Summary
Büyük pelvik gangliyonlar pelvik organları innerve parasempatik ve sempatik nöronlar içerir. Burada bir diseksiyon yöntemi tanımlamak ve bu gangliyonlar ve ilişkili sinirlerin belirlenmesi için şemalar sağlar. Bu yöntemler daha fazla çalışma için in vivo veya removal post-mortem bu ganglia deneysel manipülasyon uygulanabilir.
Abstract
Bilateral majör pelvik gangliyonu (MPG; eşanlamlı, pelvik ganglia) postganglionik sempatik ve parasempatik nöronların kemirgenlerin pelvik organlarını innerve eden birincil kaynağıdır; insanlarda fonksiyonel olarak eşdeğer yapı inferior hipogastrik pleksus. Büyük pelvik gangliyonlar da hangi lomber ve sakral duyusal aksonlar pelvik organlara ulaşmak hangi rota sağlar. Bu karmaşık, karışık gangliyonlar tanımlamak ve normal otonom mekanizmaların daha deneysel çalışma için diseksiyon veya hastalık preklinik modelleri kurmak için zor kanıtlayabilirim, yaralanma veya visseral ağrı. Burada bu gangliyonlara ve bunlara bağlı sinir yollarına erişmek ve görselleştirmek için bir protokol uyguluyoruz. Bu protokolü hem erkek hem de dişi sıçanlar için şemalar sağlıyoruz, çünkü kimlik tespiti için ganglion boyutu ve işaretleri cinsiyetler arasında farklılık göstermektedir. Protokol, in vitro çalışmalar için ganglion'un çıkarılmasını açıklar, ancak bu yöntem deneysel müdahaleler (örn. sinir ezilmesi, sinir rezeksiyonu) veya nöronal devrelerin haritalanması (örn. mikroenjeksiyon ile) için cerrahi bir kurtarma protokolüne entegre edilebilir. nöral izleyiciler). Ayrıca diseksiyonun hemen ardından ve immünohistokimyasal boyamasonrasında ganglion ve ilişkili sinirlerin birincil yapılarını gösteririz.
Introduction
Sıçan pelvik organ fizyolojisi ve anatomi çalışmalarında kullanılan en iyi karakterize türlerden biridir. Mükemmel kaynaklar bu organların açıklamaları için var iken1,2, genellikle ilgili nöral yapılar hakkında bilgi vermez ya da deneysel bir çalışma rehberlik etmek için yetersiz çözünürlükte bunu. Aşağıda ayrıntılı olarak, pelvik organ fonksiyonunu düzenleyen otonom ganglia organizasyonu otonom sinir sisteminin geri kalanından oldukça farklıdır, diğer otonom ganglia için mevcut nöroanatomik bilgilerden pelvik innervasyon özelliklerini doğru bir şekilde çıkarmanın zor olduğunu. Bu alana giren araştırmacılara rehberlik etmek için kaynaklardaki bu eksiklik pelvik organların nöral düzenlenmesi üzerine yapılan araştırmaları yavaşlatmış olabilir. Burada daha fazla in vitro çalışmalar veya deneysel müdahale için sinir sisteminin bu bölgeye erişim için protokoller açıklar.
Bilateral majör pelvik gangliyonlar (MPG; eş anlamlı: pelvik ganglia; paraservikal ganglia [kadın]; Frankenhäuser ganglion [kadın]) postganglionik sempatik ve parasempatik nöronlar kemirgenlerin pelvik organları innerve birincil kaynağıdır; inferior hipogastrik pleksus insanlarda eşdeğer nöronal yapı oluşur3,4,5,6. Lomber ve sakral dorsal kök gangliyonundan duyusal projeksiyonlar da pelvik organlara ulaşmak için MPG ile seyahat. Bu nedenle, MPG'nin nöral devresi ve biyolojisinin anlaşılması pelvik organların gelişimi ve erişkin işlevi ile ilgili sayısız klinik durum üzerinde yapılan klinik öncesi çalışmalar için kritik öneme sahiptir. Kemirgen MPG birkaç mükemmel açıklamalar yayınlanmıştır7,8, ama bizim deneyim genel olarak bu açıklamalar her zaman pratik bir deneysel diseksiyon veya hayvan kurtarma gerektiğinde bu yapıların manipülasyon bilgilendirmek için yeterli rehberlik sağlamaz olmasıdır. Ayrıca, MPG çalışmalarının çoğunluğu erkek sıçanlar üzerinde duruluyor. Kadın sıçanlarda, MPG daha küçük9 ve farklı anatomik yerler var, ve bu nedenle görselleştirme ve diseksiyon için belirgin bir özel kılavuz gerektirir.
Sempatik ve parasempatik yollar anatomi ile ayırt edilir, özellikle preganglionik nöronların yeri, torako-lomber omurilik ve parasempatik preganglionic nöronlar beyin sapı bulunan preganglionik nöronlar olan sempatik yollar ile (kranial sinir projeksiyonları) ve sakral omurilik. Otonom sistemin diğer birçok bölgesinde, hedef ganglion nöronlar farklı sempatik veya parasempatik gangglia bulunmaktadır. Ancak, MPG karışık sempatik-parasempatik gangliyon olması alışılmadık, ve bu nedenle makroskopik ölçekte hem torako-lomber ve sakral spinal bölgelerin preganglionic aksonlar yakınsama siteleri vardır. Bu nedenle protokollerimize her bir spinal bölgeyi MPG'ye bağlayan ve deneysel analizi kolaylaştıran veya bu sinir bileşenlerinin ayrı manipülasyonu yapan bu primer sinir yollarının yerini ve tanımını ekledik. Biz de özellikle türler arasında bu gangliyonları karşılaştıran okuyucular için not, kemirgenler 'fonksiyonel sakral', örneğin, aktif ve micturition sırasında gerekli olan spinal preganglionic nöronlar, dışkılama ve penil ereksiyon sırasında gerekli, spinal düzeylerde bulunan L6-S1 yerine sadece sakral segmentleri10; aynı şekilde L6 ve S1 dorsal kök gangliyonu pelvik organlara büyük 'sakral' duyusal giriş sağlar. Kemirgenlerde, daha rostral nöral devrelerden duyusal ve preganglionik giriş spinal düzeylerde L1 ve L210yoğunlaşmıştır.
Burada erkek ve dişi sıçanlarda MPG ve ilişkili sinir yolları erişmek için bir protokol açıklar ve belirli işaretleri göstermek için şemalar ile bu destek. Bu protokol, bu yapılara, örneğin moleküler karakterizasyon veya birincil kültür için MPG nöronlarının izole edilebilmektedir. Ayrıca fiksatif ile intrakardiyak perfüzyon sonrası MPG çıkarılması için adapte edilebilir, nöral doku komşu dokular kan yoksun olduğunda görselleştirmek için daha zor hale gelir, çünkü bu daha zor bir diseksiyon olmasına rağmen. Bu protokol aynı zamanda bu sinir yollarının deneysel müdahalesi için cerrahi bir ortama entegre edilebilir (örn. sinir rezeksiyonu, sinir selizatlarının mikroenjeksiyonu). Bu tip diseksiyonlar, pelvik visseranın klinik koşullarını tedavi etmek için nöromodülasyon için yeni hedeflerin ve yaklaşımların geliştirildiği biyoelektronik tıbbın büyüyen alanı için giderek daha önemlidir11. Önce erkek sıçanlar için protokolün tamamını sıyoruz, sonra da dişi sıçanlar için özel olarak hazırlanmış protokolün bir kopyasını.
Protocol
Tüm işlemler hayvan deneyleri için kurumsal ve finansman organı gereksinimlerine göre yürütülecek. Bu diseksiyon için hayvanların kullanımı ve ötenazi protokolü Melbourne Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası 1814639).
NOT: Burada gösterilen diseksiyonlar yetişkin (~10 hafta) erkek ve dişi Sprague-Dawley sıçanları (Melbourne Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Hayvan Tesisi) üzerinde, 280 g (kadın) ve 350 g (erkek) ağırlığında yapılmıştır. Bu diseksiyondan önce sıçanlar 4−5 dk. ölümden hemen sonra CO2 odasında ötenazi yapıldı ve MPG parçalandı. Fiksatif ile transkardiyal perfüzyon geçiren bir hayvanın dokularını parçalara ayırmak durumunda, operatörü fiksatife maruz kalmaktan korumak için önlemler alın, yani duman dolabında veya aşağı çekme dolabında diseksiyonu yapın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Transkardiyal perfüzyon için bir protokol ayrıntılı olarak yayınlanmıştır12.
1. Majör pelvik ganglion ve komşu sinirler: bir erkek sıçanda erişim ve rezeksiyon
NOT: Şekil 1 erkek sıçanda MPG görselleştirme için anatomik işaretler gösterir.
- Karın boşluğu ve pelvis erişimi
- Bir supine pozisyonda sıçan yerleştirin ve bir ventral orta hat kesi ile karın ve pelvis erişin, kürk ile cerrahi alanın kontaminasyonunu önlemek için özen.
- Karın organlarını forceps veya pamuk uçlu aplikatörler kullanarak yavaşça bir tarafa taşıyın. Prostat bezi ve idrar kesesi ventral lobların yerini unutmayın.
- Seminal vezikülün karşı tarafına doğru hareket ettirin.
- Ganglion örten alana daha iyi erişim sağlamak için vas deferens kesin.
NOT: Diseksiyonun bu noktasından itibaren doku kurumamalıdır; fizyolojik salin (taze doku diseksiyonu için) veya fiksatif (perfüzyon-sabit hayvan için) ile doku nemli tutmak. Dokutuzlu ile nemli tutulması sadece doku yapısına fayda sağlamaz, aynı zamanda kuru sinirler daha kırılgan ve kullanım sırasında daha kolay yırtılma gibi diseksiyon kolaylaştırır. - Prostat bezinin dorsolateral lob belirlemek, hangi ganglion yeri olan dorsal yüzeyinde; bu henüz görünür olmayacaktır.
- Ganglion görselleştirmek için, dikkatle yakın ve ganglion örten dokuları temizleyin. Gerekirse, diseksiyon alanını açık tutmak için bir retraktör kullanın.
- Yağ dokusunun yakındaki bir toplam çıkarın ve pelvis lateral fasya açın.
- MPG ve ilişkili sinirlerin diseksiyonu
- Diseksiyonun sonraki adımları için işaretler sağlayan aşağıdaki yerleri belirleyin: prostat bezinin dorsolateral lobu (ganglion bu lobun yüzeyinde yer alır, seminal vezikül arasındaki kavşaktan biraz daha fazla kaudal prostat) ve seminal veziküller (orta hatta yakındıkları yer hayvanın rostrokaudal ekseninde ganglion yerini gösterir).
- Bu noktadan itibaren gerekli olduğu gibi, dikkatle prostat bezi veya büyük damarların ince kapsül zarar görmesini önleyerek, nöral yapıların tam görünümünü engelleyen herhangi bir doku kaldırmak.
- Aşağıdaki işaretleri ve özellikleri görselleştirerek pelvik sinir tanımlayın.
- MpG ve mesane doğru yansıtılan iç iliac ven ve ince dalı bulun. Bu vasküler şube paralel çalışır ve bazen pelvik sinir içinde gömülü, sonra ganglion geçer.
- İnce uçlu açılı forcep'leri pelvik sinirin altına hafifçe yerleştirin ve çevredeki dokudan kurtarmak için forceps'u kaydırın.
NOT: Pelvik siniri ona paralel çalışan küçük damardan ayırmak da mümkün olabilir, ancak çoğu deney türü için bu gerekli değildir. Yapının, diseksiyon mikroskobu altında kolayca ayırt edilebilen ve pelvik in karakteristik olan birkaç gevşek toplu fasikül içerdiğini belirlemek için yüksek büyütme altında incelenme altında ince sinir olduğunu doğrulayın sinir, ganglion ile ilişkili diğer büyük sinirlerin hiçbiri bu açık fasikül göstermek gibi.
- Aşağıdaki işaretleri ve özellikleri görselleştirerek kavernöz sinir tanımlayın.
- Ganglion ile kavşak için pelvik sinir takip ettikten sonra, prostat boyunca seyahat ve daha sonra caudally penisin kavernöz organları doğru caudally olarak kavernöz sinir izleyin.
- Mikroskop büyütme izin verirse, pelvik ve kavernöz sinirler arasında ganglion çıkan hassas sinirlerin küçük bir grup olduğunu unutmayın; Bunlar alt bağırsa giden rektal sinirlerdir.
- Aşağıdaki işaretleri ve özellikleri görselleştirerek hipogastrik sinir tanımlayın.
- Hipogastrik sinir inter ile birlikte seyahat ettikten sonra, onun kranial kenarında ganglion birleştiği yeri belirleyin.
- Hipogastrik sinirin pelvik veya kavernöz sinirlerden çok daha ince olduğunu ve büyük damarlar eşlik etmediğini doğrulayın.
- Aşağıdaki özellikleri görselleştirerek MPG'yi tanımlayın.
- Ganglion ventral, dorsal ve kranial kenarları görselleştirin, üçgen bir şekil oluşturan.
- Her büyük sinirin yerini doğrulayın: ganglion'un sırt kenarından çıkan pelvik sinirler, ganglionun en kaudal köşesindeki kavernöz sinir, kraniyal kenarından hipogastrik sinir ve ganglionun boyundan çıkan aksesuar sinirleri ventral kenar.
- Aşağıdaki simgesel yapıları ve özellikleri görselleştirerek aksesuar sinirlerini belirleyin.
- Ganglion ventral kenarının görselleştirilmesini sağlamak için doku temizledikten sonra, idrar ve üreme yolları doğru proje sinirlerin bir küme belirlemek.
- Mikroskop büyütme izin verirse, prostat lobları ve mesane arasında bir rostral grup arasında giren sinirlerin bir kaudal grup belirlemek.
- Ilişkili sinirler ile MPG çıkarılması
- Ganglion ve altta yatan prostat bezi arasında hafifçe kaydırma forseps, prostat ince kapsül delmek için dikkatli olmak. Ganglion ve prostat arasındaki bağlantıları bozun.
- Deney için gerekli sinirlerin uzunlukları için çevreleyen dokular ile herhangi bir son bağlantıları temizleyin, sonra her sinir kesti.
- İnce forsepskullanarak, sinirleri ile ganglion'u deney için uygun çözüme taşıyın ve ana sinirlerin her birinin sağlam olduğunu onaylayın.
2. Majör pelvik ganglion ve komşu sinirler: bir kadın sıçanda erişim ve rezeksiyon
NOT: Şekil 2, dişi bir sıçanda MPG görselleştirmeiçin anatomik işaretler göstermektedir.
- Karın boşluğu ve pelvis erişimi
- Bir supine pozisyonda sıçan yerleştirin ve bir ventral orta hat kesi ile karın ve pelvis erişin, kürk ile cerrahi alanın kontaminasyonunu önlemek için özen.
NOT: Diseksiyonun bu noktasından itibaren doku kurumamalıdır; fizyolojik salin (taze doku diseksiyonu için) veya fiksatif (perfüzyon-sabit hayvan için) ile doku nemli tutmak. - Karın organlarını forceps veya pamuk uçlu aplikatörler kullanarak yavaşça bir tarafa taşıyın. Rahim boynuzu, idrar kesesi ve rektumun bulunduğu yere dikkat edin.
- Yumurtalık ve rahim damarları kesin ve rahim boynuzu geri.
- Periton boşluğuna girin ve rahim ağzı yakınında bulunan yağ dokusunun toplamını hafifçe temizleyin.
- Bir supine pozisyonda sıçan yerleştirin ve bir ventral orta hat kesi ile karın ve pelvis erişin, kürk ile cerrahi alanın kontaminasyonunu önlemek için özen.
- MPG ve ilişkili sinirlerin diseksiyonu
- Rahim servikslateral duvar tanımlayın, sadece rahim boynuzları ile kavşak için kaudal; bu bölge, hayvanın rostrokaudal ekseninde MPG konumunu tanımlamak için birincil dönüm noktasıdır.
- Bu noktadan itibaren gerekli olduğu gibi, dikkatle büyük damarlara zarar kaçınarak, nöral yapıların tam görünümünü engelleyen herhangi bir doku kaldırmak.
- Aşağıdaki işaretleri ve özellikleri görselleştirerek pelvik sinir tanımlayın.
- MpG ve mesane doğru yansıtılan iç iliac ven ve ince dalı bulun. Bu dal paralel çalışır ve bazen pelvik sinir içinde gömülü, sonra ganglion geçer.
- Yapının, diseksiyon mikroskobu altında kolayca ayırt edilebilen ve pelvik in karakteristik olan birkaç gevşek toplu fasikül içerdiğini belirlemek için yüksek büyütme altında incelenme altında ince sinir olduğunu doğrulayın sinir, ganglion ile ilişkili diğer büyük sinirlerin hiçbiri bu açık fasikül göstermek gibi.
- Aşağıdaki işaretleri ve özellikleri görselleştirerek hipogastrik sinir tanımlayın.
- Hipogastrik sinir inter ile birlikte seyahat ettikten sonra, onun kranial kenarında ganglion birleştiği yeri belirleyin.
- Hipogastrik sinirin pelvik veya kavernöz sinirlerden çok daha ince olduğunu ve büyük damarlar eşlik etmediğini doğrulayın.
- Aşağıdaki işaretleri ve özellikleri görselleştirerek kavernöz sinir tanımlayın.
- Ganglion ile kavşak için pelvik sinir izledikten sonra, vajinaya doğru serviks lateral duvar boyunca caudally seyahat gibi kavernöz sinir izleyin.
- Mikroskop büyütme izin verirse, pelvik ve kavernöz sinirler arasında ganglion çıkan hassas sinirlerin küçük bir grup olduğunu unutmayın; Bunlar alt bağırsa giden rektal sinirlerdir.
- Aşağıdaki simgesel yapıları ve özellikleri görselleştirerek aksesuar sinirlerini belirleyin.
NOT: Aksesuar sinirleri görmek zordur ama MPG medial açıdan proje. Ganglion ventral kenarının görselleştirilmesini sağlamak için doku temizledikten sonra, idrar ve üreme yolları doğru proje çok hassas sinirlerin bir küme belirlemek. - Aşağıdaki özellikleri görselleştirerek MPG'yi tanımlayın.
- Üçgen bir şekil oluşturan ganglion, ventral, dorsal ve kranial kenarları görselleştirin.
- Her büyük sinirin yerini doğrulayın: ganglion'un sırt kenarından çıkan pelvik sinirler, ganglionun en kaudal köşesindeki kavernöz sinir, kraniyal kenarından hipogastrik sinir ve ganglionun boyundan çıkan aksesuar sinirleri ventral kenar.
- Ilişkili sinirler ile MPG çıkarılması
- Pelvik sinirin altına ince uçlu açılı forcep'leri nazikçe yerleştirin ve forceps'u altta yatan rahim ağzı ve çevresindeki dokudan kurtarmak için kaydırın.
NOT: Pelvik siniri ona paralel çalışan küçük damardan ayırmak da mümkün olabilir, ancak çoğu deney türü için bu gerekli değildir. Diseksiyonu gösteriyorsanız, görselleştirmekolaylaştırmak için, pelvik sinir altında bir dikiş yerleştirin. - Kavernöz sinir için süreci tekrarlayın, sonra hipogastrik sinir, ve son olarak aksesuar sinirler.
- Ganglion ve altta yatan rahim ağzı arasında yavaşça kaydırma forseps. Ganglion ve serviks arasındaki bağlantıları bozun.
- Deney için gerekli sinirlerin uzunlukları için çevreleyen dokular ile herhangi bir son bağlantıları temizleyin, sonra her sinir kesti.
- İnce forsepskullanarak, sinirleri ile ganglion'u deney için uygun çözüme taşıyın ve ana sinirlerin her birinin sağlam olduğunu onaylayın.
- Pelvik sinirin altına ince uçlu açılı forcep'leri nazikçe yerleştirin ve forceps'u altta yatan rahim ağzı ve çevresindeki dokudan kurtarmak için kaydırın.
3. Ganglion bileşenlerinin teyidi (isteğe bağlı)
- Ganglion kaldırıldıktan sonra, geleneksel bir histolojik fiksatif (örneğin, 4% tamponlu formalin) en az 1 saat ganglion batırın, 0.1 M fosfat tampon ve kriyosectioning ve floresan immünohistokimya için proses dokusu ile fiksatif yıkayın, daha önce açıklandığı gibi13.
NOT: Özellikle bu üç sinir belirteçleri tanıyan birçok yüksek kaliteli antikorlar ticari olarak mevcuttur. Şekil 3'tegösterilen etiketleme için kullanılan reaktifler için Malzeme Tablosuna bakınız. - Alternatif olarak, yukarıdaki gibi benzer bir yöntem kullanarak immünohistokimya için işlem ganglia (wholemounts) ancak antikorlar için kuluçka süreleri artırarak 4 gün (primer antikor) ve 2 gün (ikincil antikor).
- Duyusal aksonların büyük bir popülasyon göstermek için, kalsitonin gen ile ilgili peptid karşı antikorlar kullanın (CGRP).
NOT: Bu çalışmada kullanılan antikor önerilen seyreltme 1:5.000 olduğunu. - Noradrenerjik sempatik nöronları göstermek için tirozin hidroksilaza (TH) karşı antikor kullanın.
NOT: Bu çalışmada kullanılan antikor önerilen seyreltme 1:5.000 olduğunu. - Kolinerjik nöronların büyük bir popülasyon göstermek için, nöronal nitrik oksit synthase karşı antikorlar kullanın (NOS).
NOT: Bu çalışmada kullanılan antikor önerilen seyreltme 1:500 olduğunu.
Representative Results
Başarılı bir diseksiyon sadece MPG bozulmamış tam vücut kaldırmak değil, aynı zamanda hala bağlı büyük sinirlerin her biri ilk segmentini korumak. Bu sinirler in vivo ganglion oryantasyon değerli göstergeler ve bu nedenle anatomik çalışmaların birçok türü için gerekli bilgileri sağlamak (örneğin, deneysel bir pertürbasyon sonra ifade kalıpları veya hücresel değişiklikler haritalama). İlişkili sinirlerin korunması bazı deney türleri için daha az önemli olsa da (örneğin, izole nöronların kültürü için ganglion ayrışması), sinirlerin varlığı da dokunmadan ganglion işleme bir yol sağlar (ve potansiyel olarak zarar) nöronal hücre organları.
Başarısız bir diseksiyon eksik veya hasarlı ganglion olacak, ya da birincil sinirler artık bağlı değildir. Ayrıca, fiziksel hasar diseksiyon mikroskop altında tespit etmek için çok ince ya da hasar sadece tahlilbelirli türleri sırasında belirgin hale gelir, çünkü, ya da bilmeden diseksiyon sırasında zarar görmüş olması mümkündür. Örneğin, ganglion dokusu diseksiyon sırasında kuru hale gelirse, doku daha sonra işleme sırasında normal görünebilir, ancak yüzeyde non-spesifik floresan yüksek düzeyde gösterir.
Diseksiyon mpg örnekleri Şekil 3gösterilmektedir , bütün bir kalınlık tam ganglion olarak görselleştirilmiş tüm MPG örnekleri sağlar ( Şekil3A) ve noradrenerjik ve kolinerjik nöronlar göstermek için immünororeskence gerçekleştirmek için kriyokesize edilmiş bir MPG (Şekil 3B,C).
Şekil 1: Erkek sıçanda MPG görselleştirmesi için anatomik işaretler. 1, seminal vezikül; 2, idrar kesesi; 3, pıhtılaşma bezi; 4 & 5, aksesuar sinirler; 6, prostat (ventral lob); 7, kavernöz sinir; 8, vas deferens; 9, üretra; 10, bulbocavernosus kas; 11, ischiocavernosus kas; 12, rektal sinirler; 13, kaçıran caudae externus; 14, büyük pelvik ganglion; 15, pelvik sinir; 16, kaçıran kaudae internus; 17, hipogastrik sinir; 18, iç iliak ven; 19, fleksör caudae brevis; 20, fleksör caudae longus; 21, üreter; 22, psoas majör; 23, abdominal aort; 24, aşağı vena kava. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dişi bir sıçanda MPG görselleştirmesi için anatomik işaretler. 1, distal kolon; 2, idrar kesesi; 3, rahim gövdesi; 4, hipogastrik sinir; 5, aksesuar sinirler; 6, büyük pelvik ganglion; 7, kavernöz sinir; 8, vajina; 9, üretra; 10, rektum; 11, kaçıran caudae externus; 12, rektal sinirler; 13, fleksör caudae brevis; 14, pelvik sinir; 15, iç iliak ven; 16, kaçıran kaudae internus; 17, fleksör caudae longus; 18, eksternal iliak arter; 19, üreter; 20, psoas majör; 21, rahim boynuzu; 22, abdominal aort. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Erişkin erkek sıçanlardan immünohistokimyasal olarak MPG olarak etiketlenmiştir. Tüm preparatlar, tek renkli kamera ile donatılmış, daha sonra dijital olarak renklendirilmiş geleneksel geniş alan floresan mikroskobu ile görselleştirildi. (A)Wholemount (tam kalınlık), ilişkili sinirler ile sabit MPG, immünohistokimyasal kalsitonin gen ile ilgili peptid (CGRP) ifade duyu sinirleri için etiketli; 1, pelvik sinir (çoklu fasiküller gösteren); 2, kavernöz sinir; 3, hipogastrik sinir; 4, aksesuar sinirler; 5, rektal sinirler; 6, büyük pelvik ganglion (MPG). (B,C) Ganglion karışık noradrenerjik-kolinerjik doğasını göstermek için immünohistokimyasal olarak etiketlenmiş sabit MPG kriyokesitleri (14 μm); (B) noradrenerjik nöronlar tirozin hidroksilaz için antikor tarafından gösterilmiştir ve (C) nöronal nitrik oksit synthase için antikor tarafından kolinerjik nöronların büyük bir nüfus. Kalibrasyon çubuğu (A) 1.000 μm, (B,C) 200 μm'yi temsil eder.
Discussion
Pelvik organların nöral kontrolü somatik, parasempatik, sempatik ve visseral duyusal bileşenler14,15,16,17dahil olmak üzere karmaşık yollar aracılık edilir. Bu yolların çoğu kökenli veya MPG geçer. Burada özetlenen diseksiyon protokolleri MPG anatomisine, ilgili sinirlere ve yakındaki makroskopik anatomik yapılara giriş sağlar; ikincisi anatomik şemalar ile gösterilmiştir. MPG diseksiyonu için diğer yaklaşımlar da başarılı olabilir, ama biz burada açıklanan bir sağlam ve sinir sisteminin bu alanda yeni bir araştırmacı için uygun olarak bulabilirsiniz.
Protokolün en kritik yönleri her büyük sinirin doğru tanımlanması ve MPG dokusunun tamamen çıkarılmasıdır. Dokuların dikkatli bir şekilde izlenmesi ve işlenmesi ile MPG dokuları anatomik, moleküler ve elektrofizyolojik in vitro çalışmalar için çıkarılabilir18,19,20,21,22. Protokol aynı zamanda in vivo deneysel manipülasyon için adapte edilebilir23,24,25, Bu durumda, ganglion ile ilişkili birincil sinirler ile teması en aza indirmek için büyük dikkat alınması gerektiğini belirterek veya yakındaki vaskülatür zarar. Deney bir veya daha fazla sinirin kesilmesi yle seçici denervasyon gerektiriyorsa, reinnervasyonu ve analizlerin kafa karıştırıcıolmasını önlemek için kopmuş sinirin infilak etmesi önerilir. Bu diseksiyon protokolü de fare için kullanılabilir, karşılaştırılabilir fonksiyonu ile bir MPG de var26,27,28.
Nöroanatomik çalışmalar için, antijenlerin ve doku yapısının en iyi korunması, mpg'nin deneye uygun histolojik fiksatif ile transkarjik olarak perfore edilmiş anestezili bir hayvandan kesilmesiyle elde edilir29; ancak bu süreçten sonra doku renklenmesi kaybolduğundan ganglion ve sinir yapılarının belirlenmesi daha zordur. Perfüzyon sonrası bu diseksiyonu denemeden önce ganglionun perfüzyonsuz hayvanlardan tanımlanması ve kesilmesinde usta lık olması önerilir. Aynı şekilde, eşdeğer yaş ve vücut boyutu hayvanlar için, MPG ve ilişkili sinirler kadınlarda çok daha küçük olduğu için ilk erkeklerde diseksiyon yeterli olmak için tavsiye edilir.
Çıkarılan doku gerçekten MPG olduğunu doğrulamak için, araştırmacı ilk her birincil sinir in yerini ve özelliklerini kontrol etmek için tavsiye edilir. Birçok dissectors pelvik sinir ve kavernöz sinir yerinde tanımlamak için en kolay bulabilirsiniz; hipogastrik ve aksesuar sinirler daha hassas ve daha çevre doku ayırt etmek zordur. Eğer bu sinirler diseksiyon sırasındaki sorunlar nedeniyle artık mevcut değilse veya yapıları ile ilgili belirsizlik varsa, ilk MPG diseksiyonları konvansiyonel histoloji ile karakterize dir (nöronal hücre organlarının varlığını doğrulamak için8) ve ikinci olarak immünhistokimya (hem kolinerjik hem de noradrenerjik nöronların mevcut olduğunu belirlemek için30,31) (Şekil 3). Majör sinirlerin doğru belirlenmesini doğrulamak için, kavernöz sinirler kolayca MPG yakın ilk bölümünde nöronal hücre organlarının yüksek yoğunluklu tarafından tanımlanır; bu nöronların çoğu kolinerjik belirteçleri ifade, nitrergic nöronlar32,33. Pelvik, hipogastrik ve aksesuar sinirler çok az nöronal hücre organları var34.
Bu diseksiyon gerçekleştirirken çeşitli ortak tuzaklar vardır. Acemi dissectors herhangi bir büyük sinirler veya MPG bulma sorunları varsa, onlar önemli işaretleri açıklayan adımlara dönmek için teşvik edilir. Makroskopik bağlamın izini kaybedilebilen mikroyapıları bulmaya bu kadar odaklanmak çok yaygındır. En yaygın olarak, acemi dissectors ya kendi diseksiyon yerinde çok ileri rostral hareket ya da çok 'yüzeysel'-i.e., çok yakın karın ventral açılış, yerine derin inceleyerek kalır (yani, daha fazla dorsal) yapıları. Diseksiyon sırasında sık karşılaşılan bir sorun, diseksiyon sırasında vaskülatürhasarıdır. Kanama başlarsa, kanama durana kadar yavaşça kaynağın üzerinde pamuk uçlu bir aplikatör tutun, sonra diseksiyonu yeniden başlatmadan önce bölgeyi tuzlu suyla temize çıkar. Çok fazla kanla kirlenmişse veya kanamanın durmasını beklerken diseksiyon çok uzun süre gecikirse MPG deneyler için kullanılabilir olmayacaktır. Başka bir yaygın diseksiyon hatası önemli ölçüde MPG görme ve kaldırma bozar prostat bezinin kapsül hasardır. Bu kapsül kolayca prostatlateral duvardan yağ kaldırırken delinmiş çok hassas bir yapıdır, sadece bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak bile. Son olarak, MPG ile ilişkili ana sinirler kolayca her biri belirleme işlemi sırasında ve daha sonra MPG kaldırılması sırasında zarar görür. Dissectors her sinir sırayla izole bir rutin geliştirmek için teşvik edilir, belirli bir sırada, böylece ganglion kaldırma son adımları sırasında karışıklık için daha az fırsat var.
Bu diseksiyon belirli organlara aksesuar sinirlerin bileşenlerinin her izlemek için, ya da pelvik ganglia ve pelvik organlar arasında çeşitli noktalarda yalan birçok mikroganglia her tanımlamak için aramadı8. Bu belirli lekeler kullanmadan in vivo görselleştirmek için oldukça zordur; ancak, organlara doğru sinir yollarının her birini izleyerek kaldırılabilir, ve ganglion yerini belirlemek için belirli nöral lekeler sonrası hoc kullanarak. Bu mikroganglia, MPG ile karşılaştırıldığında nöronal popülasyonun sadece küçük bir kısmını meydana germe rağmen, onlar en yakın bulunan organlara giriş belirli türleri sağlayabilir. Burada ne bu mikroganglia ne de pelvik organlara seyahat etmek için MPG çıkan küçük sinir yollarının çok henüz geniş adlarını kabul sahip alanında bir sınırlama dikkat edin. Ayrıca, mikroganglia benzer ayrıntılı bir çalışma henüz kadın sıçanlarda yapılmıştır olmamıştır.
Özetle, burada sağlanan protokol ve şemalar, araştırmacılara pelvik organlara otonom sinir kaynağı sağlayan birincil yapıları ve lumboakral dorsal kökten duyusal sinirlerin başlıca periferik kanallarını incelemek için araçlar sağlar. leğen organlarına MPG ile seyahat ganglia.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Koşulları Rahatlatmak için Çevresel Aktiviteyi Teşvik Eden (SPARC) Programı, Ot2OD023872 Ödül Numarası Direktörü Ofisi tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Dr. Bertrand'ın Dr. Keast'in laboratuvarındaki bursu: Nîmes Üniversitesi Hastanesi, Montpellier-Nîmes Tıp Fakültesi, Derneği Française de Chirurgie (AFC), Société Interdisciplinaire Francophone d'Uro Avrupa Birliği'nin Yedinci Çerçeve Programı'nın (FP7/2007-2013) Dynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) ve Rea hibe anlaşması no PCOFUND-GA-2013-609102 uyarınca, Kampüs tarafından koordine edilen PRESTIJ programı ile İnsan Programı (Marie Curie Eylemleri) Fransa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
| Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
| Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
| Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
| Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| LED light source | Schott | KL 1600 | |
| Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |
References
- Greene, E. C. Anatomy of the Rat. , American Philosophical Society. Philadelphia, PA. (1935).
- Krinke, G. J. The Laboratory Rat. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. (2000).
- Keast, J. R. Pelvic ganglia. Autonomic Ganglia. McLachlan, E. M. , Harwood Academic. Luxembourg. 445-480 (1995).
- Keast, J. R. Unusual autonomic ganglia: connections, chemistry, and plasticity of pelvic ganglia. International Review of Cytology. 193, 1-69 (1999).
- Alsaid, B., et al. Coexistence of adrenergic and cholinergic nerves in the inferior hypogastric plexus: anatomical and immunohistochemical study with 3D reconstruction in human male fetus. Journal of Anatomy. 214 (5), 645-654 (2009).
- Keast, J. R., Smith-Anttila, C. J., Osborne, P. B. Developing a functional urinary bladder: a neuronal context. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 53 (2015).
- Purinton, P. T., Fletcher, T. F., Bradley, W. E. Gross and light microscopic features of the pelvic plexus in the rat. Anatomical Record. 175 (4), 697-705 (1973).
- Arellano, J., Xelhuantzi, N., Mirto, N., Hernández, M. E., Cruz, Y. Neural interrelationships of autonomic ganglia from the pelvic region of male rats. Autonomic Neuroscience. 217, 26-34 (2019).
- Greenwood, D., Coggeshall, R. E., Hulsebosch, C. E. Sexual dimorphism in the numbers of neurons in the pelvic ganglia of adult rats. Brain Research. 340 (1), 160-162 (1985).
- Nadelhaft, I., Booth, A. M. The location and morphology of preganglionic neurons and the distribution of visceral afferents from the rat pelvic nerve: a horseradish peroxidase study. Journal of Comparative Neurology. 226 (2), 238-245 (1984).
- Kessler, T. M., Birder, L. A., Gomery, P. Neuromodulation of urinary tract function. New England Journal of Medicine. 380 (21), 2067-2069 (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Intracardiac perfusion with fixative for anatomical studies [keast-001-stage02]. , https://www.protocols.io/view/intracardiac-perfusion-with-fixative-for-anatomica-w3ffgjn (2019).
- Keast, J. R., Osborne, P. B. Immunohistochemical analysis of ganglion neurons innervating the lower urinary tract [keast-001-stage03]. , https://www.protocols.io/view/immunohistochemical-analysis-of-ganglion-neurons-i-w3efgje (2019).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Keast, J. R., Booth, A., de Groat, W. C. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell and Tissue Research. 256 (1), 105-112 (1989).
- Dail, W. G., Minorsky, N. Composition of the pelvic nerve. Experimental Neurology. 92 (1), 278-283 (1986).
- Dail, W. G. The pelvic plexus: innervation of pelvic and extrapelvic visceral tissues. Microscopy Research and Technique. 35 (2), 95-106 (1996).
- Purves-Tyson, T. D., Arshi, M. S., Handelsman, D. J., Cheng, Y., Keast, J. R. Androgen and estrogen receptor-mediated mechanisms of testosterone action in male rat pelvic autonomic ganglia. Neuroscience. 148 (1), 92-104 (2007).
- Nangle, M. R., Keast, J. R. Semaphorin 3A inhibits growth of adult sympathetic and parasympathetic neurones via distinct cyclic nucleotide signalling pathways. British Journal of Pharmacology. 162 (5), 1083-1095 (2011).
- Tan, H., Mawe, G. M., Vizzard, M. A. Electrical properties of neurons in the intact rat major pelvic ganglion. Autonomic Neuroscience. 134 (1-2), 26-37 (2007).
- Park, K. S., et al. An alpha3beta4 subunit combination acts as a major functional nicotinic acetylcholine receptor in male rat pelvic ganglion neurons. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 452 (6), 775-783 (2006).
- Park, K. S., et al. Modulation of N-type Ca2+ currents by A1-adenosine receptor activation in male rat pelvic ganglion neurons. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299 (2), 501-508 (2001).
- Payne, S. C., Belleville, P. J., Keast, J. R. Regeneration of sensory but not motor axons following visceral nerve injury. Experimental Neurology. 266, 127-142 (2015).
- Nangle, M. R., Proietto, J., Keast, J. R. Impaired cavernous reinnervation after penile nerve injury in rats with features of the metabolic syndrome. Journal of Sexual Medicine. 6 (11), 3032-3044 (2009).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Specific targeting of ganglion cell sprouts provides an additional mechanism for restoring peripheral motor circuits in pelvic ganglia after spinal nerve damage. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7987-7995 (1998).
- Yan, H., Keast, J. R. Neurturin regulates postnatal differentiation of parasympathetic pelvic ganglion neurons, initial axonal projections, and maintenance of terminal fields in male urogenital organs. Journal of Comparative Neurology. 507 (2), 1169-1183 (2008).
- Ritter, K. E., Wang, Z., Vezina, C. M., Bjorling, D. E., Southard-Smith, E. M. Serotonin receptor 5-HT3A affects development of bladder innervation and urinary bladder function. Frontiers in Neuroscience. 11, 690 (2017).
- Tompkins, J. D., Girard, B. M., Vizzard, M. A., Parsons, R. L. VIP and PACAP effects on mouse major pelvic ganglia neurons. Journal of Molecular Neuroscience. 42 (3), 390-396 (2010).
- Forrest, S. L., Payne, S. C., Keast, J. R., Osborne, P. B. Peripheral injury of pelvic visceral sensory nerves alters GFRα (GDNF family receptor alpha) localization in sensory and autonomic pathways of the sacral spinal cord. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 43 (2015).
- Keast, J. R., Luckensmeyer, G. B., Schemann, M. All pelvic neurons in male rats contain immunoreactivity for the synthetic enzymes of either noradrenaline or acetylcholine. Neuroscience Letters. 196 (3), 209-212 (1995).
- Keast, J. R., de Groat, W. C. Immunohistochemical characterization of pelvic neurons which project to the bladder, colon, or penis in rats. Journal of Comparative Neurology. 288 (3), 387-400 (1989).
- Dail, W. G., Moll, M. A., Weber, K. Localization of vasoactive intestinal polypeptide in penile erectile tissue and in the major pelvic ganglion of the rat. Neuroscience. 10 (4), 1379-1386 (1983).
- Keast, J. R. A possible neural source of nitric oxide in the rat penis. Neuroscience Letters. 143 (1-2), 69-73 (1992).
- Kepper, M. E., Keast, J. R. Transmitter profile and spinal inputs of pelvic ganglion cells projecting with preganglionic axons along the hypogastric and pelvic nerves of the male rat. Neuroscience Letters. 280 (2), 123-126 (2000).
