Summary
Descrevemos aqui um método de crescimento da gonorreia Neisseria em meio líquido restrito ao metal para facilitar a expressão de genes para a captação de metais. Também delineamos experimentos a jusante para caracterizar o fenótipo de gonococci cultivado nessas condições. Esses métodos podem ser adaptados para serem adequados para caracterização de genes reativos metálicos em outras bactérias.
Abstract
Metais de rastreamento como ferro e zinco são nutrientes vitais conhecidos por desempenhar papéis-chave em processos procarióticos, incluindo regulação genética, catalise e estrutura proteica. O sequestro metálico por anfitriões muitas vezes leva à limitação metálica para a bactéria. Essa limitação induz a expressão genética bacteriana cujos produtos proteicos permitem que as bactérias superem seu ambiente limitado ao metal. Caracterização desses genes é desafiadora. As bactérias devem ser cultivadas em mídia meticulosamente preparada que permite acesso suficiente a metais nutricionais para permitir o crescimento bacteriano, mantendo um perfil metálico propício para alcançar a expressão dos genes acima mencionados. Como tal, deve-se estabelecer um equilíbrio delicado para as concentrações desses metais. Cultivar um organismo nutricionalmente exigente, como a norréia neisseria,que evoluiu para sobreviver apenas no hospedeiro humano, adiciona um nível adicional de complexidade. Aqui, descrevemos a preparação de um meio metálico limitado definido suficiente para permitir o crescimento gonocócica e a expressão genética desejada. Este método permite que o pesquisador chelate ferro e zinco de fontes indesejadas enquanto complementa a mídia com fontes definidas de ferro ou zinco, cuja preparação também é descrita. Finalmente, descrevemos três experimentos que utilizam essa mídia para ajudar a caracterizar os produtos proteicos de genes gonocócicos regulados pelo metal.
Introduction
A gonorreia de neisseria causa a gonorreia de infecção sexualmente transmissível comum. Durante a infecção, neisseria patogênica expressa um repertório de genes reativos metálicos que permitem que as bactérias superem os esforços de restrição metálica pelo hospedeiro humano1,2,3. Os metais de rastreamento como ferro e zinco desempenham papéis-chave em muitos processos celulares, como a vinculação a enzimas em sítios catalíticos, participação em reações redoxas e como fatores estruturais em várias proteínas4,5. Em condições limitadas a metais, loci reativo metálico são desreprimidos e suas proteínas resultantes podem ajudar na aquisição desses nutrientes. A caracterização desses genes e proteínas apresenta um desafio técnico único para o pesquisador. Íons metálicos devem ser retidos de bactérias para induzir a transcrição desses genes de seus loci nativos, mas uma queda eficaz desses íons da mídia carregada de metal pode ser difícil de otimizar. Os diferentes perfis metálicos de água de origem e variação inerente lote a lote6 de ingredientes em pó significa que a quantidade de chelator necessária para remover um metal específico de um meio rico vai variar entre diferentes locais, fornecedores de ingredientes, e mesmo ao longo do tempo dentro de um único laboratório à medida que o inventário químico é substituído.
Para contornar este desafio, descrevemos a preparação de um meio definido que é tratado com resina Chelex-100 durante a preparação para remover metais de rastreamento da solução. Este meio é suficientemente nutriente denso para permitir o crescimento do gonococcus, que é difícil de cultivar fora do hospedeiro humano, e permite que o pesquisador introduza um perfil metálico específico, adição de suas próprias fontes e concentrações definidas de Metais. O método de complemento controlado de metais desejados para médio esgotado aumenta a consistência experimental e permite experimentos robustos e replicáveis, independentemente de fatores como fonte de água e números de lotes químicos. Além disso, essa mídia pode ser implantada como líquida ou sólida com apenas pequenas modificações, tornando-a bastante versátil.
Para demonstrar a utilidade desse meio, delineamos um protocolo para seu uso para o crescimento gonocócica e descrevemos três experimentos bem sucedidos para caracterizar genes Neisseria responsivos ao metal. Primeiro, preparamos lisatos de células inteiras gonocócicas de culturas metal-esgotadas ou suplementadas e demonstramos níveis variáveis de produção de proteínas a partir de loci reativo metálico. Em seguida, delineamos um ensaio de crescimento restrito ao zinco no qual o crescimento gonocócica é controlado pela suplementação de fontes específicas e utilizáveis de zinco. Finalmente, mostramos ensaios vinculativos que demonstram células gonocócicas inteiras expressando receptores de superfície religados ao metal ligados aos seus respectivos ligantes contendo metal. A apresentação superficial bem-sucedida desses receptores requer crescimento em meio metálico.
O protocolo atual foi otimizado especificamente para a neisseria gonorrhoeae,mas inúmeros outros patógenos bacterianos empregam estratégias de aquisição de metais durante a infecção7, de modo que esse protocolo pode ser adaptado para o estudo da homeostase metálica em outras bactérias. Otimizar esta mídia e esses protocolos experimentais para uso em outras bactérias provavelmente exigirá uma leve modificação das concentrações de quedor de metal e/ou tempo de tratamento com chelex-100, já que outras bactérias podem ter requisitos metálicos ligeiramente diferentes do gonococcus. Ferro e zinco são os metais primários de preocupação para as investigações descritas, mas outros metais (por exemplo, manganês) têm sido demonstrados como críticos para bactérias, incluindo Neisseria8,9,10,11,12. Além disso, métodos semelhantes foram descritos para caracterizações metálicas no trabalho de cultura celular eucatótica, que também pode ser considerado. 13
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Protocol
1. Preparação das Soluções de Ações MédiaS Definidas Tratadas pela Chelex (CDM)
- Solução de ações I
- Combine NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) e KH2PO4 (10,9 g) em água deionizada para um volume final de 1 L.
- Filtro esterilizar a solução e alíquota em tubos cônicos de 50 mL.
- Loja a -20 °C.
- Solução de ações II
- Combine hcl thiamine (0,2 g), thiamine pirophosphate-Cl (0,05 g), pantothenate de cálcio (0,19 g) e biotina (0,3 g) em 50% (vol/vol) etanol para um volume final de 1 L.
- Aliquot em tubos cônicos de 50 mL e armazenar a -20 °C.
- Solução de estoque III
- Combine L-aspartate (4,0 g), L-glutamate (10,4 g), L-arginina (1,2 g), glicina (0,2 g), L-serine (0,4 g), L-leucine (0,7 2 g), L-isoleucine (0,24 g), L-valine (0,48 g), L-tyrosine (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptophan (0,64 g), L-threonine (0,4 g), L-phenylalanine (0,2 g), L-asparagine-H2O (0,2 g), L-glutamina (0,4 g), L-histidine-HCl (0.2 g), L-methionine (0,12 g), L-alanine (0,8 g), L-lysine (0,4 g) e reduziu a glutahiona (0,36 g) em 500 mL deionizada água deionizada.
- Dissolva L-cysteine (0,44 g) e L-cystine (0,28 g) em um volume mínimo (~1 mL) de 1 M HCl e adicione à solução de aminoácido acima.
- Ajuste o pH da solução com 10 N NaOH até que todas as partículas se dissolvam. O pH final será 10.0-11.0.
- Leve o volume final para 1 L com água deionizada.
- Filtro esterilizaa a solução e a alíquota em volumes de 250 mL.
- Loja a -20 °C.
- Solução de ações IV
- Dissolva glicose (200 g) em água deionizada para um volume final de 1 L.
NOTA: A solução pode ter que ser aquecida para dissolver a glicose. - Filtrar esterilizar e alíquotar a solução em tubos cônicos de 50 mL.
- Loja a -20 °C.
- Dissolva glicose (200 g) em água deionizada para um volume final de 1 L.
- Solução de ações V
- Combine hipoxantina (5,0 g), uracil (5,0 g) e NaOH (4,0 g) em água deionizada a um volume final de 1 L.
- Filtrar esterilizar e alíquota em tubos cônicos de 50 mL.
- Loja a -20 °C.
- Solução VI
- Prepare uma solução de 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) em água desionizada. Filtrar esterilizar e armazenar à temperatura ambiente (RT).
- Solução de ações VII
- Prepare uma solução 1 M anhydrous MgSO4 em água desionizada. Filtrar esterilizar e armazenar na RT.
- Solução de ações VIII
- Prepare uma solução 1 M NaHCO3 em água deionizada. Filtrar esterilizar e armazenar na RT.
2. Preparação de Concentrado Estéril 4x e 1x CDM
NOTA: Este procedimento deve ser realizado em vidros estéreis tratados com ácido ou plástico para evitar o lixitório de metais nas soluções.
- Combine soluções de ações I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) e V (20 mL) com 20,0 g de HEPES e mexa para misturar.
- Ajuste o pH para 7,4, depois leve o volume final para 500 mL com água desionizada.
- Lave a resina Chelex-100 em 1 L água desionizada para remover conservantes antes de adicioná-la ao concentrado estéreo 4x. Faça isso adicionando 50 g de resina a 1 L água desionizada e mexendo por pelo menos 1h. Remova a água por filtragem de vácuo e use esta resina lavada para a etapa 2.4.
- Adicione 50 g de resina e mexa lentamente por exatamente 90 min.
- Remova a resina por esterilização do filtro e armazene o concentrado estéreo 4x a 4 °C.
- Para preparar uma concentração de trabalho de 1x de CDM, primeiro diluir o concentrado 4x com água desionizada estéril, depois adicionar solução VI (125 μL por 500 mL de solução 1x), solução VII (535 μL por 500 mL) e solução VIII (10 mL por 500 mL).
NOTA: Embora todas as soluções de estoque já tenham sido esterilizadas, recomenda-se filtrar a solução de 1x novamente após a preparação.
3. Preparação das placas de CDM
NOTA: A receita abaixo faz 1 L de mídia para pratos, mas é melhor prepará-los em volumes menores. Tudo diminui proporcionalmente.
- Agarose lavada
- Dissolva 50 g de agarose em 1 L água deionizada, mexendo por 1h.
- Transfira a solução para uma garrafa de centrífuga e centrífuga em 1.200 x g por 15 min na RT. Despeje cuidadosamente o supernatant e descarte.
- Adicione água deionizada suficiente para resuspender a pelota de agarose e, em seguida, transfira para um frasco de 1 L. Leve para um volume final de 1 L com água deionizada e depois mexa e centrífuga sisócia como na etapa 3.1.2. Descarte o supernatante.
- Adicione 100% de etanol suficiente para resuspender a pelota e depois transfira para um novo frasco de 1 L. Traga para um volume final de 1 L com etanol. Mexa e centrífugas como na etapa 3.1.2.
- Repita o passo 3.1.4.
- Adicione metanol à pelota de agarose para resuspender, depois transfira para um frasco de 1 L. Traga para um volume final de 1 L com metanol. Mexa e centrífugas como na etapa 3.1.2.
- Repita o passo 3.1.6.
- Transferir agarose lavada para uma bandeja forrada com papel alumínio e permitir secar em um capô de fumaça. Quando estiver seco, transfira para um recipiente sem metal para armazenamento a longo prazo.
- Adicione 10 g de agarose lavada e 5 g de amido de batata a 750 mL de água desionizada.
- Autoclave por 30 min a 121 °C, 100 kPa acima da pressão atmosférica.
- Permita que a mídia esfrie a ~65 °C, depois adicione 250 mL de 4X CDM, 250 μL de solução VI, 1,07 mL de solução VII e 20 mL da solução VIII.
- Se desejar, adicione os metais escolhidos antes de derramar placas. A adição de chelators não é necessária para manter condições livres de metais.
- Despeje em pratos petri e deixe se solidificar.
4. Metal Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae
NOTA: Para a maioria das aplicações, não é necessário estressar as bactérias antes da inoculação do MDL. A etapa inicial de duplicação no CDM e a diluição subsequente são suficientes para esgotar o gonococci de seus estoques internos de ferro e zinco. Como tal, as duas primeiras etapas do procedimento a seguir são realizadas utilizando placas de ágar feitas a partir da base média GC que foram complementadas com o suplemento de Kellogg I14 e 12,5 μM Fe(NO3)3. Se o estresse metálico precoce for desejado, recomendamos preparar placas de base média GC sem Fe (NO3)3 e com 5 μM TPEN (N,N,N', N',N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) etilediamina) para queda de zinco ou 10 μM deferoxamina para queda de ferro. Toda a incubação é realizada a 37 °C com 5% de CO2.
- Dois dias antes do experimento, no dia -2, a raia gonococci dos estoques de freezer em placas médias GC e incubar por não mais de 24 h.
- No dia -1, raia colônias individuais em placas médias gc frescas. Tente fazer isso de 14 a 16 h antes do experimento de crescimento.
- No dia do experimento, adicione 5-10 mL 1x CDM a um frasco de braço de 125 mL lavado de ácido(Figura Suplementar 1)e use isso para embranco um colorímetro Klett.
- Use um cotonete estéril, com ponta de algodão para inocular CDM de colônias saudáveis e solteiras. Aponte para 20 unidades Klett.
NOTA: Se um colorímetro Klett não estiver disponível, um espectrofotômetro também é adequado. Não há fórmula de conversão universal para unidades Klett para OD, mas um guia áspero está disponível(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - Incubar com tremor a 250 rpm até aproximadamente uma dobra em massa (40 unidades Klett). Isso deve levar entre 1-2 h.
- Neste ponto, as culturas estão de volta diluídas pela adição de um volume suficiente de MDL para atingir metade da densidade cultural inicial (por exemplo, se 5 mL de cultura passou de 20 para 40 unidades Klett, 15 mL de CDM irá reduzi-lo para 10 unidades Klett) e o crescimento continuará como na etapa 4.5. A quantidade específica de diluição nas costas, tratamentos metálicos, etc. dependem de aplicações a jusante. Damos três exemplos abaixo (seções 5, 6 ou 7).
5. Análise Ocidental de Produtos Genéticos Responsivos metálicos
- A partir da etapa 4.6, de volta diluir as culturas com três volumes de CDM (por exemplo, 15 mL de CDM se começar com 5 mL). Neste ponto, adicione tratamentos metálicos, se desejar.
- Genes sensoriais de ferro podem ser despressionados com 12,5 μM Fe (NO3)3. Genes responsivos de zinco podem ser despressionados com znSO4de 10 μM .
- O estresse adicional de ferro ou zinco não é necessário, pois a mídia já está esgotada, por isso os genes responsivos já serão expressos. Se for desejado mais estresse, recomendamos não mais do que 1-2 μM de deferoxamina ou TPEN, pois o estresse excessivo evitará que as culturas cresçam.
- Cresça as culturas como na etapa 4.5 por 4 h e registre a densidade celular final das amostras. Culturas menos estressadas pelo metal crescerão para densidades finais mais elevadas.
- Padronizar culturas para uma densidade adequada e preparar lisates.
- Padronizar lisates de células inteiras para uma densidade equivalente a 100 unidades Klett em 1 mL de cultura. Para isso, divida 100 pela densidade da unidade Klett da sua amostra. O número que você recebe é o volume, em mL, de cultura que será usado para fazer a pelota celular.
- Siga os procedimentos padrão SDS-PAGE e western blotting15 para sondar proteínas de interesse.
6. Ensaios de crescimento limitados ao metal
NOTA: Esses ensaios descrevem pré-mixes de crescimento pré-fabricados. A preparação dessas misturas é descrita na seção 8.
- Durante a dobra em massa na etapa 4.5, recue os poços de uma microplaca de poço de 96 com pré-mixes de 10x. Além disso, designe três poços para servir em branco. A esses poços, adicione 10 μL de pré-mix de 10x e 90 μL de CDM.
- Uma vez que as culturas nos frascos de braço sidearm tenham dobrado, adicione 100 μL de cada cultura a um poço não utilizado na microplaca e meça a densidade óptica em 600 nm (OD600). Isso pode ser feito com cuvettes em um espectrofotômetro, mas com um maior número de cepas dentro de um ensaio isso pode se tornar complicado e geralmente não é aconselhável a menos que seu espectrofotômetro possa medir diretamente do braço do frasco de braço lateral(Figura Suplementar 2).
- Ao medir o OD, coloque os frascos de volta na incubadora para garantir que os gonococci permaneçam viáveis.
- Calcule a quantidade correta de diluição necessária para levar as culturas para OD600 = 0,02. As pré-misturas de 10x têm um efeito insignificante no OD e podem ser omitidas a partir do cálculo.
- Diluir culturas com CDM em pequenos tubos de cultura e adicionar volume suficiente para diluir as pré-misturas de 10x a 1x na placa. Se um aquecedor de placa estiver disponível, mantenha a placa a 37 °C enquanto estiver funcionando.
- Incubar a placa por 8 a 12 h com tremor em um leitor de placas, tomando medições de OD600 em intervalos desejados.
7. Detecção de Ligand Binding por Transportadores metálicos de Membrana Externa
- Trate as culturas tão desejadas quanto na etapa 5.1, depois incubacom o tremor por 4 h.
- Pouco antes da marca de 4 h, corte três pedaços de papel filtro e um pedaço de nitrocelulose para o tamanho aproximado necessário para caber em um aparelho de mancha de ponto (Figura Suplementar 3). Presoak a nitrocelulose em água deionizada, em seguida, montar o aparelho com papel filtro abaixo da nitrocelulose.
- Às 4h, registre as densidades celulares e padronize uma densidade final adequada. Recomenda-se usar ~10% da densidade utilizada para a preparação das células na etapa 5. Por exemplo, se usar 100 KU em 1 mL para os lisates, isso significa ~10 KU em 1 mL para essas manchas. O cálculo é o mesmo descrito em 5.3.1, e as culturas são adicionadas diretamente à nitrocelulose nos volumes calculados em vez de transformadas em lisatos.
- Culturas de células pipet sobre a nitrocelulose e permitem tempo suficiente para o papel filtro absorver todo o líquido.
- Desmonte o aparelho, deixe a mancha secar e bloqueie a membrana nitrocelulose por 1 h em 5% de albumina de soro bovino ou leite sem gordura (w/v) em soro soro tampão tris.
- Remonte o aparelho de manchas de pontos, substituindo o papel filtro por película de parafina para criar um selo à prova de vazamento a nitrocelulose.
- Diluir o ligand de ligação metálica de interesse para 0,2 μM em blocker e células de sonda por 1 h.
- Sifão fora do líquido com um vácuo, lave a mancha, em seguida, siga os procedimentos imunológicos padrão para desenvolver o sinal16. Os passos de lavagem podem ser feitos dentro ou fora do aparelho.
8. Carregamento metálico de Transferrin, S100A7 e Calprotectin, e Preparação de Pré-misturas de 10x
NOTA: Assim como na preparação do CDM, use vidro lavado ácido ou plástico para preparação de soluções.
- Dissolver a transferência humana a 10 mg/mL (125 μM) no buffer inicial (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 8,4). S100A7 e calprotectin estão suspensos em tampão composto por 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoetanol e 1 mM CaCl2, pH = 8,0).
- Adicione solução de ferração (citrato de sódio de 100 mM, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH = 8,4) à solução de transferência para alcançar 30% de saturação de ferro (por exemplo, 75 μL de solução de ferração é adequado para transferência de 5 mL se feita a 10 mg/mL).
- Adicione ZnSO4 a S100A7 ou calprotectin a uma relação molar de 50% para a proteína para criar 25% de saturação (cada molécula de proteína tem dois locais de ligação metálica). Podem ser utilizadas preparações de 100 μM S100A7 ou calprotectin a 50 μM ZnSO4.
- Para ambos os casos, permita a mistura de ponta-over-end por pelo menos 1h para carregamento de metal.
- Prepare 4 L de tampão de diálise (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 7,4). Divida isso em dois volumes separados de 2 L e coloque um a 4 °C.
- Adicione as proteínas carregadas de metal em um de diálise usando uma seringa e diálise contra o primeiro volume de tampão por 4 h na RT.
- Mova o para o segundo volume de buffer e dique durante a noite a 4 °C. Após estas etapas, qualquer metais desvinculados devem ser removidos.
NOTA: Aconselhamos um ensaio ácido bicinchoníco a determinar concentrações proteicas após a diálise. - Use um pré-mix de transferência de 10x para utilização de transferrin como única fonte de ferro.
- Prepare esse premix diluindo 30% de fe-transferrina humana e apo-transferrina bovina (preparada em 125 μM como descrito para transferência humana, sem a etapa de carregamento de ferro) a 75 μM e 30 μM, respectivamente, na PBS. Um premix de controle positivo substitui 30% fe-transferrin a 75 μM Fe (NO3)3, e um premix de controle negativo omite qualquer ferro adicionado, mantendo apenas a apo-transferrin abo bovina. No ensaio de crescimento, diluir 10 μL desses concentrados com 90 μL de cultura. As concentrações finais são de 7,5 μM 30% humanafe-transferrina e 3 μM de apo-transferrina bovina.
- Use uma versão modificada do premix de 10x de transferrina para s100A7 ou utilização de calprotectin a ser uma única fonte de zinco.
- Para um pré-mix de controle positivo, incorpore 50 μM ZnSO4 no pré-mix de transferência. Para um controle negativo, incorpore 50 μM TPEN e omita o zinco. Em seguida, pegue 10 μL de cada um deles para cada amostra bem necessária, e mova esse volume para um novo tubo. Adicione a esta metade o volume de PBS estéril. Por exemplo, se 10 poços receberem o premix de controle positivo, peguem 100 μL de pré-mix, movam-no para um novo tubo e adicionem 50 μL de PBS. Faça o mesmo pelo controle negativo.
- Para fazer o Premix S100A7 ou calprotectin, pegue 10 μL do premix de controle negativo por bem necessário, mova-se para um novo tubo e adicione metade desse volume do Zn-S100A7 de 25% ou calprotectin. No ensaio de crescimento, use 15 μL de pré-mix e dilua com 85 μL de cultura. As concentrações finais para os transferrins permanecem as mesmas da etapa 8.5, com um acréscimo de 5 μM de Zn, TPEN ou S100A7/calprotectin.
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Representative Results
Um meio definido específico na ausência de metais de rastreamento para o crescimento da gonorreia neisseria foi desenvolvido e implementado para a caracterização de genes reativos metálicos e seus produtos genéticos. No protocolo otimizado, o perfil metálico da mídia é controlado adicionando metais de volta a critério do investigador, em vez de por uma queda titulada de um alvo metálico, permitindo maior controle e consistência de laboratório para laboratório e experimento para experimentar. Esta mídia pode ser empregada em estado líquido e sólido, tornando-a versátil em muitas configurações experimentais.
A produção diferencial de proteína em concentrações metálicas variáveis pode ser vista nas manchas ocidentais incluídas(Figura 1). A imagem mostra os transportadores de membrana externa tdfJ e TdfH, que foram regulados em resposta à queda de zinco por TPEN. TdfJ era essencialmente indetectável quando o zinco foi adicionado de volta à mídia, e TdfH era escasso. Além disso, o promotor do TDFJ é conhecido por ser induzido, em vez de reprimido, por ferro. Isso também é visível na mancha. Essas manchas utilizaram a lipoproteína tbpB2 responsiva ao ferro como um controle de carregamento. Em condições de retorno de ferro, a produção de TbpB foi reduzida.
Ensaios de crescimento restritos a metais demonstram a utilização de fontes específicas de zinco definidas pelo gonococcus(Figura 2). Figura 2A mostra N. gonorrhoeae crescendo na presença de calprotectina carregada de Zn (CP), que requer a ação do TdfH17,18. Quando não havia fonte de zinco utilizável disponível, seja por nenhum complemento de zinco ou pela ausência de TdfH, o crescimento foi restrito. A Figura 2B apresenta resultados semelhantes na presença do S100A7, que pode servir como única fonte de zinco quando o transportador de membrana externa TdfJ é produzido19. Apenas na presença do TPEN ou quando o TdfJ estava ausente, o crescimento foi dificultado, mas a adição do Zn-S100A7 recuperou o crescimento de forma dependente do TdfJ. Finalmente, a Figura 2C mostra um erro experimental. Neste exemplo, a etapa de diluição das culturas gonocócicas não foi suficiente para esgotar as bactérias das piscinas internas de zinco em relação ao volume total de cultura na microplaca. Como tal, o crescimento do controle negativo excedeu o OD desejado.
A ligação específica de células gonocócicas inteiras às suas respectivas ligantes é demonstrada por manchas de ponto de culturas preparadas em condições de limitação metálica e metal(Figura 3). A Figura 3A,B mostra que gonococci cultivado em CDM foram capazes de ligar CP e S100A7 ao produzir TdfH e TdfJ, respectivamente, como resultado da escassez de zinco. A Figura 3C compara a ligação de transferência, que é realizada pelas proteínas cognate feitas a partir dos genes de detecção de ferro tbpA e tbpB20, quando gonococci são cultivados apenas em CDM vs. Caldo médio GC tratado com o defarmina de quedor de ferro. Esse número mostra o aumento da vinculação de transferência por culturas cultivadas no CDM, o que indica níveis mais elevados de expressão proteica devido à natureza mais esgotada de ferro do CDM em comparação com o caldo GC quelado.
Figura 1: Mancha ocidental representativa mostrando produção diferencial de proteínas reprodutivas metálicas. (A) Neisseria gonorrhoeae wild type strain FA19 foi cultivado em CDM complementado com ZnSO4, Fe (NO3)3, ou TPEN nas concentrações indicadas. Após o tratamento, as culturas foram cultivadas por 4h antes de as células inteiras serem produzidas e submetidas à slotting SDS-PAGE e Western. Níveis diferenciais de produção para TdfJ, que é reprimido tanto por zinco quanto induzido sem ferro, podem ser claramente vistos em resposta à adição/esgotamento do zinco e à adição de ferro. (B)As intensidades relativas do sinal para a mancha ocidental foram quantitadas via densitometria. Esta figura é adaptada de Maurakis et al19. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Crescimento restrito ao zinco de gonococci. A cepa do tipo selvagem FA19, ou mutantes isogênicos dessa cepa que não produzem tdfJ ou tdfH, foram cultivados em(A)CDM não tratado até que a fase exponencial fosse alcançada,(B) então voltadilou para OD600 = 0,02 e(C)OD600 = 0,1. As amostras em A foram tratadas com pré-mix contendo calprotectina (superior) ou sem zinco adicionado (inferior) e cultivadas por 8 h. As amostras em B e C foram complementadas com pré-mix contendo zinco livre, sem zinco (5 μM TPEN), ou S100A7, e cultivadas por 6 h. O crescimento nessas condições só foi recuperado mediante suplementação da mídia com uma fonte de zinco utilizável, como CP, S100A7 ou zinco gratuito em A e B,enquanto C não foi suficientemente diluído para esgotar piscinas internas de zinco celular. A Figura 2A é adaptada de Jean et al.17Figura 2B é adaptada de Maurakis et al19. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3. Ensaios representativos vinculativos mostram ligands apresentador ligado saem com gonococci estressados pelo metal. (A)A cepa do tipo selvagem FA1090, ou mutantes dessa cepa que não produzem tdfJ, tdfH ou ambos, foram cultivados em CDM sem metais suplementares e foram pontilhados na nitrocelulose em densidades padronizadas. As células foram sondadas com calprotectina, que é reconhecida pelo TdfH responsivo ao zinco, e a ligação foi avaliada pela detecção com um anticorpo anticalprotectin (topo). A ligação de calprotectinrelativa foi quantitada via densitometria, mostrada aqui em uma escala de tronco (inferior). (B) Os experimentos de ligação foram realizados como descrito em A,mas em vez disso usando a cepa do tipo selvagem FA19 e o mutante tdfJ e complementou as cepas nesse fundo. As células foram sondadas com o S100A7, identificado pelo HRP, que é reconhecido pelo TdfJ.(C)Cepa do tipo selvagem FA19 foi cultivada lado a lado no Caldo médio CDM ou GC com 25 μM deferoxamina adicionada ao ferro livre de feclate, pontilhada à nitrocelulose em quantidades padronizadas, e sondada com transferrina, que liga o TbpA sensível ao ferro. Estes testes lado a lado mostram que o MDM, ao contrário do caldo médio GC, não exigiu nenhuma queda adicional para alcançar um ambiente limitado de ferro. A Figura 3A é adaptada de Jean et al. e a parte inferior de Maurakis et al19. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura Suplementar 1. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura Suplementar 2. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura Suplementar 3. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
A mídia de crescimento serve a uma variedade de papéis na pesquisa microbiológica. A mídia especializada é usada para seleção, enriquecimento e várias outras aplicações para muitos tipos únicos de estudo. Uma dessas aplicações é a indução de genes reativos metálicos, que normalmente é realizado pela adição de um chellador específico que tem como alvo um determinado íon metálico. Este método é limitado, pois a quantidade de queda necessária para vários metais de rastreamento provavelmente será variável devido a diferentes fontes de água contendo perfis metálicos únicos, e dois lotes do mesmo ingrediente de mídia contendo diferentes concentrações metálicas6. Para evitar essa deficiência inerente, descrevemos a preparação e o uso de um meio definido que é tratado com resina Chelex-100 para remover todos os metais de rastreamento a granel, permitindo a adição controlada de metais especificados de volta ao meio conforme necessário.
No protocolo atual, o primeiro ponto importante de discussão é a fonte de água. O protocolo descreve um tratamento Chelex que é suficiente para remover metais do laboratório Tipo 2 (1,0 megaOhms-cm de acordo com as especificações iso 3696). Diferentes fontes de água provavelmente exigirão tratamentos Chelex mais curtos ou mais longos. Descobrimos que a água de maior pureza do que o Tipo 2, como a água grau biologia molecular, não suportará o crescimento bacteriano nesta aplicação. A escolha do navio para a preparação da mídia é tão importante quanto a fonte de água. Recomendamos altamente recipientes de plástico limpos, pois os vidros podem lixiviar íons metálicos na solução. Se o plástico não estiver disponível, os vidros devem ser lavados para minimizar o risco de contaminação. A mesma lavagem ácida é necessária para frascos culturais ao usar CDM.
O crescimento da gonorreia neisseria em um ambiente in vitro pode ser bastante desafiador, pois este organismo evoluiu para prosperar especificamente em hospedeiros humanos21. Embora o CDM seja adequado para apoiar o crescimento durante a duração dos experimentos, deve-se tomar cuidado durante as etapas de inoculação e diluição para garantir que os gonococci não estejam em condições atmosféricas por mais tempo do que o necessário. Devido à natureza capnoílica do gonococci22 e sua predileção por temperaturas encontradas dentro dos hospedeiros humanos, não recomendamos manter culturas em condições atmosféricas por mais de ~15 minutos. Se o evento inicial de duplicação de massa descrito na etapa 4.5 do método demora mais de 2h, é provável que as culturas gonocócicas não tenham sido tratadas corretamente e o experimento deve ser abortado.
Embora o foco deste método esteja em métodos de crescimento e caracterização de Neisseria gonorrhoeae especificamente, o uso deste CDM específico é provavelmente também adequado para estudo de outras espécies neisseria. Além disso, pode ser facilmente aplicado à caracterização de outros sistemas de sensoriamento de metal em outras bactérias. Por exemplo, uma mídia similar sem metal tem sido usada para caracterizar a captação de metais em Staphylococcus aureus23 e Escherichia coli24. A utilização da receita descrita para outras bactérias provavelmente envolverá pequenas modificações ou adições, dependendo das necessidades nutricionais específicas das bactérias em questão. Por exemplo, o suplemento VIII está incluído na receita para auxiliar na necessidade do gonococcus de CO2suplementar . Como descrito acima, o crescimento é realizado a 37 °C com uma atmosfera de CO2 de 5%, mas descobrimos que a adição de bicarbonato suplementar na mídia auxilia os estágios iniciais de crescimento gonocócica em meio definido. Para organismos sem tal exigência, este ingrediente pode ser omitido. Infelizmente, outros exemplos dessas modificações devem ser empiricamente determinados.
Apesar da necessidade de adaptar um pouco o método para uso com outras bactérias, a estrutura básica deve ser adequada para uso amplo. Caracterização de genes reativos metálicos e transportadores metálicos é um esforço contínuo em estudo microbiano, com bactérias incluindo Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Haemophilus influenzae29, Salmonella enterica30, e E. coli31 todos recebendo atenção neste nicho. Nossa própria utilização futura dessa técnica terá como objetivo aprofundar a compreensão de outros sistemas de captação de metais gonocócicos além dos já mencionados, que permitem ao gonococcus adquirir ferro de proteínas hospedeiras como lactoferrina32,33, hemoglobina34,35, e também de xenosiderophores bacterianos36, e expandir nossos estudos para os efeitos de outros metais como o manganês, que tem sido implicado na defesa oxidativa por Neisseria12,37.
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Disclosures
Os autores não têm nada a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH R0125421, R01 AI127793 e U19 AI144182. O autor da redação gostaria de agradecer a todos os membros do laboratório que contribuíram para a revisão e revisão deste método.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
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