Summary
Nous décrivons ici une méthode pour la croissance de Neisseria gonorrhoeae dans le milieu liquide métal-restreint pour faciliter l’expression des gènes pour l’apaisement de métal. Nous dénoncions également des expériences en aval pour caractériser le phénotype des gonocoques cultivés dans ces conditions. Ces méthodes peuvent être adaptées pour être adaptées à la caractérisation des gènes sensibles au métal chez d’autres bactéries.
Abstract
Les métaux traces tels que le fer et le zinc sont des nutriments vitaux connus pour jouer un rôle clé dans les processus procaryotiques, y compris la régulation des gènes, la catalyse et la structure des protéines. La séquestration du métal par les hôtes conduit souvent à une limitation du métal pour la bactérie. Cette limitation induit l’expression des gènes bactériens dont les produits protéiques permettent aux bactéries de surmonter leur environnement métallique limité. La caractérisation de ces gènes est un défi. Les bactéries doivent être cultivées dans des médias méticuleusement préparés qui permettent un accès suffisant aux métaux nutritionnels pour permettre la croissance bactérienne tout en maintenant un profil métallique propice à la réalisation de l’expression des gènes susmentionnés. En tant que tel, un équilibre délicat doit être établi pour les concentrations de ces métaux. La culture d’un organisme exigeant sur le plan nutritionnel tel que Neisseria gonorrhoeae, qui a évolué pour survivre uniquement dans l’hôte humain, ajoute un niveau supplémentaire de complexité. Ici, nous décrivons la préparation d’un milieu métallique défini limité suffisant pour permettre la croissance gonococcique et l’expression du gène désirée. Cette méthode permet à l’investigateur de chélater le fer et le zinc à partir de sources indésirables tout en complétant les médias avec des sources définies de fer ou de zinc, dont la préparation est également décrite. Enfin, nous présentons trois expériences qui utilisent ce média pour aider à caractériser les produits protéiques des gènes gonococciques régulés par les métaux.
Introduction
Neisseria gonorrhoeae provoque l’infection sexuellement transmissible commune gonorrhée. Pendant l’infection, Neisseria pathogène exprimer un répertoire de gènes métal-sensibles qui permettent aux bactéries de surmonter les efforts de restriction de métal par l’hôte humain1,2,3. Les métaux traces comme le fer et le zinc jouent un rôle clé dans de nombreux processus cellulaires, tels que la liaison aux enzymes dans les sites catalytiques, la participation aux réactions redox, et comme facteurs structurels dans diverses protéines4,5. Dans des conditions de métal limité, les loci métal-sensibles sont déprimés et leurs protéines résultantes peuvent aider à l’acquisition de ces éléments nutritifs. La caractérisation de ces gènes et protéines représente un défi technique unique pour le chercheur. Les ions métalliques doivent être retenus contre les bactéries afin d’induire la transcription de ces gènes à partir de leurs loci indigènes, mais la chélation efficace de ces ions à partir de médias chargés de métal peut être difficile à optimiser. Les différents profils métalliques de l’eau de source et la variation inhérente du lot au lot6 des ingrédients en poudre signifient que la quantité de chélateur nécessaire pour enlever un métal spécifique d’un milieu riche variera d’un endroit à l’autre, les vendeurs d’ingrédients, et même au fil du temps dans un seul laboratoire à mesure que l’inventaire chimique sera remplacé.
Pour contourner ce défi, nous décrivons la préparation d’un milieu défini qui est traité avec de la résine Chelex-100 pendant la préparation pour enlever les métaux traces de la solution. Ce milieu est suffisamment dense en nutriments pour permettre la croissance du gonocoque, qui est difficile à culture en dehors de l’hôte humain, et permet à l’investigateur d’introduire un profil métallique spécifique en additionnant leurs propres sources et concentrations définies de Métaux. La méthode d’addition contrôlée des métaux désirés au milieu appauvri augmente la consistance expérimentale et permet des expériences robustes et reproductibles indépendamment de facteurs tels que la source d’eau et le nombre de lot séchimique. En outre, ce support peut être déployé comme un liquide ou solide avec seulement des modifications mineures, ce qui le rend assez polyvalent.
Afin de démontrer l’utilité de ce milieu, nous énonçons un protocole pour son utilisation pour la croissance gonococcique et déécrivons trois expériences réussies pour caractériser les gènes de Neisseria sensibles aux métaux. Tout d’abord, nous préparons des lysates gonococciques à cellules entières à partir de cultures appauvries ou complétées par le métal et démontrons des niveaux variables de production de protéines à partir de loci sensibles au métal. Nous cifrayons alors un assay de croissance zinc-restreint dans lequel la croissance gonococcique est commandée par la supplémentation des sources spécifiques et utilisables de zinc. Enfin, nous montrons des essais de liaison qui démontrent des cellules gonococciques entières exprimant des récepteurs de surface sensibles au métal se liant à leurs ligands contenant du métal respectifs. La présentation réussie de surface de ces récepteurs exige la croissance dans le milieu métal-appauvri.
Le protocole actuel a été optimisé spécifiquement pour Neisseria gonorrhoeae, mais de nombreux autres agents pathogènes bactériens utilisent des stratégies d’acquisition de métaux pendant l’infection7, de sorte que ce protocole peut être adapté pour l’étude de l’homéostasie métallique dans d’autres bactéries. L’optimisation de ce média et de ces protocoles expérimentaux pour une utilisation dans d’autres bactéries nécessitera probablement une légère modification des concentrations de chélateurs métalliques et/ou du temps de traitement avec Chelex-100, car d’autres bactéries peuvent avoir des besoins métalliques légèrement différents de ceux du gonocoque. Le fer et le zinc sont les principaux métaux préoccupants pour les enquêtes décrites, mais d’autres métaux (p. ex., le manganèse) ont été démontrés comme critiques pour les bactéries, y compris Neisseria8,9,10,11,12. En outre, des méthodes similaires ont été décrites pour les caractérisations métalliques dans le travail de culture cellulaire eucaryotique, qui peut également être considérée. 13 (en)
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Protocol
1. Préparation de solutions d’actions à moyen défini (MDP) traitées par Chelex
- Stock solution I
- Combiner NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) et KH2PO4 (10,9 g) dans de l’eau déionisée à un volume final de 1 L.
- Filtrer stériliser la solution et aliquot en tubes coniques de 50 ml.
- Conserver à -20 oC.
- Stock solution II
- Mélanger la thiamine HCl (0,2 g), le pyrophosphate-Cl de thiamine (0,05 g), le pantothénate de calcium (0,19 g) et la biotine (0,3 g) dans 50 % (vol/vol) de l’éthanol jusqu’à un volume final de 1 L.
- Aliquot en tubes coniques de 50 ml et conserver à -20 oC.
- Stock solution III
- Combiner L-aspartate (4,0 g), L-glutamate (10,4 g), L-arginine (1,2 g), glycine (0,2 g), L-serine (0,4 g), L-leucine (0,72 g), L-isoleucine (0,24 g), L-valine (0,48 g), L-tyrosine (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptophane (0,64 g), L-tyrosine (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptophane (0,64 g), L-threonine (0,4 g), L-phénylalanine (0,2 g), L-asparagine-H2O (0,2 g), L-glutamine (0,4 g), L-histidine-HCl (0,2 g), L-méthionine (0,12 g), L-alanine (0,8 g), L-lysine (0,4 g) et glutathion réduit (0,36 g) dans 500 mL d’eau déionisée.
- Dissoudre la L-cystéine (0,44 g) et la L-cystine (0,28 g) dans un volume minimal (1 ml) de 1 M HCl et ajouter à la solution d’acide aminé ci-dessus.
- Ajuster le pH de la solution avec 10 N NaOH jusqu’à ce que toutes les particules soient dissoutes. Le pH final sera de 10,0 à 11,0.
- Porter le volume final à 1 L avec de l’eau déionisée.
- Filtrer stériliser la solution et aliquot en 250 ml de volumes.
- Conserver à -20 oC.
- Stock solution IV
- Dissoudre le glucose (200 g) dans l’eau déionisée à un volume final de 1 L.
REMARQUE: La solution peut devoir être chauffée pour dissoudre le glucose. - Filtrer la stérilisation et aliquot la solution dans des tubes coniques de 50 ml.
- Conserver à -20 oC.
- Dissoudre le glucose (200 g) dans l’eau déionisée à un volume final de 1 L.
- Stock solution V
- Mélanger l’hypoxanthine (5,0 g), l’uracil (5,0 g) et le NaOH (4,0 g) dans de l’eau déionisée jusqu’à un volume final de 1 L.
- Filtrer la stérilisation et l’aliquot dans des tubes coniques de 50 ml.
- Conserver à -20 oC.
- Solution VI
- Préparer une solution de 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) dans de l’eau déionisée. Filtrer la stérilisation et la conserver à température ambiante (RT).
- Stock solution VII
- Préparer une solution de 1 M anhydre MgSO4 dans de l’eau déionisée. Filtrer stériliser et stocker à RT.
- Stock solution VIII
- Préparer une solution de 1 M NaHCO3 dans l’eau déionisée. Filtrer stériliser et stocker à RT.
2. Préparation de 4x concentré stérile et 1x CDM
REMARQUE : Cette procédure doit être exécutée dans la verrerie stérile ou en plastique traitée à l’acide pour empêcher le lixiviation des métaux dans les solutions.
- Combinez les solutions de stock I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 ml) et V (20 ml) avec 20,0 g de HEPES et remuer pour mélanger.
- Ajuster le pH à 7,4, puis porter le volume final à 500 ml avec de l’eau déionisée.
- Laver la résine Chelex-100 dans 1 L dionized eau pour enlever les agents de conservation avant de l’ajouter au concentré stérile 4x. Pour ce faire, en ajoutant 50 g de résine à 1 L d’eau déionisée et en remuant pendant au moins 1 h. Retirez l’eau par filtration sous vide et utilisez cette résine lavée pour l’étape 2.4.
- Ajouter 50 g de résine et remuer lentement pendant exactement 90 min.
- Retirer la résine par stérilisation du filtre et conserver le concentré stérile 4x à 4 oC.
- Pour préparer une concentration de 1x de MDP, diluer d’abord le concentré 4x avec de l’eau déionisée stérile, puis ajouter la solution VI (125 L par 500 mL de solution 1x), la solution VII (535 l par 500 mL) et la solution VIII (10 ml par 500 ml).
REMARQUE : Bien que toutes les solutions de stock aient déjà été stérilisées, il est recommandé de filtrer la stérilisation de la solution 1x à nouveau après la préparation.
3. Préparation des plaques MDP
REMARQUE: La recette ci-dessous fait 1 L médias pour les assiettes, mais il est préférable de les préparer en plus petits volumes. Tout s’abaisse proportionnellement.
- Agarose lavée
- Dissoudre 50 g d’agarose dans 1 L d’eau déionisée, en remuant pendant 1 h.
- Transférer la solution sur une bouteille de centrifugeuse et une centrifugeuse à 1 200 x g pendant 15 min à RT. Verser soigneusement le supernatant et jeter.
- Ajouter suffisamment d’eau déionisée pour suspendre à nouveau le granule d’agarose, puis transférer dans un flacon de 1 L. Porter à un volume final de 1 L avec de l’eau déionisée, puis remuer et centrifuger comme à l’étape 3.1.2. Jetez le supernatant.
- Ajouter suffisamment d’éthanol à 100 % pour suspendre à nouveau le granule, puis transférer dans un nouveau flacon de 1 L. Porter à un volume final de 1 L avec de l’éthanol. Remuer et centrifugeuse comme à l’étape 3.1.2.
- Répétez l’étape 3.1.4.
- Ajouter le méthanol à la granule d’agarose pour le resuspendre, puis transférer dans un flacon de 1 L. Porter à un volume final de 1 L avec du méthanol. Remuer et centrifugeuse comme à l’étape 3.1.2.
- Répétez l’étape 3.1.6.
- Transférer l’agarose lavée sur un plateau recouvert de papier d’aluminium et laisser sécher dans une hotte à fumée. Une fois sec, transférer dans un contenant sans métal pour un stockage à long terme.
- Ajouter 10 g d’agarose lavée et 5 g d’amidon de pomme de terre à 750 ml d’eau déionisée.
- Autoclave pendant 30 min à 121 oC, 100 kPa au-dessus de la pression atmosphérique.
- Laisser refroidir les supports à 65 oC, puis ajouter 250 ml de 4X MDC, 250 oL de solution VI, 1,07 ml de solution VII et 20 ml de solution VIII.
- Si désiré, ajouter les métaux de choix avant de verser les assiettes. L’ajout de chélateurs n’est pas nécessaire pour maintenir des conditions sans métal.
- Verser dans la vaisselle Petri et laisser se solidifier.
4. Croissance limitée en métaux de Neisseria gonorrhoeae
REMARQUE : Pour la plupart des applications, il n’est pas nécessaire de stresser les bactéries avant l’inoculation du MDP. L’étape initiale de doublement du MDP et la dilution subséquente sont suffisantes pour épuiser les gonocoques de leurs réserves internes de fer et de zinc. En tant que tel, les deux premières étapes de la procédure suivante sont effectuées à l’aide de plaques d’agar fabriqués à partir de base moyenne GC qui ont été complétés par le supplément de Kellogg I14 et 12,5 M Fe (NO3)3. Si l’on désire un stress métallique précoce, nous recommandons de préparer des plaques de base moyennes GC sans Fe (NO3)3 et avec 5 M TPEN (N,N',N',N',netrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine) pour la chélation de zinc ou 10 M deferoxamine pour la chélation de fer. Toute l’incubation est menée à 37 oC avec 5 % de CO2.
- Deux jours avant l’expérience, le jour -2, les gonocoques de stries des stocks de congélateur sur les plaques moyennes GC et incuber pendant pas plus de 24 h.
- Le jour -1, stries colonies simples sur des plaques fraîches GC moyen. Essayez de le faire 14-16 h avant l’expérience de croissance.
- Le jour de l’expérience, ajouter 5 à 10 mL 1x MDP à un flacon d’arme de poing déconcerté de 125 ml d’acide(figure supplémentaire 1) et l’utiliser pour vider un colorimètre Klett.
- Utilisez un écouvillon stérile à pointe de coton pour inoculer le MDP provenant de colonies saines et simples. Visez 20 unités Klett.
REMARQUE : Si un colorimètre Klett n’est pas disponible, un spectrophotomètre convient également. Il n’y a pas de formule de conversion universelle pour les unités Klett à OD, mais un guide approximatif est disponible (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - Incuber en secouant à 250 tr/min jusqu’à ce qu’environ un doublement de masse (40 unités Klett). Cela devrait prendre entre 1 h et 2 h.
- À ce stade, les cultures sont de retour dilué par l’ajout d’un volume suffisant de MDP pour atteindre la moitié de la densité de culture initiale (par exemple, si 5 mL de culture est passé de 20 à 40 unités Klett, 15 mL de MDP le ramènera à 10 unités Klett) et la croissance se poursuivra comme à l’étape 4.5. La quantité spécifique de dilution du dos, de traitements métalliques, etc. dépend des applications en aval. Nous donnons trois exemples ci-dessous (sections 5, 6 ou 7).
5. Analyse occidentale des produits géniques sensibles au métal
- À partir de l’étape 4.6, le dos dilue les cultures avec trois volumes de MDP (p. ex., 15 mL de MDP si le début avec 5 mL). À ce stade, ajouter des traitements métalliques si désiré.
- Les gènes de détection du fer peuvent être déprimés avec 12,5 M Fe (NO3)3. Les gènes sensibles au zinc peuvent être déprimés avec 10 M ZnSO4.
- Le stress supplémentaire en fer ou en zinc n’est pas nécessaire, car les médias sont déjà épuisés, de sorte que des gènes réactifs seront déjà exprimés. Si d’autres stress sont souhaités, nous ne recommandons pas plus de 1 à 2 millions de déferoxamine ou de TPEN, car un stress excessif empêchera les cultures de croître.
- Cultivez des cultures comme dans l’étape 4.5 pour 4 h et enregistrez la densité cellulaire finale des échantillons. Les cultures moins résistantes aux métaux aciduront à des densités finales plus élevées.
- Normaliser les cultures à une densité appropriée et préparer des lysates.
- Normaliser les lysates à cellules entières à une densité équivalente à 100 unités Klett dans 1 ml de culture. Pour ce faire, divisez 100 par la densité de l’unité Klett de votre échantillon. Le nombre que vous obtenez est le volume, en mL, de la culture qui sera utilisé pour faire le granule de cellules.
- Suivez les procédures standard de SDS-PAGE et de ballonnement occidental15 pour sonder les protéines d’intérêt.
6. Essais de croissance limités dans le métal
REMARQUE : Ces essais décrivent les prémélanges de croissance préfabriqués. La préparation de ces mélanges est décrite à la section 8.
- Pendant le doublement de masse dans l’étape 4.5, pretreat les puits d’une microplaque de puits 96 avec 10x prémélanges. En outre, désignez trois puits pour servir de blancs. À ces puits, ajouter 10 oL de prémélange 10x et 90 oL de MDP.
- Une fois que les cultures dans les flacons d’arme de poing ont doublé, ajouter 100 L de chaque culture à un puits inutilisé dans la microplaque et mesurer la densité optique à 600 nm (OD600). Cela peut être fait avec des cuvettes dans un spectrophotomètre, mais avec un plus grand nombre de souches dans un essai cela peut devenir lourd et n’est généralement pas conseillé à moins que votre spectrophotomètre peut mesurer directement à partir du bras latéral flasque (Figure supplémentaire 2).
- Tout en mesurant l’OD, placez les flacons dans l’incubateur pour s’assurer que les gonocoques restent viables.
- Calculez la quantité correcte de dilution nécessaire pour amener les cultures àLO 600 à 0,02. Les prémélanges 10x ont un effet négligeable sur l’OD et peuvent être omis du calcul.
- Diluer les cultures avec le MDP dans de petits tubes de culture et ajouter suffisamment de volume pour diluer les prémélanges 10x à 1x dans l’assiette. Si un chauffe-assiette est disponible, gardez la plaque à 37 oC pendant le travail.
- Incuber la plaque pendant 8 à 12 h en secouant dans un lecteur de plaque, en prenant des mesures OD600 à intervalles désirés.
7. Détection de la liaison Ligand par les transporteurs métalliques de membrane externe
- Traiter les cultures comme vous le souhaitez à l’étape 5.1, puis couver en secouant pendant 4 h.
- Peu de temps avant la marque de 4 h, couper trois morceaux de papier filtre et un morceau de nitrocellulose à la taille approximative nécessaire pour s’adapter à un appareil à points tache (Figure supplémentaire 3). Présapez la nitrocellulose dans de l’eau déionisée, puis assemblez l’appareil avec du papier filtre sous la nitrocellulose.
- À 4 h, enregistrez les densités cellulaires et normalisez à une densité finale appropriée. Il est recommandé d’utiliser 10 % de la densité utilisée pour la préparation des lysates cellulaires à l’étape 5. Par exemple, si vous utilisez 100 KU en 1 ml pour les lysates, cela signifie 10 KU en 1 ml pour ces taches. Le calcul est par ailleurs le même que décrit dans 5.3.1, et les cultures sont ajoutées directement à la nitrocellulose dans les volumes calculés plutôt que transformés en lysates.
- Les cultures de cellules pipet sur la nitrocellulose et laisser suffisamment de temps pour le papier filtre pour absorber tout le liquide.
- Démonter l’appareil, laisser sécher la tache et bloquer la membrane de nitrocellulose pendant 1 h dans 5 % d’albumine bovine bovine ou de lait non gras (w/v) dans la saline tamponnée Tris.
- Remonter l’appareil à points, en remplaçant le papier filtre par du film de paraffine pour créer un joint étanche sous la nitrocellulose.
- Diluer le ligand métallique d’intérêt à 0,2 M dans les cellules de bloqueur et de sonde pendant 1 h.
- Siphonner le liquide avec un aspirateur, laver la tache, puis suivre les procédures immunologiques standard pour développer le signal16. Les étapes de lavage peuvent être faites dans ou hors de l’appareil.
8. Chargement métallique de Transferin, S100A7, et Calprotectin, et préparation de 10x Premixes
REMARQUE : Comme pour la préparation du MDP, utilisez du verre lavé à l’acide ou du plastique pour la préparation des solutions.
- Dissoudre le transfert humain à 10 mg/mL (125 m) dans le tampon initial (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH - 8,4). S100A7 et calprotectin sont suspendus dans un tampon composé de 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, et 1 mM CaCl2, pH - 8,0).
- Ajouter la solution de ferration (100 mM de citrate de sodium, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH - 8,4) à la solution de transferrine pour atteindre une saturation en fer de 30 % (p. ex., 75 l de solution de ferration convient à la transferrine de 5 ml si elle est fabriquée à 10 mg/mL).
- Ajouter ZnSO4 à S100A7 ou calprotectine à un rapport de 50% molaire à la protéine pour créer 25% de saturation (chaque molécule de protéine a deux sites de liaison métallique). Les préparations de 100 M S100A7 ou calprotectine avec 50 M ZnSO4 peuvent être utilisées.
- Dans les deux cas, laisser le mélange de bout en bout pendant au moins 1 h pour le chargement du métal.
- Préparer 4 L de tampon de dialyse (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH 7,4). Divisez-le en deux volumes distincts de 2 L et placez-le à 4 oC.
- Ajouter les protéines chargées en métal à une cassette de dialyse à l’aide d’une seringue et dialyser contre le premier volume tampon pendant 4 h à RT.
- Déplacez la cassette vers le deuxième volume tampon et dialyser pendant la nuit à 4 oC. Après ces étapes, tous les métaux non liés doivent être enlevés.
REMARQUE : Nous conseillons un test d’acide bicinchoninique pour déterminer des concentrations de protéine après dialyse. - Utilisez un prémélange de transferrine 10x pour l’utilisation de la transferrine comme source de fer seule.
