Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Disseksjon av bekken autonome Ganglia og tilhørende nerver i mannlige og kvinnelige rotter

Published: March 7, 2020 doi: 10.3791/60904

Summary

De store bekkengangene inneholder parasympatiske og sympatiske nevroner som innervate bekkenorganer. Her beskriver vi en disseksjonsmetode og gir skjemaer for identifisering av disse ganglia og deres tilhørende nerver. Disse metodene kan brukes til eksperimentell manipulering av disse ganglia in vivo eller fjerning post-mortem for videre studier.

Abstract

De bilaterale store bekkengangene (MPG; synonym, bekkenganglia) er den primære kilden til postganglioniske sympatiske og parasympatiske nevroner som innerver pelvic organer av gnagere; den funksjonelt tilsvarende strukturen hos mennesker er den dårligere hypogastriske plexus. De store bekkengangene gir også ruten der lumbal og sakrale sensoriske aksoner når bekkenorganene. Disse komplekse, blandede ganglia kan være utfordrende å identifisere og dissekere for videre eksperimentell studie av normale autonome mekanismer eller å etablere prekliniske modeller av sykdom, skade eller visceral smerte. Her beskriver vi en protokoll for å få tilgang til og visualisere disse ganglia og deres tilknyttede nervekanaler. Vi gir denne protokollen med skjemaer for både mannlige og hunnrotter, da ganglionstørrelse og landemerker for identifisering varierer mellom kjønnene. Protokollen beskriver fjerning av ganglion for in vitro studier, men denne metoden kan integreres i en kirurgisk gjenopprettingsprotokoll for eksperimentelle intervensjoner (f.eks nerveknuse, nervereseksjon) eller for kartlegging av nevronale kretser (f.eks. ved mikroinjeksjon av nevrale sporstoffer). Vi demonstrerer også de primære strukturene i ganglion og dens tilhørende nerver umiddelbart etter disseksjon og etter immunohistokjemisk farging.

Introduction

Rotten er en av de best karakteriserte artene som brukes i studien av bekkenorganets fysiologi og anatomi. Mens gode ressurser finnes for beskrivelser av disse organene1,2, gir de vanligvis ikke informasjon om relaterte nevrale strukturer eller gjør det ved utilstrekkelig oppløsning for å veilede en eksperimentell studie. Som beskrevet lenger under, organiseringen av de autonome ganglia som regulerer bekken organfunksjon er ganske forskjellig fra resten av det autonome nervesystemet, noe som gjør det vanskelig å nøyaktig infer bekken innervering funksjoner fra nevroanatomisk informasjon tilgjengelig for andre autonome ganglia. Denne mangelen på ressurser for å veilede forskere som kommer inn i dette området, kan ha bremset forskningen på neural regulering av bekkenorganer. Her beskriver vi protokoller for å få tilgang til denne regionen av nervesystemet for videre in vitro studier eller eksperimentell intervensjon.

De bilaterale store bekkengangene (MPG; synonymer: bekkenganglia; paracervical ganglia [kvinne]; Frankenhäuser's ganglion [kvinne]) er den primære kilden til postganglionic sympatiske og parasympatiske nevroner innervating bekken organer av gnagere; den dårligere hypogastriske plexus består av tilsvarende nevronal struktur hos mennesker3,4,5,6. Sensoriske projeksjoner fra lumbal og sakraldorsalrotganglia er også på reise via MPG for å nå bekkenorganene. Derfor er det viktig å forstå nevrale kretser og biologi av MPG for prekliniske studier på en myriade av kliniske forhold knyttet til utvikling og voksen funksjon av bekkenorganer. Flere gode beskrivelser av gnager MPG har blitt publisert7,8, men vår erfaring er at generelt disse beskrivelsene ikke alltid gir tilstrekkelig veiledning for praktisk å praktisk talt informere en eksperimentell disseksjon eller manipulering av disse strukturene når utvinning av dyret er nødvendig. Videre fokuserer de fleste MPG-studier på hannrotter. Hos hunnrotter er MPG mindre9 og har forskjellige anatomiske landemerker, og krever derfor en tydelig skreddersydd guide til visualisering og disseksjon.

Sympatiske og parasympatiske veier er preget av deres anatomi, spesielt plasseringen av deres preganglionic nevroner, med sympatiske veier som har preganglionic nevroner i thoraco-lumbar ryggmargen og parasympatiske preganglionic nevroner som ligger i hjernestammen (kranial nerve projeksjoner) og sakraal ryggmargen. I de fleste andre regioner av det autonome systemet, deres mål ganglion nevroner ligger i distinkte sympatiske eller parasympatiske ganglia. Mpg er imidlertid uvanlig i å være blandet sympatisk-parasympatiske ganglia, og derfor i en makroskopisk skala er steder av konvergens fra preganglionic aksoner av både thoraco-lumbal og sakrale spinal regioner. Vi har derfor inkludert i våre protokoller plasseringen og beskrivelsen av disse primære nervekanalene som forbinder hver spinalregion med MPG, noe som letter eksperimentell analyse eller separat manipulering av disse nevrale komponentene. Vi merker oss også for lesere som spesifikt sammenligner disse ganglia på tvers av arter, at i gnagere er spinal preganglionic nevroner som er "funksjonelt sakral", for eksempel aktive og kreves under micturition, avføring og penile ereksjon, ligger på spinalnivåer L6-S1 i stedet for utelukkende i sakrale segmenter10; Likeledes L6 og S1 dorsal rot ganglia gi de store "sakrale" sensoriske innspill til bekken organer. Hos gnagere er sensorisk e-blåog preganglionic inngang fra mer rostral nevrale kretser konsentrert i spinalnivåer L1 og L210.

