Summary
Daha önce bir nanopore sıralama platformu üzerinde amplicon tabanlı tüm genom Usutu virüsü (USUV) sıralama için bir protokol doğruladı. Burada, daha ayrıntılı olarak kullanılan yöntemleri açıklar ve nanopore R10 akış hücresinin hata oranını belirleriz.
Abstract
Tüm genom dizilimi viral salgınları karakterize etmek ve izlemek için kullanılabilir. Nanopore tabanlı tüm genom dizileme protokolleri birkaç farklı virüs için tanımlanmıştır. Bu yaklaşımlar, belirli bir virüsü veya genetik olarak ilişkili virüs grubunu hedeflemek için kullanılabilecek örtüşen amplikon temelli bir yaklaşım kullanır. Virüs varlığının teyidine ek olarak, dizileme genomik epidemiyoloji çalışmaları için, virüsleri izlemek ve kökeni, rezervuarları ve bulaşma modlarını çözmek için kullanılabilir. Bu tür uygulamalar için, kullanılan platformile ilişkili hata oranının olası etkilerini anlamak çok önemlidir. Klinik ve genel sağlık ortamlarında rutin uygulama, protokoldeki her önemli değişiklikle belgelenmeyi gerektirir. Daha önce, nanopore sıralama platformunda tüm genom Usutu virüs dizilimi için bir protokol (R9.4 flowcell) Illumina sıralama doğrudan karşılaştırıldığında doğrulandı. Burada, R10 akış hücresi ile Illumina dizilimi arasındaki karşılaştırmayı örnek olarak kullanarak gerekli okuma kapsamını belirlemek için kullanılan yöntemi açıklıyoruz.
Introduction
Üçüncü nesil dizi teknolojilerinde hızlı gelişmeler, viral salgınlar sırasında gerçek zamanlı sıralamaya yakın bir şekilde ilerlememizi sağlar. Genetik bilginin bu zamanında kullanılabilirliği viral patojenlerin kökeni ve evrimini belirlemek için yararlı olabilir. Ancak yeni nesil sıralama alanlarında altın standartlar, hala ikinci nesil sequencers vardır. Bu teknikler, emülsiyon PCR veya klonal köprü amplifikasyonu sırasında klonal amplifikasyon gibi belirli ve zaman alıcı teknikler kullanır. Üçüncü nesil sequencers ucuz, el ve basitleştirilmiş kütüphane hazırlama metodolojileri ile birlikte gelir. Özellikle sıralı cihazın küçük boyutu ve düşük satın alma fiyatı onu konuşlandırılabilir, alana uygun sıralama için ilginç bir aday yapar. Bu örneğin Sierra Leone Ebola virüs salgını sırasında veBrezilya'dadevam eden arbovirüs salgını soruşturmaları sırasında görülebilir 1,2,3. Ancak, bildirilen yüksek hata oranı4 nanopore sıralama kullanılabilir uygulamaları sınırlayabilir.
Nanopore sıralama hızla gelişmektedir. Yeni ürünler piyasada düzenli olarak mevcuttur. Buna örnek olarak, DNA molekülünün her iki iplikçiğinin dizilemesini sağlayan 1D kare kitleri, böylece adlandırılan bazlar5'in doğruluğunu artırma ve gözenek6'dakiiki farklı durumda akımdaki değişimi ölçen R10 akış hücresinin geliştirilmesi verilebilir. Buna ek olarak, basecalling iyileştirmeler gibi geliştirilmiş biyo-informatik araçlar basecallingdoğruluğunu artıracaktır 7. En sık kullanılan basecallers biri, (örneğin, Albacore), 9 aylık bir süre içinde en az 12 kez güncellendi5. Son zamanlarda, üretici de varsayılan nanopore yazılım8uygulanan flip-flop denilen yeni bir basecaller yayımladı. Birlikte, tüm bu geliştirmeler daha doğru dizileri yol açacakve nanopore sequencer hata oranını azaltacaktır.
Usutu virüsü (USUV) Flaviviridae familyasından sivrisinek kaynaklı bir arbovirüstür ve yaklaşık 11.000 nükleotitlik pozitif iplikli RNA genomuna sahiptir. USUV esas olarak büyük gri baykuşlar ve karakuşlar etkiler9,10, diğer kuş türleri de USUV enfeksiyonu duyarlı olmasına rağmen11. Son zamanlarda, USUV da kemirgenler ve sivri fareler de tespit edildi virüs iletimi potansiyel rolü bilinmeyen kalır rağmen12. İnsanlarda, asemptomatik enfeksiyonlar kan bağışçılarında tarif edilmiştir13,14,15,16 USUV enfeksiyonları da ensefalit veya meningo-ensefalit ile ilişkili olduğu bildirilmiştir17,18. Hollanda'da USUV ilk olarak 2016 yılında yabanikuşlarda, 2018 yılında ise asemptomatik kan bağışçılarında tespit edilmiştir.14 USUV'nin ilk tespitinden bu yana, sonraki yıllarda salgınlar rapor edilmiştir ve tüm genom dizilemesi de dahil olmak üzere gözetim, şu anda daha önce naif bir popülasyonda bir arbovirüsün ortaya çıkmasını ve yayılmasını izlemek için devam etmektedir.
Ebola virüsü, Zika virüsü ve sarı hummavirüsü3,19,,20gibi diğer virüsler için açıklanan benzer, biz tam uzunlukta USUV21diziiçin bir astar seti geliştirdik. Bu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı yaklaşım, numunelerde beyin örnekleri gibi yüksek oranda kontamine olmuş numune tiplerinden tam uzunlukta USUV genomlarının 32 civarında ct değerine kadar geri kazanılmasına olanak sağlar. Amplicon tabanlı sıralama yaklaşımının yararları metagenomik sıralamaya göre daha yüksek duyarlılık ve daha yüksek özgüllüktür. Amplicon tabanlı bir yaklaşım kullanmanın sınırlamaları, dizilerin tüm suşlara uyan astarlar tasarlamak için benzer olması ve astarların virüs çeşitliliği hakkındaki mevcut bilgimiz üzerine tasarlanmasıdır.
Üçüncü nesil sıralamadaki sürekli gelişmeler ve gelişmeler göz önüne alındığında, sıralayıcının hata oranını düzenli olarak değerlendirmek gerekir. Burada, nanopore performansını doğrudan Illumina sıralamasına karşı değerlendirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem en son R10 akış hücresi ile oluşturulan dizilere uygulanır ve flip-flop basecaller'ın en son sürümü ile basecalling gerçekleştirilir.
Protocol
NOT: Kullanılacak yazılım araçları listesi: usearch v11.0.667; kas v3.8.1551; gözenek 0.2.4; cutadapt 2.5; minimap2 2.16-r922; samtools 1.9; trimmomatic 0.39; bbmap 38.33; maça v3.13.1; kma-1.2.8
1. Astar tasarımı
- Genel veya özel veri koleksiyonlarından ilgili tüm genom dizilerini indirmek veya almakla başlayın. Örneğin, NCBI veritabanı22tüm tam uzunlukta USUV genomları (taxid64286) almak. USUV yaklaşık 11.000 nükleotitten oluşan bir genomuyguluyor, bu yüzden sadece dizileri 8.000-12.000 nükleotit uzunluğunda geri alır. Bunu aşağıdaki arama girişini kullanarak yapın:
- taxid64286[Organizma:noexp] VE 8000[SLEN]:12000[SLEN].- Gönder 'e tıklayın | Tam Kayıt | Dosya; Format = FASTA'yı kullanın ve Dosyayı oluşturun.
- Başvuru dizileri kümesini küçültmek için, veri kümesinden %99'dan fazla nükleotit kimliğine sahip yinelenen dizileri veya dizileri kaldırın. Bunu usearch23'tenküme hızlı seçeneğini kullanarak yapın. Komut satırında girin:
- usearch -cluster_fast All_USUV.fasta -id 0.99 -centroids All_USUV_dedup.fasta - Astaroluşturmak için dizilerin hizalanmış olması gerekir. Bu MUSCLE24kullanılarak yapılır. Komut satırında girin:
- kas -in All_USUV_dedup.fasta -çıkış All_USUV_dedup_aligned.fasta -log log_muscle.txt
NOT: Tutarsızlıkları kontrol etmek için hizalamayı el ile incelemek esastır. Bunlar gerekirse el ile düzeltilebilir ve uçları çoğu genom dizisinin uzunluğuna göre kesilebilir. - Primal tam uzunlukta amplicon sıralama için kullanılabilir astar bir taslak seçim yapmak için kullanılır19. Hizalamayı ilkel web sitesine(http://primal.zibraproject.org/)yükleyin ve tercih edilen amplicon uzunluğunu ve farklı ampliconlar arasındaki çakışma uzunluğunu seçin. primal.zibraproject.org gidin, Şema adınıdoldurun, hizalanmış fasta dosyasını yükleyin, amplicon uzunluğunu seçin, üst üste bindirin ve düzeni oluşturun.
- Kullanılabilir tam USUV dizilerinin tam kümesini hizalayın (küçültülmüş veya çoğaltılmış kümeyi değil). Komut satırında girin:
- kas -in All_USUV.fasta -çıkış All_USUV_aligned.fasta -log log_muscle.txt
NOT: Oluşturulan astarları tam hizalamaya göre eşleyin (yinelenen hizalamayı kullanmayın), hataları el ile düzeltin ve en fazla 5 dejeneratif astar pozisyonu ekleyin.
2. Multipleks PCR
- Tasarlanmış astarlar ve nanopore ve Illumina sıralama kullanarak multipleks PCR gerçekleştirin. USUV için multipleks PCR daha önce açıklandığı gibi yapıldı19,21.
- Flip-flop sürüm 3.0.6.6+9999d81 ile taban araması yapın.
3. Nanopore verilerinden konsensüs dizileri oluşturmak için veri analizi
- Tek bir nanopore sıralama çalışmasında birkaç örnek çokkatlı olabilir. Sekans çalışmasını yaptıktan sonra nanopore verilerini demultiplex. Bunun için Porechop25'i kullanın. Kontaminasyonu önlemek ve doğruluğu artırmak için require_two_barcodes bayrağını kullanın. Komut satırında girin:
- gözenek -i Run_USUV.fastq -o Run_USUV_demultiplex --require_two_barcodes - Demultiplexing sonra, cutadapt26kullanarak astar dizileri (her iki yönde Primers_Usutu.fasta dosyasında gösterilir) kaldırın. Buna ek olarak, uzunluğu 75 nükleotitten daha kısa olan dizileri çıkarın. Konsensus sırasına suni önyargılar getirebildikleri için astarların kaldırılması gerekir. Komut satırında girin:
- cutadapt -b dosyası:Primers_USUV.fasta -o BC01_trimmed.fastq BC01.fastq -m 75 - Demultiplexed sıralı okumalar minimap227 kullanarak farklı referans suşları bir panel karşı eşlenebilir ve bir konsensüs dizisi samtools28kullanılarak oluşturulabilir. Referans tabanlı hizalama yordamını ve bir örneğin konsensüs sırası oluşturma yordamını gösteren aşağıdaki örneği izleyin: BC01. Komut satırında girin:
- minimap2 -ax harita-ont Random_Refs_USUV.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam
- samtools sıralama BC01.bam > BC01_sorted.bam
- bcftools mpileup -Ou -f Random_Refs_USUV.fasta BC01_sorted.bam | bcftools çağrı -mv -Oz -o BC01.vcf.gz
- bcftools endeksi BC01.vcf.gz
- kedi Random_Refs_USUV.fasta | bcftools konsensüs BC01.vcf.gz > BC01_consensus.fasta - Referans tabanlı hizalamalar için yakından ilişkili bir başvuru dizisinin kullanılması esastır. Bu nedenle, en yakın başvuru türünü belirlemek için oluşturulan konsensüs sırası ile bir BlastN araması gerçekleştirin. Bundan sonra, referans tabanlı hizalamayı en yakın başvuru gerilimi ile başvuru olarak tekrarlayın (adım 3.3 ve 3.4). Komut satırında girin:
- minimap2 -ax map-ont Ref_USUV_BC01.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01_ref.bam
- samtools sıralama BC01_ref.bam > BC01_sorted_ref.bam
- bcftools mpileup -Ou -f Ref_USUV_BC01.fasta BC01_sorted_ref.bam | bcftools çağrı -mv -Oz -o BC01_ref.vcf.gz
- bcftools endeksi BC01_ref.vcf.gz
- kedi Ref_USUV_BC01.fasta | bcftools konsensüs BC01_ref.vcf.gz > BC01_ref_consensus.fasta
4. Illumina verilerinin analizi
- Bu diziler sıralamadan sonra otomatik olarak demultiplexed edilir. Okur trimmomatic29kullanılarak kalite kontrol edilebilir. Eşleştirilmiş uçlu Illumina dizileri için, doğru, yüksek kaliteli okumalar elde etmek için yaygın olarak kullanılan kesme medyan PHRED puanı 33 ve 75 minimum okuma uzunluğu kullanın. Komut satırında girin:
- trimmomatic PE -phred33 9_S9_L001_R1_001.fastq.gz 9_S9_L001_R2_001.fastq.gz 9_1P.fastq 9_1U.fastq 9_2P.fastq 9_2U.fastq LEADING:3 TRAILING:3 SÜRGÜLÜ PENCERE:3:15 MINLEN:75 - Cutadapt26kullanarak yapay önyargılar getirebildiklerinden (her iki yönde de Primers_Usutu.fasta dosyasında belirtilen) astarları kaldırın. Buna ek olarak, aşağıdaki komutları kullanarak uzunluğu 75 nükleotitten daha kısa olan dizileri çıkarın. Komut satırında girin:
- cutadapt -b o 9_1P_trimmed.fastq -p 9_2P_trimmed.fastq 9_1P.fastq 9_2P.fastq -m 75 - De novo montaj önce, dizi okuma genom genelinde eşit bir kapsama için normalize edilebilir. SPAdes gibi de novo assemblers sırasını bir araya alırken dikkate okuma kapsamı almak bu önemlidir okur. Normalleştirmek BBMap paketi30BBNorm kullanarak 50 bir okuma kapsama okur. Komut satırında girin:
- bbmap/bbnorm.sh target=50 in=9_1P_trimmed.fastq in2=9_2P_trimmed.fastq out=Sample9_FW_norm.fastq out2=Sample9_RE_norm.fastq - Normalleştirilmiş okumalar SPAdes31kullanılarak monte edilen de novo'dadır. Varsayılan ayarlar tüm farklı kmers (21, 33, 55, 77, 99 ve 127) kullanılarak montaj için kullanılır. Komut satırında girin:
- spades.py -k 21,33,55,77,99,127 -o Örnek9 -1 Örnek9.qc.f.fq -2 Örnek9.qc.r.fq - Harita QC minimap2 ve Geneious, Bioedit veya Ugene gibi programları kullanarak elde edilen konsensüs sırasına karşı hizalama küratörlük okur. Bu başve bitişik sonu kontrol etmek önemlidir.
- QC minimap2 kullanarak elde edilen konsensüs sıralama karşı QC okur hizalamak.
- Geneious/Bioedit/UGene'deki hizalamayı içeri aktarın.
- Özellikle genomun başlangıcını ve sonunu el ile inceleyin, düzeltin ve küratörlük edin.
5. Altın standart olarak Illumina verileri kullanarak nanopore sıralamahata profilini telafi etmek için gerekli okuma kapsamı belirlenmesi
- Bu durumda amplicon 26, bir amplicon için eşleme okur seçin. Daha sonra, harita nanopore minimap2 kullanarak bu amplicon karşı okur. Amplicon 26 için sadece okuma eşleme seçmek ve fastq içine bam dosyası dönüştürmek için Samtools kullanın. Komut satırında girin:
- minimap2 -ax harita-ont -m 150 Amplicon26.fasta BC01_trimmed.fastq > BC01.bam
- samtools görünümü -b -F 4 BC01.bam > BC01_mapped.bam
- samtools bam2fq BC01_mapped.bam | seqtk seq - -> BC01_mapped.fastq - Örneğin 200 sıranın rastgele seçilen alt kümeleri bin kez okur. Örneğin, 10'a değiştirmek, 10 sıralık bir alt kümenin bin katı rasgele seçilmesiyle sonuçlanır. Komut dosyası Ek Dosya 1olarak sağlanır. Komut satırında girin:
- piton Random_selection.py - Rasgele seçilen tüm sıra okumalar amplicon 26'ya hizalanır. Okuma sırasını haritalamak ve hemen bir konsensüs dizisi oluşturmak için KMA32'yi kullanın. -bcNano bayrağıyla gösterilen nanopore sıralama için optimize edilmiş ayarları kullanın. Komut satırında girin:
- kma indeksi -i Amplicon26.fasta
- random_sample dosya için*;
- sampleID=${file%.fastq}
- kma -i ${sampleID}.fastq -o ${sampleID} -t_db Amplicon26.fasta -mem_mode -mp 5 -mrs 0.0 -bcNano
- bitti - Komut satırında oluşturulan konsensüs dizilerini aşağıdakileri kullanarak inceleyin:
- kedi *.fsa > All_genomes.fsa
- minimap2 -ax harita-ont Amplicon26.fasta All_genomes.fsa > All_genomes.bam
- samtools sıralama All_genomes.bam > All_genomes_sorted.bam
- samtools istatistikleri All_genomes_sorted.bam > stats.txt- Hata oranı stats.txt başlığı hata oranı #mismatches / üsleri eşlenenaltında görüntülenir. Aşağıdaki komutla ekranda görüntüleyin:
- grep ^SN stats.txt | kesme -f 2- - Indels miktarı döngü başına #Indelsbaşlığı altında görüntülenir. Aşağıdaki komutla ekranda görüntüleyin:
- grep ^IC stats.txt | kesme -f 2-
- Hata oranı stats.txt başlığı hata oranı #mismatches / üsleri eşlenenaltında görüntülenir. Aşağıdaki komutla ekranda görüntüleyin:
Representative Results
Son zamanlarda, akış hücresi sürümü (R10) yeni bir sürümü serbest bırakıldı ve DNA dizileri (sözde flip-flop basecaller) için elektronik akım sinyali dönüştürmek için kullanılan basecaller iyileştirmeler sundu. Bu nedenle, daha önce bir R9.4 akış hücresi ve Illumina Miseq enstrüman21üzerinde sıralanmış bir USUV-pozitif baykuş beyin dokusundan USUV yeniden sıralanmış var. Burada, Illumina sıralamaile doğrudan karşılaştırıldığında güvenilir konsensüs çağrısı için gerekli okuma kapsamını belirlemek için kullanılan yöntemi tanımladık.
Basecaller flip-flop ile birlikte yeni akış hücresi kullanarak, 40x'lik bir okuma kapsamının Illumina dizilimi ile karşılaştırıldığında aynı sonuçlarverdiğini gösteriyoruz. 30x'in okuma kapsamı , sıralanmış her 585.000 nükleotitte bir hataya karşılık gelen %0,0002'lik bir hata oranıyla sonuçlanırken, 20x'in okuma kapsamı sıralanmış her 63.529 nükleotitte bir hatayla sonuçlanır. 10x'in okunması, diziliher 3.312 nükleotitte bir hatayla sonuçlanır, yani tam USUV genomu başına üç nükleotitten fazla yanlış çağrılmaktadır. 30x'in üzerinde bir okuma kapsamı ile, hiçbir indels gözlendi. 20x'lik bir okuma kapsamı bir indel pozisyonunun algılanmasıyla sonuçlanırken, 10x'lik bir okuma kapsamı 29 pozisyonda indels ile sonuçlandı. Farklı okuma kapsamı kesintileri kullanılarak hata oranına genel bir bakış Tablo 1'degösterilmiştir.
| Kapsama | Hatalar yineleme 1 | Hata oranı yineleme 1 | Indels: | Hatalar yineleme 2 | Hata oranı yineleme 2 | Indels: | Hatalar yineleme 3 | Hata oranı yineleme 3 | Indels: |
| 10× | 100 | 0.0274% | 4 | 116 | 0.0297% | 18 | 110 | 0.0282% | 7 |
| 20× | 4 | 0.0010% | 0 | 6 | 0.0015% | 1 | 7 | 0.0018% | 0 |
| 30x | 2 | 0.0005% | 0 | 0 | 0.0000% | 0 | 0 | 0.0000% | 0 |
| 40x | 0 | 0.0000% | 0 | 0 | 0.0000% | 0 | 0 | 0.0000% | 0 |
| 50× | 0 | 0.0000% | 0 | 0 | 0.0000% | 0 | 0 | 0.0000% | 0 |
Tablo 1: Nanopore sıralamahata oranına genel bakış. Her yineleme bin rasgele örneği temsil eder.
Ek Dosya 1: Rastgele seçim. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Discussion
Nanopore sıralama sürekli gelişmektedir ve bu nedenle hata oranını izlemek için yöntemler için bir ihtiyaç vardır. Burada, nanopore sequencer hata oranını izlemek için bir iş akışı açıklar. Bu, yeni bir akış hücresi yayımlandıktan sonra veya basecalling'in yeni sürümleri serbest bırakılırsa yararlı olabilir. Ancak, bu, kendi sıralama protokollerini ayarlamak ve doğrulamak isteyen kullanıcılar için de yararlı olabilir.
Farklı yazılım ve hizalama araçları farklı sonuçlar verebilir33. Bu yazıda, yaygın olarak kullanılan ve açık belgelere sahip serbestçe kullanılabilen yazılım paketlerini kullanmayı amaçladık. Bazı durumlarda, tercih genellikle daha kullanıcı dostu arabirimleri var ama için ödenmesi gereken ticari araçlar, verilebilir. Gelecekte, bu yöntem sıralı teknoloji veya basecalling yazılım büyük değişiklikler tercihen bu basecaller veya flowcell her güncellemeden sonra yapılmalıdır tanıtılır durumunda aynı örnek uygulanabilir, ancak mevcut gelişmelerin hızı göz önüne alındığında bu da sadece büyük güncellemeler sonra yapılabilir.
Sıralamadaki hata oranındaki azalma, daha fazla sayıda örneğin çokkatlı olmasını sağlar. Bu nedenle, nanopore sıralama zaten grip virüsü tanı için durumdur tanı tahliller için geleneksel gerçek zamanlı PCRs yerine daha yakın oluyor. Buna ek olarak, hata oranının azaltılması, örneğin küçük varyantların belirlenmesi ve yüksek iş sahibi tarafsız metagenomik sıralama için bu tekniğin kullanılabilirliğini artırır.
Protokoldeki kritik bir adım, yakın ve güvenilir başvuru dizilerinin kullanılabilir olması gerektiğidir. Astarlar virüs çeşitliliği hakkında güncel bilgilere dayanmaktadır ve arada bir güncellenmesi gerekebilir. Amplicon tabanlı sıralama yaklaşımı kurarken bir diğer kritik nokta, amplicon derinliğinde eşit bir denge elde etmek için astar konsantrasyonunun dengelenmesidir. Bu, bir dizi çalışmasında daha fazla örneğin çoklaşmasını sağlar ve önemli bir maliyet azaltmayla sonuçlanır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, 643476 sayılı hibe anlaşması (COMPARE) kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| dNTPs | Qiagen | 201900 | |
| FLO-MIN106 R10 flowcell | Nanopore | R10 flowcell | |
| KAPA Hyperplus libarary preparation kit | Roche | 7962436001 | |
| Library Loading Bead Kit | Nanopore | EXP-LLB001 | |
| Ligation Sequencing Kit 1D | Nanopore | SQK-LSK109 | |
| Native Barcoding Kit 1D 1-12 | Nanopore | EXP-NBD103 | |
| Native Barcoding Kit 1D 13-24 | Nanopore | EXP-NBD104 | |
| NEB Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
| NEB Next Quick Ligation Module | NEB | E6056 | |
| NEB Next Ultra II End Repair / dA-Tailing Module | NEB | E7546S | |
| Protoscript II Reverse Transcriptase | NEB | M0368X | |
| Q5 High-Fidelity polymerase | NEB | M0491 | |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| Random Primers | Promega | C1181 | |
| RNAsin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 |
References
- Faria, N. R., et al. Establishment and cryptic transmission of Zika virus in Brazil and the Americas. Nature. 546 (7658), 406-410 (2017).
- Bonaldo, M. C., et al. Genome analysis of yellow fever virus of the ongoing outbreak in Brazil reveals polymorphisms. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 447-451 (2017).
- Faria, N. R., et al. Genomic and epidemiological monitoring of yellow fever virus transmission potential. bioRxiv. , 299842 (2018).
- Magi, A., Giusti, B., Tattini, L. Characterization of MinION nanopore data for resequencing analyses. Briefings in Bioinformatics. 18 (6), bbw077 (2016).
- Rang, F. J., Kloosterman, W. P., de Ridder, J. From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy. Genome Biology. 19 (1), 90 (2018).
- Nanopore Store, R10 flow cells. , https://store.nanoporetech.com/flowcells/spoton-flow-cell-mk-i-r10.html (2019).
- Wick, R. R., Judd, L. M., Holt, K. E. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing. Genome Biology. 20 (1), 129 (2019).
- GitHub - nanoporetech/flappie: Flip-flop basecaller for Oxford Nanopore reads. , https://github.com/nanoporetech/flappie (2019).
- Lühken, R., et al. Distribution of Usutu Virus in Germany and Its Effect on Breeding Bird Populations. Emerging Infectious Diseases. 23 (12), 1994-2001 (2017).
- Cadar, D., et al. Widespread activity of multiple lineages of Usutu virus, Western Europe, 2016. Eurosurveillance. 22 (4), (2017).
- Becker, N., et al. Epizootic emergence of Usutu virus in wild and captive birds in Germany. PLoS ONE. 7 (2), (2012).
- Diagne, M., et al. Usutu Virus Isolated from Rodents in Senegal. Viruses. 11 (2), 181 (2019).
- Bakonyi, T., et al. Usutu virus infections among blood donors, Austria, July and August 2017 – Raising awareness for diagnostic challenges. Eurosurveillance. 22 (41), (2017).
- Zaaijer, H. L., Slot, E., Molier, M., Reusken, C. B. E. M., Koppelman, M. H. G. M. Usutu virus infection in Dutch blood donors. Transfusion. , trf.15444 (2019).
- Cadar, D., et al. Blood donor screening for West Nile virus (WNV) revealed acute Usutu virus (USUV) infection, Germany, September 2016. Eurosurveillance. 22 (14), 30501 (2017).
- Pierro, A., et al. Detection of specific antibodies against West Nile and Usutu viruses in healthy blood donors in northern Italy, 2010–2011. Clinical Microbiology and Infection. 19 (10), E451-E453 (2013).
- Pecorari, M., et al. First human case of Usutu virus neuroinvasive infection, Italy, August-September 2009. Euro surveillance: bulletin européen sur les maladies transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 14 (50), (2009).
- Simonin, Y., et al. Human Usutu Virus Infection with Atypical Neurologic Presentation, Montpellier, France, 2016. Emerging Infectious Diseases. 24 (5), 875-878 (2018).
- Quick, J., et al. Multiplex PCR method for MinION and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
- Oude Munnink, B. B., et al. Towards high quality real-time whole genome sequencing during outbreaks using Usutu virus as example. Infection, Genetics and Evolution. 73, 49-54 (2019).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. GenBank. Nucleic Acids Research. 38 (Database issue), D46-D51 (2010).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
- GitHub - rrwick/Porechop: adapter trimmer for Oxford Nanopore reads. , https://github.com/rrwick/porechop (2018).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
- Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34 (18), 3094-3100 (2018).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics (Oxford, England). 30 (15), 2114-2120 (2014).
- BBMap download | SourceForge.net. , https://sourceforge.net/projects/bbmap/ (2019).
- Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
- Clausen, P. T. L. C., Aarestrup, F. M., Lund, O. Rapid and precise alignment of raw reads against redundant databases with KMA. BMC Bioinformatics. 19 (1), 307 (2018).
- Brinkmann, A., et al. Proficiency Testing of Virus Diagnostics Based on Bioinformatics Analysis of Simulated In Silico High-Throughput Sequencing Data Sets. Journal of Clinical Microbiology. 57 (8), (2019).