- Préparer ce prémélange en diluant 30% de Fe-transferin humain et d’apo-transferin bovin (préparé à 125 M comme décrit pour le transferrine humain, sans l’étape de chargement du fer) à 75 et 30 M, respectivement, en PBS. Un prémélange de contrôle positif remplace 30 % de Fe-transferin par 75 M Fe (NO3)3, et un prémix de contrôle négatif omet tout fer ajouté, ne conservant que l’apo-transferin bovin. Dans l’exemple de croissance, diluer 10 l de ces concentrés avec 90 l de culture. Les concentrations finales sont de 7,5 M M 30% de Fe-transferin humain et de 3 millions d’apo-transferin bovin.
- Utilisez une version modifiée du prémélange transferrine 10x pour l’utilisation de S100A7 ou de calprotectine comme seule source de zinc.
- Pour un prémélange de contrôle positif, incorporer 50 M ZnSO4 dans le prémix transferin. Pour un contrôle négatif, incorporer 50 M TPEN et omettre le zinc. Ensuite, prenez 10 L de chacun de ces échantillons pour chaque échantillon bien nécessaire, et déplacez ce volume vers un nouveau tube. Ajoutez à cela la moitié autant de volume de PBS stérile. Par exemple, si 10 puits recevront le prémélange de contrôle positif, prenez 100 l de prémélange, déplacez-le vers un nouveau tube et ajoutez 50 L de PBS. Faites de même pour le contrôle négatif.
- Pour faire le prémélange S100A7 ou calprotectin, prendre 10 l de la commande négative prémix par bien nécessaire, passer à un nouveau tube, et ajouter la moitié de ce volume de la 25% Zn-S100A7 ou calprotectin. Dans l’exemple de croissance, utilisez 15 l de prémélange et diluez avec 85 l de culture. Les concentrations finales pour les transferins restent les mêmes que dans l’étape 8.5, avec un ajout de 5 m de Zn, TPEN, ou S100A7/calprotectin.
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Representative Results
Un milieu spécifique défini en l’absence de métaux traces pour la croissance de Neisseria gonorrhoeae a été développé et mis en œuvre pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et de leurs produits géniques. Dans le protocole optimisé, le profil métallique des médias est contrôlé en ajoutant des métaux à la discrétion de l’enquêteur, plutôt que par la chélation titrée d’une cible métallique, ce qui permet un contrôle et une consistance accrus de laboratoire en laboratoire et d’expérience pour expérimenter. Ce support peut être utilisé à la fois liquide et solide, ce qui le rend polyvalent dans de nombreuses configurations expérimentales.
La production différentielle de protéines en concentrations variables de métaux peut être observée dans les taches occidentales représentatives incluses (figure 1). L’image montre les transporteurs de membrane externe sensibles au zinc TdfJ et TdfH, qui ont été reréglementés en réponse à la chélation de zinc par TPEN. TdfJ était essentiellement indétectable quand le zinc a été ajouté de nouveau aux médias, et TdfH était rare. En outre, le promoteur tdfJ est connu pour être induit, plutôt que réprimé, par le fer. Cela est également visible dans la tache. Ces taches ont utilisé la lipoprotéine de fer-sensible TbpB2 comme un contrôle de chargement. Dans des conditions de reflux, la production de TbpB a été réduite.
Les essais de croissance à teneur limitée en métaux démontrent l’utilisation de sources de zinc spécifiques et définies par le gonocoque(figure 2). La figure 2A montre N. gonorrhoeae de plus en plus en présence de calprotectine Zn-chargée (CP), qui exige l’action du TdfH17,18. Lorsqu’aucune source de zinc utilisable n’était disponible, soit par aucun add-back de zinc ou par l’absence de TdfH, la croissance a été limitée. La figure 2B montre des résultats similaires en présence de S100A7, qui peut servir de source de zinc seule lorsque le transporteur de membrane externe TdfJ est produit19. En présence de TPEN seul ou lorsque TdfJ était absent, la croissance a été entravée, mais l’ajout de Zn-S100A7 a récupéré la croissance d’une manière TdfJ-dépendante. Enfin, la figure 2C montre une erreur expérimentale. Dans cet exemple, l’étape de dilution des cultures gonococciques n’était pas suffisante pour épuiser les bactéries des bassins internes de zinc par rapport au volume total de culture dans la microplaque. En tant que tel, la croissance du contrôle négatif a dépassé l’OD souhaitée.
La liaison spécifique des cellules gonococciques entières à leurs ligands respectifs est démontrée par des taches de points provenant de cultures préparées dans des conditions de limitation de métaux et de métal(figure 3). Figure 3A,B montre que les gonocoques cultivés en MDP ont été en mesure de lier CP et S100A7 lors de la production de TdfH et TdfJ, respectivement, en raison de la rareté du zinc. La figure 3C compare la liaison de transferrine, qui est accomplie par les protéines cognate faites à partir des gènes de détection de fer tbpA et tbpB20,quand les gonococci sont cultivés dans Le MDP seul vs GC bouillon moyen traité avec le déferoxamine de chélateur de fer. Ce chiffre montre une reliure accrue de la transferrine par les cultures cultivées en MDP, ce qui est révélateur de niveaux plus élevés d’expression des protéines en raison de la nature plus appauvrie en fer du MDP par rapport au bouillon de GC chélaté.
Figure 1 : Tache occidentale représentative montrant une production différentielle de protéines sensibles au métal. (A) Neisseria gonorrhoeae souche de type sauvage FA19 a été cultivé en MDP complété par ZnSO4, Fe (NO3)3, ou TPEN dans les concentrations indiquées. Après traitement, des cultures ont été cultivées pendant 4 h avant que des lysates entiers de densité normalisée aient été produits et soumis au SDS-PAGE et au ballonnement occidental. Les niveaux de production différentiels pour TdfJ, qui est à la fois réprimé par le zinc et induit par le fer, peuvent être clairement vus en réponse à l’addition/épuisement/épuisement de zinc et à l’addition de fer. (B) Des intensités de signal relatives pour la tache occidentale ont été quanties par densitométrie. Ce chiffre est adapté de Maurakis et al19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Croissance limitée au zinc des gonocoques. La souche de type sauvage FA19, ou mutants isogéniques de cette souche qui ne produisent pas de tdfJ ou de tdfH, ont été cultivées en (A) MDP non traité jusqu’à ce que la phase exponentielle soit atteinte, (B) puis diluée à600 OD 0,02 et (C) OD600 à 0,1. Les échantillons en A ont été traités avec un prémélange contenant de la calprotectine (en haut) ou aucun zinc ajouté (en bas) et cultivés pendant 8 h. Les échantillons en B et En ont été complétés par un prémélange contenant du zinc libre, pas de zinc (5 M TPEN) ou S100A7, et cultivés pendant 6 h. La croissance dans ces conditions n’a été récupérée qu’à la supplémentation des médias avec une source de zinc utilisable, comme le CP, le S100A7, ou le zinc libre en A et B,alors que C n’était pas suffisamment dilué pour épuiser les piscines de zinc cellulaire interne. Figure 2A est adapté de Jean et coll.17Figure 2B est adapté de Maurakis et al19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Les essais de liaison représentatifs montrent ligands hôte liant aux gonocoques métal-stressés. (A) La souche de type sauvage FA1090, ou les mutants de cette souche qui ne produisent pas de tdfJ, tdfH, ou les deux, ont été cultivés en MDP sans métaux supplémentaires et ont été parsemés de nitrocellulose dans des densités normalisées. Les cellules ont été sondées avec la calprotectine, qui est identifiée par le TdfH zinc-sensible, et la liaison a été évaluée par la détection avec un anticorps anti-calprotectin (en haut). La liaison relative de calprotectine a été quantite par densitométrie, montrée ici sur une échelle de journal (en bas). (B) Des expériences de liaison ont été réalisées comme décrit dans A, mais au lieu d’utiliser la souche de type sauvage FA19 et tdfJ mutant et complété souches dans ce fond. Les cellules ont été sondées avec le S100A7 étiqueté HRP, qui est reconnu par le TdfJ. (C) La souche de type sauvage FA19 a été cultivée côte à côte dans le bouillon moyen DeM ou GC avec 25 M deferoxamine ajouté au fer sans chélate, pointillé à la nitrocellulose en quantités normalisées, et sondé e de la transferrine, qui lie le fer-TbpA sensible. Ces tests côte à côte montrent que le MDP, contrairement au bouillon moyen du GC, n’a pas besoin de chélation supplémentaire pour obtenir un environnement limité en fer. Figure 3A est adapté de Jean et coll. et le bas de Maurakis et al19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les médias de croissance joue un rôle varié dans la recherche microbiologique. Les médias spécialisés sont utilisés pour la sélection, l’enrichissement et diverses autres applications pour de nombreux types d’études uniques. Une telle application est l’induction de gènes métal-sensibles, qui est typiquement accompli par l’addition d’un chélateur spécifique qui cible un ion métallique particulier. Cette méthode est limitée, car la quantité de chélation nécessaire pour divers métaux traces est susceptible d’être variable en raison de différentes sources d’eau contenant des profils métalliques uniques, et deux lots du même ingrédient média contenant des concentrations de métaux différentes6. Pour éviter cette lacune inhérente, nous avons décrit la préparation et l’utilisation d’un milieu défini qui est traité avec de la résine Chelex-100 pour enlever tous les métaux traces en vrac, permettant l’ajout contrôlé de métaux spécifiés dans le milieu au besoin.
Dans le protocole actuel, le premier point de discussion important est l’eau source. Le protocole décrit un traitement Chelex qui est suffisant pour enlever les métaux du laboratoire de type 2 (1,0 mégaOhms-cm selon les spécifications ISO 3696) de l’eau. Différentes sources d’eau nécessiteront probablement des traitements Chelex plus courts ou plus longs. Nous avons constaté que l’eau d’une pureté supérieure à celle de type 2, comme l’eau de qualité de biologie moléculaire, ne soutiendra pas la croissance bactérienne dans cette application. Le choix du navire pour la préparation des médias est tout aussi important que la source d’eau. Nous recommandons fortement des récipients en plastique propres, car la verrerie peut lieach ions métalliques dans la solution. Si les plastiques ne sont pas disponibles, la verrerie doit être lavée à l’acide afin de minimiser les risques de contamination. Le même lavage à l’acide est nécessaire pour les flacons de culture lors de l’utilisation de MDP.
La croissance de Neisseria gonorrhoeae dans un cadre in vitro peut être très difficile, comme cet organisme a évolué pour prospérer spécifiquement chez les hôtes humains21. Bien que le MDP soit adapté pour soutenir la croissance pendant toute la durée des expériences, il faut prendre soin des étapes d’inoculation et de dilution pour s’assurer que les gonocoques ne sont pas dans des conditions atmosphériques plus longtemps que nécessaire. En raison de la nature capnophile des gonocoques22 et de sa prédilection pour les températures chez les hôtes humains, nous ne recommandons pas de maintenir les cultures dans des conditions atmosphériques pendant plus de 15 minutes. Si l’événement initial de doublement de masse décrit à l’étape 4.5 de la méthode prend plus de 2 h, il est probable que les cultures gonococciques n’ont pas été manipulées correctement et que l’expérience devrait être avortée.
Bien que cette méthode se concentre sur les méthodes de croissance et de caractérisation de Neisseria gonorrhoeae spécifiquement, l’utilisation de ce MDP spécifique est probablement également approprié pour l’étude d’autres espèces de Neisseria. En outre, il peut être facilement appliqué à la caractérisation d’autres systèmes de détection des métaux dans d’autres bactéries. Par exemple, un média sans métal similaire a été utilisé pour caractériser l’utilisation de métaux dans Staphylococcus aureus23 et Escherichia coli24. L’utilisation de la recette décrite pour d’autres bactéries impliquera probablement de petites modifications ou ajouts, selon les besoins nutritionnels spécifiques des bactéries en question. Par exemple, le supplément VIII est inclus dans la recette pour aider avec le besoin du gonocoque pourleCO 2 supplémentaire . Comme décrit ci-dessus, la croissance est réalisée à 37 oC avec une atmosphère de CO2 de 5 %, mais nous avons constaté que l’ajout de bicarbonate supplémentaire dans les milieux facilite les premières étapes de la croissance gonococcique dans le milieu défini. Pour les organismes qui n’ont pas cette exigence, cet ingrédient peut être omis. Malheureusement, d’autres exemples de ces modifications doivent être déterminés empiriquement.
Malgré la nécessité d’adapter la méthode quelque peu pour une utilisation avec d’autres bactéries, le cadre de base devrait être approprié pour une large utilisation. Caractérisation des gènes sensibles aux métaux et des transporteurs de métaux est une entreprise continue dans l’étude microbienne, avec des bactéries comme Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Haemophilus influenzae29, Salmonella enterica30, et E. coli31 tous recevoir l’attention dans ce créneau. Notre propre utilisation future de cette technique visera à améliorer la compréhension d’autres systèmes d’utilisation des métaux gonococciques au-delà de ceux déjà mentionnés, qui permettent au gonococcus d’acquérir du fer à partir de protéines hôtes telles que la lactoferrine32,33, hémoglobine34,35, et aussi de xénosiderophores bactériens36, et d’élargir nos études sur les effets d’autres métaux tels que le manganèse, qui a été impliqué dans la défense du stress oxydatif par Neisseria12,37.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01 AI125421, R01 AI127793 et U19 AI144182. L’auteur de l’écriture tient à remercier tous les membres du laboratoire qui ont contribué à la relecture et à l’examen de cette méthode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
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