Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Dissectie van Bekken Autonome Ganglia en bijbehorende zenuwen in mannelijke en vrouwelijke ratten

Published: March 7, 2020 doi: 10.3791/60904

Summary

De belangrijkste bekken ganglia bevatten parasympathische en sympathische neuronen die bekkenorganen innervate. Hier beschrijven we een dissectie methode en bieden schema's voor de identificatie van deze ganglia en hun bijbehorende zenuwen. Deze methoden kunnen worden toegepast op experimentele manipulatie van deze ganglia in vivo of verwijdering post-mortem voor verder onderzoek.

Abstract

De bilaterale belangrijkste bekken ganglia (MPG; synoniem, bekken ganglia) zijn de primaire bron van postganglionic sympathieke en parasympathische neuronen innervating bekkenorganen van knaagdieren; de functioneel gelijkwaardige structuur bij mensen is de inferieure hypogastrische plexus. De belangrijkste bekken ganglia bieden ook de route waarmee lumbale en sacrale sensorische axonen de bekkenorganen bereiken. Deze complexe, gemengde ganglia kan een uitdaging blijken te identificeren en te ontleden voor verdere experimentele studie van normale autonome mechanismen of om preklinische modellen van ziekte, letsel of viscerale pijn vast te stellen. Hier beschrijven we een protocol om toegang te krijgen tot deze ganglia en hun bijbehorende zenuwwerken. Wij voorzien dit protocol van schema's voor zowel mannelijke als vrouwelijke ratten, omdat de ganglion grootte en oriëntatiepunten voor identificatie verschillen tussen geslachten. Het protocol beschrijft het verwijderen van het ganglion voor in vitro studies, maar deze methode kan worden geïntegreerd in een chirurgisch herstelprotocol voor experimentele interventies (bijvoorbeeld zenuwbreker, zenuwresectie) of voor het in kaart brengen van neuronale circuits (bijvoorbeeld door micro-injectie van neurale tracers). We tonen ook de primaire structuren van de ganglion en de bijbehorende zenuwen onmiddellijk na dissectie en na immunohistochemische vlekken.

Introduction

De rat is een van de best gekarakteriseerde soorten die worden gebruikt in de studie van de bekkenorgaanfysiologie en anatomie. Hoewel er uitstekende middelen bestaan voor beschrijvingen van deze organen1,2, geven ze over het algemeen geen informatie over de gerelateerde neurale structuren of doen ze dit bij onvoldoende resolutie om een experimentele studie te begeleiden. Zoals hieronder beschreven, de organisatie van de autonome ganglia die bekkenorgaanfunctie reguleren is heel anders dan de rest van het autonome zenuwstelsel, waardoor het moeilijk is om bekkeninnervation-kenmerken nauwkeurig af te leiden van neuroanatomische informatie die beschikbaar is voor andere autonome ganglia. Dit tekort aan middelen om onderzoekers te begeleiden het invoeren van dit gebied kan hebben vertraagd onderzoek naar neurale regulatie van bekkenorganen. Hier beschrijven we protocollen voor de toegang tot deze regio van het zenuwstelsel voor verdere in vitro studies of experimentele interventie.

De bilaterale belangrijkste bekkenganglia (MPG; synoniemen: bekken ganglia; paracervicale ganglia [vrouw]; Frankenhäuser's ganglion [vrouwelijk]) zijn de primaire bron van postganglionic sympathieke en parasympathische neuronen innervating bekkenorganen van knaagdieren; de inferieure hypogastrische plexus omvat de gelijkwaardige neuronale structuur bij mensen3,4,5,6. Sensorische projecties van lumbale en sacrale rugwortel ganglia reizen ook via de MPG om de bekkenorganen te bereiken. Daarom is het begrijpen van de neurale circuits en biologie van de MPG van cruciaal belang voor preklinische studies over een groot aantal klinische aandoeningen met betrekking tot de ontwikkeling en volwassen functie van bekkenorganen. Verschillende uitstekende beschrijvingen van knaagdier MPG zijn gepubliceerd7,8, maar onze ervaring is dat in het algemeen deze beschrijvingen niet altijd voldoende begeleiding bieden om praktisch te informeren over een experimentele dissectie of manipulatie van deze structuren wanneer herstel van het dier nodig is. Bovendien richten de meeste MPG-studies zich op mannelijke ratten. Bij vrouwelijke ratten, de MPG zijn kleiner9 en hebben verschillende anatomische oriëntatiepunten, en daarom vereisen een duidelijk op maat gemaakte gids voor visualisatie en dissectie.

Sympathische en parasympathische paden onderscheiden zich door hun anatomie, met name de locatie van hun preganglionic neuronen, met sympathische paden met preganglionic neuronen in het thoraco-lumbale ruggenmerg en de parasympathische preganglionic neuronen gelegen in de hersenstam (craniale zenuwprojecties) en sacrale ruggenmerg. In de meeste andere regio's van het autonome systeem, hun doel ganglion neuronen bevinden zich in verschillende sympathieke of parasympathische ganglia. Echter, de MPG zijn ongebruikelijk in wordt gemengd sympathische parasympathische ganglia, en daarom op een macroscopische schaal zijn sites van convergentie van preganglionic axonen van zowel thoraco-lumbale en sacrale spinale regio's. We hebben daarom in onze protocollen de locatie en beschrijving opgenomen van deze primaire zenuwwerken die elk ruggenmerggebied verbinden met de MPG, waardoor experimentele analyse of afzonderlijke manipulatie van deze neurale componenten wordt vergemakkelijkt. We merken ook op voor lezers die deze ganglia specifiek vergelijken tussen soorten, dat bij knaagdieren de spinale preganglionische neuronen die 'functioneel sacraal' zijn, bijvoorbeeld actief zijn en vereist zijn tijdens micturition, ontlasting en peniserectie, zich op het ruggenmergniveau L6-S1 bevinden in plaats van uitsluitend in sacrale segmenten10; Ook L6 en S1 dorsale wortel ganglia zorgen voor de belangrijkste 'sacrale' zintuiglijke input voor bekkenorganen. Bij knaagdieren is sensorische en preganglionische input van meer rostral neurale circuits geconcentreerd in spinale niveaus L1 en L210.

Hier beschrijven we een protocol om toegang te krijgen tot de MPG en de bijbehorende zenuwwerken bij mannelijke en vrouwelijke ratten, en ondersteunen dit met schema's om specifieke oriëntatiepunten te illustreren. Dit protocol begeleidt chirurgische toegang tot deze structuren in een experimentele context van het verwijderen van het weefsel voor in vitro studies, bijvoorbeeld het isoleren van MPG-neuronen voor moleculaire karakterisering of primaire cultuur. Het kan ook worden aangepast aan MPG verwijdering na intracardiale perfusie met fixatieve, hoewel dit een moeilijkere dissectie omdat het neurale weefsel wordt moeilijker te visualiseren wanneer de aangrenzende weefsels zijn verstoken van bloed. Dit protocol kan ook worden geïntegreerd in een chirurgische instelling voor experimentele interventie van deze zenuwbanen (bijvoorbeeld zenuwresectie, micro-injectie van neurale tracers). Deze soorten dissecties worden steeds belangrijker voor het groeiende gebied van de bio-elektronische geneeskunde, waar nieuwe doelen en benaderingen voor neuromodulatie voor de behandeling van klinische aandoeningen van de bekkeningewanden worden ontwikkeld11. We presenteren eerst het volledige protocol voor mannelijke ratten, daarna een replica van het protocol dat speciaal is afgestemd op vrouwelijke ratten.

Protocol

Alle procedures moeten worden uitgevoerd volgens de eisen van de institutionele en financieringsinstantie voor dierproeven. Het gebruik van dieren voor deze dissectie en het protocol voor euthanasie zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Universiteit van Melbourne (Protocolnummer 1814639).

OPMERKING: De hier geïllustreerde dissecties werden uitgevoerd op volwassen (~ 10 weken) mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley ratten (Biomedical Sciences Animal Facility, Universiteit van Melbourne), met een gewicht van 280 g (vrouwelijk) en 350 g (mannelijk). Voorafgaand aan deze dissecties werden de ratten gedurende 4,5 min geëuthanaseerd in een CO 2-kamer. Als u weefsel ontleedt van een dier dat transcardiale perfusie met fixatieve heeft ondergaan, neemt u voorzorgsmaatregelen om de bediener te beschermen tegen blootstelling aan fixatieve, d.w.z. dissectie uit te voeren in rookkast of downdraft kabinet en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen. Een protocol voor transcardiale perfusie is gepubliceerd in detail12.

1. Grote bekken ganglion en aangrenzende zenuwen: toegang en resectie in een mannelijke rat

OPMERKING: Figuur 1 toont anatomische oriëntatiepunten voor MPG-visualisatie bij een mannelijke rat.

  1. Toegang tot de buikholte en het bekken
    1. Plaats de rat in een supine positie en toegang tot de buik en het bekken via een ventrale middellijn incisie, zorg ervoor om besmetting van het chirurgische veld met bont te voorkomen.
    2. Beweeg de buikorganen voorzichtig naar de ene kant met behulp van tangen of katoen-getipt applicators. Let op de locatie van de ventrale kwabben van de prostaatklier en de urineblaas.
    3. Verplaats het zaadblaasje naar de contralaterale kant.
    4. Snijd de vas deferens om een betere toegang tot het gebied boven het ganglion te bieden.
      OPMERKING: Vanaf dit punt van de dissectie mag het weefsel niet uitdrogen; houd het weefsel vochtig met fysiologische zoutoplossing (voor zoetwaterdissectie) of fixatief (voor perfusievast dier). Het houden van het weefsel vochtig met zout niet alleen voordelen weefselstructuur, maar maakt ook de dissectie gemakkelijker als droge zenuwen zijn kwetsbaarder en scheuren gemakkelijker tijdens de behandeling.
    5. Identificeer de dorsolaterale kwab van de prostaatklier, op het rugoppervlak waarvan de locatie van het ganglion is; dit zal nog niet zichtbaar zijn.
    6. Om de ganglion te visualiseren, duidelijk zorgvuldig weefsels in de buurt en het overvaren van de ganglion. Gebruik indien nodig een oprolmechanisme om het dissectieveld helder te houden.
    7. Verwijder een nabijgelegen aggregaat van vetweefsel en open de laterale fascia van het bekken.
  2. Dissectie van de MPG en de bijbehorende zenuwen
    1. Identificeer de volgende locaties die oriëntatiepunten bieden voor de volgende stappen van de dissectie: de dorsolaterale kwab van de prostaatklier (het ganglion bevindt zich op het oppervlak van deze kwab, iets meer caudal dan de kruising tussen zaadblaasjes en prostaat) en de zaadblaasjes (waarbij ze samenkomen in de middellijn geeft de ganglion locatie op de rostrocaudal as van het dier).
    2. Zoals vereist vanaf dit punt, verwijder zorgvuldig elk weefsel dat het volledige zicht van de neurale structuren belemmert, het vermijden van schade aan de dunne capsule van de prostaatklier of belangrijke bloedvaten.
    3. Identificeer de bekkenzenuw door het visualiseren van de volgende oriëntatiepunten en functies.
      1. Vind de interne iliacale ader en de fijne tak projecteren in de richting van de MPG en de blaas. Deze vasculaire tak loopt parallel aan en wordt soms ingebed in de bekkenzenuw, dan doorkruist de ganglion.
      2. Plaats fijn getipte schuine tangen onder de bekkenzenuw en schuif de tangen mee om het te bevrijden van omliggende weefsel.
        OPMERKING: Het kan ook mogelijk zijn om de bekkenzenuw te isoleren van het kleine vat dat er parallel aan loopt, maar voor de meeste soorten experimenten is dit niet essentieel. Bevestig dat de structuur is de bekkenzenuw door te bekijken onder hoge vergroting om te bepalen dat de zenuw bevat verschillende losjes geaggregeerde fascicles, die gemakkelijk te onderscheiden zijn onder de ontleden microscoop en zijn kenmerkend voor het bekken zenuw, zoals geen van de andere grote zenuwen in verband met de ganglion tonen deze duidelijke fasciculatie.
    4. Identificeer de holle zenuw door de volgende oriëntatiepunten en kenmerken te visualiseren.
      1. Na het volgen van de bekkenzenuw naar de kruising met de ganglion, volg de holle zenuw als het reist over de prostaat en vervolgens caudally naar de holle lichamen van de penis.
      2. Als microscoopvergroting het toelaat, merk dan op dat er een kleine groep van delicate zenuwen die uit de ganglion tussen het bekken en holle zenuwen; dit zijn de rectale zenuwen die reizen naar de onderdarm.
    5. Identificeer de hypogastrische zenuw door het visualiseren van de volgende oriëntatiepunten en kenmerken.
      1. Identificeer waar de hypogastrische zenuw zich aansluit bij de ganglion aan de schedelrand, na het reizen naast de ureter.
      2. Bevestig dat de hypogastrische zenuw veel dunner is dan het bekken of de holle zenuwen en niet gepaard gaat met grote bloedvaten.
    6. Identificeer de MPG door de volgende functies te visualiseren.
      1. Visualiseer de ventrale, dorsale en schedelranden van de ganglion en vorm een driehoekige vorm.
      2. Bevestig de locatie van elke grote zenuw: de bekkenzenuwen die uit de rugrand van het bendelion komen, de holle zenuw in de meest caudal hoek van het ganlion, de hypogastrische zenuw van zijn schedelrand en de accessoirezenuwen die uit de ganglion's komen ventrale rand.
    7. Identificeer de accessoirezenuwen door de volgende oriëntatiepunten en functies te visualiseren.
      1. Na het opruimen van weefsel om visualisatie van de ventrale rand van de ganglion mogelijk te maken, identificeer een cluster van zenuwen die project naar de urine-en voortplantingswegen.
      2. Als microscoopvergroting het toelaat, identificeer dan een staartgroep zenuwen die tussen de prostaatkwabben en één rostrale groep tussen het zaadblaasje en de blaas binnenkomen.
  3. Verwijdering van mpg met zijn bijbehorende zenuwen
    1. Schuif zachtjes tangen tussen de ganglion en de onderliggende prostaatklier, wees voorzichtig niet te doorboren de dunne capsule van de prostaat. Verstoor alle verbanden tussen de ganglion en de prostaat.
    2. Duidelijk alle laatste verbindingen met omliggende weefsels voor de lengtes van zenuwen die nodig zijn voor het experiment, dan snijd elke zenuw.
    3. Met behulp van fijne tangen, verplaats de ganglion met zijn zenuwen naar de juiste oplossing voor het experiment en bevestigen dat elk van de belangrijkste zenuwen intact zijn.

2. Grote bekken ganglion en aangrenzende zenuwen: toegang en resectie in een vrouwelijke rat

OPMERKING: Figuur 2 toont anatomische oriëntatiepunten voor MPG-visualisatie bij een vrouwelijke rat.

  1. Toegang tot de buikholte en het bekken
    1. Plaats de rat in een supine positie en toegang tot de buik en het bekken via een ventrale middellijn incisie, zorg ervoor om besmetting van het chirurgische veld met bont te voorkomen.
      OPMERKING: Vanaf dit punt van de dissectie mag het weefsel niet uitdrogen; houd het weefsel vochtig met fysiologische zoutoplossing (voor zoetwaterdissectie) of fixatief (voor perfusievast dier).
    2. Beweeg de buikorganen voorzichtig naar de ene kant met behulp van tangen of katoen-getipt applicators. Let op de locatie van de baarmoederhoorn, urineblaas en rectum.
    3. Snijd de eierstok- en baarmoedervaten en trek de baarmoederhoorn in.
    4. Voer de peritoneale ruimte en voorzichtig duidelijk weg een aggregaat van vetweefsel gelegen in de buurt van de baarmoeder baarmoederhals.
  2. Dissectie van de MPG en de bijbehorende zenuwen
    1. Identificeer de laterale wand van de baarmoederbaarmoederhals, net caudal naar de kruising met de baarmoederhoorns; deze regio is de belangrijkste mijlpaal voor het definiëren van de MPG-locatie op de rostrocaudal-as van het dier.
    2. Zoals vereist vanaf dit punt, zorgvuldig verwijderen van alle weefsel dat het volledige zicht van de neurale structuren belemmert, het vermijden van schade aan grote bloedvaten.
    3. Identificeer de bekkenzenuw door het visualiseren van de volgende oriëntatiepunten en functies.
      1. Vind de interne iliacale ader en de fijne tak projecteren in de richting van de MPG en de blaas. Deze tak loopt parallel aan en is soms ingebed in de bekkenzenuw, dan doorkruist de ganglion.
      2. Bevestig dat de structuur is de bekkenzenuw door te bekijken onder hoge vergroting om te bepalen dat de zenuw bevat verschillende losjes geaggregeerde fascicles, die gemakkelijk te onderscheiden zijn onder de ontleden microscoop en zijn kenmerkend voor het bekken zenuw, zoals geen van de andere grote zenuwen in verband met de ganglion tonen deze duidelijke fasciculatie.
    4. Identificeer de hypogastrische zenuw door het visualiseren van de volgende oriëntatiepunten en kenmerken.
      1. Identificeer waar de hypogastrische zenuw zich aansluit bij de ganglion aan de schedelrand, na het reizen naast de ureter.
      2. Bevestig dat de hypogastrische zenuw veel dunner is dan het bekken of de holle zenuwen en niet gepaard gaat met grote bloedvaten.
    5. Identificeer de holle zenuw door de volgende oriëntatiepunten en kenmerken te visualiseren.
      1. Na het volgen van de bekkenzenuw naar de kruising met de ganglion, volg de holle zenuw als het reist caudally langs de laterale wand van de baarmoederhals naar de vagina.
      2. Als microscoopvergroting het toelaat, merk dan op dat er een kleine groep van delicate zenuwen die uit de ganglion tussen het bekken en holle zenuwen; dit zijn de rectale zenuwen die reizen naar de onderdarm.
    6. Identificeer de accessoirezenuwen door de volgende oriëntatiepunten en functies te visualiseren.
      OPMERKING: De accessoire zenuwen zijn moeilijk te zien, maar project van de mediale aspect van de MPG. Na het opruimen van weefsel om visualisatie van de ventrale rand van de ganglion mogelijk te maken, identificeer een cluster van zeer delicate zenuwen die project naar de urine-en voortplantingswegen.
    7. Identificeer de MPG door de volgende functies te visualiseren.
      1. Visualiseer de ventrale, dorsale en schedelranden van het ganglion, die een driehoekige vorm vormen.
      2. Bevestig de locatie van elke grote zenuw: de bekkenzenuwen die uit de rugrand van het bendelion komen, de holle zenuw in de meest caudal hoek van het ganlion, de hypogastrische zenuw van zijn schedelrand en de accessoirezenuwen die uit de ganglion's komen ventrale rand.
  3. Verwijdering van mpg met zijn bijbehorende zenuwen
    1. Plaats fijn getipte schuine tangen onder de bekkenzenuw en schuif de tangen mee om het te bevrijden van de onderliggende baarmoederbaarmoederhals en het omliggende weefsel.
      OPMERKING: Het kan ook mogelijk zijn om de bekkenzenuw te isoleren van het kleine vat dat er parallel aan loopt, maar voor de meeste soorten experimenten is dit niet essentieel. Als het aantonen van de dissectie, plaats een hechting onder de bekkenzenuw, om de visualisatie te vergemakkelijken.
    2. Herhaal het proces voor de holle zenuw, dan de hypogastrische zenuw, en ten slotte de accessoire zenuwen.
    3. Schuif zachtjes tangen tussen de ganglion en de onderliggende baarmoeder baarmoederhals. Verstoor alle verbindingen tussen de ganglion en de baarmoederhals.
    4. Duidelijk alle laatste verbindingen met omliggende weefsels voor de lengtes van zenuwen die nodig zijn voor het experiment, dan snijd elke zenuw.
    5. Met behulp van fijne tangen, verplaats de ganglion met zijn zenuwen naar de juiste oplossing voor het experiment en bevestigen dat elk van de belangrijkste zenuwen intact zijn.

3. Bevestiging van ganglion-onderdelen (optioneel)

  1. Na verwijdering van het ganglion dompel tand ganglion onder in een conventionele histologische fixatieve (bijvoorbeeld 4% gebufferde formaline) voor een minimum van 1 uur, was fixatief met 0,1 M fosfaatbuffer en procesweefsel voor cryosectieing en fluorescentie immunohistochemie, zoals eerder beschreven13.
    OPMERKING: Veel hoogwaardige antilichamen die specifiek deze drie neurale markers herkennen zijn commercieel beschikbaar. Zie Tabel met materialen voor de reagentia die worden gebruikt voor de etikettering in figuur 3.
  2. Als alternatief, proces ganglia intact (wholemounts) voor immunohistochemie met behulp van een soortgelijke methode als hierboven, maar het verhogen van de incubatietijd voor de antilichamen tot 4 dagen (primaire antilichaam) en 2 dagen (secundaire antilichaam).
  3. Om een grote populatie sensorische axonen aan te tonen, gebruik je antilichamen tegen calcitonine gengerelateerd peptide (CGRP).
    OPMERKING: De aanbevolen verdunning van het antilichaam dat in dit onderzoek wordt gebruikt, is 1:5.000.
  4. Om noradrenergic sympathische neuronen aan te tonen, gebruik je antilichamen tegen tyrosine hydroxylase (TH).
    OPMERKING: De aanbevolen verdunning van het antilichaam dat in dit onderzoek wordt gebruikt, is 1:5.000.
  5. Om een grote populatie cholinerge neuronen aan te tonen, gebruik antilichamen tegen neuronale stikstofmonoxide synthase (NOS).
    OPMERKING: De aanbevolen verdunning van het antilichaam dat in dit onderzoek wordt gebruikt, is 1:500.

Representative Results

Een succesvolle dissectie zal niet alleen het volledige lichaam van de MPG intact verwijderen, maar ook het eerste segment van elk van de belangrijkste zenuwen behouden die nog verbonden zijn. Deze zenuwen zijn waardevolle indicatoren van ganglion oriëntatie in vivo en daarom essentiële informatie voor vele soorten anatomische studies (bijvoorbeeld, het in kaart brengen van expressie patronen of cellulaire veranderingen na een experimentele verstoring). Hoewel het behoud van de bijbehorende zenuwen van minder belang kan zijn voor sommige soorten experimenten (bijvoorbeeld ganglion dissociatie voor cultuur van geïsoleerde neuronen), biedt de aanwezigheid van zenuwen ook een manier om het ganglion aan te raken (en mogelijk schadelijke) de neuronale cellichamen.

Een mislukte dissectie zal een onvolledige of beschadigde ganglion hebben, of waar de primaire zenuwen niet meer zijn bevestigd. Het is ook mogelijk dat ganglia of zenuwen onbewust beschadigd zijn tijdens dissectie, hetzij omdat de fysieke schade te subtiel is om op te sporen onder de ontledende microscoop of omdat de schade alleen duidelijk wordt tijdens bepaalde soorten tests. Bijvoorbeeld, als het ganglion weefsel droog wordt tijdens dissectie, kan het weefsel normaal lijken tijdens de latere behandeling, maar zal hoge niveaus van niet-specifieke fluorescentie op het oppervlak vertonen.

Voorbeelden van ontleed MPG worden weergegeven in figuur 3, die voorbeelden geeft van de gehele MPG gevisualiseerd als een hele dikte volledige ganglion(figuur 3A) en een MPG die is cryosectioned voor het uitvoeren van immunofluorescentie aan te tonen noradrenergic en cholinerge neuronen(Figuur 3B, C).

Figure 1
Figuur 1: Anatomische oriëntatiepunten voor MPG-visualisatie bij een mannelijke rat. 1, zaadblaasje; 2, urineblaas; 3, stollingsklier; 4 & 5, accessoire zenuwen; 6, prostaat (ventrale kwab); 7, holle zenuw; 8, vas deferens; 9, plasbuis; 10, bulbocavernosus spier; 11, ischiocavernosus spier; 12, rectale zenuwen; 13, ontvoerder caudae externus; 14, grote bekken ganglion; 15, bekkenzenuw; 16, ontvoerder caudae internus; 17, hypogastrische zenuw; 18, interne iliacale ader; 19, flexor caudae brevis; 20, flexor caudae longus; 21, ureter; 22, psoas major; 23, abdominale aorta; 24, inferieure vena cava. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Anatomische oriëntatiepunten voor MPG-visualisatie bij een vrouwelijke rat. 1, distale dikke darm; 2, urineblaas; 3, baarmoederlichaam; 4, hypogastrische zenuw; 5, accessoire zenuwen; 6, grote bekken ganglion; 7, holle zenuw; 8, vagina; 9, plasbuis; 10, rectum; 11, ontvoerder caudae externus; 12, rectale zenuwen; 13, flexor caudae brevis; 14, bekkenzenuw; 15, interne iliacale ader; 16, ontvoerder caudae internus; 17, flexor caudae longus; 18, externe iliacale slagader; 19, ureter; 20, psoas major; 21, baarmoederhoorn; 22, buikaorta. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Immunohistochemisch gelabeld MPG van volwassen mannelijke ratten. Alle preparaten zijn gevisualiseerd met een conventionele widefield fluorescentie microscoop uitgerust met een monochrome camera, vervolgens digitaal gekleurd. (A) Wholemount (volledige dikte), vaste MPG met bijbehorende zenuwen, immunohistochemisch geëtiketteerd voor de sensorische zenuwen die calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) uitdrukken; 1, bekkenzenuw (met de meerdere fascicles); 2, holle zenuw; 3, hypogastrische zenuw; 4, accessoire zenuwen; 5, rectale zenuwen; 6, grote bekken ganglion (MPG). (B,C) Cryosecties (14 μm) van vaste MPG, immunohistochemisch geëtiketteerd om de gemengde noradrenergic-cholinerge aard van de ganglion aan te tonen; (B) noradrenergic neuronen aangetoond door antilichaam voor tyrosine hydroxylase en (C) een grote populatie van cholinerge neuronen door antilichaam voor neuronale stikstofmonoxide synthase. Kalibratiebalk vertegenwoordigt (A) 1.000 μm, (B,C) 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Neurale controle van de bekkenorganen wordt bemiddeld door complexe trajecten, waaronder somatische, parasympathische, sympathische en viscerale zintuiglijke componenten14,15,16,17. De meeste van deze trajecten komen voort uit of gaan door de MPG. De hier beschreven dissectieprotocollen bieden een inleiding tot MPG-anatomie, de bijbehorende bijbehorende zenuwen en nabijgelegen macroscopische anatomische oriëntatiepunten; de laatste worden geïllustreerd door anatomische schema's. Andere benaderingen van MPG dissectie kan ook succesvol zijn, maar we vinden de hier beschreven robuust en geschikt voor een onderzoeker nieuw op dit gebied van het zenuwstelsel.

De meest kritische aspecten van het protocol zijn de juiste identificatie van elke grote zenuw en de volledige verwijdering van MPG weefsel. Met een zorgvuldige weergave en behandeling van de weefsels kunnen MPG-weefsels worden verwijderd voor anatomische, moleculaire en elektrofysiologische in vitro studies18,19,20,21,22. Het protocol kan ook worden aangepast voor in vivo experimentele manipulatie23,24,25, erop wijzend dat in dit geval, grote zorg moet worden genomen om het contact met de primaire zenuwen in verband met de ganglion of schade in de buurt vasculatuur te minimaliseren. Als het experiment selectieve denervation vereist door onderbreking van een of meer zenuwen, wordt het aanbevolen om de afgehakte zenuw te ligateren om reinnervation en verwoping van analyses te voorkomen. Dit dissectieprotocol kan ook worden gebruikt voor de muis, waarbij er ook een MPG met vergelijkbare functie26,27,28is.

Voor neuroanatomische studies wordt het beste behoud van antigenen en weefselstructuur verkregen door de MPG te ontleden van een verdoofd dier dat transcardiotisch is geperfundeerd met histologische fixatief dat geschikt is voor het experiment29; echter, identificatie van de ganglion en zenuwstructuren zijn moeilijker na dit proces, als het weefsel kleuring verloren gaat. Het wordt aanbevolen om bedreven te worden in het identificeren en ontleden van de ganglion van niet-geperfundeerde dieren voordat u deze dissectie na perfusie probeert. Evenzo wordt aanbevolen om eerst bedreven te worden in de dissectie bij mannen, omdat voor dieren van gelijke leeftijd en lichaamsgrootte, de MPG en de bijbehorende zenuwen zijn veel kleiner bij vrouwen.

Om te valideren dat het weefsel verwijderd is inderdaad de MPG, de onderzoeker wordt eerst geadviseerd om de locatie en kenmerken van elke primaire zenuw te controleren. Veel dissectoren vinden de bekkenzenuw en holle zenuw het gemakkelijkst te identificeren in situ; de hypogastrische en accessoire zenuwen zijn gevoeliger en moeilijker te onderscheiden van het omliggende weefsel. Als deze zenuwen niet meer beschikbaar zijn vanwege problemen tijdens de dissectie, of als er onzekerheid is over hun structuur, wordt aanbevolen dat de eerste MPG dissecties worden gekenmerkt met conventionele histologie (om de aanwezigheid van neuronale cellichamen te bevestigen8) en ten tweede met immunohistochemie (om vast te stellen dat zowel cholinerge als noradrenergic neuronen aanwezig zijn30,31) ( Figuur3). Om de juiste identificatie van de belangrijkste zenuwen te valideren, worden de holle zenuwen gemakkelijk geïdentificeerd door hun hoge dichtheid van neuronale cellichamen in hun eerste gedeelte dicht bij de MPG; de meeste van deze neuronen uitdrukken markers van cholinerge, nitrergic neuronen32,33. De bekken-, hypogastrische en accessoire zenuwen hebben zeer weinig neuronale cel lichamen34.

Er zijn verschillende veel voorkomende valkuilen in het uitvoeren van deze dissectie. Als beginnende dissectoren problemen hebben met het vinden van een van de belangrijkste zenuwen of de MPG, worden ze aangemoedigd om terug te keren naar de stappen die de belangrijkste oriëntatiepunten beschrijven. Het is heel gebruikelijk om zo gericht te worden op het vinden van de microstructuren dat men de macroscopische context uit het oog verliest. Meestal, beginnende dissectoren ofwel te veel rostral bewegen in hun dissectie site of blijven te 'oppervlakkig'-dat wil zeggen, te dicht bij de ventrale opening van de buik, in plaats van het onderzoeken van diepere (dat wil zeggen, meer dorsale) structuren. Een veel voorkomend probleem tijdens de dissectie is schade aan de vasculatuur tijdens dissectie. Als het bloeden begint, houd voorzichtig een katoen-getipte applicator over de bron tot het bloeden stopt, dan spoel het gebied royaal met zout voordat recommencing dissectie. Het is mogelijk dat de MPG niet bruikbaar zal zijn voor experimenten als ze besmet zijn met te veel bloed of als de dissectie te lang wordt uitgesteld in afwachting van het bloeden om te stoppen. Een andere veel voorkomende dissectie fout is schade aan de capsule van de prostaatklier die aanzienlijk afbreuk doet aan de MPG visualisatie en verwijdering. Deze capsule is een zeer delicate structuur die gemakkelijk wordt doorboord tijdens het verwijderen van het vet uit de laterale wand van de prostaat, zelfs als alleen een katoen-getipte applicator wordt gebruikt. Ten slotte worden de belangrijkste zenuwen in verband met de MPG gemakkelijk beschadigd tijdens het proces van het identificeren van elk en vervolgens tijdens het verwijderen van de MPG. Dissectoren worden aangemoedigd om een routine te ontwikkelen waarbij elke zenuw op zijn beurt, in een bepaalde volgorde, wordt geïsoleerd, zodat er minder kans op verwarring is tijdens de laatste stappen van ganglion verwijdering.

Deze dissectie heeft niet getracht om elk van de componenten van het accessoire zenuwen te traceren naar specifieke organen, of om elk van de vele microganglia die liggen op verschillende punten tussen de bekken ganglia en de bekkenorganen8te identificeren. Deze zijn vrij moeilijk te visualiseren in vivo zonder gebruik te maken van specifieke vlekken; echter, ze kunnen worden verwijderd door het volgen van elk van de zenuwbanen in de richting van de organen, en gebruik te maken van specifieke neurale vlekken post hoc om ganglion locatie te bepalen. Deze microganglia, hoewel bestaande uit slechts een klein deel van de neuronale bevolking in vergelijking met de MPG, kan specifieke soorten input te bieden aan de organen waaraan ze het meest dicht gelegen. We merken hier een beperking op het gebied dat noch deze microganglia, noch veel van de kleine zenuwwerken verlaten van de MPG om te reizen naar bekkenorganen nog in grote lijnen geaccepteerde namen. Bovendien is een soortgelijke gedetailleerde studie van microganglia nog niet uitgevoerd bij vrouwelijke ratten.

Samengevat, het protocol en schema's hier bieden onderzoekers met instrumenten om de primaire structuren die de autonome zenuwtoevoer naar de bekkenorganen, evenals de belangrijkste perifere leidingen van sensorische zenuwen van lumbosacrale dorsale wortel te bestuderen ganglia die via de MPG naar bekkenorganen reizen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het Bureau van de Directeur, National Institutes of Health, Stimuleren van perifere activiteit om te verlichten Voorwaarden (SPARC) Programma, Award Number OT2OD023872. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de Nationale Instituten voor Volksgezondheid. Dr. Bertrand's fellowship in het laboratorium van Dr. Keast werd gefinancierd door: Het Universitair Ziekenhuis van Nîmes, de faculteit geneeskunde van Montpellier-Nîmes, De Vereniging Française de Chirurgie (AFC), De Société Interdisciplinaire Franstalige d'UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) en het People Programme (Marie Curie Actions) van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (KP7/2007-2013) in het kader van REA-subsidieovereenkomst GEEN PCOFUND-GA-2013-609102, via het PRESTIGE-programma gecoördineerd door Campus Campus Frankrijk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 Merck C8198
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 Invitrogen 61-7000
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 Jackson 711-165-152
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 Millipore AB152
Dissecting microscope Olympus SZ40, SC
Dumont AA epoxy coated forceps Fine Science Tools 11210-10
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11255-20
Dumont #5/45 curved forceps Fine Science Tools 11251-35
LED light source Schott KL 1600
Micro-Adson forceps Fine Science Tools 11019-12
Student Vannas spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Surgical scissors Fine Science Tools 14054-13

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greene, E. C. Anatomy of the Rat. , American Philosophical Society. Philadelphia, PA. (1935).
  2. Krinke, G. J. The Laboratory Rat. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2000).
  3. Keast, J. R. Pelvic ganglia. Autonomic Ganglia. McLachlan, E. M. , Harwood Academic. Luxembourg. 445-480 (1995).
  4. Keast, J. R. Unusual autonomic ganglia: connections, chemistry, and plasticity of pelvic ganglia. International Review of Cytology. 193, 1-69 (1999).
  5. Alsaid, B., et al. Coexistence of adrenergic and cholinergic nerves in the inferior hypogastric plexus: anatomical and immunohistochemical study with 3D reconstruction in human male fetus. Journal of Anatomy. 214 (5), 645-654 (2009).
  6. Keast, J. R., Smith-Anttila, C. J., Osborne, P. B. Developing a functional urinary bladder: a neuronal context. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 53 (2015).
  7. Purinton, P. T., Fletcher, T. F., Bradley, W. E. Gross and light microscopic features of the pelvic plexus in the rat. Anatomical Record. 175 (4), 697-705 (1973).
  8. Arellano, J., Xelhuantzi, N., Mirto, N., Hernández, M. E., Cruz, Y. Neural interrelationships of autonomic ganglia from the pelvic region of male rats. Autonomic Neuroscience. 217, 26-34 (2019).
  9. Greenwood, D., Coggeshall, R. E., Hulsebosch, C. E. Sexual dimorphism in the numbers of neurons in the pelvic ganglia of adult rats. Brain Research. 340 (1), 160-162 (1985).
  10. Nadelhaft, I., Booth, A. M. The location and morphology of preganglionic neurons and the distribution of visceral afferents from the rat pelvic nerve: a horseradish peroxidase study. Journal of Comparative Neurology. 226 (2), 238-245 (1984).
  11. Kessler, T. M., Birder, L. A., Gomery, P. Neuromodulation of urinary tract function. New England Journal of Medicine. 380 (21), 2067-2069 (2019).
  12. Keast, J. R., Osborne, P. B. Intracardiac perfusion with fixative for anatomical studies [keast-001-stage02]. , https://www.protocols.io/view/intracardiac-perfusion-with-fixative-for-anatomica-w3ffgjn (2019).
  13. Keast, J. R., Osborne, P. B. Immunohistochemical analysis of ganglion neurons innervating the lower urinary tract [keast-001-stage03]. , https://www.protocols.io/view/immunohistochemical-analysis-of-ganglion-neurons-i-w3efgje (2019).
  14. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
  15. Keast, J. R., Booth, A., de Groat, W. C. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell and Tissue Research. 256 (1), 105-112 (1989).
  16. Dail, W. G., Minorsky, N. Composition of the pelvic nerve. Experimental Neurology. 92 (1), 278-283 (1986).
  17. Dail, W. G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microscopy Research and Technique. 35 (2), 95-106 (1996).
  18. Purves-Tyson, T. D., Arshi, M. S., Handelsman, D. J., Cheng, Y., Keast, J. R. Androgen and estrogen receptor-mediated mechanisms of testosterone action in male rat pelvic autonomic ganglia. Neuroscience. 148 (1), 92-104 (2007).
  19. Nangle, M. R., Keast, J. R. Semaphorin 3A inhibits growth of adult sympathetic and parasympathetic neurones via distinct cyclic nucleotide signalling pathways. British Journal of Pharmacology. 162 (5), 1083-1095 (2011).
  20. Tan, H., Mawe, G. M., Vizzard, M. A. Electrical properties of neurons in the intact rat major pelvic ganglion. Autonomic Neuroscience. 134 (1-2), 26-37 (2007).
  21. Park, K. S., et al. An alpha3beta4 subunit combination acts as a major functional nicotinic acetylcholine receptor in male rat pelvic ganglion neurons. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 452 (6), 775-783 (2006).
  22. Park, K. S., et al. Modulation of N-type Ca2+ currents by A1-adenosine receptor activation in male rat pelvic ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299 (2), 501-508 (2001).
  23. Payne, S. C., Belleville, P. J., Keast, J. R. Regeneration of sensory but not motor axons following visceral nerve injury. Experimental Neurology. 266, 127-142 (2015).
  24. Nangle, M. R., Proietto, J., Keast, J. R. Impaired cavernous reinnervation after penile nerve injury in rats with features of the metabolic syndrome. Journal of Sexual Medicine. 6 (11), 3032-3044 (2009).
  25. Kepper, M. E., Keast, J. R. Specific targeting of ganglion cell sprouts provides an additional mechanism for restoring peripheral motor circuits in pelvic ganglia after spinal nerve damage. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7987-7995 (1998).
  26. Yan, H., Keast, J. R. Neurturin regulates postnatal differentiation of parasympathetic pelvic ganglion neurons, initial axonal projections, and maintenance of terminal fields in male urogenital organs. Journal of Comparative Neurology. 507 (2), 1169-1183 (2008).
  27. Ritter, K. E., Wang, Z., Vezina, C. M., Bjorling, D. E., Southard-Smith, E. M. Serotonin receptor 5-HT3A affects development of bladder innervation and urinary bladder function. Frontiers in Neuroscience. 11, 690 (2017).
  28. Tompkins, J. D., Girard, B. M., Vizzard, M. A., Parsons, R. L. VIP and PACAP effects on mouse major pelvic ganglia neurons. Journal of Molecular Neuroscience. 42 (3), 390-396 (2010).
  29. Forrest, S. L., Payne, S. C., Keast, J. R., Osborne, P. B. Peripheral injury of pelvic visceral sensory nerves alters GFRα (GDNF family receptor alpha) localization in sensory and autonomic pathways of the sacral spinal cord. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 43 (2015).
  30. Keast, J. R., Luckensmeyer, G. B., Schemann, M. All pelvic neurons in male rats contain immunoreactivity for the synthetic enzymes of either noradrenaline or acetylcholine. Neuroscience Letters. 196 (3), 209-212 (1995).
  31. Keast, J. R., de Groat, W. C. Immunohistochemical characterization of pelvic neurons which project to the bladder, colon, or penis in rats. Journal of Comparative Neurology. 288 (3), 387-400 (1989).
  32. Dail, W. G., Moll, M. A., Weber, K. Localization of vasoactive intestinal polypeptide in penile erectile tissue and in the major pelvic ganglion of the rat. Neuroscience. 10 (4), 1379-1386 (1983).
  33. Keast, J. R. A possible neural source of nitric oxide in the rat penis. Neuroscience Letters. 143 (1-2), 69-73 (1992).
  34. Kepper, M. E., Keast, J. R. Transmitter profile and spinal inputs of pelvic ganglion cells projecting with preganglionic axons along the hypogastric and pelvic nerves of the male rat. Neuroscience Letters. 280 (2), 123-126 (2000).

Tags

Neurowetenschappen Kwestie 157 autonome ganglia holle zenuw hypogastgastgastlijk belangrijk bekken ganglion paracervicale ganglion parasympathisch bekken ganglion bekkenzenuw bekken splanchnic zenuw sympathiek
Dissectie van Bekken Autonome Ganglia en bijbehorende zenuwen in mannelijke en vrouwelijke ratten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertrand, M. M., Keast, J. R.More

Bertrand, M. M., Keast, J. R. Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats. J. Vis. Exp. (157), e60904, doi:10.3791/60904 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter