Summary
우리는 여기에서 금속 섭취에 대한 유전자의 발현을 용이하게하기 위해 금속 제한 액체 배지에서 Neisseria 임질의 성장을위한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 이 조건에서 성장한 임노코커스의 표현형을 특성화하기 위하여 다운스트림 실험을 개략적으로 설명합니다. 이들 방법은 다른 박테리아에서 금속 반응성 유전자의 특성화에 적합하도록 적응될 수 있다.
Abstract
철과 아연과 같은 미량 금속은 유전자 조절, 촉매 및 단백질 구조를 포함한 원핵 경핵 공정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 중요한 영양소입니다. 호스트에 의한 금속 격리는 종종 박테리아에 대한 금속 한계로 이어집니다. 이 제한은 박테리아가 금속 한정된 환경을 극복하기 위하여 박테리아를 허용하는 그의 단백질 제품을 박테리아 유전자 발현을 유도합니다. 그러한 유전자의 특성화는 도전적입니다. 박테리아는 전술한 유전자의 발현을 달성하는 데 도움이 되는 금속 프로필을 유지하면서 세균 성장을 허용하기 위해 영양 금속에 충분한 접근을 허용하는 세심하게 준비된 매체에서 성장해야 합니다. 따라서 이러한 금속의 농도에 대해 섬세한 균형을 설정해야 합니다. Neisseria 임질과같은 영양학적으로 까다로운 유기체를 키우는 것은 인간 숙주에서만 생존하기 위해 진화했으며, 복잡성의 추가 수준을 추가합니다. 여기서, 우리는 임질 성장 및 원하는 유전자 발현을 허용하기에 충분한 정의된 금속 제한 배지의 제조를 기술한다. 이 방법을 사용하면 조사관이 원하지 않는 공급원으로부터 철분과 아연을 킬레이트하는 동시에 철분이나 아연의 정의된 공급원으로 매체를 보충할 수 있으며, 이 방법은 그 준비도 설명되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 금속 조절 된 임코칼 유전자의 단백질 제품을 특성화하는 데 도움이되는이 매체를 활용하는 세 가지 실험을 설명합니다.
Introduction
Neisseria 임질은 일반적인 성병 임질을 일으키는 원인이 됩니다. 감염 동안, 병원성 Neisseria는 박테리아가 인간 숙주1,2,3에의한 금속 제한 노력을 극복 할 수 있도록 금속 반응 유전자의 레퍼토리를 표현한다. 철과 아연과 같은 미량 금속은 촉매 부위의 효소에 결합하고, 산화 배원 반응에 참여하고, 다양한단백질의구조적 요인으로 많은 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다4,5. 금속 이한 조건에서, 금속 반응성 좌위는 억압되고 그 결과 단백질은 이 양분의 취득을 도울 수 있습니다. 이 유전자와 단백질의 특성화는 조사자에게 독특한 기술적 도전을 제시합니다. 금속 이온은 그들의 네이티브 loci에서 이 유전자의 전사를 유도하기 위하여 박테리아에서 보류되어야 합니다, 그러나 금속 적재매체에서 이온의 효과적인 킬레이트화는 낙관하기 어려울 수 있습니다. 분말 성분의 원천물과 고유의 로트 대 로트 변이6의 다른 금속 프로파일은 풍부한 배지에서 특정 금속을 제거하는 데 필요한 킬레이터의 양이 화학 물질 재고가 대체됨에 따라 단일 실험실 내에서 여러 위치, 성분 공급 업체 및 시간이 지남에 따라 달라질 수 있음을 의미합니다.
이러한 과제를 회피하기 위해, 우리는 용액에서 미량 금속을 제거하기 위해 준비하는 동안 Chelex-100 수지로 처리되는 정의된 배지의 제조를 설명합니다. 이 배지는 인간 숙주 외부에서 배양하기 어려운 임균의 성장을 허용하기에 충분한 영양밀도이며, 조사자가 자신의 정의된 공급원과 농도를 추가하여 특정 금속 프로파일을 도입할 수 있도록 합니다. 금속. 고갈된 배지에 원하는 금속의 제어 된 추가 백 방법은 실험 일관성을 증가시키고 수원 및 화학 로트 번호와 같은 요인에 관계없이 강력하고 복제 가능한 실험을 허용합니다. 또한 이 미디어는 사소한 수정만으로 액체 또는 고체로 배포할 수 있으므로 매우 다재다능합니다.
이 매체의 유용성을 입증하기 위하여는, 우리는 임골 성장을 위한 그것의 사용을 위한 프로토콜을 설명하고 금속 반응하는 Neisseria 유전자를 특성화하기 위하여 3개의 성공적인 실험을 기술합니다. 첫째, 우리는 금속 고갈 또는 보충 배양물에서 임노코칼 전체 세포 용해제를 준비하고 금속 반응성 로시에서 단백질 생산의 다양한 수준을 보여줍니다. 그런 다음, 특정하고 사용 가능한 아연 공급원의 보충에 의해 임코칼 성장이 조절되는 아연 제한 성장 분석법의 개요를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 각각의 금속 함유 리간드에 결합금속 반응 표면 수용체를 발현전체 임노코칼 세포를 보여주는 결합 성 세포를 보여줍니다. 이 수용체의 성공적인 표면 프리젠 테이션은 금속 고갈 매체의 성장을 필요로한다.
본 프로토콜은 Neisseria 임질을위해 특별히 최적화되었지만, 수많은 다른 세균성 병원체는감염시 금속 획득 전략을 7, 그래서 이 프로토콜은 다른 박테리아에서 금속 항상성의 연구에 적응될 수 있다. 다른 박테리아에서 사용하기 위해 이 매체와 이러한 실험 프로토콜을 최적화하려면 다른 박테리아가 임균과 약간 다른 금속 요구 사항을 가질 수 있기 때문에 Chelex-100으로 금속 킬레이트화기 농도 및/또는 처리 시간을 약간 수정해야 합니다. 철과 아연은 기재된 조사에 대한 관심의 주요 금속이지만, 다른 금속(예를 들어, 망간)은 Neisseria8,9,10,11,12를포함하는 박테리아에 대해 중요한 것으로 입증되었다. 더욱이, 진핵 세포 배양 작업에서 금속 특성화에 대해서도 유사한 방법이 기술되었으며, 이는 또한 고려될 수 있다. 13세
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Protocol
1. 첼렉스 처리 정의 매체 (CDM) 주식 솔루션의 준비
- 재고 솔루션 I
- NaCl (233.8 g), K2SO4 (40.0 g), NH4Cl (8.8 g), K2HPO4 (13.9 g), 및 KH2PO4 (10.9 g)를 최종 부피 1 L로 결합하십시오.
- 용액과 알리쿼트(aliquot)를 50 mL 원엽 튜브로 살균하는 필터.
- -20 °C에서 보관하십시오.
- 재고 솔루션 II
- 티아민 HCl (0.2 g), 티아민 파이로포스페이트 Cl (0.05 g), 칼슘 판토테네이트 (0.19 g), 비오틴 (0.3 g)을 50 % (vol / vol) 에탄올을 최종 부피로 1 L로 결합합니다.
- 50 mL 원엽 튜브에 Aliquot및 -20 °C에서 저장합니다.
- 재고 솔루션 III
- L-아스파르타테(4.0 g), L-글루타메이트(10.4g), L-아르기닌(1.2g), 글리신(0.2 g), L-세린(0.4g), L-류신(0.7g) 2g), L-이솔루신(0.24 g), L-발린(0.48 g), L-티로신(0.56 g), L-프롤린(0.4 g), L-트립토판(0.64 g), L -스레오닌 (0.4 g), L-페닐알라닌 (0.2 g), L-아스파라긴 H2O (0.2 g), L-글루타민 (0.4 g), L-히스티딘-HCl (0.2 g) g), L-메티오닌 (0.12 g), L-알라닌 (0.8 g), L-리신 (0.4 g), 및 감소 된 글루타티온 (0.36 g) 500 mL 탈이온수.
- L-시스테인 (0.44 g) 및 L-시스틴 (0.28 g)을 1 M HCl의 최소 부피 (~1 mL)에 용해시키고 위의 아미노산 용액에 첨가하십시오.
- 모든 미립자가 용해될 때까지 용액의 pH를 10 N NaOH로 조절합니다. 최종 pH는 10.0-11.0입니다.
- 최종 부피를 탈이온수로 1L로 가져옵니다.
- 용액과 알리쿼트(aliquot)를 250mL 용량으로 살균하는 필터.
- -20 °C에서 보관하십시오.
- 재고 솔루션 IV
- 탈이온수에서 포도당(200 g)을 최종 부피 1L로 용해시.
참고: 용액은 포도당을 용해시키기 위하여 가열되어야 할 수 있습니다. - 용액을 50 mL 원엽 튜브로 살균하고 알리쿼트합니다.
- -20 °C에서 보관하십시오.
- 탈이온수에서 포도당(200 g)을 최종 부피 1L로 용해시.
- 스톡 솔루션 V
- 저산소산틴(5.0 g), 우라실(5.0 g), NaOH(4.0 g)를 탈이온수에 1L의 최종 부피에 결합합니다.
- 50 mL 원엽 튜브로 살균 및 알리쿼트 필터.
- -20 °C에서 보관하십시오.
- 솔루션 VI
- 탈이온수에서 1M CaCl2-2H2O(147 g/L) 용액을 준비합니다. 필터 살균 및 실온 (RT)에서 보관하십시오.
- 재고 솔루션 VII
- 탈이온수에서 1M 무수 MgSO4 용액을 준비합니다. 필터 살균 및 RT에 보관하십시오.
- 재고 솔루션 VIII
- 탈이온수에서 1 M NaHCO3 용액을 준비합니다. 필터 살균 및 RT에 보관하십시오.
2. 4x 멸균 농축액 및 1x CDM 준비
참고 : 이 절차는 용액에 금속이 침출되는 것을 방지하기 위해 산 처리 멸균 유리 제품 또는 플라스틱에서 수행되어야한다.
- 스톡 솔루션 I(50 mL), II(20 mL), III(250 mL), IV(50 mL), V(20 mL)를 20.0 g의 HEPES와 결합하고 섞어 줍니다.
- pH를 7.4로 조정한 다음 이온화된 물로 최종 부피를 500 mL로 가져옵니다.
- 4x 멸균 농축액에 첨가하기 전에 방부제를 제거하기 위해 1 L 탈이온수에서 Chelex-100 수지세척하십시오. 1L 탈이온수에 50 g의 수지를 첨가하고 적어도 1 시간 동안 교반하여 진공 여과에 의해 물을 제거하고 이 세척 된 수지를 2.4 단계에 사용합니다.
- 50g의 수지를 넣고 정확히 90분 동안 천천히 저어줍니다.
- 필터 살균에 의해 수지를 제거하고 4 °C에서 4x 멸균 농축액을 저장합니다.
- CDM의 1배 작업 농도를 준비하려면 먼저 멸균 탈이온수로 4x 농축물을 희석한 다음 용액 VI(용액 500mL당 125 μL), 용액 VII(500 mL당 535 μL), 용액 VIII(500mL당 10mL)를 추가합니다.
참고: 모든 재고 용액은 이미 멸균되었지만, 준비 후 1x 용액을 다시 걸료로 걸것을 하는 것이 좋습니다.
3. CDM 플레이트 준비
참고 : 아래의 조리법은 접시에 대한 1 L 용지를 만들지 만 작은 볼륨으로 준비하는 것이 가장 좋습니다. 모든 것이 비례적으로 축소됩니다.
- 워시드 아가로즈
- 아가로즈 50 g을 1 L 탈이온수에 녹여 1 시간 동안 저어줍니다.
- 용액을 RT에서 15 분 동안 1,200 x g에서 원심 분리기와 원심 분리기로 옮기십시오.
- 아가로즈 펠릿을 다시 중단하기에 충분한 탈이온수를 추가한 다음 1 L 플라스크로 옮김을 옮니다. 탈이온수로 최종 부피를 1L로 가져온 다음 3.1.2 단계에서와 같이 저어서 원심분리기를 드십시오. 상급제는 버리십시오.
- 충분한 100% 에탄올을 첨가하여 펠릿을 다시 일시 중단한 다음 새로운 1 L 플라스크로 옮니다. 에탄올로 1L의 최종 부피를 가져옵니다. 3.1.2 단계에서와 같이 저어서 원심분리기를 한다.
- 3.1.4단계를 반복합니다.
- 아가로즈 펠릿에 메탄올을 넣고 다시 돌인 다음 1 L 플라스크로 옮니다. 메탄올을 사용하여 최종 부피 1L로 가져옵니다. 3.1.2 단계에서와 같이 저어서 원심분리기를 한다.
- 3.1.6단계를 반복합니다.
- 세척된 아가로즈를 알루미늄 호일로 늘어선 트레이에 옮기고 연기 후드에서 건조시면 됩니다. 건조시 금속이 없는 용기로 옮겨 장기간 보관하십시오.
- 세척된 아가로스 10 g과 감자 전분 5 g을 탈이온수 750 mL에 넣습니다.
- 121 °C에서 30 분 동안 오토 클레이브, 대기압 위의 100 kPa.
- 용지가 ~65°C까지 냉각되도록 한 다음 4X CDM 250 mL, 용액 VI 250 μL, 용액 VII 1.07 mL 및 용액 VIII 20 mL를 추가합니다.
- 원하는 경우, 접시를 붓기 전에 선택의 금속을 추가합니다. 킬레이터의 추가는 금속이없는 조건을 유지하기 위해 필요하지 않습니다.
- 페트리 접시에 붓고 굳어질 수 있습니다.
4. 니세리아 임질의 금속 제한 성장
참고 : 대부분의 응용 프로그램에 대한, CDM의 접종 전에 박테리아를 금속 스트레스 할 필요가 없습니다. CDM의 초기 이중 단계와 후속 희석은 내부 철 및 아연 저장소의 임질을 고갈시키기에 충분합니다. 따라서, 다음 절차의 처음 두 단계는 켈로그의 보충제 I14 및 12.5 μM Fe(NO3)3으로보충된GC 배지 베이스로 만든 한천 플레이트를 사용하여 수행된다. 초기 금속 응력의 경우, 우리는 Fe (NO3)3없이 5 μM TPEN (N,N,N', N'-tetrakis (2-피리딜 메틸) 에틸렌네디아민)을 아연 킬레이트화 또는 철제 킬레이션을위한 10 μM deferoxamine을 준비하는 것이 좋습니다. 모든 배양량은 37°C에서 5%CO2로 실시된다.
- 실험 이틀 전, -2일째에, 냉동고에서 부터 GC 배지 플레이트에 연속 된 여고를 24 시간 이하로 배양하였다.
- 1일째, 신선한 GC 미디엄 플레이트에 단일 식민지를 줄지어 세게. 성장 실험 전에이 작업을 수행 하려고 14-16 시간.
- 실험 당일, 5-10 mL 1x CDM을 산세척된 125 mL 의 사이드암플라스크(보충도 1)에첨가하고 이를 사용하여 클렛 색도계를 비우도록 하였다.
- 멸균 된 면봉을 사용하여 건강한 단일 식민지에서 CDM을 접종하십시오. 20 개의 Klett 유닛을 목표로합니다.
참고: Klett 색도계를 사용할 수 없는 경우 분광광도계도 적합합니다. Klett 단위를 OD로 변환하는 수식은 없지만 대략적인가이드(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales)를사용할 수 있습니다. - 250 rpm에서 약 1 질량이 두 배가 될 때까지 흔들어 서 배양하십시오 (40 Klett 단위). 이것은 1-2 시간 사이에 걸릴 것입니다.
- 이 시점에서, 배양은 초기 배양 밀도의 절반에 도달하기 에 충분한 양의 CDM을 추가하여 다시 희석됩니다 (예를 들어, 배양 5 mL이 20에서 40 Klett 단위로 사라진 경우, CDM의 15 mL은 10 Klett 단위로 다시 가져올 것입니다) 성장은 계속될 것입니다. 4.5단계에서와 같이. 특정 양의 백 희석, 금속 처리 등은 다운스트림 응용 분야에 따라 달라집니다. 아래 세 가지 예제를 제공합니다(섹션 5, 6 또는 7).
5. 금속 반응 유전자 제품의 서양 분석
- 단계 4.6에서 시작하여, 다시 3부량의 CDM(예를 들어, 5 mL로 시작하는 경우 CDM의 15 mL)으로 배양을 희석한다. 이 때, 원하는 경우 금속 처리를 추가합니다.
- 철 감지 유전자는 12.5 μM Fe (NO3)3으로 분해 될 수있습니다. 아연 반응성 유전자는 10 μM ZnSO4로분해될 수 있다.
- 미디어가 이미 고갈되었기 때문에 추가철 이나 아연 응력은 필요하지 않으므로 반응성 유전자가 이미 표현될 것입니다. 추가 스트레스가 필요한 경우 과도한 스트레스로 인해 문화가 자라는 것을 막을 수 있으므로 1-2 μM 이하의 데데록사민 또는 TPEN을 권장합니다.
- 4시간 동안 4.5단계에서와 같이 배양을 성장시키고 샘플의 최종 전지 밀도를 기록한다. 금속 응력 배양이 적어 최종 밀도가 높아집니다.
- 적절한 밀도로 배양을 표준화하고 리세이츠를 준비합니다.
- 배양의 1 mL에서 100 Klett 단위에 해당하는 밀도로 전체 셀 용해를 표준화합니다. 이를 위해 샘플의 Klett 단위 밀도로 100을 나눕니다. 당신이 얻을 수 있는 볼륨, mL에서, 세포 펠 릿을 만드는 데 사용 됩니다 배양.
- 표준 SDS-PAGE 및 서양 블로팅 절차15를 따라 관심 있는 단백질을 조사하십시오.
6. 금속 제한 성장 어세이
참고 : 이러한 이 어설수제는 미리 만들어진 성장 프리믹스를 설명합니다. 이들 혼합물의 제조는 섹션 8에 기재되어 있다.
- 4.5단계에서 질량이 두 배로 증가하는 동안, 10x 프리믹스로 96웰 마이크로플레이트의 우물을 후퇴시. 또한 공백으로 게재할 세 개의 우물을 지정합니다. 이 우물에 10 μL의 프리믹스와 90 μL의 CDM을 추가하십시오.
- 사이드암 플라스크의 배양이 두 배가 되면, 각 배양물의 100 μL을 마이크로플레이트에서 잘 사용하지 않은 것을 추가하고 600 nm(OD600)에서광학 밀도를 측정한다. 이것은 분광 광도계에서 큐벳으로 행해질 수 있습니다, 그러나 분석법 내의 긴장의 더 큰 수와 이것은 성가신 될 수 있고 당신의 분광광도계가 측암 플라스크의 팔에서 직접 측정할 수 없다면 일반적으로 조언되지 않습니다(보충 그림 2).
- OD를 측정하는 동안 플라스크를 인큐베이터에 다시 놓아 서 임균제가 생존 가능한 상태로 유지되도록 합니다.
- 배상금을 OD600 = 0.02로 가져오는 데 필요한 정확한 희석량을 계산합니다. 10x 프리믹스는 OD에 무시할 만한 영향을 미치며 계산에서 생략할 수 있습니다.
- 작은 배양 튜브에서 CDM으로 배양을 희석하고 플레이트에서 10x 프리믹스를 희석하기에 충분한 부피를 추가합니다. 플레이트 워머를 사용할 수 있는 경우, 작업하는 동안 플레이트를 37°C로 유지하십시오.
- 플레이트 판독기에서 흔들어서 8-12시간 동안 플레이트를 배양하고 원하는 간격으로 OD600 측정을 합니다.
7. 외부 멤브레인 금속 수송기의 리간드 결합 검출
- 5.1단계에서와 같이 원하는 대로 배양을 치료한 다음 4시간 동안 흔들어 서 배양합니다.
- 4시간 표시 직전에, 도트 블롯 장치에 맞추는 데 필요한 대략적인 크기로 필터 페이퍼 3장과 니트로셀룰로오스 조각을 잘라냈다(보충도 3). 탈이온수에 니트로 셀룰로오스를 미리 담근 다음 니트로 셀룰로오스 아래에 여과지로 장치를 조립하십시오.
- 4 시간에서 세포 밀도를 기록하고 적절한 최종 밀도로 표준화하십시오. 5 단계에서 세포 용해물의 제조에 사용되는 밀도의 ~ 10 %를 사용하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 용해물의 경우 1mL에서 100 KU를 사용하는 경우 이는 이러한 블롯에 대해 1mL에서 ~10 KU를 의미합니다. 계산은 그렇지 않으면 5.3.1에 설명된 것과 동일하며, 배양은 리세이트로 만들어지기보다는 계산된 부피의 니트로셀룰로오스에 직접 추가된다.
- 파이펫 세포는 니트로셀룰로오스상에 배양하고 필터 종이가 모든 액체를 흡수할 수 있는 충분한 시간을 허용한다.
- 장치를 분해하고, 블롯이 건조되도록 하고, 트리스 완충 식염수에서 5% 소 혈청 알부민 또는 무지방 우유(w/v)에서 1시간 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인을 차단합니다.
- 도트 블롯 장치를 재조립하여 필터 용지를 파라핀 필름으로 대체하여 니트로셀룰로오스 아래에 누출 방지 씰을 만듭니다.
- 관심 있는 금속 결합 리간드를 차단기 및 프로브 셀에서 0.2 μM으로 1시간 동안 희석한다.
- 진공으로 액체를 사이펀하고, 얼룩을 씻은 다음 표준 면역 학적 절차를 따라 신호(16)를개발한다. 세척 단계는 기기 안팎에서 수행될 수 있습니다.
8. 트랜스퍼린, S100A7 및 칼프로틴의 금속 하중 및 10x 프리믹스 준비
참고: CDM 준비와 마찬가지로 용액 준비를 위해 산세척 유리 또는 플라스틱을 사용하십시오.
- 초기 완충액에서 10 mg/mL (125 μM)에서 인간 트랜스퍼린을 용해하십시오 (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 8.4). S100A7 및 칼프로틴은 20 mM 트리스, 100 mM NaCl, 10 mM 2-메르카포에탄올 및 1 mM CaCl2,pH = 8.0로 구성된 완충제에 현탁된다.
- 페리용액(구연산나트륨 100m, NaHCO 100m, 5 mM FeCl3-6H2O,pH=8.4)을 트랜스페린 용액에 첨가하여 30% 철 포화도를 달성한다(예를 들어, 75 μL의 페리용액은 10 mg/mL에서 만들어지면 5 mL 트랜스페린에 적합하다).
- ZnSO4를 S100A7 또는 칼프로틴을 단백질에 50% 어금니 비율로 추가하여 25% 포화도를 만듭니다(각 단백질 분자에는 2개의 금속 결합 부위가 있습니다). 100 μM S100A7 또는 50 μM ZnSO4를 사용한 칼프로틴의 제제를 사용할 수 있다.
- 두 경우 모두 금속 하중의 경우 최소 1시간 동안 엔드 오버-엔드 혼합을 허용합니다.
- 투석 완충액 4 L(40 mM 트리스, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3,pH = 7.4)을 준비합니다. 이 것을 두 개의 별도의 2L 체적으로 분할하고 4 °C에 1을 놓습니다.
- 주사기를 사용하여 투석 카세트에 금속 로드 단백질을 추가하고 RT에서 4 시간 동안 첫 번째 완충부량에 대해 투석을 합니다.
- 카세트를 제2 완충부체로 옮기고 4°C에서 밤새 투석을 한다. 이 단계 가 끝나면 언바운드 금속을 제거해야 합니다.
참고: 우리는 투석 후 단백질 농도를 결정하기 위해 비신초닌산 분석기를 조언합니다. - 10x 트랜스페린 프리믹스를 사용하여 트랜스페린을 단독 철원으로 사용하십시오.
- 30% 인간 Fe-트랜스퍼린 및 소 아포 트랜스퍼린(철 로딩 단계 없이 인간 트랜스페린에 대해 기재된 대로 125 μM에서 제조)을 PBS에서 각각 75 μM 및 30 μM으로 희석하여 이 프리믹스를 준비한다. 포지티브 컨트롤 프리믹스는 30% Fe-트랜스퍼린을 75 μM Fe(NO3)3으로대체하고, 음극 대조프리믹스는 소 아포 트랜스퍼린만 유지하여 추가된 철을 생략합니다. 성장 분석에서, 배양 90 μL로 이들 농축물의 10 μL을 희석한다. 최종 농도는 7.5 μM 30% 인간 Fe-트랜스퍼린 및 3 μM 소 아포-트랜스페린이다.
- S100A7용 트랜스퍼린 10x 프리믹스의 수정된 버전을 사용하거나 칼프로틴 사용률을 유일한 아연 공급원으로 사용하십시오.
- 포지티브 컨트롤 프리믹스의 경우, 50 μM ZnSO4를 트랜스퍼린 프리믹스에 통합합니다. 음의 제어를 위해 50 μM TPEN을 통합하고 아연을 생략하십시오. 그런 다음 필요한 모든 샘플에 대해 각각 10 μL을 취하고 그 부피를 새 튜브로 옮습니다. 멸균 PBS의 이 절반에 더해. 예를 들어, 10개의 웰이 포지티브 컨트롤 프리믹스를 수신하는 경우, 프리믹스의 100 μL을 취하고, 새 튜브로 이동한 다음, 50 μL의 PBS를 추가합니다. 부정적인 컨트롤에 대해동일한 작업을 수행합니다.
- S100A7 또는 calprotectin 프리믹스를 만들려면 필요한 경우 10 μL의 네거티브 컨트롤 프리믹스를 취하고 새 튜브로 이동한 다음 25% Zn-S100A7 또는 칼프로틴의 부피를 절반으로 추가하십시오. 성장 분석에서, 프리믹스 15 μL을 사용하고 배양 85 μL로 희석한다. 트랜스퍼린에 대한 최종 농도는 8.5단계와 동일하게 유지되며 Zn, TPEN 또는 S100A7/calprotectin의 5 μM이 추가되었습니다.
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Representative Results
Neisseria 임질의 성장을 위한 미량 금속의 부재에 있는 특정 정의된 매체는 금속 반응하는 유전자 및 그들의 유전자 제품의 특성화를 위해 개발되고 구현되었습니다. 최적화된 프로토콜에서, 매체의 금속 프로파일은 금속 표적의 적정 킬레이션이 아닌 조사자의 재량에 따라 금속을 다시 추가하여 제어되며, 실험실에서 실험실로 의 일관성을 높이고 실험할 수 있습니다. 이 매체는 액체 및 고체 상태 모두에서 사용할 수 있으므로 많은 실험 설정에서 다재다능합니다.
가변 금속 농도에서의 차동 단백질 생산은 포함된 대표적인 서양 블롯(도1)에서알 수 있다. 이미지는 TPEN에 의한 아연 킬레이트화에 대한 반응으로 업규제된 아연 반응 외막 수송기 TdfJ 및 TdfH를 보여줍니다. TdfJ는 아연이 미디어에 다시 추가되었을 때 본질적으로 탐지할 수 없었고 TdfH는 부족했습니다. 더욱이, tdfJ 프로모터는 철에 의해 억압되기보다는 유도되는 것으로 알려져 있다. 이것은 또한 블롯에서 볼 수 있습니다. 이 블롯은 철반응성 지단백 TbpB2를 로딩 제어로 활용했다. 철 추가 조건의 조건에서, TbpB 생산은 감소되었다.
금속 제한 성장 아세노는 임균에 의해 특이적, 정의된 아연 공급원의 활용도를 입증한다(그림2). 도 2A는 아연 반응성 TdfH17,18의작용을 필요로 하는 Zn-로드 칼프로틴(CP)의 존재로부터 성장하는 N. 임질을 나타낸다. 사용 가능한 아연 공급원이 없을 때, 아연 첨가재가 없거나 TdfH가 없어서 성장이 제한되었습니다. 도 2B는 외부 멤브레인 트랜스포터 TdfJ가 생산될 때 단독 아연 공급원으로서 작용할 수 있는 S100A7의 존재에서 유사한 결과를 나타낸다19. TPEN 단독으로 또는 TdfJ가 없을 때, 성장이 방해되었지만 Zn-S100A7의 추가는 TdfJ 의존적 방식으로 성장을 회복시켰습니다. 마지막으로 그림 2C는 실험 오류를 보여줍니다. 이 예에서, 고척 배양물의 희석 단계는 마이크로플레이트내의 총 배양량에 비해 내부 아연 풀의 박테리아를 고갈시키기에 충분하지 않았다. 이와 같이, 음의 대조군에서의 성장은 원하는 OD를 초과했다.
그들의 각각의 리간드에 대한 전체 임노코칼 세포의 특이적 결합은 금속-제한 및 금속 충수 조건에서 제조된 배양물로부터의 도트 블롯에 의해 입증된다(도3). 도 3A, B는 CDM에서 자란 여진구가 아연 부족의 결과로 각각 TdfH 및 TdfJ를 제조할 때 CP와 S100A7을 결합할 수 있었다는 것을 보여준다. 그림 3C는 철 감지 유전자 tbpA 및 tbpB20으로만들어진 코그네이트 단백질에 의해 달성되는 트랜스퍼린 결합을 비교하며, 임노코치가 CDM 단독에서 재배될 때 와 철 제록사민으로 처리된 GC 배지 국물. 이 수치는 CDM에서 자란 배양물에 의한 트랜스퍼린의 결합이 증가한다는 것을 보여 주며, 이는 킬레이트 GC 국물에 비해 CDM의 철분 고갈 특성으로 인해 더 높은 수준의 단백질 발현을 나타낸다.
그림 1: 금속 반응성 단백질의 차동 생산을 나타내는 대표적인 웨스턴 블롯. (a) 니세리아 임질 야생형 균주 FA19는 지시된 농도에서 ZnSO4,Fe(NO3)3,또는 TPEN으로 보충된 CDM에서 재배하였다. 치료 후, 배양액을 4시간 동안 재배한 후, 표준화된 밀도의 전세포 용해액이 생성되고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 행하였다. 아연에 의해 억압되고 철에 의해 유도되는 TdfJ의 차동 생산 수준은 아연 첨가/고갈 및 철 분신 첨가에 대한 응답으로 명확하게 볼 수 있습니다. (B)서방 블롯에 대한 상대 신호 강도는 밀도 측정을 통해 정량화되었다. 이 그림은 마우라키스 외19에서적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 임노코치의 아연 제한 성장. 야생형 균주 FA19, 또는 tdfJ 또는 tdfH를 생성하지 않는 이 균주의 동인 생성 돌연변이체는,(A)처리되지 않은 CDM에서 기하급수적 상에 도달할 때까지 성장하였고,(B)다시 OD600 = 0.02 및(C)OD600 = 0.1로 희석하였다. A의 샘플을 칼프로틴(상부) 또는 첨가된 아연(아래)을 함유하는 프리믹스로 처리하고 8시간 동안 성장하였다. B 및 C의 샘플은 자유 아연, 아연 없음(5 μM TPEN) 또는 S100A7을 함유하는 프리믹스로 보충되었고, 이러한 조건에서 6시간 동안 성장하여 CP, S100A7, 또는 A 및 B의자유 아연과 같은 사용 가능한 아연 공급원을 보충할 때만 회수하였고, C는 내부 적으로 희석되지 않았다. 도 2A는 17도2B로부터 적응된 마라키스 외19에서적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 대표적인 결합 성 측정법은 금속 응력 여관에 결합하는 숙주 리간드를 보여준다. (a)야생형 변형FA1090, 또는 tdfJ, tdfH, 또는 둘 다를 생성하지 않는 이 균주의 돌연변이체는, 보충 금속 없이 CDM에서 재배되었고 표준화된 밀도로 니트로셀룰로오스상에 점선화시켰다. 세포는 아연 반응TdfH에 의해 인식되는 칼프로틴으로 조사되었고, 결합은 항칼프로텍틴 항체(top)로 검출함으로써 평가되었다. 상대 칼프로텍틴 결합은 고밀도 계량을 통해 양량화되었고, 여기서 로그 스케일(bottom)에 도시되어 있다. (b)결합 실험은 A에기재된 바와 같이 수행하였고, 대신 FA19 야생형 균주 및 tdfJ 돌연변이체 및 그 백그라운드에서 보완된 균주를 사용하였다. 세포는 HRP 표지된 S100A7로 조사하였고, 이는 아연 반응성 TdfJ.(C)야생형 변형체 FA19를 CDM 또는 GC 배지 국물에서 나란히 성장시켰으며, 25 μM deferoxamine을 첨가하여 킬레이트 자유 철에 첨가하고, 질소셀룰로오스에 점선하여 표준화된 양으로 점선하고, 트랜스브린을 결합하여 압제하였다. 이러한 나란히 테스트결과, CDM은 GC 배지 국물과 달리 철분 제한 환경을 달성하기 위해 추가 킬레이션이 필요하지 않다는 것을 알 수 있습니다. 그림 3A는 마우라키스 외19에서장 외 및 바닥에서 적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
성장 매체는 미생물 학적 연구에서 다양한 역할을합니다. 특수 미디어는 다양한 유형의 연구를 위한 선택, 농축 및 기타 다양한 응용 분야에 사용됩니다. 이러한 응용 중 하나는 금속 반응 유전자의 유도이며, 이는 일반적으로 특정 금속 이온을 표적으로 하는 특정 킬레이터를 첨가하여 수행됩니다. 이러한 방법은 다양한 미량 금속에 필요한 킬레이트화의 양이 독특한 금속 프로파일을 함유하는 상이한 수원으로 인해 가변될 가능성이 높으며, 상이한 금속 농도를 함유하는 동일한 매질 성분의 2제비로서 제한된다6. 이러한 본질적인 단점을 피하기 위해 Chelex-100 수지로 처리된 정의된 매체의 준비 및 사용을 설명하여 모든 미량 금속을 대량으로 제거하여 필요에 따라 지정된 금속을 다시 매체에 다시 첨가할 수 있도록 했습니다.
현재 프로토콜에서 논의의 첫 번째 중요한 점은 소스 물입니다. 이 프로토콜은 실험실 유형 2 (ISO 3696 사양에 따라 1.0 메가 옴스 -cm)에서 금속을 제거하기에 충분한 Chelex 처리를 설명합니다. 다른 수원 가능성이 더 짧거나 더 긴 Chelex 치료를 필요로 할 것이다. 우리는 분자 생물학 학년 물과 같은 타입-2보다 더 높은 순도의 물이이 응용 프로그램에서 세균 성장을 지원하지 않는다는 것을 발견했습니다. 매체 준비를 위한 용기의 선택은 수원만큼이나 중요합니다. 유리 제품이 용액에 금속 이온을 침출할 수 있으므로 플라스틱 용기를 청소하는 것이 좋습니다. 플라스틱 제품을 사용할 수 없는 경우 오염 위험을 최소화하기 위해 유리 제품을 산세척해야 합니다. CDM을 사용할 때 배양 플라스크에 대해동일한 산 세척이 필요합니다.
체외 환경에서 Neisseria 임질의 성장은 매우 어려울 수 있습니다, 이 유기체는 인간 호스트에서 특별히 번창하기 위해 진화로21. CDM은 실험 기간 동안 성장을 지원하는 데 적합하지만, 접종 및 희석 단계에서 임노코제가 필요 이상으로 대기 상태에 있지 않도록 주의해야 합니다. 임코치22의 상혈 특성과 인간 숙주 내에서 발견되는 온도에 대한 취약성으로 인해 대기 조건에서 문화를 ~ 15 분 이상 유지하지 않는 것이 좋습니다. 방법의 단계 4.5에 설명된 초기 질량 이중 이벤트가 2 시간 이상 걸리는 경우, 임질 배양이 제대로 처리되지 않았고 실험을 중단해야 할 가능성이 높습니다.
이 방법의 초점은 Neisseria 임질의 성장 및 특성화에 특히 있는 동안, 이 특정 CDM의 사용은 또한 그밖 Neisseria 종의 연구 결과에서 적당합니다. 또한, 다른 박테리아의 다른 금속 감지 시스템의 특성화에 쉽게 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 유사한 금속 프리 매체는 황색포도상구균(23)및대장균(24)에서금속 섭취를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 다른 박테리아에 대 한 설명 된 조리법의 활용 가능성이 작은 수정 또는 추가 포함 될 것 이다, 문제의 박테리아의 특정 영양 요구에 따라. 예를 들어, 보충 VIII는 보충CO2에대한 임균의 필요성을 돕기 위해 조리법에 포함되어 있습니다. 전술한 바와 같이, 성장은 5%CO2 대기로 37°C에서 수행되지만, 우리는 배지에 보충 중탄산염을 첨가하면 정의된 배지에서 임노코칼 성장의 초기 단계를 돕는다는 것을 발견했습니다. 이러한 요구 사항이없는 유기체의 경우,이 성분은 생략 될 수 있습니다. 안타깝게도 이러한 수정의 추가 예는 경험적으로 결정되어야 합니다.
다른 박테리아와 함께 사용하기 위해 방법을 다소 적응할 필요가 있음에도 불구하고 기본 프레임 워크는 광범위한 사용에 적합해야합니다. 금속 반응성 유전자 및 금속 수송기의 특성화는 Neisseria 수막염18,25,26,27,28, S. 아우레우스9, 혈혈유인플루엔자29, 살모넬라 엔티카30, 대장균31 등 미생물 연구에서 지속적인 노력을 기울이고 있습니다. 이 기술의 우리 자신의 미래 활용은 이미 언급 한 것을 넘어 다른 gonococcal 금속 섭취 시스템의 이해를 더 목표로합니다, 임균이 락토페린32,33,헤모글로빈34,35,또한 세균성 xenosiderophores36과같은 숙주 단백질에서 철을 취득하고, 산화 스트레스 방어에 연루된 망간과 같은 그밖 금속의 효력으로 우리의 연구 결과를 확장하는 것을 허용합니다 로 Neisseria12,37.
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Disclosures
저자는 선언할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R01 AI125421, R01 AI127793 및 U19 AI144182에 의해 지원되었다. 글을 쓰는 저자는 이 방법의 교정 및 검토에 기여한 모든 실험실 구성원에게 감사를 표하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
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