión representativos muestran ligandos de host que se unen a los gonococos con estresado por metal. (A) La cepa de tipo salvaje FA1090, o mutantes de esta cepa que no producen tdfJ, tdfH, o ambos, se cultivaron en CDM sin metales suplementarios y estaban salpicados a la nitrocelulosa en densidades estandarizadas. Las células fueron sondeadas con calprotectina, que es reconocida por el TdfH sensible al zinc, y la unión se evaluó mediante la detección con un anticuerpo anti-calprotectina (arriba). El enlace relativo de calprotectina se quantitó a través de la densitometría, que se muestra aquí en una escala de registro (inferior). (B) Los experimentos de enlace se realizaron como se describe en A, pero en su lugar utilizando la cepa de tipo salvaje FA19 y tdfJ mutantes y cepas complementadas en ese fondo. Las células fueron sondeadas con la etiqueta HRP S100A7, quees reconocida por la cepa de tipo salvaje FA19 con respuesta al zinc, se cultivaba lado a lado en CDM o caldo medio GC con deferoxamina de 25 M añadido al hierro libre de quelato, punteada a nitrocelulosa en cantidades estandarizadas, y sondeada con transferrina, que une el TbpA sensible al hierro. Estas pruebas en paralelo muestran que el MDC, a diferencia del caldo medio GC, no requería quelación adicional para lograr un ambiente limitado por hierro. Figura 3A está adaptado de Jean et al. y la parte inferior de Maurakis et al19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los medios de crecimiento sirven una variedad de funciones en la investigación microbiológica. Los medios especializados se utilizan para la selección, el enriquecimiento y varias otras aplicaciones para muchos tipos únicos de estudio. Una de estas aplicaciones es la inducción de genes sensibles al metal, que normalmente se logra mediante la adición de un quelante específico que apunta a un ion metálico en particular. Este método es limitado, ya que la cantidad de quelación necesaria para varios metales traza es probable que sea variable debido a diferentes fuentes de agua que contienen perfiles metálicos únicos, y dos lotes del mismo ingrediente de medios que contiene diferentes concentraciones de metal6. Para evitar esta deficiencia inherente, hemos descrito la preparación y el uso de un medio definido que se trata con resina Chelex-100 para eliminar todos los metales traza a granel, permitiendo la adición controlada de metales especificados de nuevo en el medio según sea necesario.
En el protocolo actual, el primer punto importante de discusión es el agua de origen. El protocolo describe un tratamiento Chelex que es suficiente para eliminar metales del laboratorio Tipo 2 (1,0 megaOhms-cm según las especificaciones ISO 3696) de agua. Diferentes fuentes de agua probablemente requerirán tratamientos Chelex más cortos o más largos. Hemos encontrado que el agua de mayor pureza que el tipo 2, como el agua de grado de biología molecular, no apoyará el crecimiento bacteriano en esta aplicación. La elección del recipiente para la preparación de los medios de comunicación es tan importante como la fuente de agua. Recomendamos encarecidamente recipientes de plástico limpios, ya que la cristalería puede lixiviar iones metálicos en la solución. Si no se dispone de material plástico, la cristalería debe lavarse con ácido para minimizar el riesgo de contaminación. Se requiere el mismo lavado ácido para los matraces de cultivo cuando se utiliza CDM.
El crecimiento de Neisseria gonorrhoeae en un entorno in vitro puede ser bastante difícil, ya que este organismo ha evolucionado para prosperar específicamente en los huéspedes humanos21. Si bien el MDC es adecuado para apoyar el crecimiento durante la duración de los experimentos, se debe tener cuidado durante las medidas de inoculación y dilución para garantizar que los gonococos no estén en condiciones atmosféricas más tiempo del necesario. Debido a la naturaleza cendnofílica de gonococci22 y su predilección por las temperaturas que se encuentran dentro de los huéspedes humanos, no recomendamos mantener los cultivos en condiciones atmosféricas durante más de 15 minutos. Si el evento de duplicación de masa inicial descrito en el paso 4.5 del método tarda más de 2 h, es probable que los cultivos gonocócicos no se hayan manejado correctamente y que el experimento se debe anular.
Mientras que el enfoque de este método se centra en los métodos para el crecimiento y caracterización de Neisseria gonorrhoeae específicamente, el uso de este MDC específico es probablemente también adecuado para el estudio de otras especies de Neisseria. Además, se puede aplicar fácilmente a la caracterización de otros sistemas de sensibilización metálica en otras bacterias. Por ejemplo, se ha utilizado un medio libre de metalsimilares similares para caracterizar la toma de metales en Staphylococcus aureus23 y Escherichia coli24. La utilización de la receta descrita para otras bacterias probablemente implicará pequeñas modificaciones o adiciones, dependiendo de las necesidades nutricionales específicas de las bacterias en cuestión. Por ejemplo, el suplemento VIII está incluido en la receta para ayudar con la necesidad de gonococo de CO2suplementario. Como se ha descrito anteriormente, el crecimiento se realiza a 37oC con una atmósfera deCO2 del 5%, pero hemos encontrado que la adición de bicarbonato suplementario en los medios ayuda a las etapas iniciales del crecimiento gonocócico en un medio definido. Para los organismos sin tal requisito, este ingrediente puede ser omitido. Desafortunadamente, otros ejemplos de estas modificaciones tienen que ser determinados empíricamente.
A pesar de la necesidad de adaptar un poco el método para su uso con otras bacterias, el marco básico debe ser apropiado para un uso amplio. La caracterización de genes sensibles a los metales y transportadores de metales es un esfuerzo continuo en el estudio microbiano, con bacterias como Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Haemophilus influenzae29, Salmonella enterica30, y E. coli31 todos recibiendo atención en este nicho. Nuestra propia utilización futura de esta técnica tendrá como objetivo promover la comprensión de otros sistemas de admisión de metal gonocócico más allá de los ya mencionados, que permiten al gonococo adquirir hierro de proteínas huésped como la lactoferrina32,33, hemoglobina34,35, y también de xenosideróforos bacterianos36,y ampliar nuestros estudios en los efectos de otros metales como la manganesa, que se ha implicado en la defensa oxidativa por Neisseria12,37.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH R01 AI125421, R01 AI127793 y U19 AI144182. El autor de la escritura desea dar las gracias a todos los miembros del laboratorio que contribuyeron a la corrección y revisión de este método.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
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