Her beskriver vi en protokoll for å få tilgang til MPG og deres tilknyttede nervekanaler hos hann- og hunnrotter, og støtter dette med skjemaer for å illustrere spesifikke landemerker. Denne protokollen veileder kirurgisk tilgang til disse strukturene i en eksperimentell sammenheng med å fjerne vevet for in vitro-studier, for eksempel isolere MPG-nevroner for molekylær karakterisering eller primærkultur. Det kan også tilpasses MPG fjerning etter intracardiac perfusjon med fikseringsmiddel, selv om dette er en vanskeligere disseksjon fordi nevrale vev blir vanskeligere å visualisere når tilstøtende vev er blottet for blod. Denne protokollen kan også integreres i en kirurgisk setting for eksperimentell inngrep av disse nerveveiene (f.eks. nervereseksjon, mikroinjeksjon av nevrale sporere). Disse typer desseksjoner blir stadig viktigere for det voksende feltet av bioelektronisk medisin, hvor nye mål og tilnærminger for neuromodulasjon for å behandle kliniske tilstander i bekkenvisera utvikles11. Vi presenterer hele protokollen først for hannrotter, deretter en replikering av protokollen skreddersydd spesielt for hunnrotter.

Protocol

Alle prosedyrer skal gjennomføres i henhold til institusjonelle og finansieringsorgankrav for dyreeksperimentering. Bruken av dyr for denne disseksjonen og protokollen for eutanasi er godkjent av Animal Ethics Committee ved University of Melbourne (Protokollnummer 1814639).

MERK: Desiksjonene illustrert her ble utført på voksne (~ 10 uker) mannlige og kvinnelige Sprague-Dawley rotter (Biomedical Sciences Animal Facility, University of Melbourne), veier 280 g (kvinne) og 350 g (mann). Prior to these dissections, the rats were euthanized in a CO2 chamber for 4−5 min. Immediately following death, MPG were dissected. Hvis dissekering av vev fra et dyr som har gjennomgått transkardial perfusjon med fikseringsmiddel, ta forholdsregler for å beskytte operatøren mot eksponering for fikseringsmiddel, det vil si utføre disseksjon i røykskap eller downdraft skap og bruk egnet personlig verneutstyr. En protokoll for transkardial perfusjon er publisert i detalj12.

1. Major bekken ganglion og tilstøtende nerver: tilgang og reseksjon i en mannlig rotte

MERK: Figur 1 viser anatomiske landemerker for MPG-visualisering i en mannlig rotte.

