Summary
Wir beschreiben hier eine Methode für das Wachstum von Neisseria gonorrhoeae in metallbeschränkten flüssigen Medien, um die Expression von Genen für die Metallaufnahme zu erleichtern. Wir skizzieren auch nachgelagerte Experimente, um den Phänotyp von Gonokokken zu charakterisieren, die unter diesen Bedingungen angebaut werden. Diese Methoden können angepasst werden, um für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen in anderen Bakterien geeignet zu sein.
Abstract
Spurenmetalle wie Eisen und Zink sind lebenswichtige Nährstoffe, die bekanntermaßen eine Schlüsselrolle in prokaryotischen Prozessen spielen, einschließlich Genregulation, Katalyse und Proteinstruktur. Die Metallsequestrierung durch Wirte führt oft zu Metallbeschränkungen für das Bakterium. Diese Einschränkung induziert bakterielle Genexpression, deren Proteinprodukte es Bakterien ermöglichen, ihre metallbegrenzte Umgebung zu überwinden. Die Charakterisierung solcher Gene ist eine Herausforderung. Bakterien müssen in sorgfältig vorbereiteten Medien angebaut werden, die einen ausreichenden Zugang zu Nährmetallen ermöglichen, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen und gleichzeitig ein Metallprofil beizubehalten, das der Expression der oben genannten Gene förderlich ist. Daher muss ein empfindliches Gleichgewicht für die Konzentrationen dieser Metalle hergestellt werden. Der Anbau eines ernährungsphysiologisch bemittellichen Organismus wie Neisseria gonorrhoeae, der sich entwickelt hat, um nur im menschlichen Wirt zu überleben, fügt eine zusätzliche Komplexität hinzu. Hier beschreiben wir die Herstellung eines definierten metallbegrenzten Mediums, das ausreicht, um Gonokokkenwachstum und die gewünschte Genexpression zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht es dem Prüfer, Eisen und Zink aus unerwünschten Quellen zu chelatieren und gleichzeitig die Medien mit definierten Quellen von Eisen oder Zink zu ergänzen, deren Zubereitung ebenfalls beschrieben wird. Schließlich skizzieren wir drei Experimente, die diese Medien nutzen, um die Proteinprodukte metallregulierter Gonokokkengene zu charakterisieren.
Introduction
Neisseria gonorrhoeae verursacht die häufige sexuell übertragbare Infektion Gonorrhoe. Während der Infektion, pathogene Neisseria drücken ein Repertoire von metallreagierenden Genen, die die Bakterien ermöglichen, Metallrestriktionsbemühungen durch den menschlichen Wirt zu überwinden1,2,3. Spurenmetalle wie Eisen und Zink spielen eine Schlüsselrolle in vielen zellulären Prozessen, wie die Bindung an Enzyme an katalytischen Stellen, die Teilnahme an Redoxreaktionen und als strukturelle Faktoren in verschiedenen Proteinen4,5. Unter metallbegrenzten Bedingungen werden metallresponsive Loci ausgepresst und ihre resultierenden Proteine können den Erwerb dieser Nährstoffe unterstützen. Die Charakterisierung dieser Gene und Proteine stellt eine einzigartige technische Herausforderung für den Forscher dar. Metallionen müssen Bakterien vorenthalten werden, um die Transkription dieser Gene aus ihren nativen Loci zu induzieren, aber eine effektive Chelation dieser Ionen aus metallbeladenen Medien kann schwierig zu optimieren sein. Die verschiedenen Metallprofile von Quellwasser und inhärenten Los-zu-Los-Variation6 von pulverförmigen Zutaten bedeutet, dass die Menge an Chelat erforderlich, um ein bestimmtes Metall aus einem reichen Medium zu entfernen variiert zwischen verschiedenen Standorten, Zutaten Anbieter, und sogar im Laufe der Zeit innerhalb eines einzigen Labors als chemische Inventar ersetzt wird.
Um diese Herausforderung zu umgehen, beschreiben wir die Herstellung eines definierten Mediums, das während der Vorbereitung mit Chelex-100-Harz behandelt wird, um Spurenmetalle aus der Lösung zu entfernen. Dieses Medium ist ausreichend nährstoffreich, um das Wachstum von Gonokokken zu ermöglichen, die außerhalb des menschlichen Wirts schwer zu kultitochern ist, und ermöglicht es dem Prüfer, ein bestimmtes Metallprofil durch Addition eigener definierter Quellen und Konzentrationen von Metalle. Die Methode des kontrollierten Add-back von gewünschten Metallen zu erschöpftem Medium erhöht die experimentelle Konsistenz und ermöglicht robuste, reproduzierbare Experimente unabhängig von Faktoren wie Wasserquelle und chemischen Chargenzahlen. Darüber hinaus kann dieses Medium entweder als Flüssigkeit oder Feststoff mit nur geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden, was es sehr vielseitig macht.
Um den Nutzen dieses Mediums zu demonstrieren, skizzieren wir ein Protokoll für seine Verwendung für gonokokken Wachstum und beschreiben drei erfolgreiche Experimente zur Charakterisierung metallempfindlicher Neisseria-Gene. Zunächst bereiten wir Gonokokken-Vollzelllysate aus metallenen oder ergänzten Kulturen vor und zeigen eine variable Proteinproduktion aus metallresponsiven Loci. Wir skizzieren dann einen zinkbeschränkten Wachstumstest, bei dem das Gonokokkenwachstum durch Supplementierung spezifischer, verwendbarer Zinkquellen gesteuert wird. Schließlich zeigen wir verbindliche Assays, die ganze Gonokokkenzellen zeigen, die metallresponsive Oberflächenrezeptoren exdrücken, die an ihre jeweiligen metallhaltigen Liganden binden. Eine erfolgreiche Oberflächendarstellung dieser Rezeptoren erfordert Wachstum in metallenen, erschöpften Medien.
Das vorliegende Protokoll wurde speziell für Neisseria gonorrhoeaeoptimiert, aber zahlreiche andere bakterielle Krankheitserreger verwenden Metallerfassungsstrategien während der Infektion7, so dass dieses Protokoll für die Untersuchung der Metallhomöostase bei anderen Bakterien angepasst werden kann. Die Optimierung dieser Medien und dieser experimentellen Protokolle für den Einsatz in anderen Bakterien erfordert wahrscheinlich eine leichte Änderung der Metallchelatorkonzentrationen und/oder Behandlungszeit mit Chelex-100, da andere Bakterien leicht andere Metallanforderungen als Gonococcus haben können. Eisen und Zink sind die Hauptmetalle, die für die beschriebenen Untersuchungen von Belang sind, aber andere Metalle (z. B. Mangan) wurden als kritisch für Bakterien nachgewiesen, einschließlich Neisseria8,9,10,11,12. Darüber hinaus wurden ähnliche Methoden für Metallcharakterisierungen in der eukaryotischen Zellkulturarbeit beschrieben, die ebenfalls in Betracht gezogen werden können. 13
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Protocol
1. Vorbereitung von Chelex-behandelten Defined Medium (CDM) Stock Solutions
- Lagerlösung I
- Kombinieren Sie NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) und KH2PO4 (10,9 g) in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L.
- Filter sterilisieren die Lösung und aliquot in 50 ml konische Rohre.
- Bei -20 °C lagern.
- Lagerlösung II
- Thiamin HCl (0,2 g), Thiaminpyrophosphat-Cl (0,05 g), Calciumpantothenat (0,19 g) und Biotin (0,3 g) in 50% (vol/vol) Ethanol zu einem Endvolumen von 1 L kombinieren.
- Aliquot in 50 ml konische Rohre und lagern bei -20 °C.
- Lagerlösung III
- Kombinieren Sie L-Aspartat (4,0 g), L-Glutamat (10,4 g), L-Arginin (1,2 g), Glycin (0,2 g), L-Serin (0,4 g), L-Leucin (0.) 72 g), L-Isoleucin (0,24 g), L-Valin (0,48 g), L-Tyrosin (0,56 g), L-Prolin (0,4 g), L-Tryptophan (0,64 g), L-Threonin (0,4 g), L-Phenylalanin (0,2 g), L-Asparagin-H2O (0,2 g), L-Glutamin (0,4 g), L-Histidin-HCl (0 .2 g), L-Methionin (0,12 g), L-Alanin (0,8 g), L-Lysin (0,4 g) und reduziertes Glutathion (0,36 g) in 500 ml entionisiertem Wasser.
- L-Cystein (0,44 g) und L-Cystin (0,28 g) in einem minimalen Volumen (ca. 1 ml) von 1 M HCl auflösen und der oben genannten Aminosäurelösung hinzufügen.
- Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit 10 N NaOH ein, bis sich alle Partikel auflösen. Der endgültige pH-Wert wird 10.0–11.0 sein.
- Bringen Sie das endige Volumen auf 1 L mit entionisiertem Wasser.
- Filter sterilisieren die Lösung und aliquot in 250 ml Volumen.
- Bei -20 °C lagern.
- Lagerlösung IV
- Glukose (200 g) in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L auflösen.
HINWEIS: Die Lösung muss möglicherweise erhitzt werden, um die Glukose aufzulösen. - Filter sterilisieren und aliquotdien die Lösung in 50 ml konische Rohre.
- Bei -20 °C lagern.
- Glukose (200 g) in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L auflösen.
- Lagerlösung V
- Hypoxanthin (5,0 g), Uracil (5,0 g) und NaOH (4,0 g) in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L kombinieren.
- Filter sterilisieren und aliquot in 50 ml konische Rohre.
- Bei -20 °C lagern.
- Lösung VI
- Bereiten Sie eine 1 M CaCl2-2H2 O(147 g/l) Lösung in entionisiertem Wasser vor. Filter sterilisieren und bei Raumtemperatur (RT) lagern.
- Lagerlösung VII
- Bereiten Sie eine 1 M wasserfreie MgSO4 Lösung in entionisiertem Wasser vor. Filter sterilisieren und bei RT lagern.
- Lagerlösung VIII
- Bereiten Sie eine 1 M NaHCO3 Lösung in entionisiertem Wasser vor. Filter sterilisieren und bei RT lagern.
2. Herstellung von 4x Sterilkonzentrat und 1x CDM
HINWEIS: Dieses Verfahren ist entweder in säurebehandeltem sterilem Glas oder Kunststoff durchzuführen, um das Auslaugen von Metallen in die Lösungen zu verhindern.
- Lagerlösungen I (50 ml), II (20 ml), III (250 ml), IV (50 ml) und V (20 ml) mit 20,0 g HEPES kombinieren und zum Mischen rühren.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, und bringen Sie dann das Endvolumen mit entionisiertem Wasser auf 500 ml.
- Chelex-100 Harz in 1 L entionisiertem Wasser waschen, um Konservierungsstoffe zu entfernen, bevor Sie es dem 4x sterilen Konzentrat zufügt. Nehmen Sie das Wasser durch Vakuumfiltration ab und verwenden Sie dieses gewaschene Harz für Schritt 2.4.
- 50 g Harz zugeben und genau 90 min langsam umrühren.
- Harz durch Filtersterilisation entfernen und 4x steriles Konzentrat bei 4 °C lagern.
- Um eine 1x Arbeitskonzentration von CDM vorzubereiten, verdünnen Sie zuerst das 4x-Konzentrat mit sterilem entionisiertem Wasser, und fügen Sie dann Lösung VI (125 l pro 500 ml 1x Lösung), Lösung VII (535 l pro 500 ml) und Lösung VIII (10 ml pro 500 ml) hinzu.
HINWEIS: Obwohl alle Lagerlösungen bereits sterilisiert wurden, wird empfohlen, die 1x-Lösung nach der Zubereitung wieder zu filtern.
3. Herstellung von CDM-Platten
HINWEIS: Das Rezept unten macht 1 L-Medien für Teller, aber es ist am besten, diese in kleineren Bänden vorzubereiten. Alles wird proportional verkleinert.
- Gewaschene Agarose
- 50 g Agarose in 1 L entionisiertem Wasser unter Rühren für 1 h auflösen.
- Die Lösung bei 15 min bei RT auf eine Zentrifugenflasche und Zentrifuge mit 1.200 x g geben. Den Überstand vorsichtig abgießen und entsorgen.
- Fügen Sie ausreichend entionisiertes Wasser hinzu, um das Agarosepellet wieder aufzuhängen, und übertragen Sie es dann in einen 1 L-Kolben. Auf ein Endvolumen von 1 L mit entionisiertem Wasser bringen und dann rühren und zentrifugieren wie in Schritt 3.1.2. Entsorgen Sie den Überstand.
- Fügen Sie ausreichend 100% Ethanol hinzu, um das Pellet wieder auszusetzen, und dann in einen neuen 1 L-Kolben geben. Bringen Sie auf ein endgültiges Volumen von 1 L mit Ethanol. Rühren und Zentrifugen wie in Schritt 3.1.2.
- Wiederholen Sie Schritt 3.1.4.
- Methanol zum Wiederaufsetzen des Agarosepellets geben und dann in einen 1 L-Kolben geben. Mit Methanol auf ein Endvolumen von 1 L bringen. Rühren und Zentrifugen wie in Schritt 3.1.2.
- Wiederholen Sie Schritt 3.1.6.
- Übertragen Sie gewaschene Agarose auf ein Tablett mit Aluminiumfolie ausgekleidet und lassen Sie in einer Rauchhaube trocknen. Im Trockenen in einen metallfreien Behälter zur Langzeitlagerung geben.
- 10 g gewaschene Agarose und 5 g Kartoffelstärke zu 750 ml entionisiertem Wasser geben.
- Autoklav für 30 min bei 121 °C, 100 kPa über atmosphärischem Druck.
- Lassen Sie die Medien auf 65 °C abkühlen, dann fügen Sie 250 ml 4X CDM, 250 l Lösung VI, 1,07 ml Lösung VII und 20 ml Lösung VIII hinzu.
- Falls gewünscht, fügen Sie die Metalle der Wahl vor dem Gießen Platten. Die Zugabe von Chelatoren ist nicht notwendig, um metallfreie Bedingungen zu erhalten.
- Gießen Sie in Petri-Gerichte und lassen Sie zu erstarren.
4. Metall begrenztes Wachstum der Neisseria gonorrhoeae
HINWEIS: Für die meisten Anwendungen ist es nicht notwendig, die Bakterien vor der Impfung von CDM zu belasten. Der anfängliche Verdopplungsschritt in CDM und die anschließende Verdünnung reichen aus, um die Gonokokken ihrer internen Eisen- und Zinklager zu erschöpfen. Als solche werden die ersten beiden Schritte des folgenden Verfahrens mit Agarplatten aus GC-Medium-Basis durchgeführt, die mit Kelloggs Beilage I14 und 12,5 M Fe(NO3)3ergänzt wurden. Wenn eine frühe Metallspannung gewünscht wird, empfehlen wir die Vorbereitung von GC-Mittelgrundplatten ohne Fe(NO3)3 und mit 5 M TPEN (N,N,N',N'-Tetrakis (2-Pyridylmethyl) Ethylendiamin) für die Zinkchelation oder 10 M Deferoxamin zur Eisenchelung. Die gesamte Inkubation erfolgt bei 37 °C mit 5%CO2.
- Zwei Tage vor dem Experiment, am Tag -2, Streifen Gonokokken von Gefriervorräten auf GC Mittelplatten und inkubieren für nicht mehr als 24 h.
- Am Tag -1, Streifen einzelne Kolonien auf frische GC mittlere Teller. Versuchen Sie, dies 14-16 h vor dem Wachstumsexperiment zu tun.
- Am Tag des Experiments 5–10 ml 1x CDM zu einem säuregewaschenen 125 ml verwirrten Seitenarmkolben hinzufügen (Ergänzende Abbildung 1) und verwenden Sie diese, um ein Klett-Kolorimeter zu leeren.
- Verwenden Sie einen sterilen, mit Baumwolle gekippten Tupfer, um CDM aus gesunden, einzelnen Kolonien zu impfen. Ziel für 20 Klett-Einheiten.
HINWEIS: Wenn kein Klett-Kolorimeter verfügbar ist, ist auch ein Spektralphotometer geeignet. Es gibt keine universelle Konvertierungsformel für Klett-Einheiten in OD, aber eine grobe Führung ist verfügbar (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - Inkubieren mit Schütteln bei 250 Rpm bis etwa eine Massenverdoppelung (40 Klett-Einheiten). Dies sollte zwischen 1-2 h dauern.
- An diesem Punkt werden die Kulturen wieder verdünnt, indem ein ausreichendes CDM-Volumen hinzukommt, um die Hälfte der anfänglichen Kulturdichte zu erreichen (z. B. wenn 5 ml Kultur von 20 auf 40 Klett-Einheiten gegangen sind, 15 ml CDM es wieder auf 10 Klett-Einheiten bringen) und das Wachstum wird sich fortsetzen. wie in Schritt 4.5. Die spezifische Menge an Rückenverdünnung, Metallbehandlungen usw. hängt von nachgelagerten Anwendungen ab. Wir nennen unten drei Beispiele (Abschnitte 5, 6 oder 7).
5. Westliche Analyse von metallresponsiven Genprodukten
- Ab Schritt 4.6 die Kulturen mit drei CDM-Volumen (z.B. 15 ml CDM bei Abbeginn mit 5 ml) zurück verdünnen. Fügen Sie an dieser Stelle Metallbehandlungen hinzu, wenn gewünscht.
- Eisensensing-Gene können mit 12,5 'M Fe(NO3)3verdrängt werden. Zink-responsive Gene können mit 10 M ZnSO4derepressed werden.
- Zusätzliche Eisen- oder Zinkspannung ist nicht notwendig, da die Medien bereits erschöpft sind, so dass bereits reaktionsfähige Gene ausgedrückt werden. Wenn weiterer Stress gewünscht wird, empfehlen wir nicht mehr als 1 –2 M Deferoxamin oder TPEN, da übermäßiger Stress das Wachstum von Kulturen verhindert.
- Wachsen Sie Kulturen wie in Schritt 4.5 für 4 h und erfassen Sie die endgültige Zelldichte der Proben. Weniger metallbelastete Kulturen werden zu höheren Enddichten heranwachsen.
- Standardisieren Sie Kulturen auf eine geeignete Dichte und bereiten Lysate vor.
- Standardisieren Sie Ganzzelllysate auf eine Dichte, die 100 Klett-Einheiten in 1 ml Kultur entspricht. Teilen Sie dazu 100 durch die Klett-Einheitendichte Ihrer Probe. Die Zahl, die Sie erhalten, ist das Volumen der Kultur in mL, die verwendet wird, um das Zellpellet herzustellen.
- Befolgen Sie die standardsDS-PAGE und die Western Blotting-Verfahren15, um nach Proteinen von Interesse zu suchen.
6. Metallbegrenzte Wachstumstests
HINWEIS: Diese Assays beschreiben vorgefertigte Wachstumsvormischungen. Die Herstellung dieser Mischungen wird in Abschnitt 8 beschrieben.
- Während der Massenverdoppelung in Schritt 4.5 die Brunnen einer 96-Well-Mikroplatte mit 10x Vormischungen pziehen. Weisen Sie außerdem drei Bohrungen als Rohlinge aus. Zu diesen Bohrungen fügen Sie 10 l 10x Premix und 90 l CDM hinzu.
- Sobald sich die Kulturen in den Seitenarmkolben verdoppelt haben, fügen Sie 100 l jeder Kultur zu einem ungenutzten Brunnen in der Mikroplatte hinzu und messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600). Dies kann mit Küvetten in einem Spektralphotometer getan werden, aber mit einer größeren Anzahl von Stämmen innerhalb eines Assays kann dies umständlich werden und wird in der Regel nicht empfohlen, es sei denn, Ihr Spektralphotometer kann direkt vom Arm des Seitenarmkolbens messen (Ergänzungsabbildung 2).
- Legen Sie die Kolben während der Messung des OD wieder in den Inkubator, um sicherzustellen, dass die Gonokokken lebensfähig bleiben.
- Berechnen Sie die richtige Verdünnungsmenge, die erforderlich ist, um die Kulturen auf OD600 = 0,02 zu bringen. Die 10x Premixe haben eine vernachlässigbare Wirkung auf OD und können bei der Berechnung weggelassen werden.
- Kulturen mit CDM in kleinen Kulturröhren verdünnen und genügend Volumen hinzufügen, um die 10x Premixe auf 1x in der Platte zu verdünnen. Wenn ein Plattenwärmer vorhanden ist, halten Sie die Platte während der Arbeit bei 37 °C.
- Inkubieren Sie die Platte für 8-12 h mit Schütteln in einem Plattenleser, wobei OD600 Messungen in gewünschten Intervallen durchgeführt werden.
7. Detektion der Ligandbindung durch Äußere Membran-Metalltransporter
- Behandeln Sie Kulturen wie in Schritt 5.1 gewünscht, dann mit Schütteln für 4 h bebrüten.
- Kurz vor der 4-h-Marke drei Stück Filterpapier und ein Stück Nitrocellulose auf die ungefähre Größe schneiden, die benötigt wird, um in ein Punktblot-Gerät zu passen (Ergänzende Abbildung 3). Die Nitrocellulose in entionisiertem Wasser vorträglich einweichen und dann das Gerät mit Filterpapier unter der Nitrocellulose montieren.
- Zeichnen Sie bei 4 h die Zelldichten auf und standardisieren Sie sie auf eine entsprechende Enddichte. Es wird empfohlen, in Schritt 5 die für die Herstellung der Zelllysate verwendete Dichte von 10 % zu verwenden. Wenn Sie z. B. 100 KU in 1 ml für die Lysate verwenden, bedeutet dies für diese Flecken 10 KU in 1 ml. Die Berechnung ist ansonsten die gleiche wie in 5.3.1 beschrieben, und Kulturen werden direkt der Nitrocellulose in den berechneten Volumina hinzugefügt, anstatt zu Lysaten zu machen.
- Pipettenzellkulturen auf die Nitrocellulose und lassen genügend Zeit, damit das Filterpapier die gesamte Flüssigkeit aufnehmen kann.
- Zerlegen Sie das Gerät, lassen Sie den Fleck trocknen und blockieren Sie die Nitrocellulosemembran für 1 h in 5% Rinderserumalbumin oder fettfreier Milch (w/v) in Tris-gepufferter Kochsaline.
- Setzen Sie das Punktblot-Gerät wieder zusammen und ersetzen Sie das Filterpapier durch Paraffinfolie, um eine auslaufsichere Dichtung unter der Nitrocellulose zu erzeugen.
- Verdünnen Sie den metallbindenden Liganden von Interesse auf 0,2 m in Blocker- und Sondenzellen für 1 h.
- Siphon aus der Flüssigkeit mit einem Vakuum, waschen Sie den Fleck, dann folgen Sie Standard-immunologischen Verfahren, um das Signal zu entwickeln16. Die Waschschritte können in oder aus dem Gerät durchgeführt werden.
8. Metallbeladung von Transferrin, S100A7 und Calprotectin und Vorbereitung von 10x Premixes
HINWEIS: Verwenden Sie wie bei der CDM-Zubereitung säuregewaschenes Glas oder Kunststoff zur Lösungsvorbereitung.
- Menschliches Transferrin bei 10 mg/ml (125 m) im Anfangspuffer auflösen (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 8,4). S100A7 und Calprotectin werden im Puffer aus 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM CaCl2, pH = 8,0) aufgehängt.
- Ferrationslösung (100 mM Natriumcitrat, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH = 8,4) zur Transferrinlösung hinzufügen, um eine Eisensättigung von 30 % zu erreichen (z. B. ist eine Ferrationslösung von 75 l für 5 ml Transferrin geeignet, wenn sie bei 10 mg/ml hergestellt wird).
- Fügen Sie ZnSO4 zu S100A7 oder Calprotectin in einem 50%-Molarenverhältnis zum Protein hinzu, um eine 25%ige Sättigung zu erzeugen (jedes Proteinmolekül hat zwei Metallbindungsstellen). Es können Präparate von 100 m S100A7 oder Calprotectin mit 50 m ZnSO4 verwendet werden.
- In beiden Fällen können Sie eine End-over-End-Mischung für mindestens 1 h für die Metallbeladung zulassen.
- Bereiten Sie 4 L Dialysepuffer (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 7.4). Teilen Sie diese in zwei separate 2 L-Volumen auf und platzieren Sie einen bei 4 °C.
- Fügen Sie die mit Metall beladenen Proteine mit einer Spritze in eine Dialysekassette und dialysieren Sie gegen das erste Puffervolumen für 4 h bei RT.
- Bewegen Sie die Kassette auf das zweite Puffervolumen und dialysieren Sie über Nacht bei 4 °C. Nach diesen Schritten sollten alle ungebundenen Metalle entfernt werden.
HINWEIS: Wir empfehlen einem Bicinchoninsäure-Assay, um Proteinkonzentrationen nach der Dialyse zu bestimmen. - Verwenden Sie einen 10x Transferrin Premix für die Transferrin-Nutzung als einzige Eisenquelle.
- Bereiten Sie diesen Vormix vor, indem Sie 30 % menschliches Fe-Transferrin und Rinderapo-Transferrin (zubereitet bei 125 M, wie für humanes Transferrin beschrieben, ohne Eisenladeschritt) auf 75 m bzw. 30 m in PBS verdünnen. Ein Positiv-Kontroll-Premix ersetzt 30% Fe-Transferrin durch 75 'M Fe(NO3)3, und ein Negativ-Control-Premix lässt jegliches zugesetzte Eisen aus und behält nur das Rinder-Apo-Transferrin bei. Im Wachstumstest 10 l dieser Konzentrate mit 90 l Kultur verdünnen. Die Endkonzentrationen betragen 7,5 m 30 % humanes Fe-Transferrin und 3 m Rinderapo-Transferrin.
- Verwenden Sie eine modifizierte Version des Transferrin 10x Premix für S100A7 oder Calprotectin-Nutzung als einzige Zinkquelle.
- Für einen Positiv-Control-Premix 50 'M ZnSO4 in den Transferrin-Premix einbauen. Für eine Negativkontrolle 50 M TPEN enthalten und das Zink weglassen. Nehmen Sie dann 10 l von jedem von ihnen für jede Probe gut benötigt, und bewegen Sie dieses Volumen in ein neues Rohr. Hinzu kommt halb so viel Volumen an sterilem PBS. Wenn z. B. 10 Bohrungen den Positivkontroll-Premix erhalten, nehmen Sie 100 l Premix, verschieben Sie ihn in ein neues Rohr, und fügen Sie 50 L PBS hinzu. Tun Sie dasselbe für die Negativkontrolle.
- Um den S100A7- oder Calprotectin-Vormix herzustellen, nehmen Sie 10 l des Negativ-Kontroll-Premixpro-Werts pro benötigter Bohrung, bewegen Sie sich in ein neues Rohr und fügen Sie die Hälfte des Volumens des 25% Zn-S100A7 oder Calprotectin hinzu. Verwenden Sie im Wachstumstest 15 l Vormischung und verdünnen Sie sie mit 85 l Kultur. Die Endkonzentrationen für die Transferrine bleiben die gleichen wie in Schritt 8.5, mit einem zusätzlichen Wert von 5 M Zn, TPEN oder S100A7/Calprotectin.
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Representative Results
Ein spezifisches definiertes Medium in Ermangelung von Spurenmetallen für das Wachstum von Neisseria gonorrhoeae wurde entwickelt und für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen und deren Genprodukten implementiert. Im optimierten Protokoll wird das Metallprofil von Medien durch Zugabe von Metallen nach Ermessen des Prüfers gesteuert, anstatt durch titrierte Chelatung eines Metallziels, was eine erhöhte Kontrolle und Konsistenz von Labor zu Labor und Experiment zum Experimentieren ermöglicht. Dieses Medium kann sowohl im flüssigen als auch im festen Zustand eingesetzt werden, was es vielseitig in vielen experimentellen Setups macht.
Die differenzielle Proteinproduktion in variablen Metallkonzentrationen ist in den mitgerechneten repräsentativen westlichen Flecken zu sehen (Abbildung 1). Das Bild zeigt die zinkreagierenden Außenmembrantransporter TdfJ und TdfH, die als Reaktion auf die Zinkchelation durch TPEN hochreguliert wurden. TdfJ war im Wesentlichen nicht nachweisbar, wenn Zink wieder in die Medien aufgenommen wurde, und TdfH war knapp. Darüber hinaus ist bekannt, dass der tdfJ-Promotor durch Eisen induziert und nicht unterdrückt wird. Dies ist auch im Fleck sichtbar. Diese Flecken nutzten das eisenresponsive Lipoprotein TbpB2 als Ladekontrolle. Unter den Bedingungen des Eisenzusaums wurde die TbpB-Produktion reduziert.
Metallbegrenzte Wachstumstests zeigen die Verwendung spezifischer, definierter Zinkquellen durch den Gonokokken (Abbildung 2). Abbildung 2A zeigt N. gonorrhoeae, die in Gegenwart von Zn-belastetem Calprotectin (CP) wächst, was die Wirkung des zinkresponsiven TdfH17,18erfordert. Wenn keine verwertbare Zinkquelle verfügbar war, entweder durch keinen Zinkzusatz oder durch das Fehlen von TdfH, wurde das Wachstum eingeschränkt. Abbildung 2B zeigt ähnliche Ergebnisse in Gegenwart von S100A7, das als einzige Zinkquelle dienen kann, wenn der äußere Membrantransporter TdfJ produziert wird19. In Anwesenheit von TPEN allein oder wenn TdfJ fehlte, wurde das Wachstum behindert, aber die Zugabe von Zn-S100A7 erholte sich in einer TdfJ-abhängigen Weise. Schließlich zeigt Abbildung 2C einen experimentellen Fehler. In diesem Beispiel reichte der Verdünnungsschritt der Gonokokkenkulturen nicht aus, um die Bakterien interner Zinkbecken relativ zum Gesamtkulturvolumen in der Mikroplatte zu dezimieren. Damit übertraf das Wachstum der Negativkontrolle die gewünschte OD.
Die spezifische Bindung ganzer Gonokokkenzellen an ihre jeweiligen Liganden wird durch Punktflecken aus Kulturen nachgewiesen, die unter metallbegrenzenden und metallenen Replete-Bedingungen hergestellt wurden (Abbildung 3). Abbildung 3A,B zeigt, dass in CDM angebaute Gonokokken CP und S100A7 bei der Herstellung von TdfH bzw. TdfJ aufgrund von Zinkknappheit binden konnten. Abbildung 3C vergleicht die Transferrinbindung, die durch die Cognate-Proteine aus den Eisen-Sensing-Genen tbpA und tbpB20erreicht wird, wenn Gonokokken allein in CDM angebaut werden, im Vergleich zu GC-Mediumbrühe, die mit dem Eisenchelator deferoxamin behandelt wird. Diese Abbildung zeigt eine erhöhte Bindung von Transferrin durch Kulturen, die in CDM angebaut werden, was auf eine höhere Proteinexpression aufgrund der stärker eisenabbauigen Natur von CDM im Vergleich zu chelatierter GC-Brühe hindeutet.
Abbildung 1: Repräsentativer westlicher Fleck, der die differenzielle Produktion von metallresponsiven Proteinen zeigt. (A) Neisseria gonorrhoeae wild type stamm FA19 wurde in CDM angebaut, ergänzt durch ZnSO4, Fe(NO3)3, oder TPEN in den angegebenen Konzentrationen. Nach der Behandlung wurden Kulturen für 4 h angebaut, bevor Ganzzelllysate mit standardisierter Dichte produziert und SDS-PAGE und Western Blotting unterzogen wurden. Die differenzielle Produktion von TdfJ, das sowohl durch Zink unterdrückt als auch durch Eisen induziert wird, kann als Reaktion auf Zinkzugabe/-erschöpfung und Eisenzugabe deutlich gesehen werden. (B) Relative Signalintensitäten für den westlichen Fleck wurden über den Densitometrie-Wert quantifiziert. Diese Figur ist von Maurakis et al19adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Zinkbegrenztes Wachstum von Gonokokken. Wildstamm FA19, oder isogene Mutagene dieser Sorte, die keine tdfJ oder tdfH produzieren, wurden in (A) unbehandeltem CDM angebaut, bis die exponentielle Phase erreicht war, (B) dann wieder auf OD600 = 0,02 und (C) OD600 = 0,1 verdünnt. Die Proben in A wurden mit Vormischungen behandelt, die Calprotectin (oben) oder kein zugesetztes Zink (unten) enthalten und für 8 h angebaut werden. Die Proben in B und C wurden mit Vormischungen ergänzt, die freies Zink, kein Zink (5 M TPEN) oder S100A7 enthalten, und für 6 h angebaut. Das Wachstum unter diesen Bedingungen wurde nur bei Derkomponation von Medien mit einer verwendbaren Zinkquelle wie CP, S100A7 oder freiem Zink in A und Bwiederhergestellt, während C nicht ausreichend verdünnt wurde, um interne zelluläre Zinkbecken zu erschöpfen. Abbildung 2A ist von Jean et al.17figur2B von Maurakis et al19adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Repräsentative Bindungstests zeigen Host-Liganden, die an metallbelastete Gonokokken binden. (A) Wild-Stamm FA1090, oder Mutanten dieser Sorte, die nicht produzieren tdfJ, tdfH, oder beides, wurden in CDM ohne zusätzliche Metalle angebaut und wurden auf Nitrocellulose in standardisierten Dichten gepunktet. Die Zellen wurden mit Calprotectin untersucht, das vom zinkresponsiven TdfH erkannt wird, und die Bindung wurde durch Nachweis mit einem Anti-Calprotectin-Antikörper (oben) bewertet. Die relative Calprotectinbindung wurde über densitometrie quantifiziert, hier auf einer Log-Skala (unten). (B) Bindungsexperimente wurden wie in Abeschrieben durchgeführt, stattdessen jedoch mit dem FA19-Wildstamm und tdfJ-Mutanten und ergänzten Stämmen in diesem Hintergrund. Die Zellen wurden mit HRP-beschrifteter S100A7 untersucht, die vom zinkresponsiven TdfJ erkannt wird. (C) Wild-Stamm FA19 wurde nebeneinander in CDM- oder GC-Mittelbrühe mit 25 M Deferoxamin zu Chelat freiem Eisen angebaut, zu Nitrocellulose in standardisierten Mengen gepunktet und mit Transferrin gesont, das die eisenempfindliche TbpA bindet. Diese Side-by-Side-Tests zeigen, dass CDM, im Gegensatz zu GC-Medium-Brühe, keine zusätzliche Chelation benötigte, um eine eisenbegrenzte Umgebung zu erreichen. Abbildung 3A ist von Jean et al. und der Boden von Maurakis et al19adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wachstumsmedien spielen eine Vielzahl von Rollen in der mikrobiologischen Forschung. Spezialisierte Medien werden für die Auswahl, Anreicherung und verschiedene andere Anwendungen für viele einzigartige Arten von Studien verwendet. Eine solche Anwendung ist die Induktion von metallresponsiven Genen, die in der Regel durch Zugabe eines bestimmten Chelators erreicht wird, der auf ein bestimmtes Metallion abzielt. Dieses Verfahren ist begrenzt, da die für verschiedene Spurenmetalle erforderliche Chelatmenge aufgrund unterschiedlicher Wasserquellen, die eindeutige Metallprofile enthalten, und zwei Partien derselben Medienzutat, die unterschiedliche Metallkonzentrationen enthalten, wahrscheinlich variabel ist6. Um dieses inhärente Manko zu vermeiden, haben wir die Herstellung und Verwendung eines definierten Mediums beschrieben, das mit Chelex-100-Harz behandelt wird, um alle Spurenmetalle in loser Schüttung zu entfernen, so dass die kontrollierte Zugabe bestimmter Metalle nach Bedarf wieder in das Medium aufgenommen werden kann.
