Summary
De stora bäckenganglier innehåller parasympatiska och sympatiska nervceller som innervate bäckenorganen. Här beskriver vi en dissekeringsmetod och ger scheman för identifiering av dessa ganglier och deras tillhörande nerver. Dessa metoder kan tillämpas på experimentell manipulation av dessa ganglier in vivo eller avlägsnande post-mortem för vidare studier.
Abstract
De bilaterala stora bäckenganglier (MPG; synonym, bäckenhålorna ganglier) är den primära källan till postganglionic sympatiska och parasympatiska nervceller innervating bäckenorgan gnagare; den funktionellt likvärdiga strukturen hos människor är den sämre hypogastric plexus. De stora bäckenganglierna ger också den väg genom vilken ländryggar och sakrala sensoriska axoner når bäckenorganen. Dessa komplexa, blandade ganglier kan visa sig utmanande att identifiera och dissekera för ytterligare experimentell studie av normala autonoma mekanismer eller att upprätta prekliniska modeller av sjukdom, skada eller visceral smärta. Här beskriver vi ett protokoll för att komma åt och visualisera dessa ganglier och deras tillhörande nervområden. Vi förser detta protokoll med scheman för både manliga och kvinnliga råttor, eftersom ganglion storlek och landmärken för identifiering skiljer sig mellan könen. Protokollet beskriver avlägsnandeav ganglion för in vitro-studier, men denna metod kan integreras i ett kirurgiskt återhämtningsprotokoll för experimentella interventioner (t.ex. nervkrossa, nervsamband) eller för kartläggning av neuronala kretsar (t.ex. genom mikroinjektion neurala spårämnen). Vi visar också de primära strukturerna i ganglion och dess associerade nerver omedelbart efter dissekering och efter immunohistochemical färgning.
Introduction
Råttan är en av de bäst karakteriserade arter som används i studien av bäckenorganens fysiologi och anatomi. Medan utmärkta resurser finns för beskrivningar av dessa organ1,2, de i allmänhet inte ger information om relaterade neurala strukturer eller göra det med otillräcklig upplösning för att vägleda en experimentell studie. Som beskrivs längre nedan, organisationen av autonoma ganglier som reglerar bäckenorganenfunktion är helt annorlunda än resten av det autonoma nervsystemet, vilket gör det svårt att exakt dra slutsatsen bäckenhålorna innervation funktioner från neuroanatomisk information tillgänglig för andra autonoma ganglier. Denna brist på resurser för att vägleda forskare in i detta område kan ha bromsat forskning om neural reglering av bäckenorganen. Här beskriver vi protokoll för att komma åt denna region i nervsystemet för ytterligare in vitro-studier eller experimentellintervention.
De bilaterala stora bäckenganglier (MPG; synonymer: bäckenhålorna, paracervical ganglier [kvinna]; Frankenhäusers ganglion [hona]) är den primära källan till postganglionic sympatiska och parasympatiska nervceller innervating bäckenorgan av gnagare; den sämre hypogastric plexus omfattar motsvarande neuronal struktur hos människor3,4,5,6. Sensoriska projektioner från ländryggen och sakrala dorsala rotganglier reser också via MPG för att nå bäckenorganen. Därför är förståelse av MPG:s neurala kretsar och biologi avgörande för prekliniska studier på en myriad av kliniska tillstånd som rör bäckenorganens utveckling och vuxna funktion. Flera utmärkta beskrivningar av gnagare MPG har publicerats7,8, men vår erfarenhet är att i allmänhet dessa beskrivningar inte alltid ger tillräcklig vägledning för att praktiskt informera en experimentell dissekering eller manipulation av dessa strukturer när återvinning av djuret krävs. Dessutom fokuserar majoriteten av MPG-studier på hanråttor. Hos kvinnliga råttor är MPG mindre9 och har distinkta anatomiska landmärken, och kräver därför en tydligt skräddarsydd guide till visualisering och dissekering.
Sympatiska och parasympatiska vägar kännetecknas av deras anatomi, särskilt platsen för deras preganglionic nervceller, med sympatiska vägar med preganglionic nervceller i thoraco-ländryggen ryggmärgen och den parasympatiska preganglionic nervceller ligger i hjärnstammen (kranialnervprognoser) och sakral ryggmärg. I de flesta andra regioner i det autonoma systemet, deras mål ganglion nervceller ligger i olika sympatiska eller parasympatiska ganglier. Men MPG är ovanliga i att vara blandade sympatisk-parasympatiska ganglier, och därför på makroskopiska skala är platser för konvergens från preganglionic axons av både thoraco-ländryggoch sakrala spinal regioner. Vi har därför inkluderat i våra protokoll platsen och beskrivningen av dessa primära nervskrifter som förbinder varje spinal region med MPG, underlätta experimentell analys eller separat manipulation av dessa neurala komponenter. Vi noterar också för läsare som specifikt jämför dessa ganglier mellan arter, att hos gnagare är spinal preganglionic nervceller som är "funktionellt sakrala", t.ex. likaså L6 och S1 dorsala rot ganglier ger de stora "sakrala" sensoriska ingången till bäckenorganen. Hos gnagare är sensorisk och preganglionic ingång från mer rostrala neurala kretsar koncentrerad till spinalnivåer L1 och L210.
Här beskriver vi ett protokoll för att komma åt MPG och deras tillhörande nervskrifter hos manliga och kvinnliga råttor, och stödja detta med scheman för att illustrera specifika landmärken. Detta protokoll styr kirurgisk tillgång till dessa strukturer i ett experimentellt sammanhang för att ta bort vävnaden för in vitro-studier, t.ex. Det kan också anpassas till MPG borttagning efter intracardiac perfusion med fixativ, även om detta är en svårare dissekering eftersom den neurala vävnaden blir svårare att visualisera när de intilliggande vävnaderna saknar blod. Detta protokoll kan också integreras i en kirurgisk inställning för experimentell intervention av dessa nervvägar (t.ex. nervsamband, mikroinjektion av neurala spårämnen). Dessa typer av dissektioner blir allt viktigare för det växande området bioelektronisk medicin, där nya mål och metoder för neuromodulering för behandling av kliniska tillstånd i bäckenhålorna håller på att utvecklas11. Vi presenterar hela protokollet först för hanråttor, sedan en kopia av protokollet skräddarsydd speciellt för kvinnliga råttor.
Protocol
Alla förfaranden ska genomföras enligt de institutionella kraven och finansieringsorganets krav på försök till djur. Användningen av djur för denna dissekering och protokollet för dödshjälp har godkänts av Djuretiska kommittén vid University of Melbourne (protokoll nummer 1814639).
OBS: De dissektioner som illustrerades här utfördes på vuxna (~ 10 veckor) manliga och kvinnliga Sprague-Dawley råttor (Biomedical Sciences Animal Facility, University of Melbourne), väger 280 g (kvinna) och 350 g (hane). Före dessa dissekeringsplatser avlivades råttorna i en CO2-kammare i 4−5 min. Omedelbart efter döden dissekerades MPG. Om dissekera vävnad från ett djur som har genomgått transkarur perfusion med fixativ, vidta försiktighetsåtgärder för att skydda operatören från exponering för fixativ, dvs utföra dissekering i rökskåp eller downdraft skåp och bära lämplig personlig skyddsutrustning. Ett protokoll för transkarur perfusion har publicerats i detalj12.
1. Major bäckenhålorna ganglion och intilliggande nerver: tillgång och samband i en manlig råtta
BILD 1 visar anatomiska landmärken för MPG-visualisering i en manlig råtta.
- Tillgång till bukhålan och bäckenet
- Placera råttan i en supinposition och komma åt buken och bäckenet genom ett ventralt mittinsnitt, var noga med att undvika kontaminering av det kirurgiska fältet med päls.
- Flytta försiktigt bukorganen åt sidan med hjälp av pincett eller bomullstippade applikatorer. Notera placeringen av prostatakörtelns ventrala lober och urinblåsan.
- Flytta den nyskapande vesikeln till den kontralaterala sidan.
- Skär vas deferens för att ge bättre tillgång till området som ligger över ganglion.
OBS: Från denna punkt av dissekeringen får vävnaden inte torka ut; hålla vävnaden fuktig med fysiologisk mjukgörin (för färsk vävnaddissekering) eller fixativ (för perfusion-fast djur). Att hålla vävnaden fuktig med koksin inte bara gynnar vävnadsstruktur men gör också dissekering lättare som torra nerver är mer bräckliga och riva lättare under hantering. - Identifiera prostatakörtelns dorsolaterala lob, på den ryggatorytan som är ganglionens placering; Detta kommer ännu inte att synas.
- För att visualisera ganglion, försiktigt rensa bort vävnader nära och överliggande ganglion. Använd vid behov ett upprullningsdon för att hålla dissekeringsfältet klart.
- Ta bort en närliggande mängd fettvävnad och öppna den laterala fascian av bäckenet.
- Dissekering av MPG och dess tillhörande nerver
- Identifiera följande platser som ger landmärken för nästa steg i dissekeringen: prostatakörtelns dorsolaterala lob (ganglion ligger på ytan av denna lob, något mer kaudal än korsningen mellan sädesvesikel och prostata) och sädesblåsorna (där de konvergerar vid mittlinjen indikerar ganglion-platsen på djurets rostrocaudalaxel).
- Som krävs från denna punkt, försiktigt ta bort någon vävnad som hindrar fullständig syn på neurala strukturer, undvika skador på den tunna kapseln i prostatakörteln eller större kärl.
- Identifiera bäckennerven genom att visualisera följande landmärken och funktioner.
- Hitta den inre iliaca venen och dess fina gren som projicerar mot MPG och urinblåsan. Denna vaskulära gren löper parallellt med och är ibland inbäddad i bäckennerven, sedan korsar ganglion.
- Placera försiktigt fintippade vinklade pincett under bäckennerven och skjut pincetten tillsammans för att befria den från omgivande vävnad.
OBS: Det kan också vara möjligt att isolera bäckennerven från det lilla fartyget som löper parallellt med det, men för de flesta typer av experiment är detta inte nödvändigt. Bekräfta att strukturen är bäckennerven genom att titta under hög förstoring för att fastställa att nerven innehåller flera löst aggregerade fascicles, som lätt skiljer under dissekerande mikroskop och är karakteristiska för bäckenet nerv, som ingen av de andra stora nerver i samband med ganglion visar denna tydliga fasciculation.
- Identifiera cavernous nerv genom att visualisera följande landmärken och funktioner.
- Efter att ha följt bäckennerven till sin korsning med ganglion, följ cavernous nerv när den färdas över prostatan och sedan caudally mot de cavernous kropparna av penis.
- Om mikroskop förstoring tillåter, observera att det finns en liten grupp känsliga nerver som kommer från ganglion mellan bäcken och cavernous nerver; dessa är rektalkapslar nerver som reser till den nedre tarmen.
- Identifiera hypogasgasnerven genom att visualisera följande landmärken och funktioner.
- Identifiera var hypogasgasnerven ansluter sig till ganglion vid dess kranialkan, efter att ha rest tillsammans med urinledaren.
- Bekräfta att hypogasgasnerven är mycket tunnare än antingen bäcken- eller cavernous nerver och inte åtföljs av stora fartyg.
- Identifiera MPG genom att visualisera följande funktioner.
- Visualisera ganglionens ventrala, dorsala och kraniala kanter och bildar en triangulär form.
- Bekräfta platsen för varje större nerv: bäckennerverna som kommer från ganglion's dorsala kanten, den cavernous nerven på den mest caudala hörnet av ganglion, hypogasgasnerven från dess kranialkan, och tillbehörnerver na som kommer från ganglion's ventrala kanten.
- Identifiera tillbehörsnerverna genom att visualisera följande landmärken och funktioner.
- Efter att ha rensat vävnad för att möjliggöra visualisering av ganglion ventrala kanten, identifiera ett kluster av nerver som projektet mot urin- och reproduktionsvägarna.
- Om mikroskop förstoring tillåter, identifiera en kaudal grupp av nerver som kommer in mellan prostataloberna och en rostral grupp mellan sädeskäbling och urinblåsan.
- Borttagning av MPG med tillhörande nerver
- Skjut försiktigt pincett mellan ganglion och den underliggande prostatakörteln, var noga med att inte punktera prostatans tunna kapsel. Störa eventuella kopplingar mellan ganglion och prostata.
- Rensa eventuella slutliga anslutningar med omgivande vävnader för längder av nerver som krävs för experimentet, sedan skära varje nerv.
- Med hjälp av fina pincett, flytta ganglion med sina nerver till lämplig lösning för experimentet och bekräfta att var och en av de viktigaste nerverna är intakta.
2. Major bäckenhålorna ganglion och intilliggande nerver: tillgång och samband i en kvinnlig råtta
BILD 2 visar anatomiska landmärken för MPG-visualisering i en kvinnlig råtta.
- Tillgång till bukhålan och bäckenet
- Placera råttan i en supinposition och komma åt buken och bäckenet genom ett ventralt mittinsnitt, var noga med att undvika kontaminering av det kirurgiska fältet med päls.
OBS: Från denna punkt av dissekeringen får vävnaden inte torka ut; hålla vävnaden fuktig med fysiologisk mjukgörin (för färsk vävnaddissekering) eller fixativ (för perfusion-fast djur). - Flytta försiktigt bukorganen åt sidan med hjälp av pincett eller bomullstippade applikatorer. Observera platsen för livmoderhornet, urinblåsan och ändtarmen.
- Skär äggstocks- och livmoderkärlen och dra tillbaka livmoderhornet.
- Ange det peritoneala utrymmet och rensa försiktigt bort en mängd fettvävnad som ligger nära livmoderlivmoderhalsen.
- Placera råttan i en supinposition och komma åt buken och bäckenet genom ett ventralt mittinsnitt, var noga med att undvika kontaminering av det kirurgiska fältet med päls.
- Dissekering av MPG och dess tillhörande nerver
- Identifiera den laterala väggen i livmoderlivmoderhalsen, bara caudal till sin korsning med livmoderhornen; Denna region är det främsta landmärket för att definiera MPG-platsen på djurets rostrocaudal axel.
- Som krävs från denna punkt, försiktigt ta bort någon vävnad som hindrar fullständig syn på neurala strukturer, undvika skador på stora fartyg.
- Identifiera bäckennerven genom att visualisera följande landmärken och funktioner.
- Hitta den inre iliaca venen och dess fina gren som projicerar mot MPG och urinblåsan. Denna gren löper parallellt med och är ibland inbäddad i bäckennerven, sedan korsar ganglion.
- Bekräfta att strukturen är bäckennerven genom att titta under hög förstoring för att fastställa att nerven innehåller flera löst aggregerade fascicles, som lätt skiljer under dissekerande mikroskop och är karakteristiska för bäckenet nerv, som ingen av de andra stora nerver i samband med ganglion visar denna tydliga fasciculation.
- Identifiera hypogasgasnerven genom att visualisera följande landmärken och funktioner.
- Identifiera var hypogasgasnerven ansluter sig till ganglion vid dess kranialkan, efter att ha rest tillsammans med urinledaren.
- Bekräfta att hypogasgasnerven är mycket tunnare än antingen bäcken- eller cavernous nerver och inte åtföljs av stora fartyg.
- Identifiera cavernous nerv genom att visualisera följande landmärken och funktioner.
- Efter att ha följt bäckennerven till sin korsning med ganglion, följ cavernous nerv som den färdas caudally längs den laterala väggen i livmoderhalsen mot slidan.
- Om mikroskop förstoring tillåter, observera att det finns en liten grupp känsliga nerver som kommer från ganglion mellan bäcken och cavernous nerver; dessa är rektalkapslar nerver som reser till den nedre tarmen.
- Identifiera tillbehörsnerverna genom att visualisera följande landmärken och funktioner.
OBS: Tillbehörnerverna är svåra att se men projekt från den mediala aspekten av MPG. Efter att ha rensat vävnad för att möjliggöra visualisering av ganglion ventrala kanten, identifiera ett kluster av mycket känsliga nerver som projekt mot urin- och reproduktionsvägarna. - Identifiera MPG genom att visualisera följande funktioner.
- Visualisera ganglionens ventrala, dorsala och kraniala kanter, som bildar en triangulär form.
- Bekräfta platsen för varje större nerv: bäckennerverna som kommer från ganglion's dorsala kanten, den cavernous nerven på den mest caudala hörnet av ganglion, hypogasgasnerven från dess kranialkan, och tillbehörnerver na som kommer från ganglion's ventrala kanten.
- Borttagning av MPG med tillhörande nerver
- Placera försiktigt fintippade vinklade pincett under bäckennerven och skjut pincetten tillsammans för att frigöra den från den underliggande livmoderlivmoderhalsen och omgivande vävnaden.
OBS: Det kan också vara möjligt att isolera bäckennerven från det lilla fartyget som löper parallellt med det, men för de flesta typer av experiment är detta inte nödvändigt. Om du visar dissekeringen, placera en sutur under bäckennerven, för att underlätta dess visualisering. - Upprepa processen för cavernous nerv, sedan hypogasgasnerven, och slutligen tillbehörnerverna.
- Skjut försiktigt pincett mellan ganglion och den underliggande livmoder livmoderhalsen. Störa eventuella kopplingar mellan ganglion och livmoderhalsen.
- Rensa eventuella slutliga anslutningar med omgivande vävnader för längder av nerver som krävs för experimentet, sedan skära varje nerv.
- Med hjälp av fina pincett, flytta ganglion med sina nerver till lämplig lösning för experimentet och bekräfta att var och en av de viktigaste nerverna är intakta.
- Placera försiktigt fintippade vinklade pincett under bäckennerven och skjut pincetten tillsammans för att frigöra den från den underliggande livmoderlivmoderhalsen och omgivande vävnaden.
3. Bekräftelse av ganglion komponenter (tillval)
- Efter avlägsnande av ganglion, fördjupa ganglion i en konventionell histologisk fixativ (t.ex. 4% buffrad formalin) för minst 1 h, tvätta ut fixativ med 0,1 M fosfat buffert och processvävnad för kryosektioning och fluorescens immunohistochemistry, som tidigare beskrivits13.
OBS: Många högkvalitativa antikroppar som specifikt känner igen dessa tre neurala markörer är kommersiellt tillgängliga. Se Materialtabell för de reagenser som används för den märkning som visas i figur 3. - Alternativt process ganglior intakt (wholemounts) för immunohistochemistry med en liknande metod som ovan men öka inkubationstiden för antikroppartill 4 dagar (primära antikroppar) och 2 dagar (sekundär antikropp).
- För att demonstrera en stor population av sensoriska axoner, använd antikroppar mot kalcitonin genrelaterad peptid (CGRP).
OBS: Den rekommenderade utspädningen av antikroppen som används i denna studie är 1:5 000. - För att visa noradrenergic sympatiska nervceller, använd antikroppar mot tyrosin hydroxylas (TH).
OBS: Den rekommenderade utspädningen av antikroppen som används i denna studie är 1:5 000. - För att demonstrera en stor population av kolinerga nervceller, använd antikroppar mot neuronal kväveoxid syntas (NOS).
OBS: Den rekommenderade utspädningen av antikroppen som används i denna studie är 1:500.
Representative Results
En lyckad dissekering kommer inte bara att ta bort hela kroppen av MPG intakt, men också behålla det första segmentet av var och en av de stora nerverna fortfarande bifogas. Dessa nerver är värdefulla indikatorer på ganglion orientering in vivo och ger därför viktig information för många typer av anatomiska studier (t.ex. kartläggning uttryck mönster eller cellulära förändringar efter en experimentell störning). Även om bevara de associerade nerverna kan vara av mindre betydelse för vissa experimenttyper (t.ex. ganglion dissociation för kultur av isolerade nervceller), ger närvaron av nerver också ett sätt att hantera ganglion utan att röra (och potentiellt skadliga) neuronala cellorgan.
En misslyckad dissekering kommer att ha en ofullständig eller skadad ganglion, eller där de primära nerverna inte längre är anslutna. Det är också möjligt att ganglier eller nerver är omedvetet skadade under dissekering, antingen för att den fysiska skadan är för subtil för att upptäcka under dissekera mikroskop eller för att skadan bara blir uppenbar under vissa typer av analyser. Till exempel, om ganglion vävnaden blir torr under dissekering, vävnaden kan verka normalt under senare hantering, men kommer att visa höga nivåer av icke-specifik fluorescens på ytan.
Exempel på dissekerat MPG visas i figur 3, som ger exempel på hela MPG visualiseras som en hel tjocklek komplett ganglion(figur 3A)och en MPG som har cryosectioned för att utföra immunofluorescens för att visa noradrenergic och kolinerga nervceller(figur 3B,C).
Bild 1: Anatomiska landmärken för MPG-visualisering i en manlig råtta. 1, sädesvesikel; 2, urinblåsa; 3, koagulerande körtel; 4 & 5, tillbehörnerver; 6, prostata (ventrallob); 7, cavernous nerv; 8, vas deferens; 9, urinröret; 10, bulbocavernosus muskel; 11, ischiocavernosus muskel; 12, rektalnerver; 13, kidnappare caudae externus; 14, stora bäckenhålorna ganglion; 15, bäckennerven; 16, kidnappare caudae internus; 17, hypogasgasnerv; 18, inre iliaca ven; 19, flexor caudae brevis; 20, flexor caudae longus; 21, urinoare; 22, psoas större; 23, bukaorta; 24, sämre vena cava. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Anatomiska landmärken för MPG-visualisering i en kvinnlig råtta. 1, distala kolon; 2, urinblåsa; 3, livmoderkropp; 4, hypogasnerv; 5, tillbehörnerver; 6, stora bäckenhålorna ganglion; 7, cavernous nerv; 8, vagina; 9, urinröret; 10, ändtarmen; 11, kidnappare caudae externus; 12, rektalnerver; 13, flexor caudae brevis; 14, bäckennerven; 15, inre iliaca ven; 16, kidnappare caudae internus; 17, flexor caudae longus; 18, yttre iliaca artär; 19, urinoare; 20, psoas större; 21, livmoderhorn; 22, bukaorta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunohistochemically märkt MPG från vuxna hanråttor. Alla preparat har visualiserats med ett konventionellt widefield fluorescensmikroskop utrustat med en monokrom kamera, sedan digitalt färgat. (A)Wholemount (fullständig tjocklek), fast MPG med tillhörande nerver, immunohistochemically märkt för sensoriska nerver som uttrycker calcitonin genrelaterad peptid (CGRP); 1, bäckennerven (visar flera fascicles); 2, cavernous nerv; 3, hypogasgasnerv; 4, tillbehörnerver; 5, rektalnerver; 6, stora bäckenhålorna ganglion (MPG). (B,C) Kryosektioner (14 μm) fast MPG, immunohistochemically märkt för att visa den blandade noradrenergic-kolinerga karaktären hos ganglion; (B)noradrenergic nervceller visat genom antikroppar mot tyrosin hydroxylas och(C)en stor population av kolinerga nervceller av antikroppar mot neuronal kväveoxid syntas. Kalibreringsfältet representerar (A) 1 000 μm,(B,C) 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Neural kontroll av bäckenorganen medieras av komplexa vägar inklusive somatiska, parasympatiska, sympatiska och viscerala sensoriska komponenter14,15,16,17. De flesta av dessa vägar har sitt ursprung i eller passerar genom MPG. Dissekeringsprotokollen som beskrivs här ger en introduktion till MPG-anatomi, tillhörande nerver och närliggande makroskopiska anatomiska landmärken; de senare illustreras av anatomiska scheman. Andra metoder för MPG-dissekering kan också vara framgångsrika, men vi tycker att den som beskrivs här är robust och lämplig för en forskare som är ny på detta område av nervsystemet.
De mest kritiska aspekterna av protokollet är korrekt identifiering av varje större nerv och fullständigt avlägsnande av MPG-vävnad. Med noggrann visning och hantering av vävnaderna kan MPG-vävnader tas bort för anatomiska, molekylära och elektrofysiologiska in vitro-studier18,19,20,21,22. Protokollet kan också anpassas för in vivo experimentell manipulation23,24,25, notera att i detta fall måste stor försiktighet iakttas för att minimera kontakten med de primära nerverna i samband med ganglion eller skada närliggande vasculature. Om experimentet kräver selektiv denervation genom avbrott av en eller flera nerver, rekommenderas att ligate avhuggna nerv för att förhindra återinnersvation och förvirrande analyser. Detta dissekeringsprotokoll kan också användas för musen, där det också finns en MPG med jämförbar funktion26,27,28.
För neuroanatomiska studier erhålls det bästa bevarandet av antigener och vävnadsstruktur genom att dissekera MPG från ett bedövningsmedel som har perfunderas transkardialt med histologiska fixativ som är lämpligt för experimentet29; identifiering av ganglion och nervstrukturer är dock svårare efter denna process, eftersom vävnaden färgning går förlorad. Det rekommenderas att bli skickliga på att identifiera och dissekera ganglion från nonperfused djur innan du försöker detta dissekering efter perfusion. Likaså rekommenderas att först bli skickliga i dissekering hos män eftersom för djur med motsvarande ålder och kroppsstorlek, MPG och dess tillhörande nerver är mycket mindre hos kvinnor.
För att validera att vävnaden tas bort är verkligen MPG, är forskaren först rekommenderas att kontrollera platsen och funktionerna i varje primär nerv. Många dissectors hitta bäckennerven och cavernous nerv det enklaste att identifiera på plats; hypogastrisk och tillbehör nerver är mer känsliga och svårare att skilja från den omgivande vävnaden. Om dessa nerver inte längre är tillgängliga på grund av problem under dissekering, eller om det finns osäkerhet om deras struktur, rekommenderas att inledande MPG-dissektioner kännetecknas av konventionell histologi (för att bekräfta förekomsten av neuronala cellkroppar8) och för det andra med immunohistokemi (för att identifiera att både kolinerga och noradrenergic nervceller finns30,31) (Figur 3). För att validera korrekt identifiering av de stora nerverna identifieras de cavernösa nerverna lätt genom sin höga densitet av neuronala cellkroppar i sin ursprungliga del nära MPG; de flesta av dessa nervceller uttrycka markörer för kolinerga, nitrergic nervceller32,33. Bäcken- och tarmnerverna har väldigt få neuronala cellkroppar34.
Det finns flera vanliga fallgropar i utförandet av denna dissekering. Om nybörjare dissektorer har problem att hitta någon av de stora nervereller MPG, de uppmuntras att återgå till de steg som beskriver de viktigaste landmärken. Det är mycket vanligt att bli så fokuserad på att hitta mikrostrukturer att man förlorar reda på makroskopiska sammanhang. Oftast, nybörjare dissektorer antingen flytta för långt rostral i deras dissekering webbplats eller förbli för "ytliga"-dvs. för nära den ventrala öppnandet av buken, snarare än att undersöka djupare (dvs. mer dorsala) strukturer. Ett vanligt problem under dissekering är skador på vaskulaturen under dissekering. Om blödningen börjar, håll försiktigt en bomullstippad applikator över källan tills blödningen upphör, sedan spola området frikostigt med saline innan du kommer tillbaka dissekering. Det är möjligt mpg inte kommer att kunna användas för experiment om förorenade med för mycket blod eller om dissekering försenas för länge i väntan på blödning att sluta. Ett annat vanligt dissekeringsfel är skador på prostatakörtelns kapsel som avsevärt försämrar MPG-visualisering och borttagning. Denna kapsel är en mycket känslig struktur som lätt punkteras samtidigt ta bort fettet från prostataväggen, även om du använder endast en bomullstippad applikator. Slutligen är de viktigaste nerverna i samband med MPG lätt skadas under processen att identifiera var och en och sedan under avlägsnande av MPG. Dissektorer uppmuntras att utveckla en rutin där varje nerv isoleras i sin tur, i en viss ordning, så att det finns mindre möjligheter till förvirring under de sista stegen i ganglion borttagning.
Denna dissekering försökte inte spåra var och en av komponenterna i tillbehörnerverna till specifika organ, eller för att identifiera var och en av de många mikroganglia som ligger på olika punkter mellan bäckenhålorna och bäckenorganen8. Dessa är ganska svårt att visualisera in vivo utan att använda specifika fläckar; emellertid, de kan tas bort genom att följa var och en av nervskrifter mot organen, och utnyttja specifika neurala fläckar post hoc för att bestämma ganglion plats. Dessa mikroganglier, även om endast en liten del av den neuronala populationen jämfört med MPG, kan ge specifika typer av bidrag till de organ som de är närmast belägna. Vi noterar här en begränsning på området att varken dessa mikroganglia eller många av de små nervområden som lämnar MPG för att resa till bäckenorganen men har i stort sett accepterat namn. Dessutom har en lika detaljerad studie av mikroganglia ännu inte utförts på honråttor.
Sammanfattningsvis ger det protokoll och scheman som tillhandahålls här forskare med verktyg för att studera de primära strukturerna som ger den autonoma nervtillförseln till bäckenorganen, liksom de stora perifera ledningarna av sensoriska nerver från lumbosacral dorsala rot ganglier som färdas via MPG till bäckenorganen.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av office of the Director, National Institutes of Health, Stimulera perifer aktivitet för att lindra villkor (SPARC) Program, Award Number OT2OD023872. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna hos National Institutes of Health. Dr Bertrands stipendium i Dr. Keasts laboratorium finansierades av: Universitetssjukhuset i Nîmes, fakulteten av medicinen av Montpellier-Nîmes, Anslutningen Française de Chirurgie (AFC), Sociétéen Interdisciplinaire Francophone d"UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) och people-programmet (Marie Curie Actions) i Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt REA-bidragsavtal Nr PCOFUND-GA-2013-609102, genom PRESTIGE-programmet som samordnas av Campus Frankrike.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
| Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
| Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
| Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
| Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| LED light source | Schott | KL 1600 | |
| Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |
References
- Greene, E. C. Anatomy of the Rat. , American Philosophical Society. Philadelphia, PA. (1935).
- Krinke, G. J. The Laboratory Rat. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2000).
- Keast, J. R. Pelvic ganglia. Autonomic Ganglia. McLachlan, E. M. , Harwood Academic. Luxembourg. 445-480 (1995).
- Keast, J. R. Unusual autonomic ganglia: connections, chemistry, and plasticity of pelvic ganglia. International Review of Cytology. 193, 1-69 (1999).
- Alsaid, B., et al. Coexistence of adrenergic and cholinergic nerves in the inferior hypogastric plexus: anatomical and immunohistochemical study with 3D reconstruction in human male fetus. Journal of Anatomy. 214 (5), 645-654 (2009).
- Keast, J. R., Smith-Anttila, C. J., Osborne, P. B. Developing a functional urinary bladder: a neuronal context. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 53 (2015).
- Purinton, P. T., Fletcher, T. F., Bradley, W. E. Gross and light microscopic features of the pelvic plexus in the rat. Anatomical Record. 175 (4), 697-705 (1973).
- Arellano, J., Xelhuantzi, N., Mirto, N., Hernández, M. E., Cruz, Y. Neural interrelationships of autonomic ganglia from the pelvic region of male rats. Autonomic Neuroscience. 217, 26-34 (2019).
- Greenwood, D., Coggeshall, R. E., Hulsebosch, C. E. Sexual dimorphism in the numbers of neurons in the pelvic ganglia of adult rats. Brain Research. 340 (1), 160-162 (1985).
- Nadelhaft, I., Booth, A. M. The location and morphology of preganglionic neurons and the distribution of visceral afferents from the rat pelvic nerve: a horseradish peroxidase study. Journal of Comparative Neurology. 226 (2), 238-245 (1984).
- Kessler, T. M., Birder, L. A., Gomery, P. Neuromodulation of urinary tract function. New England Journal of Medicine. 380 (21), 2067-2069 (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Intracardiac perfusion with fixative for anatomical studies [keast-001-stage02]. , https://www.protocols.io/view/intracardiac-perfusion-with-fixative-for-anatomica-w3ffgjn (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Immunohistochemical analysis of ganglion neurons innervating the lower urinary tract [keast-001-stage03]. , https://www.protocols.io/view/immunohistochemical-analysis-of-ganglion-neurons-i-w3efgje (2019).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Keast, J. R., Booth, A., de Groat, W. C. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell and Tissue Research. 256 (1), 105-112 (1989).
- Dail, W. G., Minorsky, N. Composition of the pelvic nerve. Experimental Neurology. 92 (1), 278-283 (1986).
- Dail, W. G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microscopy Research and Technique. 35 (2), 95-106 (1996).
- Purves-Tyson, T. D., Arshi, M. S., Handelsman, D. J., Cheng, Y., Keast, J. R. Androgen and estrogen receptor-mediated mechanisms of testosterone action in male rat pelvic autonomic ganglia. Neuroscience. 148 (1), 92-104 (2007).
- Nangle, M. R., Keast, J. R. Semaphorin 3A inhibits growth of adult sympathetic and parasympathetic neurones via distinct cyclic nucleotide signalling pathways. British Journal of Pharmacology. 162 (5), 1083-1095 (2011).
- Tan, H., Mawe, G. M., Vizzard, M. A. Electrical properties of neurons in the intact rat major pelvic ganglion. Autonomic Neuroscience. 134 (1-2), 26-37 (2007).
- Park, K. S., et al. An alpha3beta4 subunit combination acts as a major functional nicotinic acetylcholine receptor in male rat pelvic ganglion neurons. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 452 (6), 775-783 (2006).
- Park, K. S., et al. Modulation of N-type Ca2+ currents by A1-adenosine receptor activation in male rat pelvic ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299 (2), 501-508 (2001).
- Payne, S. C., Belleville, P. J., Keast, J. R. Regeneration of sensory but not motor axons following visceral nerve injury. Experimental Neurology. 266, 127-142 (2015).
- Nangle, M. R., Proietto, J., Keast, J. R. Impaired cavernous reinnervation after penile nerve injury in rats with features of the metabolic syndrome. Journal of Sexual Medicine. 6 (11), 3032-3044 (2009).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Specific targeting of ganglion cell sprouts provides an additional mechanism for restoring peripheral motor circuits in pelvic ganglia after spinal nerve damage. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7987-7995 (1998).
- Yan, H., Keast, J. R. Neurturin regulates postnatal differentiation of parasympathetic pelvic ganglion neurons, initial axonal projections, and maintenance of terminal fields in male urogenital organs. Journal of Comparative Neurology. 507 (2), 1169-1183 (2008).
- Ritter, K. E., Wang, Z., Vezina, C. M., Bjorling, D. E., Southard-Smith, E. M. Serotonin receptor 5-HT3A affects development of bladder innervation and urinary bladder function. Frontiers in Neuroscience. 11, 690 (2017).
- Tompkins, J. D., Girard, B. M., Vizzard, M. A., Parsons, R. L. VIP and PACAP effects on mouse major pelvic ganglia neurons. Journal of Molecular Neuroscience. 42 (3), 390-396 (2010).
- Forrest, S. L., Payne, S. C., Keast, J. R., Osborne, P. B. Peripheral injury of pelvic visceral sensory nerves alters GFRα (GDNF family receptor alpha) localization in sensory and autonomic pathways of the sacral spinal cord. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 43 (2015).
- Keast, J. R., Luckensmeyer, G. B., Schemann, M. All pelvic neurons in male rats contain immunoreactivity for the synthetic enzymes of either noradrenaline or acetylcholine. Neuroscience Letters. 196 (3), 209-212 (1995).
- Keast, J. R., de Groat, W. C. Immunohistochemical characterization of pelvic neurons which project to the bladder, colon, or penis in rats. Journal of Comparative Neurology. 288 (3), 387-400 (1989).
- Dail, W. G., Moll, M. A., Weber, K. Localization of vasoactive intestinal polypeptide in penile erectile tissue and in the major pelvic ganglion of the rat. Neuroscience. 10 (4), 1379-1386 (1983).
- Keast, J. R. A possible neural source of nitric oxide in the rat penis. Neuroscience Letters. 143 (1-2), 69-73 (1992).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Transmitter profile and spinal inputs of pelvic ganglion cells projecting with preganglionic axons along the hypogastric and pelvic nerves of the male rat. Neuroscience Letters. 280 (2), 123-126 (2000).
