Summary
نحن نصف هنا طريقة لنمو السيلان Neisseria في المتوسط السائل المقيد بالمعادن لتسهيل التعبير عن الجينات للحصول على المعادن. كما نحدد تجارب المصب لتوصيف النمط الظاهري لـ "الـ"أنوسكوات" التي تزرع في هذه الظروف. ويمكن تكييف هذه الأساليب لتكون مناسبة لتوصيف الجينات المتجاوبة مع المعادن في البكتيريا الأخرى.
Abstract
المعادن النزرة مثل الحديد والزنك هي العناصر الغذائية الحيوية المعروفة للعب أدوار رئيسية في العمليات prokaryotic بما في ذلك تنظيم الجينات، والحفز، وبنية البروتين. عزل المعادن من قبل المضيفين غالبا ما يؤدي إلى قيود معدنية للبكتيريا. هذا القيد يحفز التعبير الجيني البكتيري الذي تسمح منتجات البروتين للبكتيريا بالتغلب على بيئتها المحدودة بالمعادن. وتوصيف هذه الجينات أمر صعب. يجب أن تزرع البكتيريا في وسائل الإعلام المعدة بدقة التي تسمح بالوصول الكافي إلى المعادن الغذائية للسماح بنمو البكتيريا مع الحفاظ على التشكيل الجانبي المعدني مما يؤدي إلى تحقيق التعبير عن الجينات المذكورة أعلاه. وعلى هذا النحو، يجب إقامة توازن دقيق لتركيزات هذه المعادن. نمو كائن سريع التغذية مثل السيلان Neisseria، الذي تطور للبقاء على قيد الحياة فقط في المضيف البشري ، يضيف مستوى إضافي من التعقيد. هنا ، نصف إعداد متوسط محدد محدود بالمعادن يكفي للسماح بنمو المكورات الغونوكولية والتعبير الجيني المطلوب. تسمح هذه الطريقة للمحقق برش الحديد والزنك من مصادر غير مرغوب فيها مع استكمال وسائل الإعلام بمصادر محددة من الحديد أو الزنك ، والتي يتم وصف إعدادها أيضًا. وأخيراً، نحدد ثلاث تجارب تستخدم هذه الوسائط للمساعدة في توصيف منتجات البروتين للجينات المكورات الغونية المنظمة بالمعادن.
Introduction
النيسيريا السيلان يسبب السيلان العدوى الشائعة التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي. أثناء العدوى ، تعبر Neisseria المسببة للأمراض عن ذخيرة من الجينات المتجاوبة مع المعادن التي تسمح للبكتيريا بالتغلب على جهود تقييد المعادن من قبل المضيف البشري1،2،3. المعادن النزرة مثل الحديد والزنك تلعب أدوارا رئيسية في العديد من العمليات الخلوية، مثل ربط الإنزيمات في المواقع الحفازة، والمشاركة في ردود فعل الأكسدة، والعوامل الهيكلية في مختلف البروتينات4،5. في ظروف محدودة المعدن، يتم إلغاء قمع loci المتجاوبة مع المعادن ويمكن أن تساعد البروتينات الناتجة عن ذلك في الحصول على هذه العناصر الغذائية. ويمثل توصيف هذه الجينات والبروتينات تحديا تقنيا فريدا للمحقق. يجب حجب الأيونات المعدنية عن البكتيريا من أجل الحث على نسخ هذه الجينات من loci الأصلية ، ولكن يمكن أن يكون من الصعب تحسين الاستخلاب الفعال لهذه الأيونات من الوسائط المحملة بالمعادن. الملامح المعدنية المختلفة من مصدر المياه ومتأصلة الكثير إلى الكثير الاختلاف6 من المكونات مسحوق يعني أن كمية من chelator المطلوبة لإزالة معدن معين من وسط غني سوف تختلف بين مواقع مختلفة، وبائعي المكونات، وحتى مع مرور الوقت داخل مختبر واحد كما يتم استبدال المخزون الكيميائي.
للتحايل على هذا التحدي، ونحن نصف إعداد وسيلة محددة التي يتم التعامل مع Chelex-100 الراتنج أثناء التحضير لإزالة المعادن النزرة من الحل. هذه الوسيلة كثيفة المغذيات بما فيه الكفاية للسماح لنمو المكورات البنية ، والتي يصعب الاستزراع خارج المضيف البشري ، وتتيح للمحقق إدخال ملف معدني محدد بإضافة مصادرها المحددة وتركيزاتها الخاصة المعادن. وتزيد طريقة إضافة المعادن المطلوبة إلى المتوسطة المستنفدة من الاتساق التجريبي وتسمح بإجراء تجارب قوية وقابلة للتكرار بغض النظر عن عوامل مثل مصدر المياه وأرقام اللوت الكيميائية. وعلاوة على ذلك، يمكن نشر هذه الوسائط إما سائلة أو صلبة مع تعديلات طفيفة فقط، مما يجعلها متعددة الاستخدامات.
من أجل إظهار فائدة هذه الوسيلة ، نحدد بروتوكولًا لاستخدامه في نمو المكورات الغونوكولية ووصف ثلاث تجارب ناجحة لتوصيف جينات Neisseria المتجاوبة مع المعادن. أولاً، نقوم بإعداد الخلايا الغونوكولية الكاملة من الثقافات المستنفدة للمعادن أو المكملة ونظهر مستويات متغيرة من إنتاج البروتين من loci المستجيبة للمعادن. ثم نحدد مخطط النمو المقيد بالزنك حيث يتم التحكم في نمو المكورات الغونوكولية عن طريق مكملات مصادر الزنك المحددة القابلة للاستخدام. وأخيراً، نعرض الاختبارات الملزمة التي توضح الخلايا المكورات الغونية الكاملة التي تعبر عن مستقبلات سطحية مستجيبة للمعادن ملزمة للليغاندات المحتوية على المعادن الخاصة بها. عرض سطح ناجح من هذه المستقبلات يتطلب النمو في المتوسطة المستنفدة للمعادن.
تم تحسين البروتوكول الحالي خصيصًا لـ Neisseria السيلان، ولكن العديد من مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى تستخدم استراتيجيات اقتناء المعادن أثناء العدوى7، لذلك يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة التوازن المعدني في البكتيريا الأخرى. من المرجح أن يتطلب تحسين هذه الوسائط وهذه البروتوكولات التجريبية للاستخدام في البكتيريا الأخرى تعديلًا طفيفًا لتركيزات chelator المعدنية و / أو وقت المعالجة مع Chelex-100 ، حيث قد يكون للبكتيريا الأخرى متطلبات معدنية مختلفة قليلاً عن المكورات الأنوكولوسية. الحديد والزنك هي المعادن الرئيسية التي تثير القلق بالنسبة للتحقيقات الموصوفة ، ولكن المعادن الأخرى (مثل المنغنيز) أثبتت أنها حاسمة للبكتيريا ، بما في ذلك Neisseria8،9،10،11،12. وعلاوة على ذلك، تم وصف أساليب مماثلة لتوصيف المعادن في العمل زراعة الخلايا eukaryotic، والتي يمكن أيضا النظر فيها. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد حلول الأسهم المتوسطة المحددة (CDM) التي تعامل Chelex
- حل الأسهم الأول
- الجمع بين NaCl (233.8 غرام)، K2SO4 (40.0 غرام)، NH4Cl (8.8 غرام)، K2HPO4 (13.9 غرام)، وKH2PO4 (10.9 غرام) في الماء المؤين إلى حجم نهائي من 1 L.
- تصفية تعقيم الحل وaliquot في أنابيب مخروطية 50 مل.
- تخزين في -20 درجة مئوية.
- حل الأسهم الثاني
- الجمع بين الثيامين HCl (0.2 غرام)، الثيامين بيروفوسفات-Cl (0.05 غرام)، بانتوثينات الكالسيوم (0.19 غرام)، والبيوتين (0.3 غرام) في 50٪ (فول/فول) الإيثانول إلى حجم نهائي من 1 لتر.
- Aliquot في 50 مل أنابيب مخروطية وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- حل الأسهم الثالث
- الجمع بين L-أسبارتات (4.0 غرام)، L-الغلوتامات (10.4 غرام)، L-أرجينين (1.2 غرام)، الجليسين (0.2 غرام)، L-serine (0.4 غرام)، L-leucine (0.72 غرام) L-isoleucine (0.24 غرام), L-valine (0.48 غرام), L-التيروزين (0.56 غرام), L-proline (0.4 غرام), L-tryptophan (0.64 غرام), L--ثريونين (0.4 غرام)، L-فينيل ألانين (0.2 غرام)، L-asparagine-H2O (0.2 غرام)، L-الجلوتامين (0.4 غرام)، L-histidine-HCl (0.2 ز), L-ميثيونين (0.12 غرام), L-ألانين (0.8 غرام), L-ليسين (0.4 غرام), وانخفاض الجلوتاثيون (0.36 غرام) في 500 مل الماء الديالمتين.
- حل L-السيستين (0.44 غرام) وL-كيستين (0.28 غرام) في حجم الحد الأدنى (~ 1 مل) من 1 M HCl وإضافة إلى محلول الأحماض الأمينية أعلاه.
- ضبط درجة الحموضة من الحل مع 10 N NaOH حتى يتم حل جميع الجسيمات. درجة الحموضة النهائية ستكون 10.0-11.0.
- جلب المجلد النهائي إلى 1 لتر مع الماء deionized.
- تصفية تعقيم الحل وaliquot في وحدات تخزين 250 مل.
- تخزين في -20 درجة مئوية.
- حل الأسهم الرابع
- حل الجلوكوز (200 غرام) في الماء الديالمتين إلى حجم نهائي قدره 1 لتر.
ملاحظة: قد يكون الحل ساخنة لإذابة الجلوكوز. - تصفية تعقيم وaliquot الحل في أنابيب مخروطية 50 مل.
- تخزين في -20 درجة مئوية.
- حل الجلوكوز (200 غرام) في الماء الديالمتين إلى حجم نهائي قدره 1 لتر.
- حل الأسهم الخامس
- الجمع بين هيكسانثين (5.0 غرام)، أوراسيل (5.0 غرام)، وNaOH (4.0 غرام) في الماء المنزوع الأيونات إلى حجم نهائي من 1 لتر.
- تصفية تعقيم وaliquot في أنابيب مخروطية 50 مل.
- تخزين في -20 درجة مئوية.
- الحل السادس
- إعداد 1 M CaCl2-2H2O (147 غرام / لتر) حل في المياه الخالية من الأيونات. تصفية تعقيم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT).
- حل الأسهم السابع
- إعداد 1 M اللامائية MgSO4 الحل في المياه الديالمتينة. تصفية تعقيم وتخزينها في RT.
- حل الأسهم الثامن
- إعداد 1 M NaHCO3 حل في المياه الديالمتينة. تصفية تعقيم وتخزينها في RT.
2. إعداد مركزة معقمة 4x و 1x CDM
ملاحظة: يجب إجراء هذا الإجراء إما في الأواني الزجاجية المعقمة المعالجة بالحمض أو البلاستيك لمنع رشح المعادن في المحاليل.
- الجمع بين حلول الأسهم الأول (50 مل)، الثاني (20 مل)، الثالث (250 مل)، الرابع (50 مل)، والخامس (20 مل) مع 20.0 غرام من HEPES ويحرك لخلط.
- ضبط درجة الحموضة إلى 7.4، ثم جلب حجم النهائي إلى 500 مل مع الماء deionized.
- غسل Chelex-100 الراتنج في 1 L deionized المياه لإزالة المواد الحافظة قبل إضافته إلى التركيز المعقم 4x. القيام بذلك عن طريق إضافة 50 غرام من الراتنج إلى 1 لتر الماء deionized والتحريك لمدة 1 ساعة على الأقل. إزالة الماء عن طريق الترشيح فراغ واستخدام هذا الراتنج غسلها للخطوة 2.4.
- إضافة 50 غرام من الراتنج ويحرك ببطء لمدة 90 دقيقة بالضبط.
- إزالة الراتنج عن طريق تصفية التعقيم وتخزين مركزة معقمة 4x في 4 درجة مئوية.
- لإعداد تركيز عمل 1x من آلية التنمية النظيفة، أولاً تمييع التركيز 4x مع الماء المعقم deionized، ثم إضافة الحل السادس (125 ميكرولتر لكل 500 مل من محلول 1x)، والحل السابع (535 ميكرولتر لكل 500 مل)، والحل الثامن (10 مل لكل 500 مل).
ملاحظة: على الرغم من أن جميع حلول المخزون قد تم تعقيمها بالفعل، فمن المستحسن لتصفية تعقيم حل 1x مرة أخرى بعد التحضير.
3- إعداد لوحات آلية التنمية النظيفة
ملاحظة: وصفة أدناه يجعل 1 L الوسائط لوحات، ولكن من الأفضل لإعداد هذه في وحدات تخزين أصغر. كل شيء يتدرج بشكل متناسب.
- غسلها أغاروز
- حل 50 غرام من أغاروز في 1 لتر الماء deionized، واثارة لمدة 1 ساعة.
- نقل المحلول إلى زجاجة الطرد المركزي والطرد المركزي في 1200 × ز لمدة 15 دقيقة في RT. صب بعناية قبالة supernatant والتخلص منها.
- إضافة ما يكفي من الماء deionized لإعادة تعليق بيليه agarose، ثم نقل إلى قارورة لتر 1. جلب إلى حجم نهائي من 1 لتر مع الماء deionized ثم يحرك والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3.1.2. تجاهل السوبرناستانت.
- إضافة ما يكفي من الإيثانول 100٪ لإعادة تعليق بيليه، ثم نقل إلى قارورة لتر 1 جديدة. جلب إلى حجم نهائي من 1 لتر مع الإيثانول. اثارة والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3.1.2.
- كرر الخطوة 3.1.4.
- إضافة الميثانول إلى بيليه أغاروز لإعادة تعليق، ثم نقل إلى قارورة 1 لتر. جلب إلى حجم نهائي من 1 L مع الميثانول. اثارة والطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3.1.2.
- كرر الخطوة 3.1.6.
- نقل أغاروز غسلها إلى صينية اصطف مع رقائق الألومنيوم والسماح لتجف في غطاء الدخان. عند الجفاف، نقل إلى حاوية خالية من المعادن للتخزين على المدى الطويل.
- أضف 10 غرام من أغاروز المغسولة و 5 غرام من نشا البطاطس إلى 750 مل من الماء المغوني.
- الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية، 100 كيلو باسكال فوق الضغط الجوي.
- السماح لوسائل الإعلام لتبرد إلى ~ 65 درجة مئوية، ثم إضافة 250 مل من 4X CDM، 250 ميكرولتر من الحل السادس، 1.07 مل من الحل السابع، و 20 مل من الحل الثامن.
- إذا رغبت في ذلك، إضافة المعادن من الاختيار قبل صب لوحات. إضافة chelators ليست ضرورية للحفاظ على ظروف خالية من المعادن.
- صب في أطباق بيتري والسماح لترسيخ.
4. المعادن نمو محدود من السيلان نيسيريا
ملاحظة: بالنسبة لمعظم التطبيقات، ليس من الضروري أن تُضغط على البكتيريا قبل تلقيح آلية التنمية النظيفة. وتكفي خطوة المضاعفة الأولية في آلية التنمية النظيفة وما تلاها من تخفيف لاستنفاد المكورات البنية لمخازنالحديد والزنك الداخلية. على هذا النحو، يتم إجراء أول خطوتين من الإجراء التالي باستخدام لوحات أغار مصنوعة من قاعدة GC المتوسطة التي تم استكمالها مع ملحق كيلوغ أنا14 و 12.5 ميكرومتر في (NO3)3. إذا كان الإجهاد المعدني المبكر مطلوبًا ، نوصي بإعداد لوحات GC الأساسية المتوسطة بدون Fe (NO3)3 ومع 5 μM TPEN (N، N، N'، N'tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine) لchelation الزنك أو 10 ميكرومتر deferoxamine لchelation الحديد. يتم إجراء جميع الاحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
- قبل يومين من التجربة ، في اليوم -2 ، تتناثر الكوزونوكوز من مخزون الفريزر على لوحات GC المتوسطة واحتضان هالا يزيد عن 24 ساعة.
- في اليوم -1، سلسلة مستعمرات واحدة على لوحات GC المتوسطة الطازجة. في محاولة للقيام بذلك 14-16 ساعة قبل تجربة النمو.
- في يوم التجربة، إضافة 5-10 مل 1x CDM إلى حمض غسلها 125 مل قارورة الذراع الجانبية الحيرة(الشكل التكميلي 1)واستخدام هذا لفارغة مقياس الألوان Klett.
- استخدم مسحة معقمة ذات رؤوس قطنية لتلقيح آلية التنمية النظيفة من مستعمرات صحية ومفردة. الهدف ل20 وحدات كلليت.
ملاحظة: إذا لم يكن مقياس الألوان Klett متوفرًا، يكون مقياس الطيف الضوئي مناسبًا أيضًا. لا توجد صيغة تحويل عالمية لوحدات Klett إلى OD ، ولكن يتوفر دليل تقريبي(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales). - احتضان مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة حتى مضاعفة كتلة واحدة تقريبا (40 وحدات كليت). وينبغي أن يستغرق هذا ما بين 1-2 ساعة.
- عند هذه النقطة، يتم تخفيف الثقافات مرة أخرى بإضافة حجم كاف ٍ من آلية التنمية النظيفة للوصول إلى نصف الكثافة الثقافية الأولية (على سبيل المثال، إذا كانت 5 مل من الثقافة قد انتقلت من 20 إلى 40 وحدة كلليت، فإن 15 مل من آلية التنمية النظيفة سوف تعيدها إلى 10 وحدات من وحدات كلليت) وسيستمر النمو كما هو الحال في الخطوة 4.5. كمية محددة من تخفيف الظهر، والعلاجات المعدنية، وما إلى ذلك تعتمد على التطبيقات المصب. نعطي ثلاثة أمثلة أدناه (الأقسام 5 أو 6 أو 7).
5. التحليل الغربي للمنتجات الجينية المتجاوبة مع المعادن
- بداية من الخطوة 4.6، مرة أخرى تمييع الثقافات مع ثلاثة مجلدات من آلية التنمية النظيفة (على سبيل المثال، 15 مل من آلية التنمية النظيفة إذا بدأت مع 5 مل). عند هذه النقطة، إضافة العلاجات المعدنية إذا رغبت في ذلك.
- يمكن فك قمع جينات استشعار الحديد مع 12.5 ميكرومتر في (NO3)3. قد يتم فك الجينات المستجيبة للزنك مع 10 ميكرومتر زنزانسو4.
- ليس من الضروري زيادة إجهاد الحديد أو الزنك ، حيث أن الوسائط قد استنفدت بالفعل ، لذلك سيتم التعبير عن الجينات المستجيبة بالفعل. إذا كان المطلوب المزيد من الإجهاد، ونحن نوصي بما لا يزيد عن 1-2 ميكرومتر من deferoxamine أو TPEN، كما الإجهاد المفرط سيمنع الثقافات من النمو.
- تنمو الثقافات كما هو الحال في الخطوة 4.5 لمدة 4 ساعة وتسجيل كثافة الخلية النهائية للعينات. وسوف تنمو الثقافات الأقل توتراً بالمعادن إلى كثافات نهائية أعلى.
- توحيد الثقافات إلى كثافة مناسبة وإعداد اللاسات.
- توحيد الخلايا الكاملة ليسات إلى كثافة تعادل 100 وحدة كلليت في 1 مل من الثقافة. لتحقيق ذلك، تقسيم 100 حسب كثافة وحدة كليت من العينة الخاصة بك. الرقم الذي تحصل عليه هو حجم، في مل، من الثقافة التي سيتم استخدامها لجعل بيليه الخلية.
- اتبع معيار SDS-PAGE وإجراءات النشاف الغربية15 للتحقيق في البروتينات ذات الأهمية.
6. المعادن محدودة النمو المقالات
ملاحظة: تصف هذه المقالات الاستراتيجية premixes النمو مسبقالصنع. ويرد وصف لإعداد هذه الخلطات في الفرع 8.
- خلال مضاعفة الشامل في الخطوة 4.5، تراجع الآبار من 96 لوحة صغيرة مع 10x premixes. بالإضافة إلى ذلك، تعيين ثلاثة آبار لتكون بمثابة الفراغات. إلى هذه الآبار، أضف 10 ميكرولتر من 10x premix و 90 ميكرولتر من آلية التنمية النظيفة.
- بمجرد أن تضاعفت الثقافات في قوارير الذراع الجانبية ، أضف 100 ميكرولتر من كل ثقافة إلى بئر غير مستخدم في اللوحة الدقيقة ويقيس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600). ويمكن القيام بذلك مع cuvettes في مطياف ضوئي، ولكن مع أعداد أكبر من سلالات داخل فحص هذا يمكن أن تصبح مرهقة ولا ينصح عموما ما لم الطيف الخاص بك يمكن قياس مباشرة من ذراع قارورة الذراع الجانبية(الشكل التكميلي 2).
- أثناء قياس OD، ضع القوارير مرة أخرى في الحاضنة لضمان بقاء المكورات البنية قابلة للحياة.
- حساب المبلغ الصحيح من التخفيف المطلوبة لجلب الثقافات إلى OD600 = 0.02. وpremixes 10x لها تأثير لا يذكر على OD ويمكن حذفها من الحساب.
- تمييع الثقافات مع آلية التنمية النظيفة في أنابيب الثقافة الصغيرة وإضافة حجم كاف لتخفيف premixes 10x إلى 1x في لوحة. إذا كان طبق أكثر دفئا هو متاح، والحفاظ على لوحة في 37 درجة مئوية أثناء العمل.
- احتضان لوحة لمدة 8-12 ساعة مع اهتزاز في قارئ لوحة، مع القياسات OD600 على فترات المطلوب.
7. الكشف عن ليغاند ملزمة من قبل ناقلات المعادن الغشاء الخارجي
- تعامل مع الثقافات كما هو مطلوب كما هو الحال في الخطوة 5.1 ، ثم احتضان مع اهتزاز لمدة 4 ساعة.
- قبل وقت قصير من علامة 4 ح، وقطع ثلاث قطع من ورق التصفية وقطعة من النيتروسليلوز إلى الحجم التقريبي اللازم لتناسب جهاز لطخة نقطة(الشكل التكميلي 3). Presoak النيتروسليلوز في الماء deionized، ثم تجميع الجهاز مع ورقة تصفية تحت النيتروسليلوز.
- عند 4 ساعة، قم بتسجيل كثافات الخلايا وتوحيدها إلى كثافة نهائية مناسبة. فمن المستحسن استخدام ~ 10٪ من الكثافة المستخدمة لإعداد الخلايا lysates في الخطوة 5. على سبيل المثال، إذا كان استخدام 100 KU في 1 مل للليسات، وهذا يعني ~ 10 KU في 1 مل لهذه بقع. الحساب هو نفسه على خلاف ذلك كما هو موضح في 5.3.1، وتضاف الثقافات مباشرة إلى النيتروسيلولوز في وحدات التخزين المحسوبة بدلا من تحويلها إلى ليسات.
- الأنابيب الخلايا الثقافات على النيتروسليلوز والسماح بوقت كاف للورقة مرشح لاستيعاب كل السائل.
- تفكيك الجهاز، والسماح للوصمة لتجف، ومنع غشاء النيتروسليلوز ل1 ح في 5٪ الزلال مصل البقر أو الحليب غير الدهني (ث / v) في تريس العازلة المالحة.
- إعادة تجميع جهاز لطخة نقطة، واستبدال ورقة تصفية مع فيلم البارافين لإنشاء ختم تسرب واقية تحت النيتروسيلولوز.
- تمييع ليغاند الربط المعدني ذي الفائدة إلى 0.2 ميكرومتر في خلايا المانع والمسبار لمدة ساعة واحدة.
- سحب قبالة السائل مع فراغ، وغسل وصمة عار، ثم اتبع الإجراءات المناعية القياسية لتطوير إشارة16. ويمكن القيام بخطوات غسل في أو خارج الجهاز.
8. تحميل المعادن من النقل، S100A7، وكالفيفان، وإعداد 10x Premixes
ملاحظة: كما هو الحال مع إعداد آلية التنمية النظيفة، استخدم الزجاج المغسول بالحمض أو البلاستيك لإعداد المحلول.
- إذابة المنفي البشري عند 10 ملغم/مل (125 ميكرومتر) في المخزن المؤقت الأولي (100 مم تريس، 150 مم NaCl، 20 مم م ناهكو3،درجة الحموضة = 8.4). يتم تعليق S100A7 وcalprotectin في المخزن المؤقت الذي يتكون من 20 mM Tris ، 100 mM NaCl ، 10 mM 2-Mercaptoethanol ، و 1 mM CaCl2، pH = 8.0).
- إضافة محلول الفرات (100 mM سترات الصوديوم، 100 mM NaHCO3،5 mM FeCl3-6H2O، درجة الحموضة = 8.4) إلى محلول الإحالة إلى التشبع بالحديد بنسبة 30٪ (على سبيل المثال، 75 ميكرولتر من محلول النمس ية مناسب لـ 5 مل من المنفيين إذا تم إجراؤه بـ 10 ملغم/مل).
- أضف ZnSO4 إلى S100A7 أو calprotectin بنسبة 50٪ من الأضراس إلى البروتين لإنشاء تشبع بنسبة 25٪ (يحتوي كل جزيء بروتين على موقعين ملزمين معدنيين). يمكن استخدام مستحضرات 100 ميكرومتر S100A7 أو calprotectin مع 50 ميكرومتر ZnSO4.
- في كلتا الحالتين، اسمح بالخلط في نهاية المطاف لأكثر من ساعة واحدة على الأقل لتحميل المعادن.
- إعداد 4 لتر من العازلة غسيل الكلى (40 mM تريس، 150 mM NaCl، 20 mM NaHCO3،درجة الحموضة = 7.4). تقسيم هذا إلى مجلدين منفصلين 2 L ومكان واحد في 4 °C.
- أضف البروتينات المعدنية المحملة إلى شريط غسيل الكلى باستخدام حقنة وdialyze مقابل وحدة التخزين المؤقت ة الأولى لمدة 4 ساعة في RT.
- نقل كاسيت إلى وحدة التخزين المخزن المؤقت الثاني وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. بعد هذه الخطوات، يجب إزالة أي معادن غير منضمة.
ملاحظة: ننصح بالحصول على حمض البيسيندونينيك لتحديد تركيزات البروتين بعد غسيل الكلى. - استخدام 10x التحويل المسبق لاستخدام transferrin كمصدر الحديد الوحيد.
- إعداد هذا premix عن طريق تخفيف 30٪ الإنسان Fe-transferrin وbo-transferrin البقري (أعدت في 125 ميكرومتر كما هو موضح للنقل البشري، دون خطوة تحميل الحديد) إلى 75 ميكرومتر و 30 ميكرومتر، على التوالي، في PBS. وpremix التحكم الإيجابي يستبدل 30٪ Fe-transferrin مع 75 ميكرومتر Fe (NO3)3، وpremix التحكم السلبي يغفل أي الحديد المضافة، والإبقاء فقط على الأبقار أبو-نقل. في عملية الزرع، تمييع 10 ميكرولتر من هذه المركّزات مع 90 ميكرولتر من الثقافة. التركيزات النهائية هي 7.5 ميكرومتر 30٪ الإنسان Fe-transferrin و 3 ميكرومتر الأبقار أبو-نقل.
- استخدم نسخة معدلة من التحويل 10x premix لاستخدام S100A7 أو calprotectin كمصدر وحيد للزنك.
- للحصول على premix التحكم الإيجابي، دمج 50 ميكرومتر ZnSO4 في premix transferrin. للتحكم السلبي، قم بدمج 50 ميكرومتر TPEN وحذف الزنك. ثم، تأخذ 10 ميكرولتر من كل من هذه لكل عينة تحتاج هاجيدا، ونقل هذا الحجم إلى أنبوب جديد. إضافة إلى هذا النصف حجم الكثير من PBS العقيمة. على سبيل المثال، إذا كان 10 آبار سوف تتلقى premix التحكم إيجابية، واتخاذ 100 ميكرولتر من premix، نقله إلى أنبوب جديد، وإضافة 50 ميكرولتر من PBS. تفعل الشيء نفسه للسيطرة السلبية.
- لجعل S100A7 أو calprotectin premix، واتخاذ 10 ميكرولتر من premix التحكم السلبي لكل حاجة جيدة، والانتقال إلى أنبوب جديد، وإضافة نصف هذا الحجم من 25٪ Zn-S100A7 أو calprotectin. في مقاثة النمو، استخدم 15 ميكرولتر من المزيج المسبق وتمييع مع 85 ميكرولتر من الثقافة. تبقى التركيزات النهائية للمنفيين كما هي في الخطوة 8.5، مع إضافة 5 ميكرومتر من Zn أو TPEN أو S100A7/calprotectin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تطوير وتنفيذ وسط محدد محدد في غياب المعادن النزرة لنمو النيسيريا السيلان وتنفيذها لتوصيف الجينات المتجاوبة مع المعادن ومنتجاتها الجينية. في البروتوكول الأمثل ، يتم التحكم في الملف المعدني لوسائل الإعلام عن طريق إضافة المعادن مرة أخرى وفقًا لتقدير المحقق ، بدلاً من الاستخلاب المعقم لهدف معدني ، مما يسمح بزيادة التحكم والاتساق من المختبر إلى المختبر والتجربة للتجربة. يمكن استخدام هذه الوسائط في كل من الحالة السائلة والصلبة ، مما يجعلها متعددة الاستخدامات عبر العديد من الإعدادات التجريبية.
يمكن رؤية إنتاج البروتين التفاضلي في تركيزات المعادن المتغيرة في الفتحات الغربية التمثيلية المضمنة(الشكل 1). تُظهر الصورة ناقلي الأغشية الخارجية TdfJ وTdfH المتجاوبين بالزنك، والتي تم تنظيمها استجابة ً لتشجير الزنك من قبل TPEN. كان TdfJ أساسا غير قابل للكشف عندما أضيف الزنك مرة أخرى إلى وسائل الإعلام، وكان TdfH نادرة. وعلاوة على ذلك، من المعروف أن مروج tdfJ هو حث، بدلا من قمعها، من قبل الحديد. هذا هو أيضا مرئية في وصمة عار. استخدمت هذه الفتحات البروتين الدهني استجابة للحديد TbpB2 كتحكم التحميل. في ظروف الحديد إضافة إلى الوراء، تم تخفيض إنتاج TbpB.
تُظهر المقالات المحدودة النمو المحظورة على المعادن استخدام مصادر زنك محددة ومحددة من قبل المكورات البنية(الشكل 2). الشكل 2A يظهر ن. السيلان المتزايد في وجود كالفيوفيرين تحميل الزنك (CP), الأمر الذي يتطلب عمل من الزنك استجابة TdfH17,18. وعندما لا يتوفر مصدر للزنك قابل للاستخدام، سواء من خلال عدم وجود إضافة للزنك أو بسبب عدم وجود TdfH، كان النمو مقيداً. ويبين الشكل 2باء نتائج مماثلة في وجود S100A7، والتي يمكن أن تكون بمثابة مصدر الزنك الوحيد عندما يتم إنتاج الناقل الغشاء الخارجي TdfJ19. في وجود TPEN وحدها أو عندما كان TdfJ غائبة، كان يعوق النمو، ولكن إضافة Zn-S100A7 تعافى النمو بطريقة تعتمد على TdfJ. وأخيراً، يظهر الشكل 2C خطأ تجريبي. في هذا المثال، لم تكن خطوة التخفيف في الثقافات المكورات الغونوكولية كافية لاستنفاد بكتيريا تجمعات الزنك الداخلية بالنسبة إلى الحجم الإجمالي للثقافة في الصفيحة الدقيقة. وعلى هذا النحو، تجاوز النمو في السيطرة السلبية OD المطلوب.
ويتجلى الربط المحدد للخلايا المكورات البنية الكاملة لفترات الليغاند الخاصة بها من خلال بقع النقاط من الثقافات المعدة في ظروف محدودة للمعادن ومعدنية(الشكل 3). ويبين الشكل 3ألف وباء أن الغونوكوسيد الذي يزرع في آلية التنمية النظيفة كان قادراً على ربط CP وS100A7 عند إنتاج TdfH وTdfJ، على التوالي، نتيجة لندرة الزنك. الشكل 3C يقارن ربط الإحالة، الذي يتم إنجازه من البروتينات cognate المصنوعة من tbpA الجينات استشعار الحديد وtbpB20، عندما تزرع الغونوكواكس في آلية التنمية النظيفة وحدها مقابل GC مرق المتوسطة تعامل مع ديفيروكسامين chelator الحديد. ويبين هذا الشكل زيادة الربط بين المنتقلين حسب الثقافات التي تزرع في آلية التنمية النظيفة، مما يدل على ارتفاع مستويات التعبير البروتيني بسبب الطبيعة الأكثر نضوباً للحديد من آلية التنمية النظيفة مقارنة بمرق GC المنضب.
الشكل 1: لطخة غربية تمثيلية تُظهر الإنتاج التفاضلي للبروتينات المتجاوبة مع المعادن. (A) Neisseria السيلان البرية سلالة FA19 نمت في آلية التنمية النظيفة تكملها ZnSO4،Fe (NO3)3،أو TPEN في التركيزات المشار إليها. بعد العلاج ، نمت الثقافات لمدة 4 ساعة قبل إنتاج الخلايا الكاملة ذات الكثافة الموحدة وإخضاعها لـ SDS-PAGE والنشاف الغربي. ويمكن رؤية مستويات الإنتاج التفاضلية لـ TdfJ، التي يتم قمعها بواسطة الزنك والناجمعن الحديد، بوضوح استجابة لإضافة الزنك/النضوب وإضافة الحديد. (ب)تم قياس كثافة الإشارة النسبية لللطخة الغربية عن طريق قياس الكثافة. هذا الرقم مقتبس من Maurakis وآخرون19. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نمو الزنك المقيد لـ"الأنوسكو". سلالة البرية FA19 نوع، أو المسوخ isogenic من هذه السلالة التي لا تنتج tdfJ أو tdfH، نمت في(A)آلية التنمية النظيفة غير المعالجة حتى تم التوصل إلى المرحلة الأسي،(B)ثم خففت مرة أخرى إلى OD600 = 0.02 و(C)OD600 = 0.1. عولجت العينات في A مع premix التي تحتوي على calprotectin (أعلى) أو لا الزنك المضافة (أسفل) ونمت لمدة 8 ساعة. تم استكمال العينات في B و C بمزيج مسبق يحتوي على الزنك الحر، أو الزنك (5 ميكرومتر TPEN)، أو S100A7، ونمت لمدة 6 ساعة، ولم يتم استرداد النمو في هذه الظروف إلا عند تكميل الوسائط مع مصدر الزنك القابل للاستخدام، مثل CP، S100A7، أو الزنك الحر في A و B، في حين لم يتم تخفيف C بما فيه الكفاية لاستنفاد برك الزنك الخلوية الداخلية. الشكل 2A مقتبس من جان وآخرون17الشكل2B مقتبس من Maurakis وآخرون19. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 - ما هي الـ 3- تظهر الاختبارات الملزمة التمثيلية ligands المضيف ملزمة لـ gonococci المعلّمة بالمعادن. (أ)سلالة نوع البرية FA1090، أو المسوخ من هذه السلالة التي لا تنتج tdfJ، tdfH، أو كليهما، نمت في آلية التنمية النظيفة دون المعادن التكميلية وتنتشر على النيتروسليلوز في كثافات موحدة. تم فحص الخلايا مع كالفيفيرين، وهو ما تم التعرف عليه من قبل TdfH الاستجابة للزنك، وتم تقييم الربط عن طريق الكشف باستخدام جسم مضاد مضاد للكالفيفين (أعلى). تم كمية ربط calprotectin النسبية عبر قياس الكثافة ، كما هو موضح هنا على مقياس السجل (أسفل). (ب)أجريت التجارب الملزمة على النحو المبين في A، ولكن بدلا من ذلك باستخدام سلالة نوع FA19 البرية وtdfJ متحولة وسلالات مكملة في تلك الخلفية. تم فحص الخلايا مع S100A7 المسماة بـ HRP ، والتي يتم التعرف عليها من قبل TdfJ المتجاوبة مع الزنك(C)سلالة النوع البري FA19 نمت جنبًا إلى جنب في CDM أو GC مرق متوسط مع 25 ميكرومتر ديفيروكسامين مضاف إلى الحديد الخالي من chelate ، منقط إلى النيتروسيلولوز بكميات موحدة ، وبحثت مع المنفيين ، الذي يربط TbpA الحساسللحديد. وتبين هذه الاختبارات جنباً إلى جنب أن آلية التنمية النظيفة، على عكس مرق GC المتوسط، لا تتطلب أي تكيس إضافي لتحقيق بيئة محدودة بالحديد. الشكل 3A مقتبس من جان وآخرون والجزء السفلي من Maurakis وآخرون19. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 3. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وسائل الإعلام النمو يخدم مجموعة متنوعة من الأدوار في البحوث الميكروبيولوجية. وتستخدم وسائل الإعلام المتخصصة للاختيار والإثراء، والتطبيقات الأخرى المختلفة لأنواع مختلفة من الدراسة. أحد هذه التطبيقات هو تحريض الجينات المتجاوبة مع المعادن ، والتي يتم إنجازها عادة عن طريق إضافة chelator معين يستهدف أيون معدني معين. هذه الطريقة محدودة ، حيث من المرجح أن تكون كمية الاستخلاب اللازمة لمختلف المعادن النزرة متغيرة بسبب مصادر المياه المختلفة التي تحتوي على ملامح معدنية فريدة من نوعها ، ومجموعتين من نفس مكون الوسائط الذي يحتوي على تركيزات معدنية مختلفة6. لتجنب هذا القصور الكامن، وصفنا إعداد واستخدام وسيلة محددة التي يتم التعامل مع Chelex-100 الراتنج لإزالة جميع المعادن النزرة بكميات كبيرة، مما يسمح إضافة تسيطر عليها من المعادن المحددة مرة أخرى إلى الوسط حسب الحاجة.
وفي البروتوكول الحالي، فإن النقطة الهامة الأولى للمناقشة هي مصدر المياه. يصف البروتوكول علاج Chelex يكفي لإزالة المعادن من مياه المختبر من النوع 2 (1.0 ميجاوروم سم وفقًا لمواصفات ISO 3696). من المرجح أن تتطلب مصادر المياه المختلفة علاجات Chelex أقصر أو أطول. لقد وجدنا أن المياه ذات النقاء العالي من النوع 2 ، مثل مياه الصف البيولوجيا الجزيئية ، لن تدعم النمو البكتيري في هذا التطبيق. اختيار السفينة لإعداد وسائل الإعلام لا يقل أهمية عن مصدر المياه. نوصي بشدة حاويات بلاستيكية نظيفة ، حيث قد تتسرب الأيونات المعدنية في الحل. إذا لم تكن الأواني البلاستيكية متوفرة، يجب غسل الأواني الزجاجية لتقليل خطر التلوث. مطلوب نفس الغسيل الحمضي لقارورة الثقافة عند استخدام CDM.
نمو السيلان Neisseria في بيئة المختبر يمكن أن يكون تحديا كبيرا، كما تطورت هذه الكائن الحي لتزدهر على وجه التحديد في المضيفين الإنسان21. وفي حين أن آلية التنمية النظيفة مناسبة لدعم النمو طوال مدة التجارب، يجب توخي الحذر أثناء خطوات التلقيح والتخفيف لضمان عدم وجود مكورات الغون في الظروف الجوية لفترة أطول من اللازم. نظرًا للطبيعة الكبوفيلية للغونوكوسيد22 وميله لدرجات الحرارة الموجودة داخل المضيفين البشريين ، لا نوصي بالحفاظ على الثقافات في الظروف الجوية لمدة أطول من ~ 15 دقيقة. إذا استغرق حدث مضاعفة الكتلة الأولية الموصوفة في الخطوة 4.5 من الأسلوب أكثر من 2 ساعة، فمن المحتمل أن الثقافات المكورات البنية لم يتم التعامل معها بشكل صحيح ويجب إحباط التجربة.
في حين أن تركيز هذه الطريقة هو على أساليب النمو وتوصيف السيلان نيسيريا على وجه التحديد، واستخدام هذه الآلية محددة من المرجح أيضا مناسبة لدراسة الأنواع الأخرى من النيسيرية. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن تطبيقها بسهولة على توصيف أنظمة الاستشعار عن المعادن الأخرى في البكتيريا الأخرى. على سبيل المثال، تم استخدام وسائط مماثلة خالية من المعادن لتوصيف الحصة المعدنية في المكورات العنقودية aureus23 وEscherichia coli24. من المرجح أن ينطوي استخدام الوصفة الموصوفة للبكتيريا الأخرى على تعديلات أو إضافات صغيرة ، اعتمادًا على الاحتياجات الغذائية المحددة للبكتيريا المعنية. على سبيل المثال، يتم تضمين الملحق الثامن في وصفة للمساعدة في الحاجة مع المكورات البنية لCO2التكميلية . كما هو موضح أعلاه، يتم تنفيذ النمو في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 الغلاف الجوي، ولكن وجدنا أن إضافة بيكربونات تكميلية في وسائل الإعلام يساعد المراحل الأولية من نمو المكورات الغونوكولية في المتوسطة المحددة. بالنسبة للكائنات الحية التي لا تحتاج إلى مثل هذا الشرط ، قد يتم حذف هذا العنصر. وللأسف، لا بد من تحديد أمثلة أخرى على هذه التعديلات من الناحية التجريبية.
على الرغم من الحاجة إلى تكييف الأسلوب إلى حد ما للاستخدام مع البكتيريا الأخرى ، يجب أن يكون الإطار الأساسي مناسبًا للاستخدام على نطاق واسع. توصيف الجينات المتجاوبة مع المعادن وناقلات المعادن هو مسعى مستمر في الدراسة الميكروبية، مع البكتيريا بما في ذلك نيسيريا التهاب السحايا18،25،26،27،28، S. aureus9، الهيموفيلوس الأنفلونزا29، السالمونيلا enterica30، والإشريكية القولونية31 جميع تلقي الاهتمام في هذا المتخصصة. وسوف هدفنا في المستقبل استخدام هذه التقنية لتعزيز فهم غيرها من أنظمة التناول المعدنية غونوكوسيال ما بعد تلك المذكورة سابقا، والتي تسمح للغونوكوكوس للحصول على الحديد من البروتينات المضيفة مثل اللاكتوفيرين32،33،الهيموغلوبين34،35،وأيضا من xenosiderophores البكتيرية36،وتوسيع دراساتنا في آثار المعادن الأخرى مثل المنغنيز، والتي تورطت في الأكسدة بواسطة نيسيريا12,37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يعلنانه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R01 AI125421، R01 AI127793، وU19 AI144182. يود كاتب الكتابة أن يشكر جميع أعضاء المختبر الذين ساهموا في التدقيق اللغوي ومراجعة هذه الطريقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