Im aktuellen Protokoll ist der erste wichtige Diskussionspunkt das Quellwasser. Das Protokoll beschreibt eine Chelex-Behandlung, die ausreicht, um Metalle aus dem LaborTyp 2 (1,0 MegaOhms-cm nach ISO 3696-Spezifikationen) Wasser zu entfernen. Verschiedene Wasserquellen werden wahrscheinlich kürzere oder längere Chelex-Behandlungen erfordern. Wir haben festgestellt, dass Wasser mit höherer Reinheit als Typ 2, wie z. B. wasser der Molekularbiologie, das Bakterienwachstum in dieser Anwendung nicht unterstützen wird. Die Wahl des Gefäßes für die Medienaufbereitung ist ebenso wichtig wie die Wasserquelle. Wir empfehlen saubere Kunststoffbehälter, da Glaswaren Metallionen in die Lösung auslaugen können. Wenn keine Kunststoffe verfügbar sind, muss Glaswaren säuregewaschen werden, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren. Die gleiche Säurewäsche ist für Kulturkolben bei der Verwendung von CDM erforderlich.
Das Wachstum von Neisseria gonorrhoeae in einer In-vitro-Umgebung kann ziemlich herausfordernd sein, da dieser Organismus sich entwickelt hat, um speziell in menschlichen Wirten zu gedeihen21. Während CDM geeignet ist, das Wachstum für die Dauer der Experimente zu unterstützen, muss während der Impf- und Verdünnungsschritte darauf geachtet werden, dass Gonokokken nicht länger als nötig unter atmosphärischen Bedingungen stehen. Aufgrund der kapnophilen Natur von gonococci22 und seiner Vorliebe für Temperaturen, die in menschlichen Wirten zu finden sind, empfehlen wir nicht, Kulturen länger als 15 min unter atmosphärischen Bedingungen zu halten. Wenn das in Schritt 4.5 der Methode beschriebene anfängliche Massenverdopplungsereignis länger als 2 h dauert, ist es wahrscheinlich, dass Gonokokkenkulturen nicht richtig behandelt wurden und das Experiment abgebrochen werden sollte.
Während der Schwerpunkt dieser Methode auf Methoden für das Wachstum und die Charakterisierung von Neisseria gonorrhoeae speziell liegt, ist die Verwendung dieses spezifischen CDM wahrscheinlich auch für die Untersuchung anderer Neisseria-Arten geeignet. Darüber hinaus kann es leicht auf die Charakterisierung anderer Metallsensorsysteme in anderen Bakterien angewendet werden. Zum Beispiel wurde ein ähnliches metallfreies Medium verwendet, um die Metallaufnahme in Staphylococcus aureus23 und Escherichia coli24zu charakterisieren. Die Verwendung des beschriebenen Rezepts für andere Bakterien wird wahrscheinlich kleine Modifikationen oder Zusätze beinhalten, abhängig von den spezifischen Ernährungsbedürfnissen der betreffenden Bakterien. Zum Beispiel, Ergänzung VIII ist in der Rezeptur enthalten, um mit dem Gonococcus' Bedarf an zusätzlichenCO2zu helfen. Wie oben beschrieben, wird das Wachstum bei 37 °C mit einer 5%CO2-Atmosphäre durchgeführt, aber wir haben festgestellt, dass die Zugabe von zusätzlichem Bicarbonat in den Medien die Anfangsstadien des Gonokokkenwachstums in definiertem Medium unterstützt. Bei Organismen ohne solche Anforderung kann diese Zutat weggelassen werden. Leider müssen weitere Beispiele für diese Änderungen empirisch ermittelt werden.
Trotz der Notwendigkeit, die Methode für die Verwendung mit anderen Bakterien etwas anzupassen, sollte der Grundrahmen für eine breite Anwendung geeignet sein. Die Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metalltransportern ist ein laufendes Unterfangen in der mikrobiellen Studie, mit Bakterien wie Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Haemophilus influenzae29, Salmonella enterica30und E. coli31, die alle Aufmerksamkeit in dieser Nische erhalten. Unsere eigene zukünftige Nutzung dieser Technik wird darauf abzielen, das Verständnis anderer gonokokken Metallaufnahmesysteme über die bereits erwähnten hinaus zu fördern, die es dem Gonokokken ermöglichen, Eisen aus Wirtsproteinen wie Lactoferrin32,33, Hämoglobin34,35, und auch aus bakteriellen Xenosiderophoren36zu erwerben und unsere Studien über die Auswirkungen anderer Metalle wie Mangan zu erweitern, das in die oxidative Stressabwehr involviert ist von Neisseria12,37.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R01 AI125421, R01 AI127793 und U19 AI144182 unterstützt. Der Autor des Schreibens möchte allen Labormitgliedern danken, die zum Korrekturlesen und Überprüfen dieser Methode beigetragen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
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