  1. Tilgang til bukhulen og bekkenet
    1. Plasser rotten i en supine posisjon og få tilgang til magen og bekkenet gjennom et ventral midtlinjesnitt, pass på å unngå forurensning av det kirurgiske feltet med pels.
    2. Flytt forsiktig bukorganene til den ene siden ved hjelp av tang eller bomullsspisse applikatorer. Legg merke til plasseringen av ventrale fliker i prostata kjertelen og urinblæren.
    3. Flytt den banebrytende vesikkelen til kontralateral side.
    4. Klipp vas deferens for å gi bedre tilgang til området overliggende ganglion.
      MERK: Fra dette punktet av disseksjonen må vevet ikke tørke ut; hold vevet fuktig med fysiologisk saltvann (for fersk vevdisseksjon) eller fikseringsmiddel (for perfusjonsfast dyr). Holde vevet fuktig med saltvann ikke bare fordeler vevstruktur, men gjør også disseksjon lettere som tørre nerver er mer skjøre og rive lettere under håndtering.
    5. Identifiser den dorsolaterale fliken i prostata, på dorsaloverflaten som er plasseringen av ganglion; dette vil ennå ikke være synlig.
    6. For å visualisere ganglion, forsiktig fjerne vev nær og overliggende ganglion. Bruk eventuelt en retraktor for å holde disseksjonsfeltet klart.
    7. Fjern en nærliggende mengde fettvev og åpne bekkenets laterale fascia.
  2. Disseksjon av MPG og tilhørende nerver
    1. Identifiser følgende steder som gir landemerker for de neste trinnene i disseksjonen: den dorsolaterale fliken i prostatakjertelen (ganglionen ligger på overflaten av denne lobeen, litt mer caudal enn krysset mellom seminal vesicle og prostata) og de banebrytende vesikler (hvor de konvergerer på midtlinjen indikerer ganglion plassering på dyrets rostrocaudal aksen).
    2. Som nødvendig fra dette punktet, forsiktig fjerne eventuelle vev som hindrer fullstendig visning av nevrale strukturer, unngå skade på den tynne kapselen i prostata kjertelen eller store fartøy.
    3. Identifiser bekkennerven ved å visualisere følgende landemerker og funksjoner.
      1. Finn den interne iliac venen og denfine grenen projisere mot MPG og blæren. Denne vaskulære grenen går parallelt med og er noen ganger innebygd i bekkennerven, og krysser deretter ganglion.
      2. Plasser forsiktig fintippede vinklede tang under bekkennerven og skyv tangene sammen for å frigjøre den fra omkringliggende vev.
        MERK: Det kan også være mulig å isolere bekkennerven fra det lille fartøyet som kjører parallelt med det, men for de fleste typer eksperimenter er dette ikke avgjørende. Bekreft at strukturen er bekkennerven ved å se under høy forstørrelse for å fastslå at nerven inneholder flere løst aggregerte fascikler, som lett skilles under dissekeringsmikroskopet og er karakteristiske for bekkenet nerve, som ingen av de andre store nerver forbundet med ganglion viser denne klare fasciculation.
    4. Identifiser den cavernøse nerven ved å visualisere følgende landemerker og funksjoner.
      1. Etter å ha fulgt bekkennerven til krysset med ganglion, følg den cavernøse nerven når den beveger seg over prostata og deretter caudally mot penisens kavernøse kropper.
      2. Hvis mikroskopforstørrelse tillater det, vær oppmerksom på at det er en liten gruppe delikate nerver som kommer fra ganglion mellom bekkenet og cavernøse nerver; Dette er rektal nervene som reiser til nedre tarm.
    5. Identifiser hypogastrisk nerve ved å visualisere følgende landemerker og funksjoner.
      1. Identifiser hvor den hypogastriske nerven blir med ganglion på kranialkanten, etter å ha reist sammen med urineren.
      2. Bekreft at hypogastrisk nerve er mye tynnere enn enten bekken eller cavernøse nerver og ikke ledsages av store fartøy.
    6. Identifiser MPG ved å visualisere følgende funksjoner.
      1. Visualiser de ventrale, dorsal og kraniale kantene av ganglion, danner en trekantet form.
      2. Bekreft plasseringen av hver stor nerve: bekkennervene som kommer fra ganglionens dorsal kant, den kavernøse nerven i det mest caudale hjørnet av ganglion, den hypogastriske nerven fra kranialkanten, og tilbehørsnervene som kommer fra ganglionens ventralkant.
    7. Identifiser tilbehørsnervene ved å visualisere følgende landemerker og funksjoner.
      1. Etter å ha ryddet vev for å muliggjøre visualisering av ganglionens ventrale kant, identifiser en klynge av nerver som projiserer mot urin- og reproduktive kanaler.
      2. Hvis mikroskopforstørrelse tillater det, identifiser en årsaksgruppe av nerver som kommer mellom prostatalappene og en rosensirkelgruppe mellom den banebrytende vesikkelen og blæren.
  3. Fjerning av MPG med tilhørende nerver
    1. Skyv forsiktig pinsett mellom ganglion og den underliggende prostatakjertelen, vær forsiktig så du ikke punkterer den tynne kapselen i prostata. Forstyrre eventuelle forbindelser mellom ganglion og prostata.
    2. Fjern eventuelle endelige forbindelser med omkringliggende vev for lengdene av nerver som kreves for eksperimentet, og kutt deretter hver nerve.
    3. Ved hjelp av fine tang, flytt ganglion med nervene til riktig løsning for eksperimentet og bekreft at hver av de viktigste nervene er intakte.

2. Major bekken ganglion og tilstøtende nerver: tilgang og reseksjon i en kvinnelig rotte

MERK: Figur 2 viser anatomiske landemerker for MPG-visualisering hos en kvinnelig rotte.

  1. Tilgang til bukhulen og bekkenet
    1. Plasser rotten i en supine posisjon og få tilgang til magen og bekkenet gjennom et ventral midtlinjesnitt, pass på å unngå forurensning av det kirurgiske feltet med pels.
      MERK: Fra dette punktet av disseksjonen må vevet ikke tørke ut; hold vevet fuktig med fysiologisk saltvann (for fersk vevdisseksjon) eller fikseringsmiddel (for perfusjonsfast dyr).
    2. Flytt forsiktig bukorganene til den ene siden ved hjelp av tang eller bomullsspisse applikatorer. Legg merke til plasseringen av livmorhornet, urinblæren og endetarmen.
    3. Klipp eggstokkene og livmorkarene og trekk tilbake livmorhornet.
    4. Gå inn i bukrommet og fjern forsiktig bort en mengde fettvev som ligger i nærheten av livmorhalsen.
  2. Disseksjon av MPG og tilhørende nerver
    1. Identifiser den laterale veggen av livmorhalsen, bare caudal til krysset med livmorhornene; denne regionen er det primære landemerket for å definere MPG-plasseringen på dyrets rostrocaudal akse.
    2. Som nødvendig fra dette punktet, forsiktig fjerne eventuelle vev som hindrer fullstendig visning av nevrale strukturer, unngå skade på store fartøy.
    3. Identifiser bekkennerven ved å visualisere følgende landemerker og funksjoner.
      1. Finn den interne iliac venen og denfine grenen projisere mot MPG og blæren. Denne grenen går parallelt med og er noen ganger innebygd i bekkennerven, og krysser deretter ganglion.
      2. Bekreft at strukturen er bekkennerven ved å se under høy forstørrelse for å fastslå at nerven inneholder flere løst aggregerte fascikler, som lett skilles under dissekeringsmikroskopet og er karakteristiske for bekkenet nerve, som ingen av de andre store nerver forbundet med ganglion viser denne klare fasciculation.
    4. Identifiser hypogastrisk nerve ved å visualisere følgende landemerker og funksjoner.
      1. Identifiser hvor den hypogastriske nerven blir med ganglion på kranialkanten, etter å ha reist sammen med urineren.
      2. Bekreft at hypogastrisk nerve er mye tynnere enn enten bekken eller cavernøse nerver og ikke ledsages av store fartøy.
    5. Identifiser den cavernøse nerven ved å visualisere følgende landemerker og funksjoner.
      1. Etter å ha fulgt bekkennerven til krysset med ganglion, følg den cavernøse nerven når den reiser caudally langs livmorhalsens sidevegg mot skjeden.
      2. Hvis mikroskopforstørrelse tillater det, vær oppmerksom på at det er en liten gruppe delikate nerver som kommer fra ganglion mellom bekkenet og cavernøse nerver; Dette er rektal nervene som reiser til nedre tarm.
    6. Identifiser tilbehørsnervene ved å visualisere følgende landemerker og funksjoner.
      MERK: Tilbehørsnervene er vanskelige å se, men projiserer fra det mediale aspektet av MPG. Etter å ha ryddet vev for å muliggjøre visualisering av ganglionens ventrale kant, identifiser en klynge av svært delikate nerver som projiserer mot urin- og reproduktive kanaler.
    7. Identifiser MPG ved å visualisere følgende funksjoner.
      1. Visualiser ventrale, dorsal og kraniale kanter av ganglion, som danner en trekantet form.
      2. Bekreft plasseringen av hver stor nerve: bekkennervene som kommer fra ganglionens dorsal kant, den kavernøse nerven i det mest caudale hjørnet av ganglion, den hypogastriske nerven fra kranialkanten, og tilbehørsnervene som kommer fra ganglionens ventralkant.
  3. Fjerning av MPG med tilhørende nerver
    1. Plasser forsiktig fintippede vinklede tang under bekkennerven og skyv tangene sammen for å frigjøre den fra det underliggende livmorhalsen og det omkringliggende vevet.
      MERK: Det kan også være mulig å isolere bekkennerven fra det lille fartøyet som kjører parallelt med det, men for de fleste typer eksperimenter er dette ikke avgjørende. Hvis du demonstrerer disseksjonen, legg en sutur under bekkennerven, for å lette visualiseringen.
    2. Gjenta prosessen for cavernøs nerve, deretter hypogastrisk nerve, og til slutt tilbehøret nerver.
    3. Skyv forsiktig pinsett mellom ganglion og den underliggende livmorhalsen. Forstyrre eventuelle forbindelser mellom ganglion og livmorhalsen.
    4. Fjern eventuelle endelige forbindelser med omkringliggende vev for lengdene av nerver som kreves for eksperimentet, og kutt deretter hver nerve.
    5. Ved hjelp av fine tang, flytt ganglion med nervene til riktig løsning for eksperimentet og bekreft at hver av de viktigste nervene er intakte.

3. Bekreftelse av ganglion komponenter (valgfritt)

  1. Etter fjerning av ganglion, fordyp ganglion i en konvensjonell histologisk fikseringsmiddel (f.eks 4% bufret formalin) i minst 1 h, vask ut fikseringsmiddel med 0,1 M fosfatbuffer og prosessvev for kryoseksjon og fluorescens immunohistochemistry, som tidligere beskrevet13.
    MERK: Mange antistoffer av høy kvalitet som spesifikt gjenkjenner disse tre nevrale markørene, er kommersielt tilgjengelige. Se Materialliste for reagensene som brukes til merkingen som vises i figur 3.
  2. Alternativt, behandle ganglia intakt (wholemounts) for immunohistochemistry ved hjelp av en lignende metode som ovenfor, men øke inkubasjonstidene for antistoffene til 4 dager (primært antistoff) og 2 dager (sekundært antistoff).
  3. For å demonstrere en stor populasjon av sensoriske aksoner, bruk antistoffer mot kalsitoningenrelatert peptid (CGRP).
    MERK: Anbefalt fortynning av antistoffet som brukes i denne studien er 1:5,000.
  4. For å demonstrere noradrenerge sympatiske nevroner, bruk antistoffer mot tyrosinhydroksylase (TH).
    MERK: Anbefalt fortynning av antistoffet som brukes i denne studien er 1:5,000.
  5. For å demonstrere en stor populasjon av kolinerge nevroner, bruk antistoffer mot nevronal nitrogenoksid synthase (NOS).
    MERK: Anbefalt fortynning av antistoffet som brukes i denne studien er 1:500.

