Neuroscience

חיתוך של האגן האוטונומי האגליה והעצבים המשויכים בחולדות זכר ונקבה

Published: March 7, 2020 doi: 10.3791/60904

¹Department of Anatomy and Neuroscience, University of Melbourne, ²Department of Visceral Surgery, CHU de Nîmes

Summary

הגנגליה הגדולה מכילה נוירונים. מעוררי חמלה וסימפטיים שinnervate איברי אגן כאן אנו מתארים שיטת הניתוח ולספק תרשימים לזיהוי גנגליה אלה ואת העצבים המשויכים שלהם. שיטות אלה ניתן להחיל על מניפולציה ניסויית של גרעינים אלה ב vivo או להסרת לאחר המוות למחקר נוסף.

Abstract

גרעינים האגן הדו הראשי (MPG; מילה נרדפת, גנגליה האגן) הם המקור העיקרי של הנוירונים מעוררי חמלה הסימפתטית והinnervating של האגן של מכרסמים; המבנה המקביל מבחינה פונקציונלית אצל בני אדם הוא מקלעת הקיבה הנחותה. הגאנגליה הגדולה מספקת גם את התוואי שבו מגיעות האקסונים הרכים והסאקרלי לאברי האגן. אלה מורכבים, גרעינים מעורב יכול להוכיח מאתגרת כדי לזהות ולנתח למחקר ניסיוני נוסף של מנגנונים אוטונומית נורמלי או להקים דגמים פרה-קליניים של מחלות, פציעה או כאב בקרביים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לגשת ולדמיין את הגאנגליה האלה ואת משטח העצבים הקשורים שלהם. אנו מספקים את הפרוטוקול הזה עם תרשימים עבור חולדות זכר ונקבה, כמו בגודל גנגליון וציוני דרך לזיהוי שונים בין המינים. הפרוטוקול מתאר את הסרת גנגליון למחקרים מחוץ למערכת, אך ניתן לשלב שיטה זו בפרוטוקול התאוששות כירורגית לצורך התערבויות נסיוניות (למשל, התאהבות עצבים, הסרת עצבים) או למיפוי מעגלים עצביים (למשל, באמצעות מיקרו-הזרקה של מנותבים עצביים). אנו גם להדגים את המבנים העיקריים של גנגליון ואת העצבים המשויכים שלה מיד לאחר הניתוח ובעקבות כתמים אימונוהיסטוכימיה.

Introduction

העכברוש הוא אחד המינים הטובים ביותר בשימוש בחקר הפיזיולוגיה והאנטומיה של איברי האגן. בעוד משאבים מצוינים קיימים עבור תיאורים של איברים אלה¹^,², הם בדרך כלל אינם מספקים מידע על מבנים עצביים הקשורים או לעשות זאת ברזולוציה מספיק כדי להנחות מחקר ניסיוני. כפי שמפורט להלן, הארגון של הגנגוליה האוטונומית המווסת את תפקוד אברי האגן הוא שונה לחלוטין לשאר מערכת העצבים האוטונומית, מה שמקשה להסיק במדויק את תכונות האגן מתוך מידע נוירואנטומי הזמין עבור גנגליה אוטונומית אחרים. מחסור זה במשאבים להנחות את החוקרים הנכנסים לאזור זה אולי האטה מחקר על הרגולציה העצבית של איברי האגן. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לגישה לאזור זה של מערכת העצבים להמשך מחקרי מבחנה או התערבות ניסויית.

גנגוליה האגן הדו (MPG; מילים נרדפות): גנגוליה של האגן; גנגליון של פרנקהאטאם [נקבה]) הם המקור העיקרי של הנוירונים והinnervating הפטוניים הסימפתטית והפאראסימפתטית של מכרסמים; ההיפוקיבה הנחותה מקלעת כוללת את המבנה העצבי המקבילה בבני אדם³^,⁴^,⁵^,⁶. התחזיות החישה משורש המותניים והסאקרליה גם לנסוע דרך ה-MPG כדי להגיע לאיברי האגן. לכן, הבנת המעגלים העצביים והביולוגיה של ה-MPG הוא קריטי למחקרים פרה-קליניים על מספר רב של מצבים קליניים הנוגעים לתפקוד הפיתוח והמבוגר של איברי האגן. כמה תיאורים מצוינים של מכרסם MPG פורסמו⁷^,⁸, אבל הניסיון שלנו הוא באופן כללי תיאורים אלה לא תמיד לספק הדרכה מספקת ליידע למעשה ניתוח ניסיוני או מניפולציה של מבנים אלה כאשר ההתאוששות של בעל החיים נדרש. יתר על כן, רוב מחקרי MPG להתמקד חולדות גברים. ב חולדות נקבה, ה-MPG הם קטנים⁹ ויש להם ציוני דרך אנטומיים ברורים, ולכן דורשים מדריך מותאם בבירור הדמיה וניתוח.

מסלולים מעוררי חמלה וסימפתטית נבדלים על ידי האנטומיה שלהם, במיוחד את המיקום של הנוירונים preganglionic שלהם, עם מסלולים אוהדים לאחר נוירונים preganglionic בחוט השדרה המותני-המותניים ואת הנוירונים preganglionic הפאראסימפתטית הממוקם בגזע המוח (הקרנות עצבי הגולגולת) וחוט השדרה הסאקר ברוב האזורים האחרים של המערכת האוטונומית, היעד שלהם גנגליון נוירונים ממוקמים בנפרד בגנגליה או בפאראסימפתטית. עם זאת, ה-MPG הם יוצאי דופן בלהיות גנגוליה מעורבת ומעוררת חמלה, ולכן בקנה מידה מאקרוסקופי הם אתרים של התכנסות מתוך אקגאנלייונים מאזורי השדרה המותני והסאקרני. לפיכך כללנו את הפרוטוקולים שלנו את המיקום והתיאור של אלה העצבים הראשוניים של מרכזי הקשר כל אזור השדרה עם MPG, להקל על ניתוח ניסיוני או מניפולציה נפרדת של רכיבים עצביים אלה. כמו כן, אנו מודעים לקוראים במיוחד השוואת גרעינים אלה על פני מינים, כי מכרסמים הנוירונים טרום שדרה preganglionic כי הם ' מבחינה פונקציונלית ', למשל, פעילים ונדרש במהלך micturition, היווצרות הפין ואת האבר, ממוקמים ברמות השדרה L6-S1 ולא באופן בלעדי במקטעים סאקרא¹⁰ כמו כן L6 ו-S1 השורש הראשי מספקים את הקלט החושי העיקרי לאיברי האגן. ב מכרסמים, חושי וקלט preganglionic מ rostral יותר מעגלים עצביים מרוכז ברמות השדרה L1 ו-L2¹⁰.

כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לגשת ל-MPG ואת העצבים הקשורים שלהם בחולדות זכר ונקבה, ולתמוך זה עם תרשימים כדי להמחיש ציוני דרך ספציפיים. פרוטוקול זה מדריך גישה כירורגית למבנים אלה בהקשר ניסיוני של הסרת הרקמה עבור לימודי מבחנה, למשל, בידוד נוירונים MPG לאפיון מולקולרי או התרבות הראשית. זה יכול גם להיות מותאם להסרת MPG לאחר perארדיac הפרג עם fixative, למרות שזה קרע קשה יותר כי רקמת העצבים הופכת קשה יותר להמחיש כאשר הרקמות הסמוכות אינן חסרות דם. פרוטוקול זה יכול גם להיות משולב לתוך הגדרה כירורגית עבור התערבות ניסיונית של אלה מסלולים עצביים (למשל, כריתת עצבים, מיקרוהזרקה של מכשירי העצבים העצביים). סוגי הניתוח הללו חשובים יותר ויותר לתחום הצומח של הרפואה הביואלקטרונית, היכן שיעדים חדשים וגישות לטיפול בתנאים קליניים של מעיים האגן מפותחים¹¹. אנחנו מציגים את הפרוטוקול המלא קודם לעכברושים זכרים, ואז שכפול של הפרוטוקול המותאם במיוחד לעכברושים נשיים.

Protocol

יש לנהל את כל ההליכים על פי דרישות הגוף המוסדי והמימון לניסויים בבעלי חיים. השימוש בבעלי חיים לניתוח זה ופרוטוקול המתת החסד אושר על ידי ועדת האתיקה בבעלי חיים באוניברסיטת מלבורן (פרוטוקול מספר 1814639).

הערה: הניתוח מומחש כאן בוצעו על מבוגרים (~ 10 שבועות) זכר ונקבה מג-דאולי עכברושים (מתקן בעלי חיים ברפואה בע, אוניברסיטת מלבורן), במשקל 280 g (נקבה) ו 350 g (זכר). לפני הניתוח הללו, הורדמים העכברושים בחדר של CO₂ עבור 4-5 דקות. מיד לאחר המוות, MPG היו גזור. אם מבתר את הרקמה מבעל חיים שעבר הפריה באופן קבוע עם הקיבעון, נקוט באמצעי זהירות כדי להגן על המפעיל מפני חשיפה לתיקונים, כלומר, לבצע ניתוח בתוך הארון או להוריד את הארון וללבוש ציוד הגנה אישי מתאים. פרוטוקול עבור הפרזיה הטרזילחיוג פורסם בפירוט¹².

1. גנגליון האגן הראשי והעצבים הסמוכים: גישה וכריתה של חולדה גברית

הערה: איור 1 מראה ציוני דרך אנטומיים עבור הדמיית MPG ב עכברוש גברי.

גישה לחלל הבטן ולאגן הירכיים
1. מניחים את העכברוש בתנוחה פרקדן ולגשת הבטן והאגן דרך חתך באמצע קו ביניים, מטפל כדי למנוע זיהום של השדה כירורגי עם פרווה.
2. בעדינות להעביר את איברי הבטן לצד אחד באמצעות מלקחיים או כותנה המוליך מכשיר. שים לב את המיקום של האונות הגייתי של בלוטת הערמונית ואת שלפוחית השתן.
3. להזיז את שלפוחית הזרע לצד השני הצלעות.
4. חותכים את הזרע כדי לספק גישה טובה יותר לאזור מעל גנגליון.
  הערה: מנקודה זו של הקרע, הרקמה חייבת לא להתייבש; לשמור על הרקמה לחות עם תמיסת מלח פיסיולוגית (עבור ניתוח רקמות טרי) או קבע (עבור בעלי חיים קבוע לפרזיה). שמירה על רקמות לח עם מלוחים לא רק הטבות מבנה רקמות אלא גם הופך את הקרע קל כמו העצבים היבשים הם שבירים יותר ודמעה בקלות רבה יותר במהלך הטיפול.
5. לזהות את האונה החצי צלעות של בלוטת הערמונית, על משטח העורף שבו הוא המיקום של גנגליון; פעולה זו עדיין לא תהיה גלויה.
6. כדי להמחיש את גנגליון, בזהירות ברור את הרקמות ליד גנגליון. אם יש צורך, השתמשו במדחק. כדי לשמור על שדה החיתוך נקי
7. להסיר צבירה הסמוכה של רקמת האדיפוז ולפתוח את הfascia לרוחב של האגן.
חיתוך של ה-MPG והעצבים המשויכים לו
1. לזהות את המיקומים הבאים המספקים ציוני דרך עבור השלבים הבאים של הניתוח: האונה החצי הצלעות של בלוטת הערמונית (גנגליון ממוקם על המשטח של האונה הזאת, קצת יותר caudal מאשר הצומת בין שלפוחית הזרע ו ערמונית) ושלפוחית הזרע (שם הם מתכנסים בקו האמצע מציין את מיקום גנגליון על ציר rostrocaudal של החיה).
2. כפי שנדרש מנקודה זו, להסיר בזהירות את כל הרקמה הפוגעת להשלים את המבנים העצביים, הימנעות נזק הקפסולה הדק של בלוטת הערמונית או כלי גדול.
3. זיהוי עצבי האגן על-ידי המחשה של ציוני הדרך והתכונות הבאים.
  1. מצא את הווריד כסל הפנימי ואת הענף המשובח שלה מקרין לכיוון ה-MPG ואת שלפוחית השתן. ענף כלי הדם הזה פועל במקביל ומוטבע לעיתים בתוך עצב האגן, ולאחר מכן מפעיל את הגנגליון.
  2. בעדינות מקום עדין משופעת מלקחיים זוויתי מתחת לעצב האגן והחלק את המרדקים לאורך כדי לשחרר אותו מתוך הרקמה הסובבת.
    הערה: ייתכן גם שניתן יהיה לבודד את עצב האגן מכלי הקיבול הקטן הפועל במקביל אליו, אך ברוב סוגי הניסויים אין זה חיוני. ודא כי המבנה הוא העצב האגן על ידי הצגת תחת הגדלה גבוהה כדי לקבוע כי העצב מכיל מספר באופן רופף מצטברים, אשר מכובד בקלות תחת מיקרוסקופ מבתר והם אופייניים האגן עצב, כמו אף אחד העצבים הגדולים האחרים הקשורים גנגליון להראות זה ברור לערער.
4. זהה את העצב החלול על-ידי המחשה של ציוני הדרך והתכונות הבאים.
  1. לאחר לאחר העצב האגן לצומת שלה עם גנגליון, עקוב אחר העצב החלול כפי שהוא נוסע על פני הערמונית ולאחר מכן לעבור לעבר הגופים החלול של הפין.
  2. אם הגדלת מיקרוסקופ היתרי, שים לב כי יש קבוצה קטנה של עצבים עדינים המתעוררים הגנגליון בין האגן והעצבים החלול; אלה הם עצבי פי הטבעת כי לנסוע המעי התחתון.
5. לזהות את העצב ההיפוקיבה על ידי המחשה של ציוני הדרך הבאים ותכונות.
  1. לזהות איפה העצב ההיפוקיבה מצטרף גנגליון בקצה הגולגולת שלה, לאחר הנסיעה לצד ureter.
  2. ודא כי העצב ההיפוקיבה הוא דק הרבה יותר מאשר האגן או העצבים החלול ולא מלווה בכלים גדולים.
6. זהה את ה-MPG על-ידי המחשה של התכונות הבאות.
  1. דמיינו את הקצוות הגהים, החדים והגולגולתית של הגנגליון, ויוצרים צורה משולשת.
  2. לאשר את המיקום של כל העצב העיקרי: עצבי האגן המתעוררים הקצה השמאלי של גנגליון, את העצב החלול בפינה caudal ביותר של גנגליון, את העצב ההיפוקיבה מהקצה הגולגולת שלה, ואת עצבי האביזרים המתעוררים של גנגליון של . קצה הגחוני
7. זהה את עצבי העזר על-ידי המחשה של ציוני הדרך והתכונות הבאים.
  1. לאחר ניקוי רקמות כדי לאפשר ויזואליזציה של הקצה הגחוני של גנגליון, לזהות אשכול של עצבים כי הפרויקט לכיוון השתן והרבייה.
  2. אם הגדלת מיקרוסקופ היתרי, לזהות קבוצת caudal אחת של העצבים הנכנסים בין האונות הערמונית וקבוצה אחת rostral בין שלפוחית הזרע ושלפוחית השתן.
הסרת ה-MPG עם העצבים המשויכים לו
1. בעדינות מלקחיים השקופית בין גנגליון לבין בלוטת הערמונית הבסיסית, להיות זהירים לא ניקוב את הקפסולה הדק של הערמונית. לשבש את כל הקשרים בין גנגליון לערמונית.
2. נקה את כל הקשרים הסופיים עם הרקמות הסובבות לאורך העצבים הדרושים לניסוי, ואז חותכים כל עצב.
3. באמצעות מלקחיים עדינים, להעביר את גנגליון עם עצביו לפתרון המתאים לניסוי ולוודא כי כל העצבים העיקריים הם שלמים.

2. גנגליון האגן הראשי והעצבים הסמוכים: גישה וכריתה של חולדה נשית

הערה: איור 2 מראה ציוני דרך אנטומיים עבור הדמיית MPG ב עכברוש נקבה.

גישה לחלל הבטן ולאגן הירכיים
1. מניחים את העכברוש בתנוחה פרקדן ולגשת הבטן והאגן דרך חתך באמצע קו ביניים, מטפל כדי למנוע זיהום של השדה כירורגי עם פרווה.
  הערה: מנקודה זו של הקרע, הרקמה חייבת לא להתייבש; לשמור על הרקמה לחות עם תמיסת מלח פיסיולוגית (עבור ניתוח רקמות טרי) או קבע (עבור בעלי חיים קבוע לפרזיה).
2. בעדינות להעביר את איברי הבטן לצד אחד באמצעות מלקחיים או כותנה המוליך מכשיר. שימו לב למיקום של קרן הרחם, שלפוחית השתן והרקטום.
3. חותכים את כלי השחלות והרחם ומשכי את קרן הרחם.
4. היכנסו לחלל הצפק והתרחקו בעדינות מצבור של רקמת השומן הממוקמת ליד צוואר הרחם של הרחם.
חיתוך של ה-MPG והעצבים המשויכים לו
1. לזהות את הקיר לרוחב של צוואר הרחם הרחם, רק caudal לצומת שלה עם קרניים הרחם; אזור זה הוא נקודת הציון העיקרית להגדרת מיקום ה-MPG על ציר rostrocaudal של בעל החיים.
2. כפי שנדרש מנקודה זו, להסיר בזהירות את כל הרקמה הפוגעת להשלים את המבנים העצביים, הימנעות נזק כלי מרכזי.
3. זיהוי עצבי האגן על-ידי המחשה של ציוני הדרך והתכונות הבאים.
  1. מצא את הווריד כסל הפנימי ואת הענף המשובח שלה מקרין לכיוון ה-MPG ואת שלפוחית השתן. ענף זה פועל במקביל ומוטבע לעיתים בתוך עצב האגן, ולאחר מכן מפעיל את הגנגליון.
  2. ודא כי המבנה הוא העצב האגן על ידי הצגת תחת הגדלה גבוהה כדי לקבוע כי העצב מכיל מספר באופן רופף מצטברים, אשר מכובד בקלות תחת מיקרוסקופ מבתר והם אופייניים האגן עצב, כמו אף אחד העצבים הגדולים האחרים הקשורים גנגליון להראות זה ברור לערער.
4. לזהות את העצב ההיפוקיבה על ידי המחשה של ציוני הדרך הבאים ותכונות.
  1. לזהות איפה העצב ההיפוקיבה מצטרף גנגליון בקצה הגולגולת שלה, לאחר הנסיעה לצד ureter.
  2. ודא כי העצב ההיפוקיבה הוא דק הרבה יותר מאשר האגן או העצבים החלול ולא מלווה בכלים גדולים.
5. זהה את העצב החלול על-ידי המחשה של ציוני הדרך והתכונות הבאים.
  1. לאחר לאחר העצב האגן לצומת שלה עם גנגליון, עקוב אחר העצב החלול כפי שהוא נוסע לאורך הקיר לרוחב של צוואר הרחם לכיוון הנרתיק.
  2. אם הגדלת מיקרוסקופ היתרי, שים לב כי יש קבוצה קטנה של עצבים עדינים המתעוררים הגנגליון בין האגן והעצבים החלול; אלה הם עצבי פי הטבעת כי לנסוע המעי התחתון.
6. זהה את עצבי העזר על-ידי המחשה של ציוני הדרך והתכונות הבאים.
  הערה: עצבי האביזר קשה לראות אבל הפרויקט מתוך ההיבט המדיאלי של ה-MPG. לאחר ניקוי רקמות כדי לאפשר ויזואליזציה של הקצה הגחוני של גנגליון, לזהות אשכול של עצבים עדינים מאוד כי הפרויקט לכיוון השתן והרבייה.
7. זהה את ה-MPG על-ידי המחשה של התכונות הבאות.
  1. דמיינו את הקצוות הגהים, החדים והגולגולתית של גנגליון, היוצרים צורה משולשת.
  2. לאשר את המיקום של כל העצב העיקרי: עצבי האגן המתעוררים הקצה השמאלי של גנגליון, את העצב החלול בפינה caudal ביותר של גנגליון, את העצב ההיפוקיבה מהקצה הגולגולת שלה, ואת עצבי האביזרים המתעוררים של גנגליון של . קצה הגחוני
הסרת ה-MPG עם העצבים המשויכים לו
1. בעדינות מקום עדין משופעת מלקחיים זוויתי מתחת לעצב האגן והחלק את המרדקים לאורך כדי לשחרר אותו מצוואר הרחם הרחם והרקמה שמסביב.
  הערה: ייתכן גם שניתן יהיה לבודד את עצב האגן מכלי הקיבול הקטן הפועל במקביל אליו, אך ברוב סוגי הניסויים אין זה חיוני. אם להפגין את הקרע, לשים תפר מתחת לעצב האגן, כדי להקל על ההדמיה.
2. חזור על התהליך של העצב החלול, ואז את העצב ההיפוקיבה, ולבסוף האביזר עצבים.
3. מלקחיים מחליק בעדינות בין גנגליון. וצוואר הרחם המשמש כבסיס לשבש את כל הקשרים בין גנגליון לצוואר הרחם.
4. נקה את כל הקשרים הסופיים עם הרקמות הסובבות לאורך העצבים הדרושים לניסוי, ואז חותכים כל עצב.
5. באמצעות מלקחיים עדינים, להעביר את גנגליון עם עצביו לפתרון המתאים לניסוי ולוודא כי כל העצבים העיקריים הם שלמים.

3. אישור מרכיבי גנגליון (אופציה)

לאחר ההסרה של גנגליון, לטבול גנגליון ב קבע היסטולוגית קונבנציונאלי (למשל, 4% באגירה) עבור מינימום של 1 h, לשטוף את מתקן עם 0.1 M פוספט מאגר ורקמת תהליך עבור קריוסיטים ו-החיסונית הפלואורסצנטית, כפי שתוארה בעבר¹³.
הערה: נוגדנים באיכות גבוהה רבים המכירים במפורש את שלושת הסמנים העצביים הינם זמינים מסחרית. ראה טבלת חומרים עבור ריאגנטים המשמשים את התיוג המוצג באיור 3.
לחילופין, תהליך גרעינים שלמים (הרבה טעינות) עבור אימונוהיסטוכימיה באמצעות שיטה דומה לעיל, אבל הגדלת זמני הדגירה עבור הנוגדנים 4 ימים (נוגדן ראשי) ו 2 ימים (נוגדן משני).
כדי להדגים אוכלוסיה מרכזית של אקטונים סנסוריים, השתמש בנוגדנים נגד הפפטיד (CGRP).
הערה: הדילול המומלץ של הנוגדן המשמש במחקר זה הוא 1:5000.
כדי להדגים את הנוירונים הסימפטיים הסימפתטית, השתמש בנוגדנים נגד טירולי הידרוקסילז (TH).
הערה: הדילול המומלץ של הנוגדן המשמש במחקר זה הוא 1:5000.
כדי להדגים את האוכלוסייה הגדולה של נוירונים cholinergic, השימוש נוגדנים נגד החנקן החנקני סטנדרטים (NOS).
הערה: הדילול המומלץ של הנוגדן המשמש במחקר זה הוא 1:500.

Representative Results

ניתוח מוצלח לא רק להסיר את הגוף המלא של ה-MPG שלם, אלא גם לשמור על הקטע הראשון של כל אחד העצבים העיקריים עדיין מחוברים. עצבים אלה הם אינדיקטורים יקרי ערך של כיוון גנגליון ב vivo ולכן לספק מידע חיוני עבור סוגים רבים של מחקרים אנטומיים (למשל, מיפוי דפוסי ביטוי או שינויים סלולריים לאחר הפרטורציה ניסיונית). למרות שמירה על העצבים המשויכים יכולה להיות פחות חשיבות עבור חלק מסוגי הניסוי (למשל, גנגליון דיסוציאציה לתרבות של נוירונים מבודדים), נוכחות של עצבים גם מספק דרך טיפול גנגליון בלי לגעת (ופוטנציאל פגיעה) בגוף התאים העצבי.

לניתוח לא מוצלח יהיה גנגליון לא שלם או ניזוק, או היכן שהעצבים הראשוניים כבר אינם מחוברים. ייתכן גם כי גרעינים או העצבים נפגעו ביודעין במהלך הניתוח, או בגלל הנזק הפיזי הוא עדין מדי כדי לזהות תחת מיקרוסקופ מבתר או כי הנזק רק הופך להיות גלוי במהלך סוגים מסוימים של assays. לדוגמה, אם רקמת גנגליון הופך יבש במהלך הניתוח, הרקמה עשויה להיראות נורמלית במהלך הטיפול במועד מאוחר יותר, אבל יציג רמות גבוהות של זריחה לא ספציפית על פני השטח.

דוגמאות של גזור MPG מוצגים באיור 3, אשר מספק דוגמאות של ה-mpg כולו כגון גנגליון להשלים את העובי (איור 3a) ו-MPG כי יש כבר קריוסינות עבור ביצוע immunofluorescence הפגנת הנוירונים הcholinergic (איור 3B, ג).

איור 1: ציוני דרך אנטומיים עבור הדמיית MPG ב עכברוש זכר. 1, שלפוחית הזרע; 2, שלפוחית השתן; 3, קרוש בלוטת; 4 & 5, עצבי אביזרים; 6, הערמונית (האונה הגחוני); 7, עצב החלול; 8, שבות; 9, השופכה; 10, שריר bulbocavernosus; 11, שריר ischiocavernosus; 12, עצבים רקטלית; 13, חוטף מתחת לפני העניים; 14, גנגליון האגן הגדול; 15, עצב האגן; 16, חוטף מרוב בתוכנו; 17, עצב ההיפוקיבה; 18, הווריד הפנימי של כסל; 19, כופף בקצר; 20, כופף שמיים הארוך; 21, שופטר; 22, psoas מז; 23, אבי העורקים הבטני; . בסדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ציוני דרך אנטומיים עבור הדמיה של MPG בעכברוש נקבה. 1, המעי הגס; 2, שלפוחית השתן; 3, גוף הרחם; 4, עצב ההיפוקיבה; 5, עצבי עזר; 6, גנגליון האגן הגדול; 7, עצב החלול; 8, נרתיק; 9, השופכה; 10, רקטום; 11, חוטף מתחת לפני העניים; 12, עצבים רקטלית; 13, כופף בקצר; 14, עצב האגן; 15, הווריד הפנימי של כסל; 16, חוטף מרוב בתוכנו; 17, כופף שדיים הארוך; 18, עורק כסל חיצוני; 19, שופטר; 20, psoas מז; 21, קרן הרחם; 22. אבי העורקים הבטני אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אימונוהיסטוכימית מתויג MPG מחולדות גברים בוגרים. כל ההכנות היו דמיינו עם מיקרוסקופ הרגיל שדות פלואורסצנטית מצויד מצלמה חד-צבעית, ואז לצבוע דיגיטלית. (A) מלא הר (עובי מוחלט), MPG קבוע עם עצבים משויכים, אימונוהיסטוכימית מתויג לעצבי החושים כי לבטא קלציטונין הקשורות לגנים (CGRP); 1, עצב האגן (מראה את הפססיקלס המרובות); 2, עצב החלול; 3, עצב ההיפוקיבה; 4, עצבי עזר; 5, עצבים רקטלית; 6, גנגליון האגן הגדול (MPG). (ב, ג) קריוסעיפים (14 μm) של MPG קבוע, מתויג אימונוהיסטוכימית כדי להדגים את הטבע cholinergic מעורב של גנגליון; (ב) נוירונים עצביים הפגינו על ידי נוגדן טירולי הידרוקסילאז ו (ג) האוכלוסייה הגדולה של cholinergic נוירונים על ידי נוגדן עבור החנקן העצבי הנוירוטיאז. סרגל הכיולמייצג (A) 1,000 μm, (ב, ג) 200 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

השליטה העצבית של איברי האגן מתווכת על ידי מסלולים מורכבים, כולל מרכיבי החושים הסומאטיים, הפאראסימפתטית, הסימפתטית והקרביים¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷. רוב מסלולים אלה מקורם או לעבור דרך ה-MPG. פרוטוקולי הניתוח המפורטים כאן מספקים מבוא לאנטומיה של MPG, העצבים המשויכים הקשורים וציוני דרך מאקרוסקופי הסמוך; האחרונים מומחשים על ידי שרטוט אנטומי. גישות אחרות לניתוח MPG יכול להיות גם מוצלח, אבל אנחנו מוצאים את זה שמתואר כאן להיות חסון ומתאים לחוקר חדש באזור זה של מערכת העצבים.

ההיבטים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם זיהוי נכון של כל העצב העיקרי ואת ההסרה המלאה של רקמת MPG. עם הצגה וטיפול זהירים של הרקמות, הרקמות MPG ניתן להסיר עבור אנטומי, מולקולרי אלקטרופיזיולוגיה לימודי מבחנה בשנת¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²². הפרוטוקול יכול גם להיות מותאם עבור מניפולציה ניסיוני vivo²³^,²⁴^,²⁵, לציין כי במקרה זה, טיפול גדול יש לנקוט כדי למזער את הקשר עם העצבים העיקריים הקשורים גנגליון או לנזק הסמוך vascuלטורה. אם הניסוי דורש שימור סלקטיבי על ידי הפרעה של מעצבי אחד או יותר, מומלץ לשער את העצב הקטוע כדי למנוע שימור והקמת ניתוחים. פרוטוקול זה יכול להיות גם מנוצל עבור העכבר, שם יש גם MPG עם פונקציה דומה²⁶^,²⁷^,²⁸.

עבור מחקרים נוירואנטומיים, השימור הטוב ביותר של אנטיגנים ומבנה רקמות מתקבל על ידי מנתח את ה-MPG מבעל חיים מורדם כי כבר מבשם transcardially עם קבע היסטולוגית מתאים לניסוי²⁹; עם זאת, זיהוי של גנגליון ומבני העצב קשים יותר לאחר תהליך זה, כמו צבע הרקמה הוא איבד. מומלץ להיות בקי בזיהוי ולבתר את הגנגליון מבעלי חיים שאינם מבושם לפני שמנסים לבצע ניתוח זה לאחר הפרזיה. כמו כן, מומלץ תחילה להיות מיומן בניתוח אצל זכרים בגלל בעלי חיים של גיל שווה ערך וגודל הגוף, את ה-MPG ואת העצבים המשויכים שלה הם הרבה יותר קטן אצל נקבות.

כדי לאמת כי הרקמה הוסרו היא אכן MPG, החוקר מומלץ לבדוק את המיקום ואת התכונות של כל עצב ראשוני. מתנגדים רבים מוצאים את עצב האגן ואת העצב החלול הקלים ביותר לזיהוי באתרו; ההיפוקיבה ועצבי העזר עדינים יותר וקשה יותר להבדיל מן הרקמה המקיפה. אם העצבים האלה כבר לא זמינים בגלל בעיות במהלך הניתוח, או אם יש חוסר ודאות לגבי המבנה שלהם, מומלץ לבתר MPG הראשונית מאופיינים עם היסטולוגיה קונבנציונאלי (כדי לאשר את הנוכחות של גופות התאים העצביים⁸) ושנית עםאימונוהיסטוכימיה(כדילזהות את הנוירונים הן cholinergic ו נוראדראררגיות כדי לאמת זיהוי נכון של העצבים העיקריים, העצבים החלול מזוהים בקלות על ידי הצפיפות הגבוהה שלהם של גופי תאים עצביים בחלק ההתחלתי שלהם קרוב ל-MPG; רוב הנוירונים האלה מבטא סמנים של cholinergic, הנוירונים הנירניירגיות³²^,³³. האגן, ההיפוקיבה ועצבי האביזרים יש מעט מאוד גופות תאים עצביים³⁴.

קיימות מספר מלכודות נפוצות בביצוע הניתוח. אם העריקים הטירונים נתקלים בבעיות במציאת העצבים העיקריים או ה-MPG, הם מעודדים לחזור לשלבים המתארים את ציוני הדרך המרכזיים. זה נפוץ מאוד להיות כל כך מרוכז במציאת המיקרו מבנים כי אחד מאבד את המסלול של ההקשר מאקרוסקופי. בדרך כלל, מבתר מתחילים או לנוע רחוק מדי rostral באתר הניתוח שלהם או להישאר ' מעשה ידי ' הסופר-i. e., קרוב מדי לפתיחת הבטן, במקום לבחון עמוק יותר (כלומר, יותר בראש) מבנים. בעיה נפוצה במהלך הניתוח היא פגיעה בכלי החיתוך במהלך הניתוח. אם מתחיל דימום, בעדינות להחזיק המוליך משופעת כותנה על המקור עד עצירות דימום, ולאחר מכן ריקון האזור ליברלי עם תמיסת מלח לפני ניתוח ממליץ. זה אפשרי MPG לא יהיה שמיש עבור ניסויים אם מזוהם עם יותר מדי דם או אם הניתוח מתעכב זמן רב מדי בהמתנה לדימום להפסיק. עוד שגיאה בניתוח נפוץ הוא נזק הקפסולה של בלוטת הערמונית אשר פוגע באופן משמעותי הדמיית MPG והסרה. כמוסה זו היא מבנה עדין מאוד כי הוא מנוקב בקלות תוך הסרת השומן מן הקיר לרוחב של הערמונית, גם אם שימוש רק כותנה משופעת המוליך. בסופו של דבר, העצבים העיקריים הקשורים ל-MPG פגומים בקלות במהלך התהליך של זיהוי כל אחד ולאחר מכן במהלך ההסרה של MPG. מתנגדים מעודדים לפתח שגרה לפיה כל עצב מבודד בתורו, בסדר מסוים, כך שיש פחות הזדמנות לבלבול במהלך השלבים האחרונים של הסרת גנגליון.

ניתוח זה לא חיפש לעקוב אחר כל אחד ממרכיבי האביזרים לאברים ספציפיים, או לזהות כל אחד מהמיקרוגנגליה הרבים הטמונים בנקודות שונות בין הגנגליה לבין איברי האגן⁸. אלה די קשה לדמיין בvivo מבלי להשתמש בכתמים ספציפיים; עם זאת, הם יכולים להיות מוסרים על ידי ביצוע כל אחד העצבים לכיוון האיברים, וניצול כתמי עצבים ספציפיים לכתוב הוק כדי לקבוע מיקום גנגליון. מיקרוגנגליה אלה, אף על פי שהיא מהווה רק חלק קטן מהאוכלוסייה העצבית בהשוואה ל-MPG, עשויה לספק סוגים ספציפיים של קלט לאיברים שאליהם הם נמצאים באופן הדוק ביותר. אנו מודעים כאן מגבלה בתחום זה לא מmicroganglia אלה ולא רבים של שדות העצב הקטן היציאה MPG לנסוע איברי האגן עדיין יש שמות מקובלים. יתר על כן, מחקר מפורט דומה של microganglia עדיין לא התנהל בחולדות נקבה.

לסיכום, הפרוטוקול והשרטוטים המסופקים כאן מספקים לחוקרים כלים לחקר המבנים העיקריים המספקים את אספקת העצבים האוטונומית לאברי האגן, כמו גם תעלות היקפי גדולות של עצבי חושים משורש הקור גרעינים כי לנסוע דרך ה-MPG לאיברי האגן.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקרים שדווחו בפרסום זה תמכו על ידי המשרד של הבמאי, המכון הלאומי לבריאות, מגרה פעילות היקפית כדי להקל על תנאי (SPARC) תוכנית, הפרס מספר OT2OD023872. התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. המענק של ד ר ברטרנד במעבדה של ד ר Keast היה ממומן על ידי: בית החולים של האוניברסיטה של Nîmes, הפקולטה לרפואה של מונפלייה-Nîmes, האגודה הצרפתית של צ'ימורקג'י (באסיה), הפעילות החברתית של הארגון (SIFUD-PP) ותוכנית האנשים (מארי קירי פעולות) של תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013) תחת הסכם REA גרנט No PCOFUND-GA-2013-609102, באמצעות תוכנית יוקרה מתואמת בקמפוס צרפת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091	Merck	C8198
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937	Invitrogen	61-7000
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443	Jackson	711-165-152
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204	Millipore	AB152
Dissecting microscope	Olympus	SZ40, SC
Dumont AA epoxy coated forceps	Fine Science Tools	11210-10
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11255-20
Dumont #5/45 curved forceps	Fine Science Tools	11251-35
LED light source	Schott	KL 1600
Micro-Adson forceps	Fine Science Tools	11019-12
Student Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Surgical scissors	Fine Science Tools	14054-13

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Greene, E. C. Anatomy of the Rat. , American Philosophical Society. Philadelphia, PA. (1935).
Krinke, G. J. The Laboratory Rat. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2000).
Keast, J. R. Pelvic ganglia. Autonomic Ganglia. McLachlan, E. M. , Harwood Academic. Luxembourg. 445-480 (1995).
Keast, J. R. Unusual autonomic ganglia: connections, chemistry, and plasticity of pelvic ganglia. International Review of Cytology. 193, 1-69 (1999).
Alsaid, B., et al. Coexistence of adrenergic and cholinergic nerves in the inferior hypogastric plexus: anatomical and immunohistochemical study with 3D reconstruction in human male fetus. Journal of Anatomy. 214 (5), 645-654 (2009).
Keast, J. R., Smith-Anttila, C. J., Osborne, P. B. Developing a functional urinary bladder: a neuronal context. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 53 (2015).
Purinton, P. T., Fletcher, T. F., Bradley, W. E. Gross and light microscopic features of the pelvic plexus in the rat. Anatomical Record. 175 (4), 697-705 (1973).
Arellano, J., Xelhuantzi, N., Mirto, N., Hernández, M. E., Cruz, Y. Neural interrelationships of autonomic ganglia from the pelvic region of male rats. Autonomic Neuroscience. 217, 26-34 (2019).
Greenwood, D., Coggeshall, R. E., Hulsebosch, C. E. Sexual dimorphism in the numbers of neurons in the pelvic ganglia of adult rats. Brain Research. 340 (1), 160-162 (1985).
Nadelhaft, I., Booth, A. M. The location and morphology of preganglionic neurons and the distribution of visceral afferents from the rat pelvic nerve: a horseradish peroxidase study. Journal of Comparative Neurology. 226 (2), 238-245 (1984).
Kessler, T. M., Birder, L. A., Gomery, P. Neuromodulation of urinary tract function. New England Journal of Medicine. 380 (21), 2067-2069 (2019).
Keast, J. R., Osborne, P. B. Intracardiac perfusion with fixative for anatomical studies [keast-001-stage02]. , https://www.protocols.io/view/intracardiac-perfusion-with-fixative-for-anatomica-w3ffgjn (2019).
Keast, J. R., Osborne, P. B. Immunohistochemical analysis of ganglion neurons innervating the lower urinary tract [keast-001-stage03]. , https://www.protocols.io/view/immunohistochemical-analysis-of-ganglion-neurons-i-w3efgje (2019).
Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
Keast, J. R., Booth, A., de Groat, W. C. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell and Tissue Research. 256 (1), 105-112 (1989).
Dail, W. G., Minorsky, N. Composition of the pelvic nerve. Experimental Neurology. 92 (1), 278-283 (1986).
Dail, W. G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microscopy Research and Technique. 35 (2), 95-106 (1996).
Purves-Tyson, T. D., Arshi, M. S., Handelsman, D. J., Cheng, Y., Keast, J. R. Androgen and estrogen receptor-mediated mechanisms of testosterone action in male rat pelvic autonomic ganglia. Neuroscience. 148 (1), 92-104 (2007).
Nangle, M. R., Keast, J. R. Semaphorin 3A inhibits growth of adult sympathetic and parasympathetic neurones via distinct cyclic nucleotide signalling pathways. British Journal of Pharmacology. 162 (5), 1083-1095 (2011).
Tan, H., Mawe, G. M., Vizzard, M. A. Electrical properties of neurons in the intact rat major pelvic ganglion. Autonomic Neuroscience. 134 (1-2), 26-37 (2007).
Park, K. S., et al. An alpha3beta4 subunit combination acts as a major functional nicotinic acetylcholine receptor in male rat pelvic ganglion neurons. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 452 (6), 775-783 (2006).
Park, K. S., et al. Modulation of N-type Ca2+ currents by A1-adenosine receptor activation in male rat pelvic ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299 (2), 501-508 (2001).
Payne, S. C., Belleville, P. J., Keast, J. R. Regeneration of sensory but not motor axons following visceral nerve injury. Experimental Neurology. 266, 127-142 (2015).
Nangle, M. R., Proietto, J., Keast, J. R. Impaired cavernous reinnervation after penile nerve injury in rats with features of the metabolic syndrome. Journal of Sexual Medicine. 6 (11), 3032-3044 (2009).
Kepper, M. E., Keast, J. R. Specific targeting of ganglion cell sprouts provides an additional mechanism for restoring peripheral motor circuits in pelvic ganglia after spinal nerve damage. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7987-7995 (1998).
Yan, H., Keast, J. R. Neurturin regulates postnatal differentiation of parasympathetic pelvic ganglion neurons, initial axonal projections, and maintenance of terminal fields in male urogenital organs. Journal of Comparative Neurology. 507 (2), 1169-1183 (2008).
Ritter, K. E., Wang, Z., Vezina, C. M., Bjorling, D. E., Southard-Smith, E. M. Serotonin receptor 5-HT3A affects development of bladder innervation and urinary bladder function. Frontiers in Neuroscience. 11, 690 (2017).
Tompkins, J. D., Girard, B. M., Vizzard, M. A., Parsons, R. L. VIP and PACAP effects on mouse major pelvic ganglia neurons. Journal of Molecular Neuroscience. 42 (3), 390-396 (2010).
Forrest, S. L., Payne, S. C., Keast, J. R., Osborne, P. B. Peripheral injury of pelvic visceral sensory nerves alters GFRα (GDNF family receptor alpha) localization in sensory and autonomic pathways of the sacral spinal cord. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 43 (2015).
Keast, J. R., Luckensmeyer, G. B., Schemann, M. All pelvic neurons in male rats contain immunoreactivity for the synthetic enzymes of either noradrenaline or acetylcholine. Neuroscience Letters. 196 (3), 209-212 (1995).
Keast, J. R., de Groat, W. C. Immunohistochemical characterization of pelvic neurons which project to the bladder, colon, or penis in rats. Journal of Comparative Neurology. 288 (3), 387-400 (1989).
Dail, W. G., Moll, M. A., Weber, K. Localization of vasoactive intestinal polypeptide in penile erectile tissue and in the major pelvic ganglion of the rat. Neuroscience. 10 (4), 1379-1386 (1983).
Keast, J. R. A possible neural source of nitric oxide in the rat penis. Neuroscience Letters. 143 (1-2), 69-73 (1992).
Kepper, M. E., Keast, J. R. Transmitter profile and spinal inputs of pelvic ganglion cells projecting with preganglionic axons along the hypogastric and pelvic nerves of the male rat. Neuroscience Letters. 280 (2), 123-126 (2000).

Neuroscience

חיתוך של האגן האוטונומי האגליה והעצבים המשויכים בחולדות זכר ונקבה

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.