Summary
Los ganglios pélvicos principales contienen neuronas parasimpáticas y simpáticas que inervan órganos pélvicos. Aquí describimos un método de disección y proporcionamos esquemas para la identificación de estos ganglios y sus nervios asociados. Estos métodos se pueden aplicar a la manipulación experimental de estos ganglios in vivo o eliminación post-mortem para su estudio posterior.
Abstract
Los ganglios pélvicos mayores bilaterales (MPG; sinónimo, ganglios pélvicos) son la principal fuente de neuronas simpáticas y parasimpáticas postgangliónicas que inercen órganos pélvicos de roedores; la estructura funcionalmente equivalente en los seres humanos es el plexo hipogástrico inferior. Los ganglios pélvicos principales también proporcionan la ruta por la cual los axones sensoriales lumbares y sacros llegan a los órganos pélvicos. Estos complejos ganglios mixtos pueden resultar difíciles de identificar y diseccionar para un estudio experimental posterior de los mecanismos autonómicos normales o para establecer modelos preclínicos de enfermedad, lesión o dolor visceral. Aquí describimos un protocolo para acceder y visualizar estos ganglios y sus vías nerviosas asociadas. Proporcionamos este protocolo con esquemas para ratas macho y hembra, ya que el tamaño de los ganglios y los puntos de referencia para la identificación difieren entre sexos. El protocolo describe la eliminación del ganglio para estudios in vitro, pero este método puede integrarse en un protocolo de recuperación quirúrgica para intervenciones experimentales (por ejemplo, aplastamiento nervioso, resección nerviosa) o para mapear circuitos neuronales (por ejemplo, por microinyección de trazadores neurales). También demostramos las estructuras primarias del ganglio y sus nervios asociados inmediatamente después de la disección y después de la tinción inmunohistoquímica.
Introduction
La rata es una de las especies mejor caracterizadas utilizadas en el estudio de la fisiología y anatomía del órgano pélvico. Si bien existen excelentes recursos para las descripciones de estos órganos1,2, generalmente no proporcionan información sobre las estructuras neuronales relacionadas o lo hacen con una resolución insuficiente para guiar un estudio experimental. Como se detalla más adelante, la organización de los ganglios autónomos que regulan la función del órgano pélvico es muy diferente al resto del sistema nervioso autónomo, lo que dificulta la inferir con precisión las características de inervación pélvica a partir de información neuroanatómica disponible para otros ganglios autónomos. Esta deficiencia en los recursos para guiar a los investigadores que entran en esta área puede haber ralentizado la investigación sobre la regulación neuronal de los órganos pélvicos. Aquí describimos protocolos para acceder a esta región del sistema nervioso para más estudios in vitro o intervención experimental.
Los ganglios pélvicos mayores bilaterales (MPG; sinónimos: ganglios pélvicos; ganglios paracervicales [hembra]; El ganglio de Frankenh-user [hembra]) es la principal fuente de neuronas simpáticas y parasimpáticas postgangliónicas que invaden los órganos pélvicos de los roedores; el plexo hipogástrico inferior comprende la estructura neuronal equivalente en humanos3,4,5,6. Las proyecciones sensoriales de los ganglios de raíz dorsal lumbar y sacro también viajan a través del MPG para llegar a los órganos pélvicos. Por lo tanto, la comprensión de los circuitos neuronales y la biología del MPG es fundamental para los estudios preclínicos sobre una miríada de condiciones clínicas relacionadas con el desarrollo y la función adulta de los órganos pélvicos. Varias excelentes descripciones de ROedores MPG se han publicado7,8, pero nuestra experiencia es que en general estas descripciones no siempre proporcionan suficiente orientación para informar prácticamente una disección experimental o manipulación de estas estructuras cuando se requiere la recuperación del animal. Además, la mayoría de los estudios MPG se centran en ratas macho. En ratas hembras, los MPG son más pequeños9 y tienen puntos de referencia anatómicos distintos, y por lo tanto requieren una guía claramente adaptada para la visualización y la disección.
Las vías simpáticas y parasimpáticas se distinguen por su anatomía, específicamente la ubicación de sus neuronas pregangliónicas, con vías simpáticas que tienen neuronas pregangliónicas en la médula espinal toco-lumbar y las neuronas pregangliónicas parasimpáticas ubicadas en el tronco cerebral (proyecciones del nervio craneal) y la médula espinal sacro. En la mayoría de las otras regiones del sistema autónomo, sus neuronas ganglionares objetivo se encuentran en ganglios simpáticos o parasimpáticos distintos. Sin embargo, los MPG son inusuales en ser mixtos ganglios simpáticos-parasimpáticos, y por lo tanto a escala macroscópica son sitios de convergencia de axones preganglónicos de ambas regiones espinales toraco-lumbar y sacral. Por lo tanto, hemos incluido en nuestros protocolos la ubicación y descripción de estos tracto nerviosos primarios que conectan cada región espinal con el MPG, facilitando el análisis experimental o la manipulación separada de estos componentes neuronales. También observamos para los lectores que comparan específicamente estos ganglios entre especies, que en los roedores las neuronas pregangliónicas espinales que son 'funcionalmente sacral', por ejemplo, son activas y necesarias durante la micción, la defecación y la erección del pene, se encuentran en los niveles espinales L6-S1 en lugar de exclusivamente en los segmentos sacros10; del mismo modo, los ganglios de raíz dorsal L6 y S1 proporcionan la principal entrada sensorial "sacral" a los órganos pélvicos. En roedores, la entrada sensorial y pregangliónica de los circuitos neuronales más rostral se concentra en los niveles espinales L1 y L210.
Aquí describimos un protocolo para acceder al MPG y sus vías nerviosas asociadas en ratas macho y hembra, y apoyamos esto con esquemas para ilustrar puntos de referencia específicos. Este protocolo guía el acceso quirúrgico a estas estructuras en un contexto experimental de extracción del tejido para estudios in vitro, por ejemplo, aislar las neuronas MPG para la caracterización molecular o el cultivo primario. También se puede adaptar a la eliminación de MPG después de la perfusión intracardiaca con fijativo, aunque esta es una disección más difícil porque el tejido neural se vuelve más difícil de visualizar cuando los tejidos adyacentes están desprovistos de sangre. Este protocolo también se puede integrar en un entorno quirúrgico para la intervención experimental de estas vías nerviosas (por ejemplo, resección nerviosa, microinyección de marcadores neurales). Estos tipos de disecciones son cada vez más importantes para el creciente campo de la medicina bioelectrónica, donde se están desarrollando nuevos objetivos y enfoques de neuromodulación para tratar las condiciones clínicas de las vísceras pélvicas11. Presentamos el protocolo completo primero para ratas macho, luego una réplica del protocolo adaptado específicamente para ratas hembra.
Protocol
Todos los procedimientos se llevarán a cabo de acuerdo con los requisitos institucionales y de financiación de los organismos para la experimentación con animales. El uso de animales para esta disección y el protocolo para la eutanasia han sido aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad de Melbourne (protocolo número 1814639).
NOTA: Las disecciones ilustradas aquí se realizaron en ratas Sprague-Dawley machos y hembras (Instalaciones Biomédicas de Animales, Universidad de Melbourne), con un peso de 280 g (hembra) y 350 g (masculino). Antes de estas disecciones, las ratas fueron eutanasiadas en una cámara deCO2 durante 4 x 5 minutos inmediatamente después de la muerte, MPG fueron diseccionados. Si disecciona tejido de un animal que ha sufrido perfusión transcardial con fijador, tome precauciones para proteger al operador de la exposición a fijadores, es decir, realice disección en el armario de humos o en el armario de corriente descendente y use un equipo de protección personal adecuado. Se ha publicado en detalle un protocolo para la perfusión transcardial12.
1. Ganglio pélvico mayor y nervios adyacentes: acceso y resección en una rata macho
NOTA: La Figura 1 muestra puntos de referencia anatómicos para la visualización de MPG en una rata macho.
- Acceso a la cavidad abdominal y la pelvis
- Coloque la rata en una posición supina y acceda al abdomen y la pelvis a través de una incisión ventral de línea media, teniendo cuidado de evitar la contaminación del campo quirúrgico con piel.
- Mueva suavemente los órganos abdominales hacia un lado con fórceps o aplicadores con punta de algodón. Observe la ubicación de los lóbulos ventrales de la glándula prostática y la vejiga urinaria.
- Mueva la vesícula seminal al lado contralateral.
- Cortar el vas deferente para proporcionar un mejor acceso a la zona que cubre el ganglio.
NOTA: Desde este punto de la disección, el tejido no debe secarse; mantener el tejido húmedo con solución salina fisiológica (para disección de tejido fresco) o fijador (para animales fijos en perfusión). Mantener el tejido húmedo con salina no solo beneficia la estructura del tejido, sino que también hace que la disección sea más fácil, ya que los nervios secos son más frágiles y se desgarran más fácilmente durante la manipulación. - Identificar el lóbulo dorsolateral de la glándula prostática, en la superficie dorsal de la cual es la ubicación del ganglio; esto aún no será visible.
- Para visualizar el ganglio, despeje cuidadosamente los tejidos cerca y sobreel ganglio. Si es necesario, utilice un retractor para mantener el campo de disección despejado.
- Retire un agregado cercano de tejido adiposo y abra la fascia lateral de la pelvis.
- Disección del MPG y sus nervios asociados
- Identificar las siguientes ubicaciones que proporcionan puntos de referencia para los siguientes pasos de la disección: el lóbulo dorsolateral de la glándula prostática (el ganglio se encuentra en la superficie de este lóbulo, ligeramente más caudal que la unión entre la vesícula seminal y la vesícula seminal y prostática) y las vesículas seminales (donde convergen en la línea media indica la ubicación del ganglio en el eje rostrocaudal del animal).
- Como se requiere a partir de este punto, retire cuidadosamente cualquier tejido que impida la visión completa de las estructuras neurales, evitando el daño a la cápsula delgada de la glándula prostática o los vasos principales.
- Identifique el nervio pélvico visualizando los siguientes puntos de referencia y características.
- Encuentra la vena ilíaca interna y su rama fina que se proyecta hacia el MPG y la vejiga. Esta rama vascular corre paralela y a veces está incrustada dentro del nervio pélvico, luego atraviesa el ganglio.
- Coloque suavemente fórceps en ángulo de punta fina debajo del nervio pélvico y deslice los fórceps para liberarlo del tejido circundante.
NOTA: También puede ser posible aislar el nervio pélvico del vaso pequeño que corre paralelo a él, pero para la mayoría de los tipos de experimentos esto no es esencial. Confirme que la estructura es el nervio pélvico viendo bajo aumento alto para determinar que el nervio contiene varios fascículos sueltos agregados, que se distinguen fácilmente bajo el microscopio de disección y son característicos de la pelvis nervio, como ninguno de los otros nervios principales asociados con el ganglio muestran esta fascipula clara.
- Identifique el nervio cavernoso visualizando los siguientes puntos de referencia y características.
- Después de seguir el nervio pélvico hasta su unión con el ganglio, siga el nervio cavernoso a medida que viaja a través de la próstata y luego caudalmente hacia los cuerpos cavernosos del pene.
- Si el aumento del microscopio lo permite, tenga en cuenta que hay un pequeño grupo de nervios delicados que emergen del ganglio entre los nervios pélvicos y cavernosos; estos son los nervios rectales que viajan hacia el intestino inferior.
- Identifique el nervio hipogástrico visualizando los siguientes puntos de referencia y características.
- Identifique dónde se une el nervio hipogástrico al ganglio en su borde craneal, después de viajar junto al uréter.
- Confirme que el nervio hipogástrico es mucho más delgado que los nervios pélvicos o cavernosos y no está acompañado de vasos grandes.
- Identifique el MPG visualizando las siguientes características.
- Visualizar los bordes ventral, dorsal y craneal del ganglio, formando una forma triangular.
- Confirmar la ubicación de cada nervio principal: los nervios pélvicos que emergen del borde dorsal del ganglio, el nervio cavernoso en la esquina más caudal del ganglio, el nervio hipogástrico de su borde craneal y los nervios accesorios que emergen del ganglio borde ventral.
- Identifique los nervios accesorios visualizando los siguientes puntos de referencia y características.
- Después de limpiar el tejido para permitir la visualización del borde ventral del ganglio, identifique un grupo de nervios que se proyectan hacia las vías urinarias y reproductivas.
- Si el aumento del microscopio lo permite, identifique un grupo caudal de nervios que entren entre los lóbulos de la próstata y un grupo rostral entre la vesícula seminal y la vejiga.
- Eliminación del MPG con sus nervios asociados
- Deslice suavemente los fórceps entre el ganglio y la glándula prostática subyacente, teniendo cuidado de no perforar la cápsula delgada de la próstata. Interrumpe cualquier conexión entre el ganglio y la próstata.
- Despeje las conexiones finales con los tejidos circundantes durante las longitudes de los nervios necesarios para el experimento y, a continuación, corte cada nervio.
- Usando fórceps finos, mueva el ganglio con sus nervios a la solución adecuada para el experimento y confirme que cada uno de los nervios principales está intacto.
2. Ganglio pélvico mayor y nervios adyacentes: acceso y resección en una rata hembra
NOTA: La Figura 2 muestra puntos de referencia anatómicos para la visualización de MPG en una rata hembra.
- Acceso a la cavidad abdominal y la pelvis
- Coloque la rata en una posición supina y acceda al abdomen y la pelvis a través de una incisión ventral de línea media, teniendo cuidado de evitar la contaminación del campo quirúrgico con piel.
NOTA: Desde este punto de la disección, el tejido no debe secarse; mantener el tejido húmedo con solución salina fisiológica (para disección de tejido fresco) o fijador (para animales fijos en perfusión). - Mueva suavemente los órganos abdominales hacia un lado con fórceps o aplicadores con punta de algodón. Observe la ubicación del cuerno uterino, la vejiga urinaria y el recto.
- Cortar los vasos ováricos y uterinos y retirar el cuerno uterino.
- Ingrese el espacio peritoneal y despeje suavemente un agregado de tejido adiposo situado cerca del cuello uterino.
- Coloque la rata en una posición supina y acceda al abdomen y la pelvis a través de una incisión ventral de línea media, teniendo cuidado de evitar la contaminación del campo quirúrgico con piel.
- Disección del MPG y sus nervios asociados
- Identificar la pared lateral del cuello uterino, simplemente caudal a su unión con los cuernos uterinos; esta región es el punto de referencia principal para definir la ubicación mpg en el eje rostrocaudal del animal.
- Como se requiere a partir de este punto, retire cuidadosamente cualquier tejido que impida la visión completa de las estructuras neurales, evitando daños a los vasos principales.
- Identifique el nervio pélvico visualizando los siguientes puntos de referencia y características.
- Encuentra la vena ilíaca interna y su rama fina que se proyecta hacia el MPG y la vejiga. Esta rama corre paralela y a veces está incrustada dentro del nervio pélvico, luego atraviesa el ganglio.
- Confirme que la estructura es el nervio pélvico viendo bajo aumento alto para determinar que el nervio contiene varios fascículos sueltos agregados, que se distinguen fácilmente bajo el microscopio de disección y son característicos de la pelvis nervio, como ninguno de los otros nervios principales asociados con el ganglio muestran esta fascipula clara.
- Identifique el nervio hipogástrico visualizando los siguientes puntos de referencia y características.
- Identifique dónde se une el nervio hipogástrico al ganglio en su borde craneal, después de viajar junto al uréter.
- Confirme que el nervio hipogástrico es mucho más delgado que los nervios pélvicos o cavernosos y no está acompañado de vasos grandes.
- Identifique el nervio cavernoso visualizando los siguientes puntos de referencia y características.
- Después de seguir el nervio pélvico hasta su unión con el ganglio, siga el nervio cavernoso mientras viaja caudalmente a lo largo de la pared lateral del cuello uterino hacia la vagina.
- Si el aumento del microscopio lo permite, tenga en cuenta que hay un pequeño grupo de nervios delicados que emergen del ganglio entre los nervios pélvicos y cavernosos; estos son los nervios rectales que viajan hacia el intestino inferior.
- Identifique los nervios accesorios visualizando los siguientes puntos de referencia y características.
NOTA: Los nervios accesorios son difíciles de ver, pero se proyectan desde el aspecto medial del MPG. Después de limpiar el tejido para permitir la visualización del borde ventral del ganglio, identificar un grupo de nervios muy delicados que se proyectan hacia las vías urinarias y reproductivas. - Identifique el MPG visualizando las siguientes características.
- Visualice los bordes ventral, dorsal y craneal del ganglio, que forman una forma triangular.
- Confirmar la ubicación de cada nervio principal: los nervios pélvicos que emergen del borde dorsal del ganglio, el nervio cavernoso en la esquina más caudal del ganglio, el nervio hipogástrico de su borde craneal y los nervios accesorios que emergen del ganglio borde ventral.
- Eliminación del MPG con sus nervios asociados
- Coloque suavemente fórceps en ángulo de punta fina debajo del nervio pélvico y deslice los fórceps para liberarlo del cuello uterino subyacente y del tejido circundante.
NOTA: También puede ser posible aislar el nervio pélvico del vaso pequeño que corre paralelo a él, pero para la mayoría de los tipos de experimentos esto no es esencial. Si demuestra la disección, coloque una sutura debajo del nervio pélvico, para facilitar su visualización. - Repite el proceso para el nervio cavernoso, luego el nervio hipogástrico, y finalmente los nervios accesorios.
- Deslice suavemente los fórceps entre el ganglio y el cuello uterino subyacente. Interrumpa cualquier conexión entre el ganglio y el cuello uterino.
- Despeje las conexiones finales con los tejidos circundantes durante las longitudes de los nervios necesarios para el experimento y, a continuación, corte cada nervio.
- Usando fórceps finos, mueva el ganglio con sus nervios a la solución adecuada para el experimento y confirme que cada uno de los nervios principales está intacto.
- Coloque suavemente fórceps en ángulo de punta fina debajo del nervio pélvico y deslice los fórceps para liberarlo del cuello uterino subyacente y del tejido circundante.
3. Confirmación de componentes ganglioneros (opcional)
- Después de la eliminación del ganglio, sumerja al ganglio en un fijador histológico convencional (por ejemplo, una formalina tamponada del 4%) durante un mínimo de 1 h, lave el fijador con un tampón de fosfato de 0,1 M y el tejido de proceso para la inmunohistoquímica criosección e fluorescencia, como se describió anteriormente13.
NOTA: Muchos anticuerpos de alta calidad que reconocen específicamente estos tres marcadores neuronales están disponibles comercialmente. Consulte Tabla de materiales para los reactivos utilizados para el etiquetado que se muestra en la Figura 3. - Alternativamente, procese ganglios intactos (sumas) para inmunohistoquímica utilizando un método similar al anterior, pero aumentando los tiempos de incubación de los anticuerpos a 4 días (anticuerpo primario) y 2 días (anticuerpo secundario).
- Para demostrar una población importante de axónes sensoriales, utilice anticuerpos contra el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP).
NOTA: La dilución recomendada del anticuerpo utilizado en este estudio es de 1:5.000. - Para demostrar las neuronas simpáticas noadrenérgicas, utilice anticuerpos contra la tirosina hidroxilasa (TH).
NOTA: La dilución recomendada del anticuerpo utilizado en este estudio es de 1:5.000. - Para demostrar una población importante de neuronas colinérgicas, utilizar anticuerpos contra el óxido nítrico neuronal sintasa (NOS).
NOTA: La dilución recomendada del anticuerpo utilizado en este estudio es de 1:500.
Representative Results
Una disección exitosa no sólo eliminará intacto el cuerpo completo del MPG, sino que también conservará el primer segmento de cada uno de los nervios principales todavía unidos. Estos nervios son valiosos indicadores de orientación de ganglios in vivo y, por lo tanto, proporcionan información esencial para muchos tipos de estudios anatómicos (por ejemplo, mapear patrones de expresión o cambios celulares después de una perturbación experimental). Aunque preservar los nervios asociados puede ser menos importante para algunos tipos de experimentos (por ejemplo, disociación de ganglios para el cultivo de neuronas aisladas), la presencia de nervios también proporciona una manera de manejar el ganglio sin tocar (y potencialmente daños) los cuerpos de las células neuronales.
Una disección sin éxito tendrá un ganglio incompleto o dañado, o cuando los nervios primarios ya no estén unidos. También es posible que los ganglios o los nervios se dañen sin saberlo durante la disección, ya sea porque el daño físico es demasiado sutil para detectar bajo el microscopio de disección o porque el daño sólo se hace evidente durante ciertos tipos de ensayos. Por ejemplo, si el tejido ganglionar se seca durante la disección, el tejido puede parecer normal durante el manejo posterior, pero mostrará altos niveles de fluorescencia no específica en la superficie.
Ejemplos de MPG diseccionado se muestran en la Figura 3, que proporciona ejemplos de todo el MPG visualizado como un ganglio completo de espesor completo(Figura 3A) y un MPG que ha sido criodisección para realizar inmunofluorescencia para demostrar neuronas noradenérgicas y colinérgicas(Figura 3B,C).
Figura 1: Puntos de referencia anatómicos para la visualización de MPG en una rata macho. 1, vesícula seminal; 2, vejiga urinaria; 3, glándula coagulante; 4 y 5, nervios accesorios; 6, próstata (lóbulo ventral); 7, nervio cavernoso; 8, vas deferente; 9, uretra; 10, músculo bulbocavernoso; 11, músculo isquiocavernoso; 12, nervios rectales; 13, secuestrador caudae externus; 14, ganglio pélvico mayor; 15, nervio pélvico; 16, secuestrador caudae internus; 17, nervio hipogástrico; 18, vena ilíaca interna; 19, flexor caudae brevis; 20, flexor caudae longus; 21, uréter; 22, psoas mayor; 23, aorta abdominal; 24, vena cava inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Puntos de referencia anatómicos para la visualización de MPG en una rata hembra. 1, colon distal; 2, vejiga urinaria; 3, cuerpo uterino; 4, nervio hipogástrico; 5, nervios accesorios; 6, ganglio pélvico mayor; 7, nervio cavernoso; 8, vagina; 9, uretra; 10, recto; 11, secuestrador caudae externus; 12, nervios rectales; 13, flexor caudae brevis; 14, nervio pélvico; 15, vena ilíaca interna; 16, secuestrador caudae internus; 17, flexor caudae longus; 18, arteria ilíaca externa; 19, uréter; 20, psoas mayor; 21, cuerno uterino; 22, aorta abdominal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: MPG inmunohistoquímico etiquetado de ratas macho adultas. Todas las preparaciones han sido visualizadas con un microscopio de fluorescencia de campo ancho convencional equipado con una cámara monocroma, luego coloreada digitalmente. (A) Montaje completo (espesor completo), MPG fijo con nervios asociados, inmunohistoquímicamente etiquetado para los nervios sensoriales que expresan péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP); 1, nervio pélvico (mostrando los fascículos múltiples); 2, nervio cavernoso; 3, nervio hipogástrico; 4, nervios accesorios; 5, nervios rectales; 6, ganglio pélvico mayor (MPG). (B,C) Criosecciones (14 m) de MPG fijo, inmunohistoquímicamente etiquetados para demostrar la naturaleza noradrenérgica-colinérgica mixta del ganglio; (B) neuronas noradrenérgicas demostradas por anticuerpos para tirosina hidroxilasa y (C) una población importante de neuronas colinérgicas por anticuerpos para el óxido nítrico neuronal sintasa. La barra de calibración representa (A) 1,000 ám, (B,C) 200 ám. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El control neuronal de los órganos pélvicos está mediado por vías complejas que incluyen componentes sensoriales somáticos, parasimpáticos, simpáticos y viscerales14,15,16,17. La mayoría de estas vías se originan o pasan a través del MPG. Los protocolos de disección descritos aquí proporcionan una introducción a la anatomía MPG, los nervios asociados relacionados y los puntos de referencia anatómicos macroscópicos cercanos; estos últimos están ilustrados por esquemas anatómicos. Otros enfoques de la disección MPG también pueden tener éxito, pero encontramos que el descrito aquí es robusto y adecuado para un investigador nuevo en esta área del sistema nervioso.
Los aspectos más críticos del protocolo son la identificación correcta de cada nervio principal y la eliminación completa del tejido MPG. Con una cuidadosa visualización y manejo de los tejidos, los tejidos MPG se pueden extraer para estudios anatómicos, moleculares y electrofisiológicos in vitro18,19,20,21,22. El protocolo también se puede adaptar para la manipulación experimental in vivo23,24,25, señalando que en este caso, se debe tener mucho cuidado para minimizar el contacto con los nervios primarios asociados con el ganglio o para dañar la vasculatura cercana. Si el experimento requiere una denervación selectiva por interrupción de uno o más nervios, se recomienda ligar el nervio cortado para evitar la reinnervación y la confunción de análisis. Este protocolo de disección también podría ser utilizado para el ratón, donde también hay un MPG con función comparable26,27,28.
Para estudios neuroanatómicos, la mejor preservación de antígenos y estructura tisular se obtiene disección el MPG de un animal anestesiado que ha sido peroperado transcardialmente con fijación histológica adecuada al experimento29; sin embargo, la identificación del ganglio y las estructuras nerviosas son más difíciles después de este proceso, ya que la coloración del tejido se pierde. Se recomienda ser competente en la identificación y disección del ganglio de animales no perfundidos antes de intentar esta disección después de la perfusión. Del mismo modo, se recomienda primero ser competente en la disección en los machos porque para los animales de edad y tamaño corporal equivalentes, el MPG y sus nervios asociados son mucho más pequeños en las hembras.
Para validar que el tejido extraído es de hecho el MPG, primero se aconseja al investigador que compruebe la ubicación y las características de cada nervio primario. Muchos dissectores encuentran que el nervio pélvico y el nervio cavernoso son los más fáciles de identificar in situ; los nervios hipogástrico y accesorios son más delicados y más difíciles de distinguir del tejido circundante. Si estos nervios ya no están disponibles debido a problemas durante la disección, o si hay incertidumbre con respecto a su estructura, se recomienda que las disecciones iniciales MPG se caracterizan por la histología convencional (para confirmar la presencia de cuerpos celulares neuronales8) y en segundo lugar con inmunohistoquímica (para identificar que las neuronas colinérgicas y noradrenérgicas están presentes30,31) (Figura 3). Para validar la correcta identificación de los nervios principales, los nervios cavernosos se identifican fácilmente por su alta densidad de cuerpos celulares neuronales en su porción inicial cerca del MPG; la mayoría de estas neuronas expresan marcadores de neuronas colinérgicas, nitreérgicas32,33. Los nervios pélvico, hipogástrico y accesorio tienen muy pocos cuerpos de células neuronales34.
Hay varios escollos comunes en la realización de esta disección. Si los dissectores novicios tienen problemas para encontrar cualquiera de los nervios principales o el MPG, se les alienta a volver a los pasos que describen los puntos de referencia clave. Es muy común centrarse tanto en encontrar las microestructuras que se pierde la pista del contexto macroscópico. Más comúnmente, los dissectores novicios se mueven demasiado lejos rostral en su sitio de disección o permanecen demasiado "superficiales", es decir, demasiado cerca de la abertura ventral del abdomen, en lugar de examinar estructuras más profundas (es decir, más dorsales). Un problema común durante la disección es el daño a la vasculatura durante la disección. Si comienza el sangrado, sostenga suavemente un aplicador con punta de algodón sobre la fuente hasta que se detenga el sangrado, luego enjuague el área liberalmente con salina antes de volver a componer la disección. Es posible que el MPG no sea utilizable para experimentos si está contaminado con demasiada sangre o si la disección se retrasa demasiado tiempo mientras espera a que se detenga el sangrado. Otro error de disección común es el daño a la cápsula de la glándula prostática que afecta significativamente la visualización y eliminación de MPG. Esta cápsula es una estructura muy delicada que se perfora fácilmente mientras se retira la grasa de la pared lateral de la próstata, incluso si se utiliza sólo un aplicador con punta de algodón. Finalmente, los nervios principales asociados con el MPG se dañan fácilmente durante el proceso de identificación de cada uno y luego durante la eliminación del MPG. Se alienta a los dissectores a desarrollar una rutina mediante la que cada nervio se aísle a su vez, en un orden particular, de modo que haya menos oportunidades de confusión durante los pasos finales de la eliminación de ganglios.
Esta disección no buscaba rastrear cada uno de los componentes de los nervios accesorios a órganos específicos, ni identificar cada uno de los muchos microganglios que se encuentran en varios puntos entre los ganglios pélvicos y los órganos pélvicos8. Estos son bastante difíciles de visualizar in vivo sin usar manchas específicas; sin embargo, se pueden extraer siguiendo cada uno de los tracto nerviosos hacia los órganos, y utilizando manchas neuronales específicas post hoc para determinar la ubicación del ganglio. Estos microganália, aunque comprenden sólo una pequeña fracción de la población neuronal en comparación con el MPG, pueden proporcionar tipos específicos de entrada a los órganos a los que están más cerca. Observamos aquí una limitación en el campo que ni estas microgangliania ni muchas de las pequeñas vías nerviosas que salen del MPG para viajar a los órganos pélvicos, pero tienen nombres ampliamente aceptados. Además, todavía no se ha realizado un estudio similarmente detallado de las microganglia en ratas hembra.
En resumen, el protocolo y los esquemas aquí proporcionados proporcionan a los investigadores herramientas para estudiar las estructuras primarias que proporcionan el suministro nervioso autónomo a los órganos pélvicos, así como los principales conductos periféricos de los nervios sensoriales de la raíz dorsal lumbosacral pandidos que viajan a través del MPG a los órganos pélvicos.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por la Oficina del Director, Institutos Nacionales de Salud, Estimulando la Actividad Periférica para Aliviar Condiciones (SPARC) Programa, Premio Número OT2OD023872. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. La beca del Dr. Bertrand en el laboratorio del Dr. Keast fue financiada por: El Hospital Universitario de Nimes, la facultad de medicina de Montpellier-Nimes, la Asociación Francesa de Chirurgie (AFC), la Société Interdisciplinaire Francophone d'UroDyna Et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) y el Programa de Personas (Marie Curie Actions) del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) en virtud del acuerdo de subvención REA no PCOFUND-GA-2013-609102, a través del programa PRESTIGE coordinado por Campus Francia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
| Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
| Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
| Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
| Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| LED light source | Schott | KL 1600 | |
| Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |
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