Representative Results

En vellykket disseksjon vil ikke bare fjerne hele kroppen av MPG intakt, men også beholde det første segmentet av hver av de store nervene fortsatt festet. Disse nervene er verdifulle indikatorer på ganglion orientering in vivo og gir derfor viktig informasjon for mange typer anatomiske studier (f.eks. kartlegging uttrykksmønstre eller cellulære endringer etter en eksperimentell perturbasjon). Selv om bevaring av de tilknyttede nervene kan være av mindre betydning for noen eksperimenttyper (f.eks. ganglion dissociation for kultur av isolerte nevroner), gir tilstedeværelsen av nerver også en måte å håndtere ganglion uten å berøre (og potensielt skadelig) de nevronale cellelegemene.

En mislykket disseksjon vil ha en ufullstendig eller skadet ganglion, eller hvor de primære nervene ikke lenger er festet. Det er også mulig at ganglia eller nerver er uvitende skadet under disseksjon, enten fordi den fysiske skaden er for subtil til å oppdage under dissekering mikroskopet eller fordi skaden bare blir tydelig under visse typer analyser. For eksempel, hvis ganglion vevet blir tørt under disseksjon, kan vevet virke normalt under senere håndtering, men vil vise høye nivåer av ikke-spesifikk fluorescens på overflaten.

Eksempler på dissekert MPG er vist i figur 3, som gir eksempler på hele MPG visualisert som en hel tykkelse komplett ganglion (Figur 3A) og en MPG som har blitt kryosectioned for å utføre immunfluorescens for å demonstrere noradrenerge og kolinerge nevroner (Figur 3B, C).

Figure 1
Figur 1: Anatomiske landemerker for MPG-visualisering i en mannlig rotte. 1, seminal vesikkel; 2, urinblære; 3, koagulerende kjertel; 4 og 5, tilbehør nerver; 6, prostata (ventral lobe); 7, cavernøs nerve; 8, vas deferens; 9, urinrør; 10, bulbocavernosus muskel; 11, ischiocavernosus muskel; 12, rektal nerver; 13, abductor caudae externus; 14, store bekken ganglion; 15, bekkennerve; 16, abductor caudae internus; 17, hypogastrisk nerve; 18, intern iliac vene; 19, flexor caudae brevis; 20, flexor caudae longus; 21, uriner; 22, psoas major; 23, abdominal aorta; 24, dårligere vena cava. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Anatomiske landemerker for MPG-visualisering i en kvinnelig rotte. 1, distale kolon; 2, urinblære; 3, livmor kropp; 4, hypogastrisk nerve; 5, tilbehør nerver; 6, store bekken ganglion; 7, cavernøs nerve; 8, vagina; 9, urinrør; 10, endetarmen; 11, abductor caudae externus; 12, rektal nerver; 13, flexor caudae brevis; 14, bekkennerve; 15, intern iliac vene; 16, abductor caudae internus; 17, flexor caudae longus; 18, ekstern iliac arterie; 19, uriner; 20, psoas major; 21, livmor horn; 22, abdominal aorta. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Immunhistokjemisk merket MPG fra voksne hannrotter. Alle preparater har blitt visualisert med et konvensjonelt widefield fluorescensmikroskop utstyrt med et monokromt kamera, deretter digitalt fargelagt. (A) Wholemount (komplett tykkelse), fast MPG med tilhørende nerver, immunohistokjemisk merket for sensoriske nerver som uttrykker kalsitonin genrelatert peptid (CGRP); 1, bekkennerve (som viser flere fascikler); 2, cavernøs nerve; 3, hypogastrisk nerve; 4, tilbehør nerver; 5, rektal nerver; 6, store bekken ganglion (MPG). - Jeg har ikke noe åsi. Kryosections (14 μm) av fast MPG, immunohistokjemisk merket for å demonstrere den blandede noradrenerge-kolinerge natur ganglion; (B) noradrenerge nevroner demonstrert av antistoff for tyrosinhydroksylase og (C) en stor populasjon av kolinerge nevroner av antistoff for nevronal nitrogenoksid synthase. Kalibreringslinjen representerer (A) 1000 μm, (B,C) 200 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Discussion

Nevrale kontroll av bekkenorganene formidles av komplekse veier, inkludert somatiske, parasympatiske, sympatiske og viscerale sensoriske komponenter14,15,16,17. De fleste av disse banene stammer fra eller passerer gjennom MPG. Disseksjonsprotokollene som er skissert her, gir en introduksjon til MPG-anatomi, de relaterte tilhørende nervene og nærliggende makroskopiske anatomiske landemerker; sistnevnte er illustrert av anatomiske skjemaer. Andre tilnærminger til MPG disseksjon kan også være vellykket, men vi finner den som er beskrevet her for å være robust og egnet for en forsker ny til dette området av nervesystemet.

De mest kritiske aspektene ved protokollen er riktig identifisering av hver stor nerve og fullstendig fjerning av MPG vev. Med nøye visning og håndtering av vevet kan MPG vev fjernes for anatomiske, molekylære og elektrofysiologiske in vitro-studier18,19,20,21,22. Protokollen kan også tilpasses in vivo eksperimentell manipulasjon23,24,25, bemerker at i dette tilfellet må det tas stor forsiktighet for å minimere kontakt med de primære nervene forbundet med ganglion eller skade nærliggende vaskulatur. Hvis eksperimentet krever selektiv denervation ved avbrudd av en eller flere nerver, anbefales det å ligate den avkuttede nerven for å forhindre reinnervation og forvirrende av analyser. Denne disseksjonprotokollen kan også brukes for musen, hvor det også er en MPG med sammenlignbar funksjon26,27,28.

For nevroanatomiske studier oppnås den beste bevaringen av antigener og vevsstruktur ved å dissekere MPG fra et bedøvet dyr som har blitt perfundert transkaralt med histologisk fikseringsmiddel som passer til eksperimentet29; Imidlertid er identifisering av ganglion og nervestrukturer vanskeligere etter denne prosessen, da vevsfargen går tapt. Det anbefales å bli dyktig i å identifisere og dissekere ganglion fra ikke-perfunderte dyr før du prøver denne disseksjonen etter perfusjon. Likeledes anbefales det å først bli dyktig i disseksjon hos menn fordi for dyr av tilsvarende alder og kroppsstørrelse er MPG og tilhørende nerver mye mindre hos kvinner.

For å validere at vevet fjernet er faktisk MPG, anbefales forskeren først å sjekke plasseringen og funksjonene til hver primærnerve. Mange dissektorer finner bekkennerven og cavernøs nerve den enkleste å identifisere in situ; hypogastriske og tilbehørsnerver er mer delikate og vanskeligere å skille fra det omkringliggende vevet. Hvis disse nervene ikke lenger er tilgjengelige på grunn av problemer under disseksjon, eller hvis det er usikkerhet om deres struktur, anbefales det at innledende MPG-desseksjoner er preget av konvensjonell histologi (for å bekrefte tilstedeværelsen av nevronale cellelegemer8) og for det andre med immunohistochemistry (for å identifisere at både kolinerge og noradrenerge nevroner er tilstede30,31) (Figur 3). For å validere riktig identifisering av de store nervene, blir de cavernøse nervene lett identifisert av deres høye tetthet av nevronale cellelegemer i sin første del nær MPG; de fleste av disse nevronene uttrykker markører for kolinerge, nitrerge nevroner32,33. Bekkenet, hypogastriske og tilbehørsnerver har svært få nevronale cellelegemer34.

Det er flere vanlige fallgruver i å utføre denne disseksjonen. Hvis nybegynnere dissektorer har problemer med å finne noen av de store nervene eller MPG, oppfordres de til å gå tilbake til trinnene som beskriver de viktigste landemerkene. Det er svært vanlig å bli så fokusert på å finne mikrostrukturer at man mister oversikten over makroskopisk kontekst. Vanligvis beveger nybegynnere enten seg for langt rostral i sitt disseksjonssted eller forblir for "overfladiske"-dvs., for nær ventralåpningen av magen, i stedet for å undersøke dypere (dvs. mer dorsal) strukturer. Et vanlig problem under disseksjon er skade på vaskulaturen under disseksjon. Hvis blødningen starter, hold forsiktig en bomullsspiss applikator over kilden til blødningen stopper, skyll deretter området liberalt med saltvann før du recommencing disseksjon. Det er mulig mpg vil ikke være brukbar for eksperimenter hvis forurenset med for mye blod eller hvis disseksjon er forsinket for lenge mens du venter på blødning å stoppe. En annen vanlig disseksjonsfeil er skade på kapselen i prostata kjertelen som betydelig svekker MPG-visualiseringog fjerning. Denne kapselen er en veldig delikat struktur som lett punkteres mens du fjerner fettet fra prostataens sidevegg, selv om du bare bruker en bomullstippet applikator. Til slutt blir de viktigste nervene forbundet med MPG lett skadet under prosessen med å identifisere hver og deretter under fjerning av MPG. Dissektorer oppfordres til å utvikle en rutine der hver nerve er isolert i sin tur, i en bestemt rekkefølge, slik at det er mindre mulighet for forvirring under de siste trinnene av ganglion fjerning.

Denne disseksjonen søkte ikke å spore hver av komponentene i tilbehørsnervene til bestemte organer, eller for å identifisere hver av de mange mikrogangliaene som ligger på ulike punkter mellom bekkengangene og bekkenorganene8. Disse er ganske vanskelig å visualisere in vivo uten å bruke spesifikke flekker; Imidlertid kan de fjernes ved å følge hver av nervekanalene mot organene, og utnytte spesifikke nevrale flekker post hoc for å bestemme ganglion plassering. Disse mikroganglia, selv om bestående av bare liten brøkdel av nevronal befolkningen i forhold til MPG, kan gi bestemte typer innspill til organer som de er mest nært plassert. Vi merker oss her en begrensning i feltet at verken disse mikroganglia eller mange av de små nervekanalene som forlater MPG for å reise til bekkenorganer, men har bredt akseptert navn. Videre er en tilsvarende detaljert studie av mikroganglia ennå ikke utført hos hunnrotter.

Oppsummert gir protokollen og skjemaene som tilbys her forskere verktøy for å studere de primære strukturene som gir den autonome nervetilførselen til bekkenorganene, samt de store perifere ledningene av sensoriske nerver fra lumbosakral dorsalrot ganglia som reiser via MPG til bekkenorganer.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av Office of the Director, National Institutes of Health, Stimulere perifer aktivitet for å lindre forhold (SPARC) Program, Award Number OT2OD023872. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Dr. Bertrands fellesskap i Dr. Keasts laboratorium ble finansiert av: Universitetssykehuset i Nîmes, Fakultet for medisin i Montpellier-Nîmes, Foreningen Française de Chirurgie (AFC), Société Interdisciplinair Francophone d'UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) og People Programme (Marie Curie Actions) i EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under REA-avtale Ingen PCOFUND-GA-2013-609102, gjennom PRESTIGE koordinert av Campus Frankrike.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 Merck C8198
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 Invitrogen 61-7000
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 Jackson 711-165-152
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 Millipore AB152
Dissecting microscope Olympus SZ40, SC
Dumont AA epoxy coated forceps Fine Science Tools 11210-10
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11255-20
Dumont #5/45 curved forceps Fine Science Tools 11251-35
LED light source Schott KL 1600
Micro-Adson forceps Fine Science Tools 11019-12
Student Vannas spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Surgical scissors Fine Science Tools 14054-13

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greene, E. C. Anatomy of the Rat. , American Philosophical Society. Philadelphia, PA. (1935).
  2. Krinke, G. J. The Laboratory Rat. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2000).
  3. Keast, J. R. Pelvic ganglia. Autonomic Ganglia. McLachlan, E. M. , Harwood Academic. Luxembourg. 445-480 (1995).
  4. Keast, J. R. Unusual autonomic ganglia: connections, chemistry, and plasticity of pelvic ganglia. International Review of Cytology. 193, 1-69 (1999).
  5. Alsaid, B., et al. Coexistence of adrenergic and cholinergic nerves in the inferior hypogastric plexus: anatomical and immunohistochemical study with 3D reconstruction in human male fetus. Journal of Anatomy. 214 (5), 645-654 (2009).
  6. Keast, J. R., Smith-Anttila, C. J., Osborne, P. B. Developing a functional urinary bladder: a neuronal context. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 53 (2015).
  7. Purinton, P. T., Fletcher, T. F., Bradley, W. E. Gross and light microscopic features of the pelvic plexus in the rat. Anatomical Record. 175 (4), 697-705 (1973).
  8. Arellano, J., Xelhuantzi, N., Mirto, N., Hernández, M. E., Cruz, Y. Neural interrelationships of autonomic ganglia from the pelvic region of male rats. Autonomic Neuroscience. 217, 26-34 (2019).
  9. Greenwood, D., Coggeshall, R. E., Hulsebosch, C. E. Sexual dimorphism in the numbers of neurons in the pelvic ganglia of adult rats. Brain Research. 340 (1), 160-162 (1985).
  10. Nadelhaft, I., Booth, A. M. The location and morphology of preganglionic neurons and the distribution of visceral afferents from the rat pelvic nerve: a horseradish peroxidase study. Journal of Comparative Neurology. 226 (2), 238-245 (1984).
  11. Kessler, T. M., Birder, L. A., Gomery, P. Neuromodulation of urinary tract function. New England Journal of Medicine. 380 (21), 2067-2069 (2019).
  12. Keast, J. R., Osborne, P. B. Intracardiac perfusion with fixative for anatomical studies [keast-001-stage02]. , https://www.protocols.io/view/intracardiac-perfusion-with-fixative-for-anatomica-w3ffgjn (2019).
  13. Keast, J. R., Osborne, P. B. Immunohistochemical analysis of ganglion neurons innervating the lower urinary tract [keast-001-stage03]. , https://www.protocols.io/view/immunohistochemical-analysis-of-ganglion-neurons-i-w3efgje (2019).
  14. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
  15. Keast, J. R., Booth, A., de Groat, W. C. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell and Tissue Research. 256 (1), 105-112 (1989).
  16. Dail, W. G., Minorsky, N. Composition of the pelvic nerve. Experimental Neurology. 92 (1), 278-283 (1986).
  17. Dail, W. G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microscopy Research and Technique. 35 (2), 95-106 (1996).
  18. Purves-Tyson, T. D., Arshi, M. S., Handelsman, D. J., Cheng, Y., Keast, J. R. Androgen and estrogen receptor-mediated mechanisms of testosterone action in male rat pelvic autonomic ganglia. Neuroscience. 148 (1), 92-104 (2007).
  19. Nangle, M. R., Keast, J. R. Semaphorin 3A inhibits growth of adult sympathetic and parasympathetic neurones via distinct cyclic nucleotide signalling pathways. British Journal of Pharmacology. 162 (5), 1083-1095 (2011).
  20. Tan, H., Mawe, G. M., Vizzard, M. A. Electrical properties of neurons in the intact rat major pelvic ganglion. Autonomic Neuroscience. 134 (1-2), 26-37 (2007).
  21. Park, K. S., et al. An alpha3beta4 subunit combination acts as a major functional nicotinic acetylcholine receptor in male rat pelvic ganglion neurons. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 452 (6), 775-783 (2006).
  22. Park, K. S., et al. Modulation of N-type Ca2+ currents by A1-adenosine receptor activation in male rat pelvic ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299 (2), 501-508 (2001).
  23. Payne, S. C., Belleville, P. J., Keast, J. R. Regeneration of sensory but not motor axons following visceral nerve injury. Experimental Neurology. 266, 127-142 (2015).
  24. Nangle, M. R., Proietto, J., Keast, J. R. Impaired cavernous reinnervation after penile nerve injury in rats with features of the metabolic syndrome. Journal of Sexual Medicine. 6 (11), 3032-3044 (2009).
  25. Kepper, M. E., Keast, J. R. Specific targeting of ganglion cell sprouts provides an additional mechanism for restoring peripheral motor circuits in pelvic ganglia after spinal nerve damage. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7987-7995 (1998).
  26. Yan, H., Keast, J. R. Neurturin regulates postnatal differentiation of parasympathetic pelvic ganglion neurons, initial axonal projections, and maintenance of terminal fields in male urogenital organs. Journal of Comparative Neurology. 507 (2), 1169-1183 (2008).
  27. Ritter, K. E., Wang, Z., Vezina, C. M., Bjorling, D. E., Southard-Smith, E. M. Serotonin receptor 5-HT3A affects development of bladder innervation and urinary bladder function. Frontiers in Neuroscience. 11, 690 (2017).
  28. Tompkins, J. D., Girard, B. M., Vizzard, M. A., Parsons, R. L. VIP and PACAP effects on mouse major pelvic ganglia neurons. Journal of Molecular Neuroscience. 42 (3), 390-396 (2010).
  29. Forrest, S. L., Payne, S. C., Keast, J. R., Osborne, P. B. Peripheral injury of pelvic visceral sensory nerves alters GFRα (GDNF family receptor alpha) localization in sensory and autonomic pathways of the sacral spinal cord. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 43 (2015).
  30. Keast, J. R., Luckensmeyer, G. B., Schemann, M. All pelvic neurons in male rats contain immunoreactivity for the synthetic enzymes of either noradrenaline or acetylcholine. Neuroscience Letters. 196 (3), 209-212 (1995).
  31. Keast, J. R., de Groat, W. C. Immunohistochemical characterization of pelvic neurons which project to the bladder, colon, or penis in rats. Journal of Comparative Neurology. 288 (3), 387-400 (1989).
  32. Dail, W. G., Moll, M. A., Weber, K. Localization of vasoactive intestinal polypeptide in penile erectile tissue and in the major pelvic ganglion of the rat. Neuroscience. 10 (4), 1379-1386 (1983).
  33. Keast, J. R. A possible neural source of nitric oxide in the rat penis. Neuroscience Letters. 143 (1-2), 69-73 (1992).
  34. Kepper, M. E., Keast, J. R. Transmitter profile and spinal inputs of pelvic ganglion cells projecting with preganglionic axons along the hypogastric and pelvic nerves of the male rat. Neuroscience Letters. 280 (2), 123-126 (2000).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 157 autonome ganglia cavernøs nerve hypogastrisk stor bekken ganglion paracervical ganglion parasympatisk bekken ganglion bekken nerve bekken splanchnic nerve sympatisk
Disseksjon av bekken autonome Ganglia og tilhørende nerver i mannlige og kvinnelige rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertrand, M. M., Keast, J. R.More

Bertrand, M. M., Keast, J. R. Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats. J. Vis. Exp. (157), e60904, doi:10.3791/60904 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter