Summary
Protokollen præsenterer de optimerede parametre for forberedelse termofølsomme liposomer ved hjælp af forskudt sildeben micromixer microfluidics enhed. Dette giver også mulighed for co-indkapsling af doxorubicin og indocyanin grøn i liposomer og fototermisk-udløst frigivelse af doxorubicin for kontrolleret / udløst narkotika frigivelse.
Abstract
Den præsenterede protokol muliggør en høj gennemløb kontinuerlig forberedelse af lav temperatur-følsomme liposomer (LCL'er), som er i stand til at indlæse kemoterapeutiske lægemidler, såsom doxorubicin (DOX). For at opnå dette, en ethanolisk lipid blanding og ammoniumsulfat opløsning injiceres i en forskudt sildeben micromixer (SHM) mikrofluidic enhed. Opløsningerne blandes hurtigt af SHM, hvilket giver et homogent opløsningsmiddelmiljø for liposomer selvsamling. Indsamlede liposomer er først udslettet, derefter dialyzed at fjerne resterende ethanol. En ammoniumsulfat pH-gradient etableres ved bufferudveksling af den eksterne opløsning ved hjælp af størrelsesudelukkelseskromatografi. DOX er derefter fjernindlæsset i liposomer med høj indkapsling effektivitet (> 80%). De opnåede liposomer er homogene i størrelse med Z-gennemsnitlig diameter på 100 nm. De er i stand til temperaturudløst burst frigivelse af indkapslet DOX i nærvær af mild hypertermi (42 °C). Indocyanin grøn (ICG) kan også co-loaded i liposomer for nær-infrarød laser-udløst DOX frigivelse. Den mikrofluidiske tilgang sikrer høj gennemløb, reproducerbar og skalerbar forberedelse af LCL'er.
Introduction
LTSL formulering er et klinisk relevant liposomal produkt, der er udviklet til at levere det kemoterapeutiske lægemiddel doxorubicin (DOX) og giver mulighed for effektiv burst lægemiddel frigivelse på klinisk opnåelige milde hypertermi (T ≈ 41 °C)1. LTSL-formuleringen består af 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), lysolipid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphtidaylcholin (MSPC; M står for "mono") og PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000] (DSPE-PEG2000). Ved at nå faseovergangstemperaturen (Tm ≈ 41 °C) letter lysolipiden og DSPE-PEG2000 tilsammen dannelsen af membranporer, hvilket resulterer i en eksplosionsfrigivelse af lægemidlet2. Udarbejdelsen af LCL'er bruger primært en masse top-down tilgang, nemlig lipid film hydrering og ekstrudering. Det er fortsat en udfordring at reproducereligt forberede store partier med identiske egenskaber og i tilstrækkelige mængder til kliniske anvendelser3.
Microfluidics er en ny teknik til at forberede liposomer, der tilbyder tunable nanopartikel størrelse, reproducerbarhed, og skalerbarhed3. Når produktionsparametrene er optimeret, kan gennemløbet opskaleres ved parallelisering med egenskaber, der er identiske med dem, der er udarbejdet på bænkskala3,4,5. En stor fordel ved mikrofluidik i forhold til konventionelle bulk teknikker er evnen til at håndtere små flydende mængder med høj kontrollerbarhed i rum og tid gennem miniaturisering, så hurtigere optimering, mens du opererer i en kontinuerlig og automatiseret måde6. Produktion af liposomer med mikrofluidiske enheder opnås ved en bottom-up nanonedbør tilgang, som er mere tid og energieffektive, fordi homogenisering processer såsom ekstrudering og sonikering er unødvendige7. En organisk opløsning (f.eks. ethanol) af lipider (og hydrofob nyttelast) blandes typisk med et misbart ikke-opløsningsmiddel (f.eks. vand og hydrofile nyttelast). Da det organiske opløsningsmiddel blandes med det ikke-opløsningsmiddel, reduceres opløseligheden for lipiderne. Lipidkoncentrationen når til sidst en kritisk koncentration, hvor nedbørsprocessen udløses7. Nanoprecipitates af lipider i sidste ende vokse i størrelse og tæt ind i en liposom. De vigtigste faktorer for liposomernes størrelse og homogenitet er forholdet mellem det ikke-opløsningsmiddel og opløsningsmiddel (dvs. forholdet mellem stor-til-organisk strømningshastighed; FRR) og homogeniteten af opløsningsmiddelmiljøet under selvmontering af lipider i liposomer8.
Effektiv væskeblanding i mikrofluidik er derfor afgørende for præparatet af homogene liposomer, og forskellige design af blandere har været anvendt i forskellige applikationer9. Forskudt sildeben micromixer (SHM) repræsenterer en af de nye generationer af passive blandere, som muliggør høj gennemløb (i intervallet mL / min) med en lav fortynding faktor. Dette er bedre end traditionelle mikrofluidiske hydrodynamiske blandingsanordninger8,10. SHM har mønstret sildeben siller, som hurtigt blande væsker ved kaotisk advection9,11. Den korte blanding stidskala af SHM (< 5 ms, mindre end den typiske sammenlægning tidshorisont på 10-100 ms) tillader lipid selvsamling at forekomme i et homogent opløsningsmiddel miljø, der producerer nanopartikler med ensartet størrelse fordeling3,12.
Udarbejdelsen af lCL'er med mikrofluidik er imidlertid ikke så ligetil sammenlignet med konventionelle liposomal formuleringer på grund af manglen på kolesterol8, uden hvilken lipid tolag er modtagelige for ethanol-induceret interdigitation13,14,15. Indtil nu, effekten af resterende ethanol præsenterer under den mikrofluidiske produktion af liposomer er ikke blevet godt forstået. De fleste af de rapporterede formuleringer er i sagens natur resistente over for interdigitation (indeholdende kolesterol eller umættede lipider)16, som i modsætning til lup er både mættet og kolesterol-fri.
Protokollen præsenteres heri bruger SHM til at forberede ncl'er til temperatur udløst frigivelse narkotika levering. I den præsenterede metode sikrede vi, at de mikrofluidiske-forberedte LCL'er er nanostørrelse (100 nm) og ensartet (dispersity < 0,2) ved dynamisk lysspredning (DLS). Desuden indkapslede vi DOX ved hjælp af transmembranen ammoniumsulfatgradientmetode (også kendt som fjernbelastning)17 som en validering af ltsl lipidtolagets integritet. Fjernbelastning af DOX kræver liposom at opretholde en pH-gradient for at opnå høj indkapsling effektivitet (EE), som er usandsynligt, at ske uden en intakt lipid tolags. I denne præsenterede metode, karakteristisk fra typiske mikrofluidiske liposome forberedelse protokoller, en glødetrin er påkrævet, før ethanol er fjernet for at muliggøre fjernbetjeningen lastning kapacitet; dvs.
Som tidligere nævnt kan hydrofile og hydrofobe nyttelast også introduceres til de første løsninger til samtidig indkapsling af nyttelast under dannelsen af LCL'er. Som et proof-of-concept, indocyanin grøn (ICG), en FDA-godkendt nær-infrarød fluorescerende farvestof, som også er en lovende fototermisk middel, introduceres til den første lipid blanding og med succes co-loaded i LCL'er. En 808 nm laser bruges til at bestråle DOX/ ICG-loaded LTSLs og med held fremkalde fototermisk opvarmning-udløst burst frigivelse af DOX inden for 5 min.
Alle instrumenter og materialer er kommercielt tilgængelige, klar til brug og uden behov for tilpasning. Da alle parametre for formulering af LCL'er er blevet optimeret, efter denne protokol, forskere uden forudgående kendskab til mikrofluidik kunne også forberede lcl'er, der tjener som grundlag for en termofølsom lægemiddel leveringssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opsætning af udstyr
- Saml sprøjtepumperne og SHM på følgende måde.
- Tilslut "Til computer" port af den sekundære sprøjtepumpe (Pumpe 02, for vandig løsning) til "Til netværk" port af master sprøjte pumpen (Pump 01, for ethanol lipid løsning) ved hjælp af pumpe til pumpe netværkskabel(Figur 1, gul).
- Tilslut "Til computer" porten for masterpumpen til "RS232 Serial" porten på computeren ved hjælp af PC til pumpen netværkskabel(Figur 1, blå).
- Tilslut slanger til hver af de indløb og udtag af SHM ved hjælp af en møtrik og ferrule. Konverter karslangens terminal til både indløb til hunluer ved hjælp af en anden møtrik og ferrule og en fagforeningsforsamling. Længere slanger af indløb giver lettere fastgørelse til sprøjterne(Figur 2).
- Konfigurer pumpestyringssoftwaren.
- Tildel adressen på master sprøjtepumpen og den sekundære sprøjtepumpe til henholdsvis "Ad:01" og "Ad:02" ved hjælp af "Opsætningsknappen" på sprøjtepumpen. Dette skal kun gøres for første gang.
- Åbn pumpestyringssoftwaren på computeren. De to sprøjtepumper skal registreres automatisk efterfulgt af en biplyd. Ellers skal du klikke på Pumper og Søge efter pumper for at opdatere forbindelsen. (Figur 3).
- Tildel diameter til 12,45 (mm) ved at vælge "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12.45)".
- Tildel sats til 0,25 ml/min til pumpe 01 (ethanol lipid opløsning) og 0,75 ml / min for Pump 02 (vandig opløsning). Strømningshastigheden svarer til en samlet strømningshastighed (TFR) på 1 ml/min og et vandigt til ethanol-flowratio (FRR) på 3.
- Tildel diskenhed til alle værdier over 5 ml.
BEMÆRK: Det målrettede infusionsvolumen er indstillet større end det belastede væskevolumen i betragtning af slangens rumfang. - Vælg INF-tilstand (infusion) for begge pumper.
- Tryk på Indstil for at bekræfte indstillingerne.
2. Udarbejde lcl'er
- Forbered en LTSL10 eller LTSL10-ICG lipid blanding (se tabel 1).
- Træk 1 ml lipidblanding tilbage og mindst 3 ml (NH4)2SO4 opløsning ved hjælp af to 5 ml luer låsesprøjter.
- Monter de to sprøjter på sprøjtepumperne i opretstående stilling ved at skubbe sprøjtens tøndeflange til pumpens sprøjteholder og sprøjtens stempelflang er på pumpens skubbeblok (figur 4).
- Pak enden af varmetapbåndet ind på sprøjten med den vandige opløsning. Wrap den anden ende af varmetapog temperatur sonde af termostatomkring sprøjten med lipid opløsning. Det er nyttigt at øve dette trin med tomme sprøjter på plads for at lette samlingsprocessen(figur 5A).
- Tilslut de to sprøjter til de kvindelige Luer-adaptere af de tilsvarende indløb i SHM. Sørg for, at sprøjterne, der indeholder lipidblandingen, og (NH4)2SO4 opløsninger er tilsluttet henholdsvis ethanolindtag og vandig indløb. Juster stemplets position for at fjerne luftbobler fra sprøjterne (figur 5B).
BEMÆRK: Sørg for, at sprøjterne stadig er placeret sikkert på pumpebeholderens sprøjteholder. - Sprøjterne opvarmes til over 51 °C ved hjælp af varmetapningen ved hjælp af en 10 s varmesession. Lad termostaten opdatere sprøjternes temperatur. Gentag dette trin i følgende trin for at opretholde temperaturen under infusionen.
FORSIGTIG: Sluk for varmetapningen efter 10 s for at forhindre temperaturoverskridelser og lad termostaten opdatere den faktiske temperatur. Varmebåndet skal også håndteres med forsigtighed, da temperaturen stiger meget hurtigt. Opvarmning kan konstant beskadige udstyr og sprøjter på grund af tidsforsinkelsen af termostaten til opdatering af den målte temperatur. - Når temperaturen er over 51 °C, skal sprøjtens pumper køres ved at trykke på Kør alle i pumpestyringssoftwaren (Figur 3).
- Sørg for, at væskestrømmen er fri for luftbobler og lækage. Den oprindelige mængde (ca. 0,5 ml) væske bortskaffes fra udløbet som affald.
BEMÆRK: Denne indledende affaldsmængde er ikke bestemt og afhænger af opsætningens indvendige volumen, som er mængden for væske at køre fra sprøjterne gennem slangen og SHM til stikkontakten. - Saml resten af væsken som liposome prøver i en mikrocentrifuge rør eller bijou hætteglas.
- Sæt infusionen på pause/stop, når væsken i en af sprøjterne næsten er tom.
BEMÆRK: Pumperne skal stoppes manuelt, da pumperne muligvis ikke nøjagtigt registrerer positionen, når sprøjterne er tomme. - De indsamlede liposomopløsninger anbringes i et vandbad på 60 °C til anneal i 1,5 timer.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at muliggøre narkotika lastning i liposomer. - Overfør opløsningerne til dialyserør. Dialyze opløsningerne mod 1 L af 240 mM (NH4)2SO4 ved 37 °C i mindst 4 timer for at opnå rensede liposomer.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Liposomer på dette trin er på 5 mM fosfolipid. Rensede liposomer kan opbevares ved 4 °C. - For at rengøre SHM til gentagen brug skal SHM skylles sekventialt med deioniseret vand, ethanol og tør med nitrogengas.
3. Fjernindlæsning af DOX i LTSLs ved transmembrane pH-gradient
- Exchange ekstern buffer af LTSLs til HEPES-buffered saltvand (HBS) ved hjælp af størrelse udelukkelse kromatografi (SEC) for at etablere en transmembrane pH gradient.
- Føj i alt 25 ml HBS til toppen af en SEK-kolonne for at forberede kolonnen. Lad alle eluent eluute eluute gennem kolonnen og bortskaffe eluat.
- Tilføj 1 ml af dialyzed liposomer, fremstillet fra trin 2.12, til kolonnen og bortskaffe elute.
- Tilføj 1,5 ml HBS til kolonnen, og bortskæs selen.
- Tilføj 3 ml HBS til kolonnen og saml 3 ml elute.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Liposomer er indsamlet på dette trin og er på 1.67 mM fosfolipid. Buffer udvekslede liposomer kan opbevares ved 4 °C.
- Inkubere LCL'er med doxorubicin (DOX) og renser LCL'er.
- Tilføj DOX opløsning i 1:20 DOX-til-fosfolipid molar forhold i 1 ml buffer-udvekslede liposomer løsning (1,67 mmol) indeholdt i en bijou hætteglas. Dette kan opnås ved tilsætning af 48,4 μL 1 mg/ml DOX opløsning (83,4 μmol).
- Placer bijou hætteglasset i en 37 °C vandbad i 1,5 timer for at tillade DOX lastning i liposomer.
- Bland 10 μL af liposomerne med 170 μL HBS og 20 μL 1% (v/v) Triton X-100 opløsning i en sort 96-brøndsplade. Gentag for tre brønde. Disse brønde svarer til "før rensning" DOX indhold.
- I tilfælde af tilberedning af LTSL10-ICG blandes 40 μL liposomerne med 160 μL DMSO i en klar 96-brøndsplade. Gentag for tre brønde. Disse brønde svarer til "før rensning" ICG indhold.
- Rens liposom opløsning som beskrevet i trin 3.1.
BEMÆRK: Hvis kolonnen skal genbruges til fremtidig rensning, skal kolonnen rengøres fra gratis DOX ved først at tilføje 1 ml fortyndet 0,5 M NaOH-opløsning, før du udfører trin 3.1.1. Gratis DOX i rødt vil hurtigt blive violetblå og elute gennem kolonnen. - Bland 30 μL af den rensede liposomopløsning med 150 μL HBS og 20 μL 1% (v/v) Triton X-100 opløsning i en sort 96-brøndplade. Gentag for tre brønde. Disse brønde svarer til "efter rensning" DOX indhold.
- Hvis LTSL10-ICG er der tale om LTSL10-ICG, blandes 40 μL af den rensede liposomopløsning med 160 μL DMSO i en klar 96-brøndsplade. Gentag for tre brønde. Disse brønde svarer til "efter rensning" ICG indhold.
- DoX fluorescensintensiteten af brøndene før (trin 3.2.3) og efter (trin 3.2.5) rensning ved hjælp af en mikropladelæser (λex = 485 nm, λem = 590 nm).
- Beregn dox's indkapslingseffektivitet (DOX EE) ved at tage forholdet mellem fluorescensintensiteterne før og efter rensningen.
- Mål ICG-absorbansen af brøndene før og efter rensning, ved hjælp af en mikropladelæser (600 til 1000 nm).
- ICG's indkapslingseffektivitet (ICG EE) beregnes ved at tage forholdet mellem absorbansen ved 792 nm før og efter rensning, idet der tages hensyn til fortyndingsfaktoren (3 gange) under rensningen.
4. Dynamisk lysspredning (DLS)
- Der tilsættes 50 μL liposomopløsning (trin 2.12) til 450 μL deioniseret vand.
- Anbring cuvetten inde i DLS-instrumentet, og målingen udføres i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Den gennemsnitlige Z-gennemsnitlige diameter og dispersity af tre målinger for hver prøve registreres.
5. Differentialscanning kalorimetri (DSC)
- Koncentrer 1 ml liposomer prøver (trin 2,12) med en centrifugalfilter enhed til 0,5 ml (endelig lipid koncentration på 10 mM). Brug en fastvinklet rotor, drej ved 7500 x g i ca. 15 min.
- Overfør 20 μL (NH4)2SO4 opløsning og liposomer prøver til to respektive DSC pander. Forsegle pander med DSC hermetiske låg ved hjælp af DSC prøve pressekit.
- Prøven måles fra 30 °C til 60 °C ved en opvarmningshastighed på 1 °C/min ved hjælp af et differensscanningskalorimeter.
- Analysér dataene med passende software. Tag faseovergangstemperaturen (Tm) som faseovergangens start (smeltende top), som måles ved x-skæringspunktet for tangenten af det maksimale hældningspunkt.
6. Doxorubicin frigivelse
- Forvarm HBS ved en bestemt temperatur (37 eller 42 °C) ved hjælp af et vandbad. Forbered et isvandbad til at slukke prøverne.
- Tilsæt 100 μL rensede DOX-lastede liposomer (trin 3.2.5) i 1,9 ml HBS i et mikrocentrifugerør. Anbring røret i vandbadet på den angivne temperatur.
- Træk straks 200 μL prøver ud af røret og læg den hurtigt i isvandsbadet for at slukke enhver efterfølgende udløsning af lægemidlet. Denne prøve svarer til det oprindelige (t = 0) tidspunkt.
- Træk 200 μL prøver tilbage på efterfølgende tidspunkter (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) og læg den hurtigt i isvandsbadet for at slukke enhver udløsning af stoffer.
- Der blandes 50 μL prøve af hvert tidspunkt med 150 μL HBS i en sort 96-brøndsplade. Mål DOX fluorescensintensiteten ved hjælp af en pladelæser.
- Der tilsættes 20 μL 1% (v/v) Triton X-100 i tilfældige udvalgte brønde, der er tilberedt i trin 6.5. Mål DOX fluorescensintensiteten af disse brønde ved hjælp af en pladelæser. Disse værdier svarer til det fuldt udgivne (t = ∞; 100% frigivelse) tidspunkt.
- Beregn og afbilde procentdelen af DOX frigivet ved interpolering fluorescens intensiteten af hvert tidspunkt (I (t)), sammenlignet med den oprindelige (I(0)), og fuldt frigivet (I(∞)), værdi.
7. Laser opvarmning og udløst frigivelse
- Indstil vandbadstemperaturen til 37 °C, og lad temperaturen stabilisere sig.
- Der tilsættes 200 μL DOX-lastede LTSL10-ICG ([ICG] = 10 μg/ml) til en klar 96-brøndsplade, og placer den derefter i vandbadet, hold bunden nedsænket i vand.
- Indstil lasersystemets strøm til 2,27 A. Anbring kollimatoren i lasersystemet på 5 cm lodret over overfladen af 96-brøndpladen, hvilket svarer til en energiflux på 0,5 W/cm2 [Figur 6].
FORSIGTIG: Lasersystemet skal betjenes i overensstemmelse med relevante lasersikkerhedsforanstaltninger. - Tænd for laseren, og overvåg temperaturen hvert minut ved hjælp af en fiberoptisk temperatursonde.
- Ved 5 og 10 min trækkes 10 μL laserbestrålede liposomer tilbage fra den klare 96-brøndsplade ved og blandes med 190 μL HBS for tre brønde i en sort 96-brøndsplade.
- Bland 10 μL af liposomerne med 170 μL HBS og 20 μL 1% (v/v) Triton X-100 opløsning til tre brønde i en sort 96-brøndsplade. Disse brønde svarer til "100% frigivet" DOX indhold. Mål DOX fluorescerende intensitet, og beregn DOX-udslippet som beskrevet i trin 6.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremstilling af lup'er efter mikrofluidik kræver lipidsammensætning af DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, molar-forhold; LTSL10). Figur 7A (til venstre) viser udseendet af forberedt LTSL10 fra trin 2.9 som en klar og ikke-tyktflydende væske. LTSL10 formulering er udviklet ud fra den konventionelle formulering, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, molar forhold), da LTSL4 danner en gel-lignende tyktflydende prøve, som angivet med den store mængde luftbobler fanget i prøven (figur 7A; højre).
DLS-måling af HENHOLDSVIS LTSL10(figur 7B, red) viste, at LTSL10's Z-gennemsnitsdiameter og dispersitet var henholdsvis 95,28 ± 7,32 nm og 0,100 ± 0,022, hvilket indikerer forsøgets succes. Figur 7B (grå) viser også en ikke optimal prøve, som blev fremstillet ved 20 °C, hvor der blev opnået større og mere spredte liposomer.
Figur 7C viser, at DOX EE af LTSL10. DOX EE bør normalt være omkring 80%. Ltsls fremstillet ved den konventionelle metode til lipid film hydrering med ekstrudering (LF) er inkluderet til sammenligning, udarbejdet som beskrevet andetsteds18. DOX EE af LTSL4 (LF) og LTSL10 (LF) viste anstændige DOX lastning på omkring 70% og 50%, hhv. Annealing af forberedt LTSL10 (trin 2.11) er afgørende for at muliggøre DOX-belastning. I mangel af glødetrinnet, lav DOX EE (< 20%) var persistent, uanset inkubationstemperatur (20 °C til 42 °C) og varighed (1 til 24 timer). Dette indikerede, at LTSL10 ikke opretholdt en transmembranpH-gradient, hvor DOX i stedet blev indlæst passivt eller adsorption. Ved at annealing den som-forberedt LTSL10, DOX EE steg betydeligt til et gennemsnit på 85%, hvilket indikerer succes en fjern belastning af DOX og tilstedeværelsen af transmembrane pH gradient.
Figur 7D viser DOX-udgivelsesprofilen for LTSL10. Ved 37 °C var frigivelsen af indkapslet DOX over 60 min omkring 10%. I modsætning hertil blev alle de indkapslede DOX i 42 °C frigivet inden for 5 minutter, hvilket viser LTSL10's temperaturfølsomhed. Lignende resultater blev observeret med LTSL10 (LF) som kontrol.
Figur 8 viser faseovergangstemperaturen (Tm) af LTSL10 karakteriseret ved hjælp af differentialscanningkalorimetri (DSC). Stiplede linjer som tangent af det punkt af maksimal hældning, tilsættes som en visuel hjælp af den indledende fase overgangstemperatur (x-skæringspunkt af tangent linje). LTSL10 har en forholdsvis bred faseovergang med debut ved 41,6 °C og topper ved 42,6 °C. Lignende resultater blev observeret med LTSL10 (LF), hvilket tyder på en mindre forskel mellem tilberedningsteknikkerne. Til sammenligning har LTSL4 (LF) en lavere og skarpere faseovergang efter aftale med litteraturen1.
Figur 9 viser karakteriseringen af LTSL10-ICG. Virkningen af den oprindelige ICG-koncentration på størrelse (figur 9A) og dox- og ICG's lasteeffektivitet (figur 9B) kategoriseres i tre koncentrationsområder. Ved lav ICG-koncentration (ICG-til-lipid molar-forholdet på 0,003; indledende koncentration på 60 μM ICG og 20 mM lipid), Z-gennemsnit, dispersity og DOX EE svarede til LTSL10 uden ICG-belastning; ICG EE var omkring 75%. Den effektive co-loading af DOX og ICG i LTSL10 kan opnås ved denne ICG-koncentration. Ved mellemliggende ICG-koncentrationer blev både DOX og ICG EE reduceret, mens prøvernes størrelse og spredningsevne var tilfredsstillende. Især, faldet i DOX EE angivet afbrydelse af liposomal membran og dermed pH-gradient. Ved høje ICG-koncentrationer blev prøverne igen geléret; DOX og ICG EE blev begge reduceret betydeligt.
LTSL10-ICG blev bestrålet med nær-infrarød laser (afsnit 7) for at fremkalde fototermisk opvarmning og udløste frigivelsen af DOX (Figur 10). Ved laserbestråling opvarmede prøven først op til 49,7 °C med en gradvis temperaturreduktion. Efterfølgende laserbestråling øgede temperaturen til 36,7 °C. Kvantificeringen af den frigivne DOX indikerede, at en fuldstændig burst frigivelse af indkapslet DOX blev opnået efter den første opvarmningcyklus. Dette var som forventet, da temperaturen nåede over 42 °C efter aftale med dox-udsætningsprofilen i figur 7D. I modsætning hertil kan LTSL10 uden ICG ikke levere fototermisk opvarmning, og dermed ikke frigive DOX ved laserbestråling.
Figur 1: Fotografi af sprøjten pumper setup. "Til netværk" port af master pumpen (Pump 01) er fastgjort til "Til computer" af den sekundære pumpe (Pumpe 02; gul); "Til computer"-porten for masterpumpen er fastgjort til computerens RS-232-port (blå). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fotografi af SHM-opsætningen. (A) Samlet visning af SHM-opsætningen. (B) Eksploderede visning af SHM setup. Indløb og udtag af SHM er forbundet til slanger ved hjælp af en møtrik og ferrule. Slangen af begge fjorde forlænges med en længere slange med møtrik og ferrule i hver ende, afsluttet af en kvindelig Luer adapter ved hjælp af en union forsamling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Grænseflade af pumpekontrolsoftwaren. De to sprøjtepumper skal registreres automatisk, når softwaren påbegyndes. ellers skal du klikke på Pumper i øverste venstre hjørne og søge efter pumper. De parametre, der skal konfigureres, fremhæves i røde bokse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Foto af sprøjtepumperne og installation af en sprøjte. (A) Sprøjteholderbeslag og sprøjteholdertommeltagebesætning (2, en på hver side) af sprøjtepumpen (gul kasse). Skubbeblok, justeringstommeltageog drevmøtrikknap (hvid knap til venstre) af sprøjtepumpen (grøn boks). (b) Placeringen af en installeret sprøjte på sprøjtepumpen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Foto af samling af sprøjter, varmeelement og SHM. (A) Samling af sprøjter, varmetape og termostat. B) Samling af sprøjter, varmebånd, termostat og SHM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Fotografi af laseropsætningen. (A) Fotografi af fiberkoblet lasersystem under drift. B) Kollimatorens placering 5 cm over 96-brøndpladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Karakterisering af LTSL10. (A) Fotografi af (venstre) LTSL10 og (højre) LTSL4, før dialyse. LTSL10 fremstod som klar og ikke-tyktflydende væske, mens LTSL4 var gel-lignende og tyktflydende. B) Z-gennemsnitsdiameter og dispersitet på 10 mM LTSL10 fremstillet ved 20 og 51 °C. Faste søjler og åbne cirkler (○) angiver henholdsvis Z-gennemsnitsdiameter og dispersitet. (C) DOX EE af LTSL4 (LF; hvid), LTSL10 (LF, hvid), og LTSL10 før (grå) og efter glødning (rød). D) DOX-frigivelse af LTSL10 (cirkel) og LTSL10 (LF; cross) ved 37 °C (sort) og 42 °C (rød). Data repræsenterer gennemsnitlige ± SD for mindst tre uafhængige forsøg. p < 0,001; to-tailed ikke-sammenpardet t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Termiske egenskaber af LTSL10. Termografer af LTSL4 (LF), LTSL10 (LF) og LTSL10 karakteriseret ved DSC. Stiplede linjer tilføjes som et visuelt hjælpemiddel af den indledende fase overgangstemperatur. Data repræsenterer gennemsnitet af mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Karakterisering af LTSL10-ICG. (A) Z-gennemsnitsdiameter (rød) og dispersitet (blå) af ICG-belastede LTSL10. B) DOX EE (rød) og ICG EE (grøn) af ICG-loaded LTSL10. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SD for mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Laser-induceret fototermisk opvarmning udløste frigivelsen af DOX-loaded LTSL10 og LTSL10-ICG. A) Temperaturen for bestrålede prøver ogb) DOX-frigivelse af DOX-loaded LTSL10 (blå) og LTSL10-ICG (rød) under den laserinducerede fototermiskopvarmning. Data repræsenterer den gennemsnitlige ± SD for mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Lipidblandinger, buffere og lagerløsninger.
| 20 mM LTSL10 lipid blanding (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, molar-forhold) |
For 1 ml 20 mM LTSL10 lipid blanding: 11,75 mg DPPC opløses med 210 μL MSPC-ethanollager (5 mg/ml), 558 μL DSPE-PEG2000 ethanollager (10 mg/ml) og 232 μL ethanol. Alternativt kan tilsvarende mængde MSPC (1,05 mg) og DSPE-PEG2000 (5,58 mg) tilsættes som pulver. |
| 20 mM LTSL10-ICG lipid blanding (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, molar-forhold ICG-til-lipid molar forhold = 0,003) |
For 1 ml 20 mM ICG-loaded LTSL10 lipid blanding: 11,75 mg DPPC opløses med 210 μL MSPC-ethanollager (5 mg/ml), 558 μL DSPE-PEG2000 ethanollager (10 mg/ml) og 46,5 μL ICG-ethanollager (1 mg/ml) og 185,5 μL ethanol. Alternativt kan tilsvarende mængde MSPC (1,05 mg) og DSPE-PEG2000 (5,58 mg) tilsættes som pulver. Indeholder 60 μM ICG og 20 mM lipid. |
| 240 mM Ammoniumsulfatopløsning (NH4)2SO4, pH 5.4 | 31,71 g (NH4)2SO4 pr. L deioniseret vand opløses. PH-værdien af opløsningen er indbygget 5,4, yderligere pH justering er ikke påkrævet. |
| Doxorubicin opløsning (DOX), 1 mg/ml | 1 mg DOX pr. ml deioniseret vand opløses. |
| DSPE-PEG2000 ethanollager, 10 mg/ml | 10 mg DSPE-PEG2000 opløses pr. ml ethanol. |
| HEPES-buffered saltvand (HBS), pH 7.4 | Der opløses 8,0 g NaCl og 4,766 g HEPES pr. L af deioniseret vand. Juster pH til 7,4 med 2,5 M NaOH-opløsning. |
| ICG ethanol lager, 1 mg/ml | 1 mg ICG pr. ml ethanol opløses. |
| MSPC ethanollager, 5 mg/ml | 5 mg DPPC pr. ml ethanol opløses. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver udarbejdelsen af lav temperaturfølsomme liposomer (LCL'er) ved hjælp af en forskudt sildeben micromixer (SHM). LTSL10-formuleringen muliggør temperaturudløst burstfrigivelse af doxorubicin inden for 5 minutter ved en klinisk opnåelig hyperterm temperatur på 42 °C. Indocyanin grøn (ICG) kan også være co-loaded til fototermisk opvarmning udløste frigivelsen af DOX. Metoden bygger på: i) selvsamling af fosfolipider i liposomer under et homogeniseret opløsningsmiddelmiljø, der er fastsat ved hurtig, kaotisk blanding af ethanol og ammoniumsulfatopløsning i SHM11; ii) udglødning af liposomerne for at bevare integriteten af lipidtolaget, der er afgørende for DOX-belastning og iii) fjernindlæsning af DOX i LTSLs med ammoniumsulfat pH-gradient17. Da det udstyr, der anvendes i denne protokol er kommercielt tilgængelige off-the-shelf og parametrene er optimeret, denne tilgang er håndterbar for brugere uden forudgående viden eller microfluidics erfaring.
Et af de mest kritiske trin i protokollen er at sikre, at hele samlingen er korrekt sikret, og at væske kan infunderes korrekt (trin 2.5). Da genproducerbarheden af selvmontering af liposomer er afhængig af et homogeniseret opløsningsmiddelmiljø, vil enhver ustabilitet, såsom forføring af sprøjter eller indførelse af luftbobler, forstyrre væskestrømmens stabilitet og resultere i suboptimal liposom størrelse og dispersity. Dette er også rationalet bag trin 2.8, hvor volumen, der består af den væske, der oprindeligt besætter kanalen, og før et stabilt flow er nået, skal bortskaffes.
Et andet kritisk skridt for et vellykket eksperiment er glødetrinnet for at muliggøre høj DOX EE (trin 2.11). I kolesterol-fri liposomer, micelle-dannende membran komponenter (dvs. MSPC og DSPE-PEG2000)vil akkumulere på korn grænser med en høj grad af fejl til at rumme en høj membran krumning2. Disse arrangementer termodynamisk favorisere dannelsen og stabilisere membran porer, åbnede liposomer, eller tolags diske. Den lave DOX EE af LTSL10 uden glødning antydede, at porøse strukturer eksisterede selv under Tm, hvilket resulterede i fraværet af pH gradient kræves for DOX lastning (Figur 7C). Den for tidlige dannelse af porer under Tm blev ikke observeret for lCL'er fremstillet af lipidfilm (LTSL4 (LF) og LTSL10 (LF)), hvor glødning ikke er påkrævet. Desuden kræver kolesterolholdige formuleringer fremstillet af mikrofluidik heller ikke annealing8. Det er derfor spekuleret på, at for tidlig dannelse af porer er en kombineret effekt af tilstedeværelsen af ethanol under præparatet og manglen på kolesterol i lipid tolaget. Strukturelle defekter i tolagsmembranen er blevet rapporteret at være elimineret ved at annealere liposomerne over Tm, så lipidmolekyler kan omfordele homogent , og at defekter skal korrigeres19. Hertil kommer, at annealing processen er en irreversibel proces, hvor annealed liposomer vender tilbage til en temperatur under Tm ikke genskabe utætte vesikler19, i overensstemmelse med den annealed LTSL10.
Arten af mikrofluidic præparat af liposom er en nanonedbørproces, som kræver to blandbare opløsningsmidler med karakteristisk opløselighed for lipiderne: typisk ethanol (som et lipidopløsningsmiddel) og vandig opløsning (som en lipid ikke-opløsningsmiddel). Tilstedeværelsen af ethanol er således uundgåelig. Derfor, formuleringer, der er følsomme eller tilbøjelige til alkohol-induceret interdigitation13, såsom kolesterol-fri liposomer20, kan kræve ændring af formuleringen eller reoptimering af protokollen. Som det fremgår af fremstillingen af LTSL4, blev den meget tyktflydende gel fremstillet (figur 7A), hvilket sandsynligvis skyldtes dannelsen af en interdigitated gel fase15. På den anden side blev LTSL10 med sin højere polymerkoncentration, der forhindrer interdigitation21,forberedt med succes. Der skal derfor også udføres en procedure for fjernelse af ethanol. her blev det fjernet blot ved dialyse. Mens on-chip kontinuerlig rensning teknikker såsom tangential flow filtrering (i stand til både ethanol fjernelse og buffer udveksling) er blevet udviklet22,23, deres gennemførelse (som one-chip eller modulære) er uden for formålet med denne protokol. Ikke desto mindre forventer vi i fremtiden, at disse modulære eller standardiserede designs optimeres og øges i tilgængelighed, hvilket strømliner den mikrofluidiske produktionsproces.
En anden begrænsning af protokollen er prøvetabet på grund af væskernes rejseafstand, nemlig den oprindelige affaldsmængde (trin 2.8) samt den sidste brøkdel af løsninger, der ville blive injiceret, men som ikke ville nå forretningen. Disse stikprøvetab er næsten uundgåelige og kan bidrage til en betydelig del af tilberedningsvolumenet ved bordproduktion, især når der skal fremstilles en lille mængde eller dyrebare prøver. Når det er nødvendigt, lipid opsving kunne kvantificeres ved højtydende flydende kromatografi-fordampningslys spredning detektor metode, der muliggør hurtig kvantificering af lipid koncentrationer24. Men når processen er optimeret og skaleret op, såsom ved hjælp af en større sprøjte eller væske reservoir, kunne gennemløbet være yderligere skaleret op og prøve tab ville være mindre signifikant.
Den væsentligste forskel mellem denne metode og den eksisterende tilberedningsmetode er, at liposomer er selvsamlet i et kontrollerbart opløsningsmiddelmiljø på en kontinuerlig måde med høj gennemløb. Lipidfilmmetoden er en batchproduktionsproces og kræver størrelseshomogenisering. Selv om det er meget muligt på en bænk-skala, er det fortsat udfordrende at skalere op til klinisk produktion. Inden for eksisterende mikrofluidiske teknikker, for eksempel, mikrofluidic hydrodynamisk fokusering, Tilbyder SHM en kortere blanding tidsskala11 og en større gennemløb (i rækken af mL / min) med lavere fortynding faktor; uanset udarbejdelsen af lcl'er er indtil videre ikke rapporteret ved hjælp af andre mikrofluidiske anordninger. Den største fordel ved vores tilgang er høj-throughput, skalerbar produktion af termofølsomme liposomer.
Hidtil har vores mikrofluidic protokol tilbyder kontinuerlig produktion af LTSL10 med narkotika lastning kapacitet. Nyttelast andre end DOX og ICG er også levedygtige. Men, ethanol fjernelse af dialyse, narkotika fjernlastning, og rensning af SEC kolonne forbliver som batch processer og er flaskehalse i den samlede formulering proces. Fremtidig udvikling kunne fokusere på at udnytte mikrofluidic tilgange (såsom tangential flow filtrering) for at forbedre gennemløbet af disse downstream processer og øge skalerbarheden af protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Prostata Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship), og Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) for finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer - Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
