Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מתכת-צמיחה מוגבלת של הגגורסריה של ניציבטיים לאפיון של גנים מתכתיים מגיבים ורכישת מתכות מהמארח ליגנדס

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60903
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Biomedical Sciences, Georgia State University

Summary

אנו מתארים כאן שיטה לצמיחה של זיבה Neisseria במדיום נוזלי מוגבל מתכת כדי להקל על ביטוי של גנים ספיגת מתכת. כמו כן, אנו מגדירים במטה ניסויים לאפיון הפנוטיפ של גונקוצ'י שגדל בתנאים אלה. שיטות אלה ניתן להתאים כדי להיות מתאים לאפיון של גנים התגובה מתכת בחיידקים אחרים.

Abstract

עקבות מתכות כגון ברזל ואבץ הם חומרים מזינים חיוניים הידועים לשחק תפקידי מפתח בתהליכים prokaryotic כולל רגולציה גנטית, זרז, מבנה החלבון. קיבוע על מתכת על ידי מארחים מוביל לעתים קרובות הגבלת מתכת עבור החיידק. מגבלה זו מעוררת ביטוי גנים חיידקי אשר מוצרי החלבון שלהם מאפשרים לחיידקים להתגבר על הסביבה מתכת מוגבלת שלהם. אפיון של גנים כאלה הוא מאתגר. חיידקים יש לגדל במדיה מוכנה בקפדנות המאפשרת גישה מספקת מתכות תזונתיות כדי לאפשר גידול חיידקי תוך שמירה על פרופיל מתכת התורמת להשגת ביטוי של הגנים הנ ל. ככזה, יש להקים איזון עדין בריכוזים של מתכות אלה. גידול אורגניזם בררן מבחינה תזונתית, כגון גונדו,שהתפתח לשרוד רק בפונדקאי האנושי, מוסיף רמה נוספת של מורכבות. כאן, אנו מתארים את ההכנה של המדיום מוגבל מתכת מוגבלת מספיק כדי לאפשר צמיחת דלקת ואת הביטוי הגן הרצוי. שיטה זו מאפשרת לחוקר ברזל ואבץ ממקורות בלתי רצויים, תוך הגדלת המדיה עם מקורות ברזל או אבץ, שהכנתה מתוארת גם כן. בסופו של דבר, אנו מתווה שלושה ניסויים המשתמשים במדיה זו כדי לעזור לאפיין את מוצרי החלבון של הגנים המוסדרים מתכת המתכת.

Introduction

גונדוניים גורם לזיבה השכיחה. של זיהום מינית במהלך הדלקת, Neisseria הפתוגניים מבטא רפרטואר של גנים מגיבים מתכת המאפשרים לחיידקים להתגבר על מאמצי הגבלת מתכת על ידי הפונדקאי האנושי1,2,3. מעקב אחר מתכות כמו ברזל ואבץ תפקידי מפתח בתהליכים סלולריים רבים, כגון קשירה לאנזימים באתרים קטליטיים, השתתפות בתגובות נגד חמצון, וכגורמים מבניים בחלבונים שונים4,5. בתנאים מוגבלים במתכת, המצב הניתן לתגובה ממתכת מצטמצם והחלבונים העשויים לסייע לרכישת החומרים המזינים הללו. אפיון הגנים והחלבונים הללו מציג אתגר טכני ייחודי עבור החוקר. יוני מתכת חייב להיות מחוץ חיידקים כדי לגרום שעתוק של גנים אלה מן המוצא הילידים שלהם, אבל הכלרות יעיל של יונים אלה מדיה לאדן מתכת יכול להיות קשה למטב. פרופילי מתכת שונים של מים המקור הטבועה הרבה-ללוט וריאציה6 של מרכיבים אבקה פירושה כי כמות הכלור נדרש כדי להסיר מתכת מסוימת ממדיום עשיר ישתנה בין מיקומים שונים, ספקי המרכיב, ואפילו לאורך זמן בתוך מעבדה אחת כמו מלאי כימי מוחלף.

כדי לעקוף את האתגר הזה, אנו מתארים את ההכנה של בינוני מוגדר כי הוא טיפל עם שרף צ'אקס-100 במהלך ההכנה להסרת מתכות מעקב מהפתרון. המדיום הזה הוא מזון מספיק צפוף כדי לאפשר את הצמיחה של gonococcus, אשר קשה לתרבות מחוץ הפונדקאי האנושי, ומאפשר לחוקר להציג פרופיל מתכת ספציפית על ידי הוספת מקורות שלהם מוגדרים וריכוזים של מתכות. שיטת התוספת מבוקרת של מתכות הרצוי לרוקן בינונית מגביר את העקביות ניסיוני ומאפשר לחזק, ניסויים השכפול ללא קשר לגורמים כגון מקור המים מספרים החומר הכימי. יתר על כן, מדיה זו ניתן לפרוס כמו נוזל או מלא עם שינויים קלים בלבד, מה שהופך אותו צדדי למדי.

כדי להדגים את כלי השירות של המדיום הזה, אנו מתארים פרוטוקול עבור השימוש בו עבור צמיחה דלקת ולתאר שלושה ניסויים מוצלחים לאפיון גנים מתכת התגובה הגיבה. ראשית, אנו מכינים בתאי מתכת שלמים מתרבויות מתכתיות או שנוספו ומדגימים רמות משתנה של ייצור חלבונים מתוך המצב התגובה המתכתי. לאחר מכן אנו מתווה שיטת צמיחה מוגבלת אבץ שבו הצמיחה דלקת נשלטת על ידי תוספי מקורות אבץ ספציפיים, שמיש. בסופו של דבר, אנו מראים כריכה מחייב כי להפגין תאים דלקת שלם ביטוי מתכת-תגובה קולטני השטח כריכה על מתכת בהתאמה שלהם המכילים ליגנדס. מצגת פני השטח מוצלחת של קולטנים אלה דורש צמיחה בינונית המרוקנת מתכת.

הפרוטוקול הנוכחי היה מיטבי במיוחד עבור גונדוסטין, אבל רבים פתוגנים חיידקים אחרים להעסיק אסטרטגיות רכישת מתכת במהלך זיהום7, כך פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לחקר הומאוסטזיס מתכת בחיידקים אחרים. מיטוב התקשורת הזאת ואת הפרוטוקולים הניסיוניים האלה לשימוש בחיידקים אחרים צפויים לדרוש שינוי קל של ריכוזי מתכת כלאטור ו/או זמן טיפול עם צ'אקס-100, כמו חיידקים אחרים עשויים להיות מעט שונה דרישות מתכת מאשר gonococcus. ברזל ואבץ הם המתכות העיקריות של דאגה החקירות המתוארות, אבל מתכות אחרות (למשל, מנגן) הוכחו כקריטיים עבור חיידקים, כולל neisseria8,9,10,11,12. יתר על כן, שיטות דומות תוארו עבור המאפיינים מתכת בעבודה בתרבות התאים איקריוטית, אשר עשוי גם להיחשב. מיכל בן 13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מניות שטופלו במדיום (CDM) פתרונות מדמין

  1. פתרון מניות אני
    1. לשלב הנאל (233.8 g), K2SO4 (40.0 g), NH4Cl (8.8 g), K2hpo4 (13.9 g), ו-KH2פו4 (10.9 g) במים מאוהים לנפח הסופי של 1 L.
    2. מסננים לחטא את הפתרון סדרת מחלקים לתוך 50 מ"ל צינורות חרוט.
    3. חנות ב-20 ° c.
  2. פתרון מניות II
    1. לשלב את הHCl תיאמין (0.2 g), תיאמין פירופוספט-קלרנית (0.05 g), הסידן פנטטיאט (0.19 g), ו ביוטין (0.3 g) ב 50% (vol/vol) אתנול לכרך הסופי של 1 L.
    2. מ50 לצינורות חרוטיים ולחנות ב-20 ° c.
  3. פתרון מניות III
    1. לשלב L-aspartate (4.0 g), L-גלוטמט (10.4 g), L-arginine (1.2 g), גליצין (0.2 g), L-סרין (0.4 g), L-leucine (0.72 g), L-isoleucine (0.24 g), L-valine (0.48 g), l-טירולך (0.56 g), L-proline (0.4 g), L-טריפטופן (0.64 g), L-טראונין (0.4 g), L-פנילאלנין (0.2 g), L-אספרגין-H2O (0.2 g), l-גלוטמין (0.4 g), l-היסטידין-HCl (0.2 g), l-מתיונין (0.12 g), l-alanine (0.8 g), l-ליזין (0.4 g), ומופחתת גלוטתיון (0.36 g) במים שאינם מוהים בשנת 500.
    2. התמוססות L-cysteine (0.44 g) ו-L-cyסטינה (0.28 g) בנפח מינימלי (~ 1 mL) של הHCl 1 M ולהוסיף לפתרון חומצות אמינו לעיל.
    3. להתאים את ה-pH של הפתרון עם 10 N NaOH עד כל החלקיקים הוא הומס. ה-pH האחרון יהיה 10.0 – 11.0.
    4. הביאו את הכרך האחרון ל-1 ל' עם מים מפוהים.
    5. מסנן לחטא את הפתרון סדרת מחלקים לתוך אמצעי אחסון 250 mL.
    6. חנות ב-20 ° c.
  4. פתרון מניות IV
    1. התמוססות גלוקוז (200 g) במים מפוהים לנפח הסופי של 1 ל.
      הערה: ייתכן שיש לחמם את הפתרון כדי לפזר את הגלוקוז.
    2. מסנן לעקר ולאחד את הפתרון לתוך 50 מ"ל צינורות חרוט.
    3. חנות ב-20 ° c.
  5. פתרון מניות V
    1. לשלב היפוקסאתה (5.0 g), אורציל (5.0 g), ו naoh (4.0 g) במים מאוהים לנפח הסופי של 1 L.
    2. מסנן לעקר ו סדרת מחלקים לתוך 50 מ"ל צינורות חרוט.
    3. חנות ב-20 ° c.
  6. פתרון VI
    1. הכינו 1 מטרים2-2h 2O (147 g/L) הפתרון במים מוכי מלים. מסנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
  7. פתרון מניות VII
    1. הכינותמיסה של 1 מטר וחצי. במים מוכי מלים סנן לעקר ולאחסן ב RT.
  8. פתרון מניות VIII
    1. הכינו תמיסה של 1 מ א3 במים הנהים. סנן לעקר ולאחסן ב RT.

2. הכנת 4 x ריכוז סטרילי ו-1x CDM

הערה: הליך זה הוא להתבצע באמצעות חומצה מטופלת כלי זכוכית סטרילי או פלסטיק כדי למנוע שטיפת מתכות לתוך הפתרונות.

  1. לשלב פתרונות מניות I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL), ו V (20 mL) עם 20.0 g של HEPES ומערבבים לערבב.
  2. להתאים את ה-pH ל 7.4, ואז להביא את הנפח הסופי ל 500 mL עם מים מוכי.
  3. לשטוף את השרף צ'אקס-100 ב 1 ליטר מים להסרת חומרים משמרים לפני הוספת אותו לריכוז סטרילי 4x. לעשות את זה על ידי הוספת 50 g של שרף ל 1 L מוכי המים ו זע לפחות 1 h. להסיר את המים על ידי סינון ואקום ולהשתמש שרף זה שטף לשלב 2.4.
  4. הוסף 50 גרם של שרף ומערבבים לאט בדיוק 90 דקות.
  5. להסיר שרף על ידי סינון עיקור ולאחסן את הריכוז 4 x סטרילי ב 4 ° c.
  6. כדי להכין ריכוז 1x עבודה של CDM, הראשון לדלל את הריכוז 4x עם מים מוכי סטרילי, לאחר מכן להוסיף פתרון VI (125 μL לכל 500 mL של פתרון 1x), פתרון VII (535 μL לכל 500 mL), פתרון VIII (10 מ"ל לכל 500 mL).
    הערה: למרות כל הפתרונות מניות כבר מעוקר, מומלץ לסנן לעקר את הפתרון 1x שוב לאחר ההכנה.

3. הכנת צלחות CDM

הערה: המתכון להלן מבצע 1 מדיית L עבור צלחות, אך מומלץ להכין אותן בנפחים קטנים יותר. . הכל מאזניים באופן פרופורציונלי

  1. צמח שטוף
    1. מתמוסס 50 גרם של agarose ב 1 לאחד המים הללו, מערבב עבור 1 h.
    2. העבר את הפתרון בקבוק צנטריפוגה ו צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 15 דקות ב-RT. בזהירות לשפוך את supernatant ולהשליך.
    3. הוסף מים מספיקים מספיק כדי להשעות מחדש את הגלולה הראשונה, ואז להעביר ל 1 בקבוקון. הביאו את הכרך האחרון של L 1 עם מים מפוהים ולאחר מכן מערבבים וצנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2. . מחק את הסופרנטאנט
    4. הוסף מספיק 100% אתנול כדי להשעות את הגלולה, ואז להעביר לבקבוקון 1 L חדש. הביאי את הכרך האחרון. של ל -1 עם אתנול מערבבים וצנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2.
    5. חזור על שלב ה3.1.4.
    6. הוסף מתנול לגלולה agarose כדי להשעות מחדש, ואז להעביר ל 1 בקבוקון. הביאי את הכרך האחרון. של 1 ל' עם מתנול מערבבים וצנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2.
    7. חזור על שלב ה3.1.6.
    8. העברת שטף מעלה למגש מרופדת ברדיד אלומיניום ומאפשרים ייבוש במנוע. כאשר יבשים, העבר למיכל נטול מתכת לאחסון לטווח ארוך.
  2. הוסף 10 גרם של שטוף שטף ו 5 גרם של עמילן תפוחי אדמה כדי 750 mL של מים מוכי.
  3. אוטוקלב במשך 30 דקות ב 121 ° c, 100 kPa מעל לחץ אטמוספירי.
  4. אפשר למדיה להתקרר ~ 65 ° c, לאחר מכן להוסיף 250 mL של 4X CDM, 250 μL של פתרון VI, 1.07 mL של פתרון VII, ו 20 מ ל של פתרון VIII.
  5. אם תרצה, הוסף את מתכות הבחירה לפני שפיכת צלחות. אין צורך בתוספת מתכת לשמירת תנאים ללא מתכות.
  6. יוצקים לתוך מנות פטרי ומאפשרות לגבש.

4. מתכת צמיחה מוגבלת של גונדואני מתכתי

הערה: עבור רוב היישומים, אין צורך להדגיש מתכת את החיידקים לפני החיסון CDM. הצעד ההתחלתי ההכפלה ב-CDM ואת הדילול הבאים הוא מספיק כדי לרוקן את gonococci של הברזל הפנימי שלהם חנויות אבץ. ככזה, שני השלבים הראשונים של ההליך הבא מתנהלים באמצעות לוחות אגר עשוי בסיס בינוני GC כי כבר שיושלם עם תוספת של קלוג אני14 ו 12.5 Μm FE (לא3)3. אם הלחץ מתכת מוקדם הוא הרצוי, אנו ממליצים להכין לוחות בסיס בינוני GC ללא Fe (לא3)3 עם 5 μm tpen (n, n, n ', n'-טטרקיס (2-פיקנוridylמתיל) ethylenediamine) עבור אבץ הכליון או 10 μm דפרוקסמין עבור ב כל הדגירה מתבצעת ב 37 ° c עם 5% CO2.

  1. יומיים לפני הניסוי, ביום-2, פס gonococci מן המקפיא מניות אל הצלחות בינונית GC ו דגירה עבור לא יותר מ 24 h.
  2. ביום -1, רצף מושבות יחיד על לוחיות חדשות של GC בינונית. נסה לעשות את זה 14-16 h לפני הניסוי הצמיחה.
  3. ביום הניסוי, להוסיף 5 – 10 מ ל 1x CDM חומצה שנשטפו 125 mL מבולבל בקבוקון נשק (איור משלים 1) ולהשתמש בזה כדי לריק מונה הצביעה klett.
  4. השתמש בדגימה סטרילית, משופעת כותנה כדי לחסן CDM מתוך בריאות, מושבות יחיד. . המטרה היא 20 יחידות קלט
    הערה: אם מונה הצביעה Klett אינו זמין, גם ספקטרוסקופיה מתאימה. אין נוסחת המרה אוניברסלית עבור יחידות Klett ל-OD, אך מדריך מחוספס זמין (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
  5. דגירה עם טלטול ב 250 סל ד עד הכפלה אחת המסה (40 היחידות Klett). זה צריך לקחת בין 1 – 2 ה.
  6. בשלב זה, התרבויות חזרו מדולל על ידי תוספת של נפח מספיק של CDM להגיע למחצית צפיפות התרבות הראשונית (למשל, אם 5 מ ל התרבות הלכה מ 20 כדי 40 Klett יחידות, 15 מ ל של CDM יביא אותו חזרה אל 10 Klett יחידות) וצמיחה יימשך כמו בשלב 4.5. כמות מסוימת של דילול הגב, טיפולי מתכת, וכו ' תלויים ביישומים במורד הזרם. אנו מעניקים שלוש דוגמאות להלן (סעיפים 5, 6, או 7).

5. אנליזה מערבית של מוצרי מתכת לתגובה גנטית

  1. החל בשלב 4.6, לאחור לדלל את התרבויות עם שלושה כרכים של CDM (למשל, 15 מ ל של CDM אם מתחילים עם 5 מ ל). בשלב זה, להוסיף טיפולי מתכת אם תרצה.
    1. ניתן להסיר את הלחץ על גנים בעלי חישת ברזל עם 12.5 μM Fe (מס '3)3. הגנים להגיב אבץ ניתן להסיר את הלחץ עם 10 μM לייכה4.
    2. אין צורך במתח נוסף ברזל או אבץ, מכיוון שהתקשורת כבר מרוקנת, כך שניתן יהיה להביע את הגנים המתגיבים. אם המתח הנוסף רצוי, אנו ממליצים לא יותר מ 1 – 2 μm של דפרוקסמין או tpen, כמו לחץ מוגזם תמנע תרבויות לצמוח.
  2. לצמוח תרבויות כמו בשלב 4.5 עבור 4 h ולהקליט את צפיפות התא הסופי של דגימות. פחות תרבויות מתכת להדגיש יגדל לצפיפויות הסופי גבוהה יותר.
  3. לתקנן את התרבויות לצפיפות מתאימה ולהכין ליסביטים.
    1. תקנן את התאים האחרים לדחיסות שווה ערך ל-100 יחידות Klett ב-1 מ ל של תרבות. כדי להשיג זאת, לחלק 100 על ידי צפיפות יחידת Klett של המדגם שלך. המספר שאתה מקבל הוא הנפח, ב-mL, של התרבות שישמש כדי להפוך את הגלולה התא.
  4. בצע את ההליכים הסטנדרטיים של SDS-PAGE ו-המערבי15 כדי לחקור עבור חלבונים של עניין.

6. מתכת-מוגבלת הצמיחה Assays

הערה: מאמר זה מתאר מראש צמיחה מראש. הכנת תערובות אלה מתוארת בסעיף 8.

  1. במהלך הכפלת המסה בשלב 4.5, התייחס מראש את הבארות של 96 מיקרופלייט היטב עם מפרקסים 10x. בנוסף, הגדר שלוש בארות שישמשו ככדורי סרק. כדי בארות אלה, להוסיף 10 μL של 10x הכורה x ו 90 μL של CDM.
  2. לאחר התרבויות בצלוחיות נשק הוכפלו, להוסיף 100 μL של כל תרבות היטב בשימוש במיקרו לוחית ולמדוד את הצפיפות האופטית ב 600 nm (OD600). זה יכול להיעשות עם כימיקלים ב ספקטרוסקופיה, אבל עם מספר גדול יותר של זנים בתוך התשובה זה יכול להיות מסורבל והוא בדרך כלל לא מומלץ אלא אם ספקטרוסקופיה שלך יכול למדוד ישירות מהזרוע של הזרוע בצד בקבוקון (משלים איור 2).
    1. בזמן מדידת OD, מניחים את מבחנות בחזרה בחממה כדי להבטיח gonococci להישאר קיימא.
  3. לחשב את כמות הדילול הנכונה הנדרשת כדי להביא את התרבויות OD600 = 0.02. הפרקסים 10x יש השפעה זניחה על OD וניתן להשמיט מהחישוב.
  4. לדלל תרבויות עם CDM צינורות התרבות הקטנה ולהוסיף נפח מספיק כדי לדלל את מראשות 10x מראש 1 x בצלחת. אם מחמם צלחת זמין, שמור את הצלחת ב 37 ° c בזמן העבודה.
  5. מודקת את הצלחת עבור 8-12 h עם טלטול בקורא צלחת, לקיחת OD600 מדידות במרווחי זמן הרצוי.

7. זיהוי ליגוקשירה על-ידי טרנספורטי מתכת ממברנות חיצוניים

  1. לטפל בתרבויות כרצונך כמו בשלב 5.1, ולאחר מכן דגירה עם טלטול עבור 4 h.
  2. זמן קצר לפני הסימון 4 h, לחתוך שלוש חתיכות של נייר סינון פיסת תאית לגודל המשוער הדרוש כדי להתאים למנגנון כתמי נקודה (משלים איור 3). להשרות את הניטרוצלולוזה במים המוהים, ואז להרכיב את המנגנון עם נייר סינון מתחת הניטרוצלולוזה.
  3. בשעה 16:00, הקלט את צפיפות התא ותקנן לצפיפות סופית מתאימה. מומלץ להשתמש ב-~ 10% מהצפיפות המשמשת להכנת התאים הסלולריים בשלב 5. לדוגמה, אם באמצעות 100 KU ב-1 mL עבור lysates, זה אומר ~ 10 KU ב 1 mL עבור אלה blots. החישוב הוא אותו הדבר כפי שמתואר ב 5.3.1, ותרבויות מתווספים ישירות הניטרוצלולוזה באמצעי האחסון המחושבים ולא נעשה lysates.
  4. התרבויות התאים pipet על הניטרוצלולוזה לאפשר זמן מספיק עבור נייר סינון לקלוט את כל הנוזל.
  5. לפרק את המנגנון, לאפשר את האבן החשופה לייבוש, ולחסום את קרום הניטרוצלולוזה עבור 1 h ב 5% סרום שור או חלב ללא שומן (w/v) ב-Tris מלוחים באגירה.
  6. לחבר את מנגנון כתמי הנקודה, החלפת נייר סינון עם סרט פרפין כדי ליצור חותם הוכחה דליפה מתחת ניטרוצלולוזה.
  7. לדלל את המתכת מחייב מתכת ועניין של 0.2 μM ב חוסם ו בדיקה תאים 1 h.
  8. לשאוב את הנוזל בוואקום ואקום, לשטוף את האבן החשופה ולאחר מכן לבצע הליכים אימונולוגיים סטנדרטיים כדי לפתח את האות16. ניתן לבצע את צעדי השטיפה בתוך או מחוץ למנגנון.

8. טעינת מתכת, S100A7 וקלגנה והכנת מראשות המלך 10x

הערה: כמו עם הכנה CDM, חומצה שנשטפו זכוכית או פלסטיק עבור הכנת הפתרון.

  1. התמוססות האדם ב 10 מ"ג/mL (125 μM) במאגר הראשוני (100 mM טריס, 150 מ"מ הנאל, 20 מ"מ נחקו3, pH = 8.4). S100A7 ו cal tin הם הושעו במאגר המורכב 20 מ"מ טריס, 100 מ"מ הנאל, 10 מ"מ 2-Mercaptoethanol, ו 1 מ"מ CaCl2, pH = 8.0).
    1. להוסיף פתרון ferration (100 mM נתרן ציטראט, 100 mM נחקו3, 5 מ"מ לתקן3-6h2O, pH = 8.4) לפתרון העברת כדי להשיג 30% ברזל רוויית (g., 75 μl של פתרון Ferration מתאים ל 5 mL העברת אם נעשה ב 10 מ"ג/mL).
    2. הוסף לS100A7או לקלגנה ביחס טוחנת של 50% לחלבון כדי ליצור רוויה של 25% (לכל מולקולת חלבון יש שני אתרי איגוד מתכת). ההכנות של 100 μM S100A7 או cal tin עם 50 μM האוכל לשימוש4 ניתן להשתמש.
    3. בשני המקרים, אפשר ערבוב מהסוף לקצה עבור לפחות 1 h עבור טעינת מתכת.
  2. להכין 4 L של מאגר דיאליזה (40 mM טריס, 150 מ"מ הנאל, 20 מ"מ נחקו3, pH = 7.4). פצל את זה לשני כרכים נפרדים של L ומניחים אחד ב -4 ° c.
  3. הוסף את המתכת טעון חלבונים לקלטת דיאליזה באמצעות מזרק ו dialyze נגד נפח המאגר הראשון עבור 4 h ב RT.
  4. הזז את הקלטת לכרך השני של המאגר והבן לילה ב-4 ° c. לאחר שלבים אלה, יש להסיר כל מתכות לא מאוגדות.
    הערה: אנו ממליצים על שיטת החומצה הבינועית לקביעת ריכוזי חלבונים לאחר דיאליזה.
  5. השתמש בקדם העברת 10 x לניצול ההעברה כמקור ברזל יחיד.
    1. להכין את זה מראש על ידי דילול 30% האדם Fe-transferrin ו בשור העברת-החלפת (מוכן ב 125 μM כפי שמתואר עבור העברת האדם, ללא שלב הטעינה ברזל) כדי 75 μM ו 30 μM, בהתאמה, ב-PBS. מראשות שליטה חיובית מחליף 30% Fe-transferrin עם 75 μM Fe (NO3)3, ו מראשות שליטה שלילית x משמיט כל ברזל נוסף, שמירה רק על בסיס השור-הועבר. בתוך שיטת הצמיחה, לדלל 10 μL של מרכזים אלה עם 90 μL של התרבות. ריכוזי הסופי הם 7.5 μM 30% האדם Fe-transferrin ו 3 μM בשור-מועבר.
  6. השתמש בגירסה שונה של הקדם 10x מראש עבור S100A7 או מקור ניצול כמקור אבץ הבלעדי.
    1. לקבלת שליטה חיובית בכורה, לשלב 50 μM לוקס4 לתוך העברת מראשות. עבור פקד שלילי, לשלב 50 μM TPEN ולהשמיט את האבץ. לאחר מכן, לקחת 10 μL של כל אחד מהם עבור כל מדגם הדרוש היטב, ולהעביר את הנפח הזה לשפופרת חדשה. הוסף לחצי הזה נפח של הערוץ הסטרילי. לדוגמה, אם 10 בארות יקבל את השליטה החיובי בראש, לקחת 100 μL של מראשות השנה, להעביר אותו צינור חדש, ולהוסיף 50 μL של PBS. עשה את אותו הדבר עבור השליטה השלילית.
    2. כדי להפוך את S100A7 או calprotectin מראש, לקחת 10 μL של השליטה שלילי מראשות השנה לצורך היטב, לעבור צינור חדש, ולהוסיף חצי כמות זו של 25% Zn-S100A7 או calprotectin. בתוך העיבוד הצמיחה, להשתמש 15 μL של מראשות המלך ולדלל עם 85 μL של התרבות. ריכוזי הסופי עבור העברת שיישארו זהה בשלב 8.5, עם התווסף 5 μM של Zn, TPEN, או S100A7/calprotectin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בינונית מוגדרת ספציפית בהיעדר מתכות מעקב לצמיחתה של ניציסריה הרואובטיים פותחה ויושמה לאפיון הגנים המגיבים במתכת ומוצרי הגנים שלהם. בפרוטוקול הממוטב, פרופיל המתכת של המדיה נשלט על ידי הוספת מתכות בחזרה לשיקול הדעת של החוקר, ולא על ידי הכלתה של מטרה מתכת, המאפשר שליטה מוגברת ועקביות מהמעבדה למעבדה ולהתנסות בניסוי. מדיה זו יכולה להיות מועסק הן במצב נוזלי והן מוצק, מה שהופך אותו רב-תכליתי על פני כיוונונים ניסיוניים רבים.

ניתן לראות את ייצור החלבון הדיפרנציאלי בריכוזי מתכות משתנים בתוך המייצג המערבי (איור 1). התמונה מציגה את מובילי הממברנה החיצוניים המגיבים באבץ TdfJ ו-Tdfj, שהיו מאוגוללים בתגובה לטיפול באבץ על ידי TPEN. TdfJ היה למעשה בלתי ניתן לגילוי כאשר אבץ התווסף חזרה לתקשורת, ו-Tdfj היה נדיר. יתר על כן, היזם Tdfj ידוע כי הוא המושרה, ולא מודחק, על ידי ברזל. הדבר נראה גם באבן החשופה. הבלוטים האלה משתמשים בלייפופרוטאין. המגיב ברזל TbpB2 כבקרת העמסה בתנאי התוספת ברזל, הייצור TbpB הופחת.

הצמיחה מוגבלת מתכת מוגבל להדגים את הניצול של מקורות אבץ ספציפיים, מוגדרים על ידי gonococcus (איור 2). איור 2A הופעות (ש ע ) הגדלה בנוכחות של "קלגנה" מלאה (משנת CP), הדורשת את פעולתו של האבץ המגיב ב-17לחודש,18. כאשר מקור אבץ שמיש לא היה זמין, או באמצעות לא התוספת אבץ או על ידי היעדר TdfH, הצמיחה הוגבלה. איור 2B מראה תוצאות דומות בנוכחות של S100A7, אשר יכול לשמש כמקור אבץ הבלעדי כאשר מוביל הממברנה החיצוני tdfj מופק19. בנוכחות TPEN בלבד, או כאשר TdfJ היה נעדר, הגדילה היתה הכשלה, אבל הוספת Zn-S100A7 התאושש הצמיחה באופן תלוי TdfJ. לבסוף, איור 2ג מראה שגיאה ניסיונית. בדוגמה זו, שלב הדילול של התרבויות דלקת לא היה מספיק כדי לרוקן את החיידקים של בריכות אבץ פנימיות ביחס לנפח התרבות הכולל במיקרופלייט. ככזה, הגדילה בשליטה השלילית חרגה ממנת היתר הרצויה.

מחייב ספציפי של תאים דלקת שלם לגימותיהם המתאימים הוא הפגינו על ידי גושי נקודות מתרבויות שהוכנו מתכת הגבלת תנאים מתכת גדושה (איור 3). איור 3A, B מראה כי gonococci גדל ב-cdm הצליחו לאגד CP ו S100A7 בעת הפקת Tdfh ו tdfh, בהתאמה, כתוצאה של מחסור באבץ. איור 3C משווה את הכריכה transferrin, אשר מושגת על ידי חלבונים קנצוני שנעשו מן הגנים חישת ברזל tbpa ו tbpa20, כאשר gonococci גדלים ב-cdm לבד לעומת המרק הבינוני GC התייחס ברזל deferoxamine. איור זה מציג את הכריכה הגוברת של העברת התרבויות על ידי תרבות גדל CDM, אשר מעיד על רמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון בשל הטבע מרוקן יותר ברזל של CDM לעומת הציר הכללי GC.

Figure 1
איור 1: הנציג המערבי מציג את הייצור הדיפרנציאלי של חלבונים המגיבים מתכת. (A) neisseria מסוגפראי FA19 זן מאמץ גדל ב-cdm שיושלם עם הזאז4, Fe (לא3)3, או tpen בריכוזים שצוין. לאחר הטיפול, התרבויות גדלו עבור 4 h לפני lysates שלמים של צפיפות סטנדרטית הופקו ו-SDS-עמוד ומערבי בלוק. רמות הייצור הדיפרנציאלי של TdfJ, שהוא גם מודחק על ידי אבץ והמושרה על ידי ברזל, ניתן לראות בבירור בתגובה בתוספת אבץ/דלדול ותוספת ברזל. (ב) עוצמות האות היחסיות של הכתם המערבי היו מקוונזים באמצעות דנסידולנסה. דמות זו מותאמת מאוריאקיס ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: צמיחה מוגבלת אבץ של gonococci. פראי סוג זן FA19, או מוטציות איזוגניים של זן זה שאינם מייצרים Tdfj או tdfj, גדלו (א) לא מטופל cdm עד השלב האקספוננציאלי הגיע, (ב) אז חזרה מדולל כדי OD600 = 0.02 ו (ג) OD600 = 0.1. הדגימות ב טופלו היו מראש המכיל calprotectin ( למעלה ) או לא הוסיף אבץ (למטה) וגדל עבור 8 h. הדגימות ב- B ו- C היו בתוספת עם הכוללת אבץ חינם, לא אבץ (5 μm tpen), או S100A7, גדל עבור 6 h. צמיחה בתנאים אלה רק התאושש על תוספת של מדיה עם מקור אבץ שמיש, כגון CP, S100A7, או בחינם אבץ ב ו B, בעוד C לא היה מדולל מספיק כדי לרוקן בריכות אבץ הסלולר הפנימי . איור 2A מותאם מז ואח '17איור 2A מותאם מאוריאקיס et al19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. כריכת כריכה ייצוגית מראה כריכת ליגניות מארחים לגונאוקוצ'י הדגיש מתכת. (א) סוג פראי הזנים FA1090, או מוטציות של זן זה שאינם מייצרים Tdfj, tdfj, או שניהם, גדלו ב-cdm ללא מתכות משלימות היו מנוקד ניטרוגליצרין תאית בצפיפות סטנדרטית. תאים נחקר עם calprotectin, אשר מזוהה על ידי האבץ מגיב TdfH, והכריכה הוערך על ידי זיהוי עם נוגדן נגד קלפרוטטין (למעלה). הכריכה היחסית של כריכת הקלגנה הייתה באופן כימות באמצעות densi, המוצג כאן בסולם היומן (למטה). (ב) ניסויים כריכה בוצעו כמתואר ב,אבל במקום זאת באמצעות זן פראי FA19 ו tdfj המוטציות והשלים זנים ברקע זה. תאים נחקר עם התווית hrp S100A7, אשר מזוהה על-ידי tdfj התגובה אבץ-(C) פראי סוג FA19 היה גדל זה לצד זה ב-cdm או בציר בינוני GC עם 25 μm דפרוקסמין התווסף למגהץ ברזל חינם, מנוקד ניטרוצלולוזה כמויות סטנדרטיות, ובחן עם הטרנספרין, אשר מאגד את הברזל רגיש tbpa. אלה זה לצד בדיקות להראות כי CDM, בניגוד מרק בינוני GC, לא נדרש הכלרות נוספת כדי להשיג ברזל מוגבל הסביבה. איור 3A מותאם מז ואח ' והחלק התחתון מאוריאקיס ואח '19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 1
משלים איור 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 2
משלים איור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 3
משלים איור 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מדיית הצמיחה משרתת מגוון תפקידים במחקר מיקרוביולוגי. מדיה מתמחה משמשים לבחירה, העשרה, ויישומים אחרים שונים עבור סוגים רבים וייחודיים של המחקר. יישום אחד כזה הוא אינדוקציה של גנים המגיבים מתכת, אשר בדרך כלל מושגת על ידי הוספת כלקטור ספציפי כי מטרות יון מתכת מסוים. שיטה זו מוגבלת, ככל שכמות הכלרות הנחוצה עבור מתכות מעקב שונות עשויה להיות משתנה בשל מקורות מים שונים המכילים פרופילי מתכת ייחודיים, ושני המון מרכיב מדיה המכיל ריכוזי מתכות שונים6. כדי למנוע את הגירעון הפנימי, תיארנו את ההכנה והשימוש של בינוני מוגדר כי הוא טיפל עם שרף צ'אקס-100 כדי להסיר את כל מתכות מעקב בכמויות גדולות, המאפשר תוספת מבוקרת של מתכות שצוינו בחזרה למדיום לפי הצורך.

בפרוטוקול הנוכחי, נקודת הדיון החשובה הראשונה היא מי המקור. הפרוטוקול מתאר טיפול צ'לקס כי הוא מספיק כדי להסיר מתכות מסוג מעבדה 2 (1.0 מגה אוהם-ס מ לפי מפרט ISO 3696) מים. מקורות מים שונים עשויים לדרוש הרבה יותר או יותר טיפולים צ'לקס. מצאנו כי מים של טוהר גבוה יותר מסוג 2, כגון מים בביולוגיה מולקולרית בכיתה, לא יתמכו בגידול חיידקי ביישום זה. הבחירה של כלי ההכנה לתקשורת חשובה בדיוק כמו מקור המים. אנו ממליצים במידה רבה על מיכלי פלסטיק נקיים, כמו כלי זכוכית שעשויים לליץ יוני מתכת לתוך הפתרון. אם פלסטלינה אינה זמינה, כלי זכוכית חייב להיות שטוף חומצה כדי למזער את הסיכון לזיהום. שטיפת חומצה זהה נדרש עבור צלוחיות התרבות בעת שימוש CDM.

הצמיחה של גונדולבטיים בתוך הגדרת חוץ גופית יכול להיות מאתגר למדי, כמו אורגניזם זה התפתח לשגשג במיוחד במארחים אנושיים21. בעוד CDM מתאים לתמוך בצמיחה למשך הניסויים, יש לנקוט במהלך החיסונים והדילול כדי להבטיח כי gonococci אינם בתנאים אטמוספריים יותר מהדרוש. בשל טבעו הקפנופילי של גונאוקוצ'י22 והנטייה שלה לטמפרטורות שנמצאו בתוך המארחים האנושיים, אנחנו לא ממליצים על שמירה על תרבויות בתנאים אטמוספריים למשך יותר מ ~ 15 דקות. אם אירוע ההכפלה ההתחלתי המתואר בשלב 4.5 של השיטה נמשך יותר מ-2 שעות, סביר להניח שתרבויות דלקת לא טופלו כראוי והניסוי צריך להיות מבוטלת.

בעוד המוקד של שיטה זו הוא על שיטות לצמיחה ואפיון של הזיבה Neisseria במיוחד, השימוש של cdm ספציפי זה עשוי להיות גם מתאים לחקר מינים neisseria אחרים. כמו-כן, ניתן להחיל אותה בקלות על אפיון של מערכות חישה ממתכת אחרות בחיידקים אחרים. לדוגמה, מדיה נטולת מתכת דומה שימשו לאפיון ספיגת מתכות באורהקוקס 23 ואסאנכיה קולי24. הניצול של המתכון המתואר עבור חיידקים אחרים צפוי כרוך שינויים קטנים או תוספות, בהתאם לצרכים התזונתיים הספציפיים של החיידק הנדון. לדוגמה, תוספת VIII כלולה במתכון כדי לסייע עם הצורך gonococcus עבור CO משלים2. כפי שמתואר לעיל, הצמיחה מבוצעת ב 37 ° c עם 5% CO2 אווירה, אבל גילינו כי תוספת של ביקרבונט משלימה בתקשורת מסייעת בשלבים הראשוניים של צמיחה דלקת במדיום מוגדר. עבור אורגניזמים ללא דרישה כזו, מרכיב זה עשוי להיות מושמט. למרבה הצער, דוגמאות נוספות של שינויים אלה צריכות להיקבע באמפירי.

למרות הצורך להתאים את השיטה במידת מה לשימוש עם חיידקים אחרים, המסגרת הבסיסית צריכה להיות מתאימה לשימוש נרחב. אפיון של גנים מתכתיים ומובילי מתכת הוא מאמץ מתמשך במחקר מיקרוביאלית, עם חיידקים כולל neisseria מנינגטידיס18,25,26,27,28, S. האוראוס9, haemophilus השפעה29, סלמונלה enterica30, ו -E. coli31 כל תשומת לב בנישה זו. הניצול העתידי שלנו של טכניקה זו תכוון להמשיך להבין את מערכות ספיגה מתכת אחרים של דלקת מעבר לאלה שהוזכרו כבר, אשר מאפשרים gonoקוקוס לרכוש ברזל מפני חלבונים מארחים כגון לקטופרין32,33, המוגלובין34,35, וגם מתוך החיידק xenosiderophores36, כדי להרחיב את המחקרים שלנו לתוך ההשפעות של מתכות אחרות כגון מנגן, אשר היה מעורב ההגנה לחץ חמצוני על ידי neisseria12,37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה להצהיר

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על-ידי מענקי NIH R01 AI125421, R01 AI127793 וU19 AI144182. מחבר הכתיבה רוצה להודות לכל חברי המעבדה שתרמו להגהה ולסקירה של שיטה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
125 mL sidearm flasks Bellco 2578-S0030 Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol VWR M131 Open in fume hood
3MM Paper GE Health 3030-6461 Called "filter paper" in text
Agarose Biolone BIO-41025 Powder
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434 Powder
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Powder
Blotting grade blocker Bio-Rad 170-6404 Nonfat dry milk
Bovine serum albumin Roche 3116964001 Powder
Bovine transferrin Sigma-Aldrich T1428 Powder
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 Powder
Calcium pantothenate Sigma-Aldrich C8731 Powder
Calprotectin N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin Bio-Rad 142-2832 Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab Puritan 25-806 Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine Sigma-Aldrich D9533 Powder
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Powder
Dialysis cassette Thermo 66380 Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus Schleicher & Schwell 10484138 Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol Koptec V1016 Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride Sigma-Aldrich F7134 Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich F1143 Irritant, do not inhale
GC medium base Difco 228950 Powder, already contains agar
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Powder
HEPES Fisher L-15694 Powder
Human transferrin Sigma-Aldrich T2030 Powder
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 Powder
Klett colorimeter Manostat 37012-0000 Uses color transmission to assess culture density
L-alanine Sigma-Aldrich A7627 Powder
L-arginine Sigma-Aldrich A5006 Powder
L-asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A8381 Powder
L-aspartate Sigma-Aldrich A9256 Powder
L-cysteine hydrochloride Sigma-Aldrich C1276 Powder
L-cystine Sigma-Aldrich C8755 Powder
L-glutamate Sigma-Aldrich G1251 Powder
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126 Powder
L-histidine monohydrochloride Sigma-Aldrich H8125 Powder
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752 Powder
L-leucine Sigma-Aldrich L8000 Powder
L-lysine Sigma-Aldrich L5501 Powder
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 Powder
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126 Powder
L-proline Sigma-Aldrich P0380 Powder
L-serine Sigma-Aldrich S4500 Powder
L-threonine Sigma-Aldrich T8625 Powder
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254 Powder
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754 Powder
L-valine Sigma-Aldrich V0500 Powder
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Powder
Methanol VWR BDH1135-4LP Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose GE Health 10600002 Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 60356 Powder
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Powder
Potassium sulfate Sigma-Aldrich P0772 Powder
Potato starch Sigma-Aldrich S4251 Powder
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G4251 Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7 N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder
Sodium chloride VWR 470302 Powder
Sodium citrate Fisher S279 Powder
Sodium hydroxide Acros Organics 383040010 Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625 Powder
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Also called cocarboxylase
TPEN Sigma-Aldrich P4413 Powder
Tris VWR 497 Powder
Uracil Sigma-Aldrich U0750 Powder
Zinc sulfte heptahydrate Sigma-Aldrich 204986 Irritant, do not inhale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
  2. Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
  3. Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
  4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
  5. Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
  6. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  7. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  8. Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
  9. Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
  12. Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
  13. Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
  14. Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
  17. Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
  18. Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
  19. Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
  20. Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
  21. Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
  22. Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
  23. Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
  24. Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
  25. Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
  26. Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
  27. Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
  28. Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
  29. Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
  30. Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
  31. Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
  32. Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
  33. Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
  34. Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
  35. Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
  36. Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
  37. Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 157 מתכות וכלי מתכת מדיה הגדרת אמצעי לצמיחה כריכת שוליים פתוגנים בקטריאליים
מתכת-צמיחה מוגבלת של הגגורסריה של <em>ניציבטיים</em> לאפיון של גנים מתכתיים מגיבים ורכישת מתכות מהמארח ליגנדס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurakis, S., Cornelissen, C. N.… More

Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter