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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60905
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands
* These authors contributed equally

Summary

Apresentado aqui é um procedimento stepwise para diferenciação in vitro de queratinócitos primários humanos por inibição de contato seguido de caracterização a nível molecular pela análise de RNA-seq.

Abstract

Os queratinócitos primários humanos são frequentemente usados como modelos in vitro para estudos sobre diferenciação epidérmica e doenças relacionadas. Métodos têm sido relatados para diferenciação in vitro de queratinócitos cultivados em modos submersos (2D) bidimensionais (2D) usando várias condições de indução. Descrito aqui é um procedimento para método de diferenciação de queratinócito in vitro 2D por inibição de contato e subsequente caracterização molecular por RNA-seq. Resumindo, os queratinócitos são cultivados em meio de queratinócito definido complementado com fatores de crescimento até que estejam totalmente confluentes. A diferenciação é induzida por contatos próximos entre os queratinócitos e estimulada pela exclusão dos fatores de crescimento no meio. Utilizando análises de RNA-seq, mostra-se que ambos os queratinócitos diferenciados exibem assinaturas moleculares distintas durante a diferenciação e 2) o padrão dinâmico de expressão genética se assemelha em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Quanto à comparação com a diferenciação normal de queratinócitos, os queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 apresentam morfologia alterada e assinaturas moleculares, consistentes com seus defeitos de diferenciação. Em conclusão, este protocolo detalha as etapas para a diferenciação de queratinócitos in vitro 2D e sua caracterização molecular, com ênfase na análise bioinformática dos dados RNA-seq. Como a extração de RNA e os procedimentos de RNA-seq foram bem documentados, não é o foco deste protocolo. O procedimento experimental de diferenciação de queratinócito in vitro e pipeline de análise bioinformática pode ser usado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.

Introduction

Os queratinócitos primários humanos derivados da pele humana são frequentemente usados como modelo celular para estudar a biologia da epiderme1,2,3,4. A estratificação da epiderme pode ser modelada pela diferenciação de queratinócitos, seja de forma monocamada submersa 2D ou no modelo organotípico 3D air-lift2,3,5,6,7. Embora os modelos 3D tenham se tornado cada vez mais importantes para avaliar a estrutura e a função epidérmica, os modelos de diferenciação 2D ainda são amplamente utilizados, devido à sua conveniência e à possibilidade de gerar um grande número de células para análises.

Várias condições têm sido aplicadas para induzir a diferenciação de queratinócitos em 2D, incluindo adição de soro, alta concentração de cálcio, menor temperatura e inibição dos receptores do fator de crescimento epidérmico2,3. Cada um desses métodos foi validado por uma série de genes marcadores de diferenciação de queratinacitos e mostrou-se eficaz na avaliação da diferenciação de queratinócitos, inclusive em condições patológicas. No entanto, essas condições de indução também mostram diferenças em sua eficiência de diferenciação e cinética quando painéis específicos de genes marcadores são examinados2,3.

Um desses métodos envolve a inibição do contato queratinócito e o esgotamento dos fatores de crescimento no meio da cultura8. Foi demonstrado que os queratinócitos podem se diferenciar espontaneamente quando as células atingem a densidade máxima.  A exclusão dos fatores de crescimento no meio da cultura pode aumentar ainda mais a diferenciação. O método que combina inibição de contato e esgotamento dos fatores de crescimento tem se mostrado para gerar queratinócitos diferenciados com padrões de expressão genética semelhantes à epiderme estratificada normal ao usar vários marcadores epidérmicos3,sugerindo que este modelo é adequado para estudar a diferenciação normal de queratinócitos. Recentemente, duas análises abrangentes de expressão genética da diferenciação de queratinócitos utilizando este modelo foramrelatadas 9,10. Os pesquisadores validaram esse modelo a nível molecular e mostraram que ele pode ser usado para estudar a diferenciação normal e doente do queratinócito.

Este protocolo descreve o procedimento para o método de diferenciação in vitro e análise molecular de células diferenciadas usando RNA-seq. Também ilustra a caracterização do transcriptome das células no dia 0 de diferenciação (estágio de proliferação), dia 2, dia 4 e dia 7 (diferenciação precoce, média e tardia, respectivamente). É mostrado que que queratinócitos diferenciados exibem padrões de expressão genética que se assemelham em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Para examinar se esse método pode ser usado para estudar a patologia da pele, aplicamos o mesmo pipeline experimental e de análise para investigar queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 derivados de pacientes com displasia ectodérmica e fissura/fissura (CEE)síndrome 11,12. Este protocolo se concentra na diferenciação in vitro de queratinócitos, bem como na análise bioinformática subsequente do RNA-seq. Outras etapas do procedimento completo, como extração de RNA, preparação de amostras de RNA-seq e construção de biblioteca, são bem documentadas e podem ser facilmente seguidas, especialmente quando se usa muitos kits comerciais comumente usados. Portanto, essas etapas são descritas apenas brevemente no protocolo. Os dados mostram que este gasoduto é adequado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.

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Protocol

Biópsias de pele foram retiradas do tronco de voluntários saudáveis ou pacientes com mutações p63, para configurar a cultura primária de queratinócitos. Todos os procedimentos relativos à criação de queratinócitos primários humanos foram aprovados pelo comitê ético do Centro Médico nijmegen da Universidade Radboud ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen"). O consentimento informado foi obtido.

1. Diferenciação de queratinócitos primários humanos por inibição de contato

  1. Prepare o meio de crescimento de queratinócito (KGM) do meio basal de querotinócito(Tabela de Materiais)quando necessário.
  2. Faça 500 mL de proliferação usando estoques pré-preparados (KGM-pro; veja Tabela 1).
  3. Faça um meio de diferenciação de 500 mL (KGM-dif; veja Tabela 2).
    NOTA: O KGM com suplementos pode ser mantido a 4 °C por duas semanas. Para maior armazenamento, ele pode ser aliquoado e armazenado a -20°C.
  4. Queratinócitos primários de sementes na densidade de 5,0-20 x 103 células/cm2,dependendo da capacidade de proliferação celular. Adicione o meio KGM-pro suficiente para cobrir as células.
    NOTA: 1) Detalhes da cultura celular regular dentro do meio KGM podem ser encontrados no site da Lonza13. 2) A densidade de semeadura deve ser testada para cada linha celular. Por exemplo, uma linha de queratinócitos primários normais pode ser semeada a uma densidade de 5,0 x 103 células/cm2, enquanto uma linha que carrega mutações no fator de transcrição p63 que seja menos proliferativa deve ser semeada a uma densidade de 20 x 103 células/cm2. 3) Dependendo da configuração experimental, vários pratos ou poços de células devem ser semeados para permitir a coleta de amostras em diferentes dias de diferenciação em réplicas.
  5. Refrescar as células com o meio KGM-pro por dois dias após a semeadura (semeadura no dia 0, refrescante pela1ª vez no dia 3). Depois, refresque com o meio KGM-pro a cada dois dias. Verifique as células regularmente, pelo menos a cada dois dias.
  6. Induzir a diferenciação celular quando as células são mais de 90% confluentes alterando o médio para KGM-dif. O dia de mudança de médio para KGM-dif é definido como diferencial dia 0. Coletar células para novas análises de RNA, primeiro lavando 2x com DPBS, depois adicionando o tampão de lise (de um kit de extração de RNA).
    NOTA: Com a densidade de semeadura acima mencionada, as células devem atingir confluência dentro de 7 a 10 dias. As células podem ser semeadas com uma densidade inicial maior para atingir a confluência mais cedo. Se as células não forem proliferativas, uma espera mais longa pode não dar origem a células totalmente confluentes. Uma maior densidade de semeadura pode ser necessária.
  7. Refrescar células com o meio KGM-dif todos os dias e coletar células no dia 2, 4. e 7 para extração adicional de RNA.

2. Extração de RNA

  1. Isolar o RNA total. Isso pode ser realizado usando um kit comercial de isolamento de RNA (como Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA) ou usando fenol14. No entanto, um kit de isolamento contendo um tratamento DNAse é altamente recomendado para amostras de RNA-seq para evitar contaminação de DNA e fenol. Um exemplo de kit comercial de isolamento de RNA é dado na Tabela de Materiais.
  2. Meça a concentração de RNA com um espectrômetro. Tanto o DNA quanto o RNA têm um pico de absorção de 260 nm.
    NOTA: 1) A razão entre as absorvâncias em 260 nm e 280 nm é utilizada para avaliar a pureza do RNA. Uma proporção de cerca de 2.0 é geralmente aceita como RNA 'pura'. Se a razão for substancialmente inferior a 2,0, a amostra pode estar contaminada com contaminantes que absorvem a 280 nm, como proteínas, fenóis ou outras substâncias. 2) A razão entre as absorvâncias em 260 nm e 230 nm mede a pureza do ácido nucleico. Espera-se uma razão entre 2,0 e 2,2. Se a razão for substancialmente menor, a amostra pode estar contaminada com contaminantes que absorvem a 230 nm, como EDTA, etanol ou outras substâncias.

3. Verificação de qualidade de RNA

  1. Execute o RNA em um chip RNA Pico bioanalyzer para validar o RNA Integrity Number (RIN) quantitativamente, ou em um gel para uma medida qualitativa. Em geral, um RIN de pelo menos oito é altamente aconselhável. No entanto, ao extrair RNA de tecidos, o RIN pode ser menor.
    NOTA: Opcionalmente, o controle de qualidade pode ser realizado por qPCR no material RNA.

4. Preparação da biblioteca RNA-seq

NOTA: A preparação da biblioteca RNA-seq é frequentemente realizada com um kit comercial ou em ambientes comerciais. O protocolo descrito é adaptado de um kit comercial, KAPA RNA HyperPrep Kit com RiboErase (Illumina), com uma breve descrição de todas as etapas necessárias: esgotamento do rRNA com hibridização oligo para RNAs ribossômicos humanos, fragmentação de RNA, síntese de primeira linha, síntese de segunda linha e cauda A, e limpeza após cada etapa15. Outros kits de preparação da biblioteca também podem ser usados para este fim. Recomenda-se realizar esta etapa usando um kit comercialmente disponível, pois a qualidade da biblioteca cDNA gerada é muitas vezes mais consistente. 2) As etapas a seguir são descritas para preparação da biblioteca 1x. Se preparar várias amostras, faça misturas mestras com 10% de volume extra.

  1. Hibridização do Oligo e esgotamento do rRNA
    1. Prepare o mix mestre de hibridização oligo (total = 11 μL, com 4,4 μL de tampão de hibridização, 4,4 μL de oligos de hibridização e 2,2 μL de água sem RNase) e mistura mestre de esgotamento (total = 5,5 μL, com 3,3 μL de tampão de esgotamento e 2,2 μL de RNase H).
    2. Configure o programa de reação PCR em um termociclador: 95 °C por 2 min; rampa para baixo para 45 °C a -0,1 °C/s; Pausa de 45 °C; 45 °C por 30 min; 4 °C para sempre.
      NOTA: Considere começar com o dobro da quantidade de RNA do que o necessário para amplificação. Na primeira tentativa, use metade da quantidade para continuar com os seguintes passos. Isto é para garantir que ainda haja material para repetir essas etapas com um número diferente de ciclos (ver passo 4.7.2), se os ciclos de amplificação se tornarem insuficientes ou superamplificados.
    3. Use entre 25 ng e 1 μg de RNA total em 10 μL de água livre de RNAse, adicione 10 μL de mistura mestre de hibridização oligo. Coloque amostras no termociclador pré-programado e inicie o programa.
    4. Quando o programa atingir a etapa de pausa a 45 °C, adicione 5 μL de mistura mestre de esgotamento à reação de hibridização de 20 μL sem removê-la do termociclizador. Misture bem por pipetting para cima e para baixo várias vezes.
    5. Retome o programa termociclador para continuar com a etapa de esgotamento (45 °C por 30 min).
      NOTA: 1) Coloque as contas para esgotamento do rRNA (por exemplo, contas puras KAPA) à temperatura ambiente (RT) durante a etapa de esgotamento para a próxima parte do protocolo. 2) Considere preparar a mistura mestre de digestão DNase (para a seção 4.2), uma vez que os reagentes são necessários diretamente após a limpeza do esgotamento do rRNA.
    6. Realize uma limpeza kapa pure beads baseada em 2,2x: combine a mistura de RNA (25 μL) e KAPA Pure Beads (55 μL), resuspensando completamente as contas na mistura de RNA por pipetar para cima e para baixo várias vezes.
    7. Incubar em RT por 5 minutos para permitir a ligação de RNA às contas, e colocar o tubo em um rack de ímã para capturar as contas até que o líquido esteja limpo, e remover cuidadosamente e descartar 60 μL de supernadante.
    8. Mantendo o tubo no ímã, lave 2x com 200 μL de 80% de etanol incubando as contas com o etanol por ≥30 s e descarte o etanol. Tente remover todo o etanol residual sem perturbar as contas após a segunda lavagem.
    9. Seque as contas em RT por 3-5 min ou até que todo o etanol tenha evaporado.
      NOTA: A secagem excessiva das contas pode resultar em redução do rendimento.
  2. Digestão DNase
    1. Prepare o mix mestre de digestão DNase (total = 22 μL, com 2,2 μL de tampão DNase, 2 μL de DNase e 17,8 μL de água sem RNase) .
    2. Resuspende as contas na mistura mestre de digestão DNAse (20 μL) por pipetar para cima e para baixo várias vezes. Incubar o tubo em RT por 3 minutos para tirar o RNA das contas.
    3. Coloque o tubo em um rack de ímã para capturar as contas, até que o líquido esteja limpo, e transfira cuidadosamente 20 μL de supernasce para um tubo limpo.
    4. Incubar o tubo com sobrenaante a 37 °C por 30 min.
      NOTA: Considere preparar as misturas mestres de elução, fragmentação e escoramento de RNA (para a seção 4.3), uma vez que os reagentes são diretamente necessários após a limpeza da digestão DNase.
    5. Realize uma limpeza baseada em contas de 2,2x seguindo 4.1.6-4.1.9.
  3. Elução de RNA, fragmentação e escoramento
    1. Prepare a mistura mestre Fragment, Prime e Elute Buffer (1x) com 11 μL de Buffer Fragment, Prime e Elute (2x) e 11 μL de água sem RNase.
    2. Resuspenque minuciosamente as contas com RNA purificado, tratado de DNase em 22 μL de Fragmentação, Prime e Elute Buffer (1x) por pipetação para cima e para baixo várias vezes.
    3. Incubar à temperatura ambiente por 3 minutos para elute RNA foradas contas, em seguida, coloque o tubo(s) em um ímã para capturar as contas até que o líquido esteja limpo.
    4. Transfira cuidadosamente 20 μL de supernante em um tubo(s). Descarte o tubo com contas.
      NOTA: Este é um ponto de parada seguro, pois as amostras podem ser armazenadas a -20 °C por ≤24 h.
    5. Coloque o tubo em um termociclador e realize a fragmentação e a escoração a 94 °C por 6 minutos. Resultando em fragmentos aproximados de 200-300 bp longos.
      NOTA: Incubar por 8 min a 94 °C para fragmentos de 100 a 200 bp. Ao usar RNA parcialmente degradado, fragmento entre 1-6 min a 85 °C, dependendo da gravidade da degradação.
    6. Coloque o tubo no gelo e prossiga imediatamente para a síntese do primeiro fio.
  4. Síntese do primeiro fio
    1. Prepare a primeira mistura mestre de síntese de fios (total = 12 μL, com 11 μL de tampão de síntese de primeira linha e 1 μL de script KAPA).
    2. Configure o programa de reação PCR em um termociclador: 25 °C por 10 min; 42 °C por 15 min; 70 °C por 15 min; 4 °C para sempre.
    3. No gelo, combine 20 μL de RNA fragmentado com 10 μL de primeira mistura mestre de síntese de fios. Mantenha o tubo no gelo, misture bem ao escoar suavemente a reação várias vezes.
    4. Coloque o tubo no termociclador pré-programado e inicie o programa.
  5. Síntese de segunda vertente e A-tailing
    1. Prepare a síntese do segundo fio e a mistura mestre de cauda A no gelo (total = 33 μL, com 31 μL de tampão de síntese de segundo fio e 2 μL de mistura de enzimas de segunda linha e a cauda).
    2. Configure o programa de reação PCR em um termociclador: 16 °C por 30 min; 62 °C por 10 min; 4 °C para sempre.
    3. Combine 30 μL do produto de síntese do primeiro fio com 30 μL de segunda síntese de fios e mistura mestre de cauda A, e misture bem por pipetar várias vezes no gelo.
    4. Coloque o tubo no termociclador pré-programado e inicie o programa.
  6. Ligadura adaptador e limpeza pós-ligadura
    1. Adaptadores de estoque diluídos (códigos de barras de DNA NEXTflex, 25 μM) 3,57x em água sem RNase a 7 μM.
    2. Prepare o mix mestre de ligadura adaptador (total = 50 μL, com 40 μL de tampão de ligadura e 10 μL de ligadura de DNA).
    3. Combine 60 μL do produto de síntese de segunda linha, 45 μL de mix mestre de ligadura adaptador e 5 μL de adaptadores diluídos. Misture bem por pipetting para cima e para baixo várias vezes no gelo.
    4. Incubar os tubos a 20 °C por 15 min e continuar imediatamente com a primeira limpeza pós-ligadura.
    5. Realize uma limpeza à base de contas de 0,63x combinando DNA ligado por adaptador (110 μL) e contas puras KAPA (70 μL), em seguida, resuspenque minuciosamente as contas na mistura de DNA, pipetando para cima e para baixo várias vezes.
    6. Repetição de passos 4.1.7-4.1.9.
    7. Remova os tubos do ímã. Resuspense completamente as contas em 50 μL de 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5) e incubar as contas em RT por 2 min.
    8. Coloque a placa sobre o ímã e espere até que o líquido esteja limpo. Transfira 50 μL do supernanato claro para um novo tubo.
      NOTA: Ponto de parada seguro por menos de 24h a 4 °C.
    9. Realize uma limpeza baseada em contas de 0,7x combinando 50 μL de contas com DNA purificado ligado a adaptador com 35 μL de solução PEG/NaCL. Misture bem pelo vórtice.
    10. Realizar as etapas de limpeza 4.1.7-4.1.9. Resuspense completamente as contas em 20 μL de 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5), e incubar as contas em RT por 2 min.
    11. Coloque a placa no ímã; espere até que o líquido esteja limpo. Transfira 20 μL do supernanato claro para um novo tubo e prossiga para a seção 4.7.
      NOTA: Ponto de parada seguro por menos de 1 semana a 4 °C ou menos de 1 mês a -20 °C.
  7. Ampliação e limpeza da biblioteca
    1. Prepare o mix mestre de amplificação da biblioteca (total = 33 μL, com 27,5 μL de 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix e 5,5 μL de 10x mix de primer de amplificação da biblioteca).
    2. Configure o programa de reação PCR em um termociclador usando os seguintes parâmetros. 98 °C para 45 s; N ciclos (veja a nota abaixo) de: 98 °C para 15 s; 60 °C para 30 s; 72 °C para 30 s; 72 °C por 1 min; e 4 °C para sempre.
      NOTA: Os ciclos para a amplificação da biblioteca dependem do material de entrada. Pode ser estimado como tal: começando com RNA = 25-100 ng, N = 11-15 ciclos; 100-250 ng, N = 9-12 ciclos; 250-500 ng, N = 7-10 ciclos.
    3. Realize uma limpeza à base de contas de 0,8x combinando DNA de biblioteca amplificada (50 μL) e contas puras KAPA (40 μL), em seguida, resuspenque minuciosamente as contas na mistura de DNA, pipetando para cima e para baixo várias vezes.
    4. Realizar as etapas de limpeza 4.1.7-4.1.9. Resuspense completamente as contas em 50 μL de 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5), e incubar as contas em RT por 2 min.
    5. Transfira 50 μL do supernanato claro para um novo tubo e prossiga para a segunda limpeza de amplificação da biblioteca.
    6. Realize uma limpeza baseada em contas 1x combinando DNA de biblioteca amplificada (50 μL) e contas puras KAPA (50 μL), em seguida, resuspende completamente as contas na mistura de DNA por pipetting para cima e para baixo várias vezes.
    7. Realizar as etapas de limpeza 4.1.7-4.1.9. Resuspense completamente as contas em 22 μL de 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5), e incubar as contas em RT por 2 min.
    8. Transfira 20 μL do supernanato claro para um novo tubo proceder às medições de Qbit e bioanalzer.
  8. Tamanho de concentração e fragmentação
    1. Meça as concentrações de DNA das amostras. Usando um kit à base de corante fluorescente altamente sensível (por exemplo, Denovix Qbit, consulte Tabela de Materiais), ou se a concentração parece estar abaixo de 0,5 ng/μL, requantify usando uma abordagem qPCR mais sensível (por exemplo, Quantificação Kappa, ver Tabela de Materiais).
    2. Determine o tamanho do fragmento da biblioteca, usando eletroforese altamente sensível (por exemplo, um bioanalílise).
      NOTA: Opcionalmente, o controle de qualidade por qPCR pode ser realizado antes do sequenciamento (apêndice) usando uma biblioteca preparada diluída em vez de cDNA.
  9. Seqüenciamento
    1. Envie a biblioteca para sequenciar. Para a análise da expressão genética diferencial RNA-seq, uma profundidade de sequenciamento de leituras entre 10-25 milhões por amostra é geralmente suficiente.

5. Pré-processamento de dados

  1. Verificação de qualidade Arquivos Fastq
    1. Baixe e instale trimgalore16 para remover pares de base de baixa qualidade e leituras vazias dentro dos arquivos Fastq.
      NOTA: 1) A maioria dos softwares mencionados aqui só funciona no Linux. Se limitado a um computador Windows, é possível executar análises em um servidor Linux usando o software MobaXterm ou Putty. Tenha em mente que para a indexação do genoma é necessário muita memória de acesso aleatório (RAM) (cerca de 64 GB). 2) A instalação de todos os softwares necessários em um ambiente conda é altamente recomendável. Isso permitirá fácil instalação de software e gerenciamento de pacotes. Para obter mais informações sobre conda, visite .
    2. Crie um diretório (pasta) para os dados, por exemplo, a pasta 'RNA_seq_KC_diff'. Defina isso como o diretório de trabalho digitando: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      NOTA: Para uma visão geral da estrutura da pasta, consulte 'folder_structure.txt' nos arquivos de codificação suplementar.
    3. Crie várias pastas no diretório de trabalho com os nomes específicos: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts' e 'Mapping'.
    4. Mova os arquivos fasta dos dados sequenciados para a pasta fastq. Alternativamente, gere links suaves usando o comando: "ln –s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" para os arquivos Fastq para economizar espaço em disco.
    5. Execute o galore de Trim nos arquivos Fastq, consulte o arquivo TrimGalore.txt para que o código copie colado em bash. Altere nomes e configurações da pasta dentro do comando, quando necessário.
  2. Mapeamento
    1. Baixe um genoma para mapear as leituras para, por exemplo, hg38 ensembl versão 97 (versão desmascarada): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; e o arquivo de anotação genética correspondente: hg 38 gene anotação ensembl liberação 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Transferir ambos os arquivos para a pasta CRCh38_fasta.
      NOTA: Alternativamente, use uma versão diferente do genoma, por exemplo, a versão UCSC do hg38, se o mapeamento para IDs de transcrição em vez de IDs de genes é preferido.
    2. Instale o STAR 2.7.117.
    3. Gere um genoma de referência interna usando o STAR 2.7.1 pelo script de genoma de geração (ver Arquivos de Codificação Suplementar). Altere a quantidade de threads para o que o processador tem (--runThreadN X). Altere nomes e configurações de pastas neste script quando necessário. Executá-lo copiando/colando em bash.
    4. Instale samtools 1.918 para indexar os arquivos bam e gzip para comprimir os arquivos de agitação.
    5. Alinhar o sequenciamento validado Trim Galore lê-se para o conjunto de genoma humano hg38 (ensembl release 97) usando STAR 2.7.1 seguido de indexação usando samtools e gzip. Isso deve ser realizado usando o script map_fastq.txt (ver Arquivos de Codificação Suplementar). Altere os nomes e configurações da pasta neste script quando necessário. Execute-o copiando/colando em bash.
      NOTA: O mapeamento STAR gera vários arquivos de saída, incluindo um arquivo bam, um arquivo de movimento e uma tabela de contagens de leitura chamada *_ReadsPerGene.out.tab, que pode ser usada diretamente concatenada por R para usar como entrada para Deseq2.
  3. Visualização do navegador genoma
    1. Instale wigToBigWig a partir das ferramentas de navegador de genoma da UCSC para gerar arquivos bigwig com o script big2bw19.
    2. Transfira os arquivos 'convertBigWigChroms.py' e 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' dos arquivos de codificação suplementar para uma pasta 'scripts' no diretório de trabalho.
    3. Torne a convertBigWigChroms.py executável (usando o comando: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' em uma máquina Linux).
    4. Gerar arquivos bigWig a partir dos arquivos Wiggle, usando o script wig2bw.txt (ver Arquivos de Codificação Suplementar). Executá-lo copiando/colando em bash.
    5. Insira os arquivos BigWig no navegador de genoma UCSC ou visualizador de genômica integrativa (IGV) para visualização.

6. Análise de dados RNA-seq

  1. Dados de amostra de entrada no Deseq2
    1. Baixe e instale rstudio (versão 1.1.456) e R (versão 3.6).
    2. Instale todos os pacotes R necessários (consulte arquivos de codificação suplementar).
      NOTA: Para obter um arquivo R-markdown detalhado que mostra todo o código de programação e saída, consulte os arquivos anexados: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" e "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". Uma descrição geral de todas as etapas está incluída abaixo.
    3. Gere uma tabela de contagem a partir dos arquivos ReadsPerGene.out.tab.
    4. Escreva um arquivo de dados de amostra, contendo todos os nomes de arquivos, o dia da diferenciação e outros dados de amostra relevantes. Para obter um exemplo de arquivo de exemplo, consulte "sample_data_example.csv" nos arquivos de codificação suplementar.
    5. Use a tabela de contagem e os dados da amostra para gerar um objeto Deseq220 contendo os dados contáveis e amostrais.
  2. Normalização da expressão genética, distância amostral e PCA
    1. Normalize a tabela de contagem no objeto Deseq2, usando deseq2 rld ou normalização vst. A normalização de RLD é preferida, mas com muitas amostras, a normalização do VST é muito mais rápida.
    2. A distância da amostra de plotagem com base nas intensidades de contagem de leitura normalizadas usando a função "dist" em R e, posteriormente, realizando agrupamento "hclust" com base na distância da amostra. Plote o mapa de calor em si usando o pacote de fenoatmap.
    3. Gere um gráfico PCA das intensidades de contagem de leitura normalizadas usando a função plotPCA do Deseq2.
      NOTA: O PCA atua como uma ferramenta na análise exploratória de dados e pode ser usado para visualizar a distância e a relatividade entre diferentes amostras.
  3. Análise diferencial/altamente variável da expressão genética
    1. Calcule os genes diferenciais usando a função de resultado Deseq2. No entanto, ao avaliar mudanças ao longo de vários pontos de tempo em que comparações pareiras não são aplicáveis, use genes altamente variáveis. Neste caso, extraia os 500 genes altamente variáveis através do pedido sobre a variância entre amostras de diferentes pontos de tempo com a função rowVars.
      NOTA: Em nossa análise, para as amostras de controle, foram utilizados os 500 genes altamente variáveis (os genes com maior desvio padrão de sua intensidade normalizada em dias de diferenciação) para análise posterior. No entanto, para a análise doente vs controle, os genes expressos diferencialmente entre a doença e os controles saudáveis ao longo do tempo foram calculados pelo Deseq2 usando um múltiplo valor p corrigido de 1 x 10-4 como um corte. Outra possível etapa de filtragem é excluir genes diferenciais que mudam menos do que um certo corte de alteração de dobra.
    2. Realize os kmeans agrupando-se nos genes diferenciais ou altamente variáveis para agrupar-os por diferentes padrões de expressão.
    3. Visualize genes diferenciais ou altamente variáveis em um mapa de calor usando o pacote de fenoatmap. A intensidade traçada no mapa de calor é a intensidade normalizada do Deseq2 com o valor mediano subtraído.
  4. Análise de enriquecimento de anotações de Gene Ontology (GO)
    1. Gere uma lista de genes de fundo expressos tirando todos os genes com mais de 10 contagens em uma única amostra.
    2. Realize a análise go usando ferramentas on-line como gOrilla21. Use as listas dos genes diferenciais/altamente variáveis em clusters como "lista genética", e os genes de fundo como pano de fundo para comparação.
      NOTA: Usuários de R mais avançados podem usar o cluster de pacoteProfiler22 para automatizar a análise de enriquecimento a prazo go.

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Representative Results

Diferenciação normal de queratinócitos e análise RNA-seq
Neste experimento, foram utilizadas linhas de queratinócitos derivadas de cinco indivíduos para diferenciação e análises de RNA-seq. A Figura 1 resume o procedimento experimental de diferenciação e os resultados da análise do RNA-seq. Uma visão geral dos procedimentos de diferenciação in vitro de queratinócitos normais e mudanças de morfologia celular durante a diferenciação são ilustradas na Figura 1A. A análise de componentes de princípio (PCA) mostrou que os queratinócitos submetidos à diferenciação tinham perfis de expressão genética global conectados, mas distintos (Figura 1B). Genes altamente variáveis foram agrupados por kmeans para visualizar dinâmicas e padrões de expressão genética durante a diferenciação (Figura 1C).

Cada conjunto de genes foi representado pelos genes da marca de diferenciação queratinada (por exemplo, KRT5 para proliferação, KRT1 e KRT10 para diferenciação precoce e média, e IVL/LOR/FLG para diferenciação tardia). A análise de anotação da ontologia genética (GO) de aglomerados genéticos altamentevariáveis (Figura 1C) mostrou uma clara diferença nas funções genéticas desses aglomerados genéticos (por exemplo, queratinização nos estágios médios de diferenciação; e diferenciação celular epidérmica, diferenciação de queratinas e ligação cruzada de peptídeos nos estágios finais; Figura 1D). A expressão proteica de vários marcadores de diferenciação foi medida pela mancha ocidental(Figura 1E).

Diferenciação de queratinócitos mutantes P63 e análise RNA-seq:
No segundo experimento, as diferenças de morfologia celular e expressão genética foram comparadas entre os queratinócitos de controles saudáveis e três linhas derivadas de pacientes portadores de mutações p63 (mutantes R204W, R279H e R304W). A Figura 2A mostra uma visão geral dos procedimentos de diferenciação e das mudanças de morfologia celular. Os queratinócitos mutantes permaneceram planos na superfície do prato e não se tornaram lotados ou se sobrepõem ao crescimento como queratinócitos de controle no dia 7.

Na análise do PCA, as linhas de células de controle seguiram claramente um padrão de diferenciação, em comparação com a Figura 1B. No entanto, o padrão de expressão genética das células mutantes durante a diferenciação permanece em grande parte semelhante aos de células proliferadoras/indiferenciadas. Entre as três linhas mutantes, diferenciando amostras de R279 se moveram ao longo de PC1 e PC2 até certo ponto, indicando que sua diferenciação foi menos prejudicada, em comparação com R204W e R304W.

Na análise de clustering(Figura 2C),os genes regulados nas células de controle (cluster 1) foram parcialmente rebaixados em R204W e R279W, mas sua expressão genética não foi drasticamente alterada em R304W. Esses genes provavelmente desempenham papéis na proliferação celular, como mostra a anotação go(Figura 2D). No cluster 2 (Figura 2C),os genes foram induzidos pela primeira vez e posteriormente regulados em células de controle. Esses genes provavelmente estão envolvidos na diferenciação de queratinócitos, uma vez que as funções de diferenciação epidérmica e queratinização foram altamente enriquecidas para esses genes de cluster(Figura 2D). Esses genes não foram induzidos em R204W e R304W, enquanto nas células R279H, esses genes foram induzidos, mas não desregulamentados tanto quanto as células de controle.

Genes no cluster 3 só foram induzidos no final da diferenciação nas células de controle(Figura 2D). Consistentes com isso, esses genes podem ter um papel na camada mais externa da epiderme, pois têm se mostrado responsivos a estímulos externos e inflamação(Figura 2D). O padrão de expressão desses genes não mudou muito nas três linhas celulares mutantes. As diferenças visíveis nos padrões de expressão genética entre controle e células mutantes demonstram que as células mutantes não podem se diferenciar adequadamente nesses modelos de diferenciação in vitro.

Figure 1
Figura 1: Diferenciação e análise de queratinócitos. (A) Visão geral do protocolo de diferenciação de queratinacitos e morfologia celular. Barra de escala = 100 μm. (B) Análise de componentes de princípio dos queratinócitos de controle diferenciado. (C) Mapa de calor dos 500 genes altamente variáveis durante a diferenciação de queratinócitos. Genes são agrupados em três aglomerados usando agrupamentos de kmean. Genes marcadores de diferenciação representativos para cada aglomerado genético são indicados ao lado. (D) Análise de enriquecimento de termo go de funções superrepresentadas para genes nos aglomerados genéticos altamente variáveis, em comparação com um fundo de todos os genes expressos (contagens de >10). GOrilla foi usada para o teste de enriquecimento. (E) Mancha ocidental de marcadores de diferenciação de queratinócitos durante a diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparação do controle e queratinócitos mutantes p63. (A) Visão geral do protocolo de diferenciação de queratinócitos e morfologia celular de controle e queratinócitos mutantes p63. Escala = 100 μm. (B) Análise de componentes de princípio do controle diferenciador e do paciente (R204W, R279H & R304W). (C) Mapa de calor de genes diferenciais entre o controle e os queratinócitos mutantes. Genes são agrupados em três aglomerados usando agrupamentos de kmean. São indicados genes marcadores de diferenciação representativos para cada aglomerado genético. (D) Análise de enriquecimento de termo go de funções superrepresentadas para genes nos aglomerados genéticos altamente variáveis, em comparação com um fundo de todos os genes expressos (contagens de >10). GOrilla foi usada para o teste de enriquecimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componente KGM Estoque Média Volume
Kbm 500 mL
Caneta/Estreptococos 100.000 unidades/mL 100 unidades/mL 5 mL
BPE ~13 mg/mL 0.4% 2 mL
Etanolamina 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosfoetanolamina 0,1 M 0,1 mM 500 μL
Hidrocortisona 0,5 mg/mL 0,5 μg/mL 500 μL
Insulina 5 mg/mL 5 μg/mL 500 μL
Feg 10 μg/mL 10 ng/mL 500 μL

Mesa 1. Suplementos médios KGM-pro.

Componente KGM Estoque Média Volume
Kbm 500 mL
Caneta/Estreptococos 100.000 unidades/mL 100 unidades/mL 5 mL
Etanolamina 0,1 M 0,1 mM 500 μL
o-fosfoetanolamina 0,1 M 0,1 mM 500 μL

Mesa 2. Suplementos médios KGM-diff.

Arquivos de codificação suplementar: Folder_structure.txt; Generate_genome.txt. Map_fastq.txt. RNA_seq_kc_differentiation_patient.html. RNA_seq_kc_differentiation_wt.html; Sample_data_example.csv; TrimGalore.txt; e Wig2bw.txt. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Este trabalho descreve um método para induzir a diferenciação de queratinócitos humanos e a caracterização subsequente utilizando análises de RNA-seq. Na literatura atual, muitos estudos sobre diferenciação de queratinócitos humanos utilizam dois outros métodos, com alta concentração de cálcio ou com soro como métodos para induzir diferenciação2,3,23. Um relatório anterior comparou cuidadosamente esses três métodos diferentes3 e mostrou que esses métodos podem representar biologia distinta da diferenciação de queratinócitos. Neste mesmo relatório, os autores mostraram que as células diferenciadas induzidas pelo soro têm alto potencial proliferativo e expressam genes como KRT16 e SKALP/PI3 que se expressam na pele da psoríase, mas não em epiderme normal, e que, portanto, o modelo de diferenciação induzido pelo soro pode ser usado para estudar psoríase. Em contraste, o método de inibição de contato mais a exclusão do fator de crescimento pode induzir KRT1 e KRT10, que normalmente são expressos na epiderme e se assemelham à diferenciação normal de queratinócitos. A alta indução de cálcio dá origem a um perfil de expressão genética que está entre indução de soro e inibição de contato, como o método menos específico. As análises utilizando análises de RNA-seq durante a diferenciação confirmaram que o método de inibição de contato mais a exclusão do fator de crescimento resulta em queratinócitos diferenciados com perfis de expressão genética semelhantes aos esperados para diferenciação epidérmica (por exemplo, KRT5 em células proliferadoras, KRT1 e KRT10 na indução de diferenciação precoce, e LOR e FLG em diferenciação tardia; Figura 1C).

Esses achados demonstram que essa técnica de diferenciação é um método fácil de usar e confiável para estudar a diferenciação de queratinócitos. Além disso, este trabalho sobre queratinócitos derivados de queratinócitos mutantes p63 também mostram que o método pode ser usado para estudar a diferenciação de queratinócitos afetados em condições doentes. Nesta abordagem de diferenciação in vitro, é utilizada a KGM comprada da Lonza, pois este meio produz resultados consistentes. Em princípio, outro meio epidérmico com composição semelhante, como o meio sem soro de queratinócito (KSFM) da Thermo Fisher Scientific também é provavelmente adequado, embora isso precise ser testado.

Deve-se notar que este método tem algumas limitações. Como se baseia na inibição do contato, a confluência da densidade celular é necessária. Em nossos experimentos com queratinócitos mutantes p63, uma maior densidade inicial de semeadura tem sido necessária para garantir que as células alcancem a confluência. Além disso, quando as células não crescem com a mesma velocidade, a diferenciação às vezes deve ser induzida em dias diferentes. Essas considerações devem ser levadas em conta na criação de experimentos. Em ambientes experimentais onde as células precisam ser induzidas ao mesmo tempo, outros métodos de diferenciação devem ser considerados, incluindo adição de soro, altas concentrações de cálcio e inibição dos receptores do fator de crescimento epidérmico2,3. No entanto, todos os métodos de diferenciação in vitro possuem prós e contras, pois provavelmente representam sinais de indução de diferenciação parcial que estão presentes durante o desenvolvimento da pele in vivo2.

Uma análise molecular abrangente que compare esses diferentes métodos será altamente informativa e pode instruir a escolha do método mais adequado para diferentes estudos sobre processos biológicos. Além disso, a validação de alterações medidas no nível transcriptômico é altamente aconselhável, por exemplo, através de análises de manchas ocidentais ou proteômicas. Além disso, os dados in vitro devem ser usados com cautela, e as conclusões desses modelos devem ser validadas in vivo, preferencialmente no desenvolvimento da pele humana.

Os princípios básicos da extração de RNA e da preparação da biblioteca RNA-seq foram bem descritos anteriormente24,25,26,27,28. Neste protocolo, os procedimentos de extração de RNA e preparação da biblioteca RNA-seq são baseados em fluxos de trabalho de kits disponíveis comercialmente. Em princípio, diferentes métodos para extração de RNA não devem ter uma grande influência nas análises do RNA-seq se a qualidade do RNA for boa. Nos casos em que a qualidade do RNA é ruim (ou seja, quando o RNA é extraído tecidos incorporados para parafina fixas por formalina), o RNA-seq ainda pode ser realizado; no entanto, a etapa de fragmentação do RNA deve ser ajustada. A preparação da biblioteca RNA-seq abrange desde a remoção do RNA ribossômico (rRNA) até a construção da biblioteca cDNA para sequenciamento. Os principais procedimentos podem ser realizados utilizando-se vários kits, ou utilizando enzimas individuais e tampões caseiros29,30,31,32. Deve-se notar que, se a análise do RNA-seq for realizada utilizando diferentes princípios básicos (por exemplo, tanto o esgotamento do RNA ribossômico quanto o enriquecimento de mRNA poliA por hibridização para oligos poliT), o resultado das análises de RNA-seq pode diferir. Além disso, o protocolo utiliza a remoção do RNA ribossômico por hibridização de oligos de DNA para rRNA humano, rato e rato. Ao trabalhar com diferentes espécies, deve-se empregar um conjunto alternativo de oligo.

O sequenciamento da biblioteca gerada pode ser realizado em ambas as extremidades dos fragmentos (extremidade emparelhada) ou em uma extremidade do fragmento (extremidade única). Em geral, o sequenciamento final emparelhado melhora consideravelmente a capacidade de aplicação e fornece mais informações sobre variantes de transcrição. No entanto, para uma análise genética diferencial relativamente simples como descrito aqui, o sequenciamento de extremidade única também pode fornecer informações suficientes.

Para o importante passo da análise de dados, um método relativamente simples para controle de qualidade dos arquivos fastq é descrito, seguido de leituras de mapeamento para o genoma. Embora o código bash fornecido não tenha escalabilidade ideal, ele tem a vantagem da transparência. A escolha do software, quais etapas ele executa, e a versão do genoma usado durante o pré-processamento de dados são todas etapas nãotriviais que devem ser bem documentadas, o que é essencial para a repetibilidade.

Para usuários mais avançados, um pipeline automatizado pode ser usado para executar as etapas de verificação de qualidade de arquivo fastQ, aparamento e mapeamento do adaptador, por exemplo, o fluxo de trabalho ARMOR snakemake33 ou o fluxo de trabalho 'RNA-seq' Snakemake do laboratório van Heeringen34. No entanto, esses gasodutos completamente automatizados são menos transparentes e mais difíceis de mudar. Ao usar essas ferramentas, é vital entender as funções dentro desses pipelines automatizados. Finalmente, o protocolo inclui a análise de dados RNA-seq com ênfase na expressão genética variável ao longo do tempo. A expressão genética variável é preferida em relação ao teste diferencial em pares ao olhar para processos com vários pontos de tempo, como diferenciação. Em conclusão, este pipeline de análise introduz ferramentas relevantes para análise bioinformática dos dados rnaseq. Contém ferramentas que podem avaliar minuciosamente a diferenciação de queratinócitos, tanto em condições normais quanto doentes.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Bolsa da Universidade Radboud (H.Z.); e bolsa do Conselho de Bolsas chinês 201406330059 (J.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioanalyzer 2100 Agilent G2929BA
Bovine pituitary extract (BPE) Lonza Part of the bulletKit
CFX96 Real-Time system Bio-Rad qPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537
Epidermal Growth Factor (EGF) Lonza Part of the bulletKit
Ethanolamine >= 98% Sigma-Aldrich E9508
High Sensitivity DNA chips Agilent 5067-4626
Hydrocortison Lonza Part of the bulletKit
Insulin Lonza Part of the bulletKit
iQ SYBR Green Kit BioRad 170-8886
iScript cDNA synthesis Bio rad 1708890
KAPA Library Quant Kit Roche 07960255001 Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase Roche KK8540 RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Nanodrop deNovix DS-11 FX (model) Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24 Illumnia NOVA-514103 6 bp long primers
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
RNA Pico Chip Agilent 5067-1513

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References

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