Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Металл-ограниченный рост Neisseria gonorrhoeae для характеристики Металл-ответственных генов и приобретения металла от Хост Лигандс

doi: 10.3791/60903 Published: March 4, 2020

Summary

Мы описываем здесь метод для роста Neisseria gonorrhoeae в метал-ограниченной жидкой среде для облегчения экспрессии генов для поглощения металла. Мы также наметить вниз по течению эксперименты, чтобы охарактеризовать фенотип гонококки, выращенные в этих условиях. Эти методы могут быть адаптированы, чтобы быть пригодными для характеристики металлочувствительных генов в других бактериях.

Abstract

След металлов, таких как железо и цинк являются жизненно важными питательными веществами, как известно, играют ключевую роль в прокариотических процессов, включая регуляцию генов, катализ и структуру белка. Улавливание металла хостами часто приводит к ограничению металла для бактерии. Это ограничение индуцирует экспрессию бактериальных генов, белковые продукты которых позволяют бактериям преодолевать ограниченную металлом окружающую среду. Характеристика таких генов является сложной задачей. Бактерии должны быть выращены в тщательно подготовленных средствах массовой информации, что позволяет достаточный доступ к питательным металлам, чтобы позволить рост бактерий при сохранении металлического профиля, способствующих достижению экспрессии вышеупомянутых генов. Таким образом, необходимо установить хрупкий баланс концентраций этих металлов. Выращивание питательно примиренного организма, такого как Neisseria gonorrhoeae,который эволюционировал, чтобы выжить только у человека-хозяина, добавляет дополнительный уровень сложности. Здесь мы описываем подготовку определенной метал-ограниченной среды, достаточной для того, чтобы позволить гонококковому росту и желаемому экспрессии генов. Этот метод позволяет следователю хелат железа и цинка из нежелательных источников, дополняя средства массовой информации с определенными источниками железа или цинка, подготовка которых также описана. Наконец, мы наметили три эксперимента, которые используют это средства массовой информации, чтобы помочь охарактеризовать белковые продукты металлорегулируемых гонококковых генов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neisseria gonorrhoeae вызывает распространенную инфекцию, передаемую половым путем, гонореей. Во время инфекции, патогенные Neisseria выразить репертуар металл-чувствительных генов, которые позволяют бактериям преодолеть усилия ограничения металла человека хозяина1,2,3. След металлов, как железо и цинк играют ключевую роль во многих клеточных процессов, таких как связывание с ферментами в каталитических участках, участие в редокс реакции, и как структурные факторы в различных белков4,5. В метал-ограниченных условиях, металл-реагируя loci derepressed и их резцирующие протеины могут помочь присваивать эти питательные вещества. Характеристика этих генов и белков представляет собой уникальную техническую задачу для исследователя. Ионы металла должны быть удержаны от бактерий, чтобы вызвать транскрипцию этих генов из их родной локусы, но эффективное хелатора этих ионов из металлических носителей может быть трудно оптимизировать. Различные металлические профили исходной воды и присущие много-много вариации6 порошкообразных ингредиентов означает, что количество хелатора, необходимых для удаления конкретного металла из богатой среде будет варьироваться в зависимости от различных местах, ингредиент поставщиков, и даже с течением времени в рамках одной лаборатории, как химический инвентарь заменяется.

Чтобы обойти эту задачу, мы описываем подготовку определенной среды, которая обрабатывается с помощью моли chelex-100 во время подготовки к удалению следов металлов из раствора. Эта среда является достаточно питательной плотной, чтобы обеспечить рост гонококка, который трудно культуры за пределами человеческого хозяина, и позволяет следователю ввести конкретный профиль металла путем добавления своих собственных определенных источников и концентраций Металлов. Метод контролируемого дополнения желаемых металлов к истощению среды увеличивает экспериментальную консистенцию и позволяет проводить надежные, воспроизводимые эксперименты независимо от таких факторов, как источник воды и химические номера лотов. Кроме того, эти носители могут быть развернуты как жидкость или твердые только с незначительными изменениями, что делает его довольно универсальным.

Для того, чтобы продемонстрировать полезность этой среды, мы наметили протокол для его использования для гонококкового роста и описать три успешных эксперимента для характеристики металлоотвечающего генов Neisseria. Во-первых, мы готовим гонококковые цельноклеточные лизаты из истощенных металлом или дополненных культур и демонстрируем переменные уровни производства белка из металлочувствительных локусов. Затем мы наметили цинк-ограниченный обзор роста, в котором гонококковый рост контролируется добавками конкретных, пригодных для использования источников цинка. Наконец, мы показываем связывающие анализы, которые демонстрируют целые гонококковые клетки, выражающие металлореакционные поверхностные рецепторы, связывающиеся с их соответствующими металлосодержащих лигандами. Успешное поверхностное представление этих рецепторов требует роста в металло-обеденный среды.

Настоящий протокол был оптимизирован специально для Neisseria gonorrhoeae, но многие другие бактериальные патогены используют стратегии приобретения металла во время инфекции7, так что этот протокол может быть адаптирован для изучения металла гомеостаза в других бактерий. Оптимизация этого носителя и этих экспериментальных протоколов для использования в других бактериях, скорее всего, потребует незначительной модификации концентрации металлического хелатора и/или времени лечения с Chelex-100, так как другие бактерии могут иметь несколько иные требования к металлу, чем у гонококка. Утюг и цинк являются основными металлами, вызывающими озабоченность в связи с описанными исследованиями, но другие металлы (например, марганец) были продемонстрированы как критические для бактерий, в том числе Neisseria8,9,10,11,12. Кроме того, аналогичные методы были описаны для характеристик металла в работе эукариотической клеточной культуры, которые также могут быть рассмотрены. 13 Год

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка Chelex-обработанных Определенных средних (CDM) Фондовые решения

  1. Акционерное решение I
    1. Комбинат NaCl (233,8 г), K2SO4 (40,0 г), NH4Cl (8,8 г), K2HPO4 (13,9 г) и KH2PO4 (10,9 г) в деионизированной воде до конечного объема 1 л.
    2. Фильтр стерилизовать раствор и aliquot в 50 мл конических труб.
    3. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  2. Акционерное решение II
    1. Смешайте тиамин HCl (0,2 г), тиамин пирофосфат-Cl (0,05 г), пантотенат кальция (0,19 г) и биотин (0,3 г) в 50% (vol/vol) этанола до окончательного объема 1 л.
    2. Aliquot в 50 мл конических труб и хранить при -20 градусов по Цельсию.
  3. Акционерное решение III
    1. Комбинат L-аспартат (4,0 г), L-глутамамат (10,4 г), L-аргинин (1,2 г), глицин (0,2 г), L-серин (0,4 г), L-лейцин (1,2 г), L-лецин (0,2 г) 0,72 г), L-изолеуцин (0,24 г), L-валин (0,48 г), L-тирозин (0,56 г), L-пролин (0,4 г), L-триптофан (0,64 г) L-threonine (0,4 г), L-фенилаланин (0,2 г), L-аспарагин-Н2О (0,2 г), L-глутамин (0,4 г), L-гистидин-Хл (0.2 г). 2 г), L-метионин (0,12 г), L-аланин (0,8 г), L-лизин (0,4 г) и снижение глутатиона (0,36 г) в 500 мл деионизированной воды.
    2. Растворите L-цистеин (0,44 г) и L-цистин (0,28 г) в минимальном объеме (1 мл) 1 М ЛК и добавьте к вышеупомянутому аминокислоте раствору.
    3. Отрегулируйте рН раствора с 10 N NaOH до тех пор, пока все частицы не растворятся. Окончательный рН будет 10.0-11.0.
    4. Доведите окончательный объем до 1 л с деионизированной водой.
    5. Фильтр стерилизовать раствор и aliquot в 250 мл объемов.
    6. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  4. Биржевое решение IV
    1. Растворите глюкозу (200 г) в деионизированной воде до конечного объема 1 л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор, возможно, придется нагревать, чтобы растворить глюкозу.
    2. Фильтр стерилизовать и aliquot раствор в 50 мл конических труб.
    3. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  5. Акционерное решение V
    1. Смешайте гипоксантин (5,0 г), урацил (5,0 г) и НаОХ (4,0 г) в деионизированной воде до конечного объема 1 л.
    2. Фильтр стерилизовать и aliquot в 50 мл конических труб.
    3. Хранить при -20 градусах по Цельсию.
  6. Решение VI
    1. Приготовьте раствор 1 M CaCl2-2H2O (147 г/л) в деионизированной воде. Фильтр стерилизовать и хранить при комнатной температуре (RT).
  7. Биржевое решение VII
    1. Приготовьте раствор 1 M anhydrous MgSO4 в деионизированной воде. Фильтр стерилизовать и хранить на RT.
  8. Акционерное решение VIII
    1. Подготовьте раствор 1 M NaHCO3 в деионизированной воде. Фильтр стерилизовать и хранить на RT.

2. Приготовление 4x стерильного концентрата и 1x CDM

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна быть выполнена в любом кислоты обработанной стерильной стеклянной посуды или пластика, чтобы предотвратить выщелачивание металлов в растворы.

  1. Объедините фондовые растворы I (50 мл), II (20 мл), III (250 мл), IV (50 мл) и V (20 мл) с 20,0 г HEPES и перемешайте для смешивания.
  2. Отрегулируйте рН до 7,4, затем доведите окончательный объем до 500 мл с деионизированной водой.
  3. Вымойте сетельную Chelex-100 в 1 л деионизированной воды, чтобы удалить консерванты до добавления ее в стерильный концентрат 4x. Сделайте это, добавив 50 г мисы в 1 л деионизированной воды и помешивая, по крайней мере 1 ч. Удалите воду вакуумной фильтрацией и используйте эту промытую мизину для шага 2.4.
  4. Добавьте 50 г мишеки и медленно перемешайте ровно 90 мин.
  5. Удалите сброс ыватки путем стерилизации фильтра и храните 4x стерильный концентрат при 4 c.
  6. Для подготовки 1x рабочей концентрации CDM сначала разбавить 4x концентрат со стерильной деионизированной водой, затем добавьте раствор VI (125 л на 500 мл 1x раствора), раствор VII (535 л на 500 мл) и раствор VIII (10 мл на 500 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя все биржевые решения уже стерилизованы, рекомендуется фильтровать стерилизовать раствор 1x снова после приготовления.

3. Подготовка CDM пластин

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт ниже делает 1 L средств массовой информации для пластин, но лучше всего подготовить их в меньших объемах. Все сокращается пропорционально.

  1. Вымытая агароза
    1. Растворите 50 г агарозы в 1 л деионизированной воды, помешивая в течение 1 ч.
    2. Перенесите раствор в центрифугу и центрифугу на 1200 х г в течение 15 мин на RT. Осторожно вылейте супернатант и отбросьте.
    3. Добавьте достаточно деионизированной воды, чтобы повторно приостановить гранулы агарозы, затем перенесите в колбу 1 л. Довести до окончательного объема 1 л с деионизированной водой, а затем перемешать и центрифуги, как в шаге 3.1.2. Отбросьте супернатант.
    4. Добавьте достаточно 100% этанола, чтобы переприимить гранулы, затем перенесите в новую колбу 1 л. Довести до окончательного тома 1 л с этанолом. Перемешать и центрифуги, как в шаге 3.1.2.
    5. Повторите шаг 3.1.4.
    6. Добавить метанол в гранулы агарозы, чтобы переоставить, а затем передать в колбу 1 л. Довести до окончательного объема 1 л с метанолом. Перемешать и центрифуги, как в шаге 3.1.2.
    7. Повторите шаг 3.1.6.
    8. Передача промытой агарозы в лоток, облицованная алюминиевой фольгой, и дайте высохнуть в дымовом капюшоне. При сухом состоянии перенесите в контейнер без металла для длительного хранения.
  2. Добавьте 10 г промытой агарозы и 5 г картофельного крахмала до 750 мл деионированной воды.
  3. Автоклав в течение 30 мин при температуре 121 градуса По Цельсию, 100 кПа выше атмосферного давления.
  4. Дайте носителям остыть до 65 градусов по Цельсию, затем добавьте 250 мл 4X CDM, 250 л раствора VI, 1,07 мл раствора VII и 20 мл раствора VIII.
  5. При желании добавьте металлы выбора перед заливкой пластин. Добавление хелаторов не обязательно для поддержания условий без металла.
  6. Налейте в Петри блюда и дайте затвердеть.

4. Металл ограниченный рост Neisseria гонореи

ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства приложений, это не обязательно металла стресса бактерий до прививки CDM. Первоначальный шаг удвоения в CDM и последующее разбавление достаточно, чтобы истощить gonococci их внутренних магазинов железа и цинка. Таким образом, первые два шага следующей процедуры проводятся с использованием агар пластин из GC средней базы, которые были дополнены дополнением Kellogg I14 и 12,5 мкм Fe (NO3)3. При желании раннего металлического стресса мы рекомендуем готовить гК средних базовых пластин без Фе (NO3)3 и с 5 мкм TPEN (N,N,N',N',N'-tetrakis (2-пиридилметил) этиленедиамин) для цинковой челациации или 10 мкм дефероксамина для чул-железа. Вся инкубация проводится при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.

  1. За два дня до эксперимента, в день -2, полоса gonococci из морозильной камеры запасов на ГК средних пластин и инкубировать не более 24 ч.
  2. На день -1, полоса одиночных колоний на свежие средние плиты GC. Попробуйте сделать это 14-16 ч до эксперимента роста.
  3. В день эксперимента добавьте 5-10 мл 1x CDM к кислотной промытой 125 мл озадачитой колбы для боковых рук(Дополнительная череска 1) и используйте это для того, чтобы очистить колориметр Klett.
  4. Используйте стерильный, хлопчатобумажный мазок, чтобы привить CDM от здоровых, одиноких колоний. Цель для 20 единиц Клетт.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если колориметр Klett недоступен, то подойдет и спектрофотометр. Универсальной формулы преобразования для единиц Klett для OD не существует, но имеется грубое руководство(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
  5. Инкубировать с тряской при 250 об/мин примерно до одного удвоения массы (40 единиц Klett). Это должно занять от 1 до 2 ч.
  6. На данный момент, культуры обратно разбавленной путем добавления достаточного объема CDM достичь половины первоначальной плотности культуры (например, если 5 мл культуры пошел от 20 до 40 Единиц Klett, 15 мл CDM принесет его обратно до 10 единиц Klett) и рост будет продолжаться как в шаге 4.5. Конкретное количество обратно разбавления, обработки металла и т.д. зависит от вниз по течению приложений. Ниже приведены три примера (разделы 5, 6 или 7).

5. Западный анализ металлических ответственных генных продуктов

  1. Начиная с шага 4.6, задняя разбавляет культуры тремя томами CDM (например, 15 мл CDM, если начиная с 5 мл). В этот момент, добавить металлические обработки при желании.
    1. Гены, чувствительные к железу, могут быть подавлены с помощью 12,5 км ММ Фе (NO3)3. Цинк-ответные гены могут быть подавлены с 10 мкм NSO4.
    2. Дополнительный утюг или цинк стресс не является необходимым, так как средства массовой информации уже исчерпаны, так что отзывчивые гены уже будут выражены. При желании дальнейшего стресса мы рекомендуем не более 1-2 км от дефероксамина или TPEN, так как чрезмерное напряжение предотвратит рост культур.
  2. Выращивайте культуры в шаге 4,5 на 4 ч и записывайте окончательную плотность клеток образцов. Меньше металл-напряженных культур вырастет до более высокой конечной плотности.
  3. Стандартизуируй культурдой до подходящей плотности и приготовьте лизата.
    1. Стандартизуизировать цельноклеточные лизаты с плотностью, эквивалентной 100 единицк Клетта в 1 мл культуры. Для достижения этой цели разделите 100 на плотность единицы Klett в выборке. Номер, который вы получаете, это объем, в мЛ, культуры, которая будет использоваться для изготовления клеточных гранул.
  4. Следуйте стандартным SDS-PAGE и западным процедурам промотирования15 для проверки белков, представляющих интерес.

6. Металлические анализы роста

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти анализы описывают заранее сделанные примики роста. Подготовка этих смесей описана в разделе 8.

  1. Во время массового удвоения в шаге 4.5, pretreat скважины 96 хорошо микроплиты с 10x premixes. Кроме того, обозначьте три скважины в качестве заготовок. К этим скважинам добавьте 10 кЛ 10-x примикш и 90 КЛ CDM.
  2. После того, как культуры в боковых колбах удвоились, добавьте 100 кЛ каждой культуры к неиспользованной скважине в микроплите и измерьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600). Это может быть сделано с кюветами в спектрофотометр, но с большим количеством штаммов в рамках анализа это может стать громоздким и, как правило, не рекомендуется, если ваш спектрофотометр может измерять непосредственно из руки колбы стороны руки (Дополнительная рисунок 2).
    1. При измерении OD, место фляги обратно в инкубатор для обеспечения gonococci остаются жизнеспособными.
  3. Рассчитайте правильное количество разбавления, необходимое для доведения культур доOd 600 и 0,02. 10x premixes имеют незначительное влияние на OD и могут быть исключены из расчета.
  4. Разбавить культуры с CDM в небольших трубах культуры и добавить достаточный объем, чтобы разбавить 10x premixs до 1x в пластине. Если тарелка теплее доступна, держать пластину на 37 градусов по Цельсию во время работы.
  5. Инкубировать пластину для 8-12 ч с встряхиванием в плите читателя, принимая OD600 измерений с желаемыми интервалами.

7. Обнаружение Лиганда Связывания внешними переносчиками металла Membrane

  1. Лечить культуры как желаемое, как в шаге 5.1, затем инкубировать с встряхивания в течение 4 ч.
  2. Незадолго до 4 ч знак, вырезать три куска фильтровальной бумаги и кусок нитроцеллюлозы до приблизительного размера, необходимого для вписываются в точка пятно прибора(Дополнительный рисунок 3). Предварительно замочите нитроцеллюлозу в деионизированной воде, затем соберите аппарат с фильтровальной бумагой ниже нитроцеллюлозы.
  3. На 4 ч запишите плотность клеток и стандартизируем соответствующую конечную плотность. Рекомендуется использовать 10% плотности, используемой для подготовки клеточных лисатов в шаге 5. Например, если использовать 100 KU в 1 мл для lysates, это означает, что 10 КУБ в 1 мл для этих помарки. Расчет в противном случае такой же, как описано в 5.3.1, и культуры добавляются непосредственно к нитроцеллюлозы в расчетных объемах, а не сделаны в lysates.
  4. Пиперт клеток культур на нитроцеллюлозы и позволяют достаточно времени для фильтровальной бумаги, чтобы поглотить всю жидкость.
  5. Разобрать аппарат, дать пятно высохнуть, и блокировать мембрану нитроцеллюлозы в течение 1 ч в 5% бычьего сыворотки альбумина или обезжиренного молока (w/v) в Tris-буферированный солен.
  6. Соберите точечный аппарат, заменив фильтровальную бумагу парафиновой пленкой для создания герметичного уплотнения под нитроцеллюлоза.
  7. Разбавить металлосвязывающую лиганд, представляющий интерес, до 0,2 мкм блокатором и зондными ячейками на 1 ч.
  8. Сифон с жидкости с вакуумом, мыть пятно, а затем следовать стандартным иммунологических процедур для разработки сигнала16. Шаги мытья могут быть сделаны в или из аппарата.

8. Металлическая загрузка Трансферрин, S100A7 и Calprotectin, и подготовка 10x Премиксов

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в подготовке CDM, используйте кислотно-промытое стекло или пластик для приготовления раствора.

  1. Растворите трансферрин человека при 10 мг/мл (125 мл) в исходном буфере (100 мм, 150 мм NaCl, 20 мм NaHCO3,рН 8,4). S100A7 и calprotectin подвешены в буфере, состоящем из 20 мм Трис, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-Mercaptoethanol, и 1 мМ CaCl2, рН 8,0).
    1. Добавьте раствор феррации (100 мМ цитрат натрия, 100 мм NAHCO3,5 мМ FeCl3-6H2O, рН no 8.4) к раствору трансфертина для достижения 30% насыщения железа (например, 75 л раствора феррации подходит для 5 мл трансфертина, если он сделан при 10 мг/мл).
    2. Добавьте snSO4 к S100A7 или calprotectin в соотношении 50% моляров к белку, чтобы создать 25% насыщения (каждая молекула белка имеет два места связывания металла). Можно использовать препараты 100 мкм S100A7 или калпротекин с 50 мкм «NSO4».
    3. В обоих случаях допускайте перемешивание по крайней мере на 1 ч для погрузки металла.
  2. Подготовьте 4 l диализного буфера (40 мм Трис, 150 мм NaCl, 20 мМ NaHCO3,рН 7,4). Разделите это на два отдельных 2 L тома и поместите один на 4 градуса По Цельсию.
  3. Добавьте металлические нагруженные белки в кассету диализа с помощью шприца и диализировать против первого объема буфера в течение 4 ч на RT.
  4. Переместите кассету на второй объем буфера и диализ на ночь при 4 градусах Цельсия. После этих шагов, любые несвязанные металлы должны быть удалены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы советуем анализ bicinchoninic кислоты для определения концентрации белка после диализа.
  5. Используйте 10-x трансферрин-премикс для использования трансферрина в качестве единственного источника железа.
    1. Подготовьте этот премикс, разбавив 30% человека Fe-трансферрин и бычьей апо-трансферрин (подготовлен на 125 мкм, как описано для человека трансферрин, без шага загрузки железа) до 75 мкм и 30 мкм, соответственно, в PBS. Положительный контрольный примикс заменяет 30% Фе-трансферрин на 75 мкм Fe (NO3)3, а отрицательный контрольный премикс опускает любое добавленное железо, сохраняя только бычьего апо-трансферрин. В оценке роста разбавьте 10 концентратов с 90 зл культуры. Окончательные концентрации 7,5 мкм 30% человека Fe-трансферрин и 3 мКМ бычьего апо-трансферрин.
  6. Используйте модифицированную версию трансферрина 10x-премикса для использования S100A7 или кальпротецина в качестве единственного источника цинка.
    1. Для положительного контрольного премикса, включите 50 км знСО4 в трансферин-премикс. Для отрицательного контроля, включить 50 км TPEN и опустить цинка. Затем возьмите по 10 кЛ каждого из них для каждого хорошо необходимого образца и переместите этот объем в новую трубку. Добавьте к этому вдва меньше объема стерильных PBS. Например, если 10 скважин получат положительный контрольный премикс, возьмите 100 кЛ примикса, переместите его в новую трубку и добавьте 50 Л Л PBS. Сделайте то же самое для отрицательного контроля.
    2. Чтобы сделать S100A7 или calprotectin premix, возьмите 10 зЛ отрицательного контрольного примикса на нужную, перейдите на новую трубку и добавьте половину этого объема 25% n-S100A7 или калпротецина. В оценке роста используйте 15 л примиксов и разбавьте с 85 л культуры. Окончательные концентрации для трансферрин остаются такими же, как и в шаге 8.5, с добавлением 5 мкм из N, TPEN или S100A7/calprotectin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Для характеристики металлочувствительных генов и их генных продуктов была разработана и внедрена специальная определенная среда при отсутствии микроэлементов для роста гонореи Neisseria. В оптимизированном протоколе металлический профиль носителей контролируется путем добавления металлов обратно по усмотрению следователя, а не путем титрования хелирования металлической мишени, что позволяет усилить контроль и согласованность от лаборатории к лаборатории и экспериментировать для экспериментов. Это носители могут быть использованы как в жидком, так и в твердом состоянии, что делает его универсальным во многих экспериментальных установках.

Дифференциальная выработка белка в концентрациях переменных металлов можно увидеть в включенных репрезентативных западных помарких(рисунок 1). На рисунке показаны цинк-реагирующие внешние мембраны транспортеров TdfJ и TdfH, которые были upregulated в ответ на цинк chelation TPEN. TdfJ был по существу обнаружить, когда цинк был добавлен обратно в средствах массовой информации, и TdfH было мало. Кроме того, промоутер tdfJ, как известно, индуцированных, а не репрессированных, железом. Это также видно в помарки. Эти помарки использовали железо-ответный липопротеин TbpB2 в качестве контроля нагрузки. В условиях железа надстройки производство TbpB было сокращено.

Металлические анализы роста демонстрируют использование конкретных, определенных источников цинка гонококком(рисунок 2). На рисунке 2A показаны Н. гонореи, растущие в присутствии загружаемого кальпротерином (CP), который требует действия цинка-ответного TdfH17,18. Когда не было доступно ни одного искупиемого источника цинка, либо из-за отсутствия цинкового дополнения, либо из-за отсутствия TdfH, рост был ограничен. Рисунок 2B показывает аналогичные результаты в присутствии S100A7, который может служить единственным источником цинка, когда внешняя мембрана транспортер TdfJ производится19. В присутствии TPEN в одиночку или когда TdfJ отсутствовал, рост был затруднен, но добавление N-S100A7 восстановил рост в TdfJ-зависимым образом. Наконец, на рисунке 2C показана экспериментальная ошибка. В этом примере шага разбавления гонококковых культур было недостаточно для истощения бактерий внутренних цинковых бассейнов по отношению к общему объему культуры в микроплите. Таким образом, рост отрицательного контроля превысил желаемый ОД.

Специфическое связывание целых гонококковых клеток к их соответствующим лигандам демонстрируется точечными пятнами от культур, подготовленных в металлоограничивающих и металлических изобилующих условиях(рисунок 3). Рисунок 3A,B показывает, что gonococci, выращенные в CDM смогли связать CP и S100A7 при производстве TdfH и TdfJ, соответственно, в результате дефицита цинка. Рисунок 3C сравнивает перевязку трансферрина, которая достигается зубчатыми белками, изготовленными из железочувствительных генов tbpA и tbpB20, когда гонококки выращиваются только в CDM против среднего бульона GC, обработанного железным хелатором дефероксамина. Эта цифра показывает увеличение связывания трансферрина культурами, выращенными в CDM, что свидетельствует о более высоких уровнях экспрессии белка из-за более истощенного железом характера CDM по сравнению с хелатированным бульоном GC.

Figure 1
Рисунок 1: Представитель Западной покло, показывающий дифференциальное производство металлочувствительных белков. (A) Neisseria gonorrhoeae дикий штамм типа FA19 был выращен в CDM, дополненном Nos4 , Fe (NO3)3, или TPEN в указанных концентрациях. После обработки, культуры были выращены в течение 4 ч, прежде чем цельноклеточные лизаты стандартизированной плотности были произведены и подвергаются SDS-PAGE и западной blotting. Дифференциальные уровни производства для TdfJ, который подавляется цинком и индуцируется железом, можно четко увидеть в ответ на добавление цинка / истощение и добавление железа. (B) Относительная интенсивность сигнала для западного подавителя были количественно с помощью денситометрии. Эта цифра адаптирована из Maurakis et al19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Цинк ограниченный рост гонококки. Дикий тип штамма FA19, или изогенных мутантов этого штамма, которые не производят tdfJ или tdfH, были выращены в (A) необработанных CDM до экспоненциальной фазы была достигнута, (B) затем обратно разбавленной до OD600 и 0,02 и (С) OD600 и 0,1. Образцы в А были обработаны с премиксом, содержащим калпротекин (вверху) или без добавления цинка (внизу) и выращены в течение 8 ч. Образцы в B и C были дополнены примкомком, содержащим свободный цинк, без цинка (5 мКм TPEN), или S100A7, и выращены в течение 6 ч. Рост в этих условиях был восстановлен только при приеме средств массовой информации с полезным источником цинка, таким как CP, S100A7, или бесплатный цинк в A и B,в то время как C не был достаточно разбавлен для того, чтобы деплировать внутренний пул. Рисунок 2A адаптирован из Jean et al.17Рисунок 2B адаптирован из Maurakis et al19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3. Представитель связывания анализы показывают хост лиганды, связывающиеся с металлическим стрессом gonococci. (A) Дикий тип штамма FA1090, или мутантов этого штамма, которые не производят tdfJ, tdfH, или оба, были выращены в CDM без дополнительных металлов и были усеяны на нитроцеллюлозы в стандартизированной плотности. Клетки были зондированы с calprotectin, который узнан цинк-реагирущий TdfH, и связывание было оценено обнаружением с антителом anti-calprotectin (верху). Относительная связывание кальпротецина была количественно количественно с помощью денситометрии, показанной здесь на бревенчатой шкале (внизу). (B) Связывание эксперименты были выполнены, как описано в ,но вместо этого с помощью FA19 дикий тип штамма и tdfJ мутант и дополняют штаммов в этом фоне. Клетки были исследованы с HRP-маркировки S100A7, который признается цинка-ответных TdfJ. (C) Дикий тип штамма FA19 был выращен бок о бок в CDM или GC средний бульон с 25 мкм deferoxamine добавил к хелату свободного железа, пунктирной nitrocellulose в стандартизированных количествах, и зондируется с передачей. Эти побочные тесты показывают, что CDM, в отличие от среднего бульона GC, не требует дополнительного хелатора для достижения железо-ограниченной среды. Рисунок 3A адаптирован от Jean et al. и дно от Maurakis et al19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplemental Figure 1
Дополнительная рисунок 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplemental Figure 2
Дополнительная рисунок 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplemental Figure 3
Дополнительная рисунок 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Средства роста играют различные роли в микробиологических исследованиях. Специализированные средства массовой информации используются для отбора, обогащения и различных других приложений для многих уникальных типов исследований. Одним из таких применений является индукция металлочувствительных генов, которая, как правило, достигается путем добавления конкретного хелатора, который нацелен на определенный ион металла. Этот метод ограничен, так как количество хелации, необходимое для различных следов металлов, вероятно, будет переменной из-за различных источников воды, содержащих уникальные металлические профили, и два лота одного и того же медиа-ингредиента, содержащего различные концентрации металла6. Чтобы избежать этого присущего недостатка, мы описали подготовку и использование определенной среды, которая обрабатывается с помощью мишени Chelex-100, чтобы удалить все следы металлов оптом, что позволяет контролируемое добавление указанных металлов обратно в среду по мере необходимости.

В текущем протоколе первым важным пунктом обсуждения является источник воды. Протокол описывает обработку Chelex, которая достаточна для удаления металлов из воды 2-го типа (1,0 мегаохмсс-см в соответствии со спецификациями ISO 3696). Различные источники воды, скорее всего, потребует сяпок в области лечения Chelex. Мы обнаружили, что вода более высокой чистоты, чем тип 2, таких как молекулярная биология класса воды, не будет поддерживать рост бактерий в этом приложении. Выбор судна для подготовки средств массовой информации так же важен, как и источник воды. Мы настоятельно рекомендуем чистые пластиковые контейнеры, так как стеклянная посуда может выщелачивать ионы металла в раствор. Если пластиковая посуда недоступна, стеклянная посуда должна быть промыта кислотой, чтобы свести к минимуму риск загрязнения. Такая же кислотная стирка необходима для культурных колб при использовании CDM.

Рост Neisseria gonorrhoeae в обстановке in vitro может быть довольно сложной задачей, так как этот организм эволюционировал, чтобы процветать именно в человеческих хозяевах21. Хотя CDM подходит для поддержки роста в течение всего периода экспериментов, необходимо проявлять осторожность во время прививок и разбавления шагов для обеспечения того, чтобы гонококки не были в атмосферных условиях дольше, чем это необходимо. Из-за капофильного характера гонококки22 и его пристрастия к температурам, встречаемым в пределах человеческих хозяев, мы не рекомендуем держать культуры в атмосферных условиях дольше, чем 15 мин. Если первоначальное событие удвоения массы, описанное в шаге 4.5 метода, занимает больше, чем 2 ч, вполне вероятно, что гонококковые культуры не были обработаны должным образом и эксперимент должен быть прерван.

Хотя основное внимание в этом методе уделяется методам роста и характеристике Neisseria gonorrhoeae в частности, использование этого конкретного CDM, вероятно, также подходит для изучения других видов Neisseria. Кроме того, он может быть легко применен к характеристике других систем металлочувствения в других бактерий. Например, аналогичные безметаллы средства массовой информации были использованы для характеристики поглощения металла в золотистых staphylococcus23 и Escherichia coli24. Использование описанного рецепта для других бактерий, скорее всего, связаны с небольшими изменениями или дополнениями, в зависимости от конкретных потребностей в питании бактерий, о котором идет речь. Например, дополнение VIII включено в рецепт, чтобы помочь с потребностью гонококка для дополнительного CO2. Как описано выше, рост осуществляется при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 атмосферы, но мы обнаружили, что добавление дополнительного бикарбоната в средствах массовой информации помогает начальные этапы гонококкового роста в определенной среде. Для организмов без такого требования, этот ингредиент может быть опущен. К сожалению, необходимо эмпирически определить дальнейшие примеры этих изменений.

Несмотря на необходимость несколько адаптировать метод для использования с другими бактериями, основные рамки должны быть подходящими для широкого использования. Характеристика металлореакции генов и металлотранспортеров является постоянной деятельности в микробных исследований, с бактериями, включая Neisseria meningitidis18,25,26,27,28, S. aureus9, Haemophilus flue29, Salmonella enterica30, и E. coli31 все, что получает внимание в этой нише. Наше собственное будущее использование этого метода будет направлена на дальнейшее понимание других систем поглощения гонококковых металлов за пределами уже упомянутых, которые позволяют gonococcus приобретать железо из белков-хозяев, таких как лактоферрин32,33, гемоглобин34,35, а также от бактериальных xenosiderophores36, и расширить наши исследования в эффекты других металлов, таких как марганец, который был вовлечен в окислительной защиты стресс по Neisseria12,37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего декларировать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами NIH R01 AI125421, R01 AI127793 и U19 AI144182. Автор письма хотел бы поблагодарить всех членов лаборатории, которые внесли свой вклад в корректуру и обзор этого метода.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
125 mL sidearm flasks Bellco 2578-S0030 Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol VWR M131 Open in fume hood
3MM Paper GE Health 3030-6461 Called "filter paper" in text
Agarose Biolone BIO-41025 Powder
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434 Powder
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Powder
Blotting grade blocker Bio-Rad 170-6404 Nonfat dry milk
Bovine serum albumin Roche 3116964001 Powder
Bovine transferrin Sigma-Aldrich T1428 Powder
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 Powder
Calcium pantothenate Sigma-Aldrich C8731 Powder
Calprotectin N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin Bio-Rad 142-2832 Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab Puritan 25-806 Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine Sigma-Aldrich D9533 Powder
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Powder
Dialysis cassette Thermo 66380 Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus Schleicher & Schwell 10484138 Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol Koptec V1016 Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride Sigma-Aldrich F7134 Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich F1143 Irritant, do not inhale
GC medium base Difco 228950 Powder, already contains agar
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Powder
HEPES Fisher L-15694 Powder
Human transferrin Sigma-Aldrich T2030 Powder
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 Powder
Klett colorimeter Manostat 37012-0000 Uses color transmission to assess culture density
L-alanine Sigma-Aldrich A7627 Powder
L-arginine Sigma-Aldrich A5006 Powder
L-asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A8381 Powder
L-aspartate Sigma-Aldrich A9256 Powder
L-cysteine hydrochloride Sigma-Aldrich C1276 Powder
L-cystine Sigma-Aldrich C8755 Powder
L-glutamate Sigma-Aldrich G1251 Powder
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126 Powder
L-histidine monohydrochloride Sigma-Aldrich H8125 Powder
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752 Powder
L-leucine Sigma-Aldrich L8000 Powder
L-lysine Sigma-Aldrich L5501 Powder
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 Powder
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126 Powder
L-proline Sigma-Aldrich P0380 Powder
L-serine Sigma-Aldrich S4500 Powder
L-threonine Sigma-Aldrich T8625 Powder
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254 Powder
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754 Powder
L-valine Sigma-Aldrich V0500 Powder
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Powder
Methanol VWR BDH1135-4LP Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose GE Health 10600002 Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 60356 Powder
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Powder
Potassium sulfate Sigma-Aldrich P0772 Powder
Potato starch Sigma-Aldrich S4251 Powder
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G4251 Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7 N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder
Sodium chloride VWR 470302 Powder
Sodium citrate Fisher S279 Powder
Sodium hydroxide Acros Organics 383040010 Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625 Powder
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Also called cocarboxylase
TPEN Sigma-Aldrich P4413 Powder
Tris VWR 497 Powder
Uracil Sigma-Aldrich U0750 Powder
Zinc sulfte heptahydrate Sigma-Aldrich 204986 Irritant, do not inhale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76, (1), (2018).
  2. Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187, (14), 4865-4874 (2005).
  3. Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194, (23), 6594-6603 (2012).
  4. Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5, (11), 3173-3178 (2006).
  5. Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93, (4), 609-616 (2014).
  6. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39, (2), 51-60 (2018).
  7. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10, (8), 525-537 (2012).
  8. Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23, (6), 737-748 (2018).
  9. Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81, (9), 3395-3405 (2013).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14, (2), 218-224 (2010).
  11. Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, (2), 344-361 (2006).
  12. Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60, (2), 401-416 (2006).
  13. Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8, (3), 188-192 (1995).
  14. Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4, (9), 429-434 (2012).
  16. Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152, (2), 227-236 (1992).
  17. Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84, (10), 2982-2994 (2016).
  18. Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9, (10), 1003733 (2013).
  19. Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15, (8), 1007937 (2019).
  20. Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14, (5), 843-850 (1994).
  21. Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16, (4), 226-240 (2018).
  22. Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4, (2), 129-132 (1976).
  23. Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8, (5), 01281-01317 (2017).
  24. Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190, (15), 5431-5438 (2008).
  25. Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
  26. Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81, (6), 1915-1927 (2013).
  27. Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80, (2), 657-667 (2012).
  28. Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
  29. Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79, (8), 3366-3376 (2011).
  30. Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75, (12), 5867-5876 (2007).
  31. Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
  32. Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67, (1), 455-459 (1999).
  33. Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63, (8), 2958-2967 (1995).
  34. Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64, (12), 5008-5014 (1996).
  35. Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
  36. Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181, (9), 2895-2901 (1999).
  37. Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40, (5), 1175-1186 (2001).
Металл-ограниченный рост <em>Neisseria gonorrhoeae</em> для характеристики Металл-ответственных генов и приобретения металла от Хост Лигандс
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).More

Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter