Summary
Het protocol presenteert de geoptimaliseerde parameters voor de voorbereiding van thermogevoelige liposomen met behulp van de gespreide visgraat micromixer microfluidics apparaat. Dit maakt het ook mogelijk co-inkapseling van doxorubicin en indocyanine groen in de liposomen en de fotothermale geactiveerde release van doxorubicin voor gecontroleerde / getriggerde drug release.
Abstract
Het gepresenteerde protocol maakt een continue voorbereiding met hoge doorvoer mogelijk van lage temperatuurgevoelige liposomen (LTSLs), die chemotherapeutische geneesmiddelen kunnen laden, zoals doxorubicin (DOX). Om dit te bereiken, worden een ethanolisch lipidenmengsel en ammoniumsulfaatoplossing geïnjecteerd in een gespreide visgraatmicromixer (SHM) microfluïdisch apparaat. De oplossingen worden snel gemengd door de SHM, het verstrekken van een homogene oplosmiddel omgeving voor liposomen zelfassemblage. Verzamelde liposomen worden eerst ingeannealed, vervolgens dialyseerd om resterende ethanol te verwijderen. Een ammoniumsulfaatpH-gradiënt wordt vastgesteld door bufferuitwisseling van de externe oplossing met behulp van grootteuitsluitingschromatografie. DOX wordt dan op afstand geladen in de liposomen met een hoge inkapseling efficiëntie (> 80%). De verkregen liposomen zijn homogeen in grootte met Z-gemiddelde diameter van 100 nm. Ze zijn in staat om door de temperatuur geactiveerde burst-release van ingekapselde DOX in aanwezigheid van milde hyperthermie (42 °C). Indocyanine groen (ICG) kan ook worden meegeladen in de liposomen voor bijna-infrarood laser-triggered DOX release. De microfluïde benadering zorgt voor een hoge doorvoer, reproduceerbare en schaalbare voorbereiding van LTSLs.
Introduction
LTSL-formulering is een klinisch relevant liposomale product dat is ontwikkeld om het chemotherapeutische medicijn doxorubicin (DOX) te leveren en maakt het mogelijk om een efficiënt burst-medicijn vrij te laten bij klinisch haalbare milde hyperthermie (T ∙ 41 °C)1. De LTSL formulering bestaat uit 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPPC), de lysolipide 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosphatidylcholine (MSPC; M staat voor "mono") en PEGylated lipide 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (DSPE-PEG2000). Bij het bereiken van de faseovergangstemperatuur (Tm ∙ 41 °C) vergemakkelijken de lysolipide en DSPE-PEG2000 samen de vorming van membraanporiën, wat resulteert in een burst-afgifte van het medicijn2. De voorbereiding van LTSLs maakt voornamelijk gebruik van een bulk top-down benadering, namelijk lipide film hydratatie en extrusie. Het blijft een uitdaging om grote partijen met identieke eigenschappen en in voldoende hoeveelheden voor klinische toepassingen te bereiden3.
Microfluidics is een opkomende techniek voor het voorbereiden van liposomen, het aanbieden van tunable nanodeeltjes grootte, reproduceerbaarheid, en schaalbaarheid3. Zodra de productieparameters zijn geoptimaliseerd, kan de doorvoer worden opgeschaald door parallelisatie, met eigenschappen die identiek zijn aan die welke zijn voorbereid op bankschaal3,4,5. Een groot voordeel van microfluidica ten opzichte van conventionele bulktechnieken is de mogelijkheid om kleine vloeibare volumes met een hoge controleerbaarheid in ruimte en tijd te verwerken door middel van miniaturisatie, waardoor een snellere optimalisatie mogelijk is, terwijl het op een continue en geautomatiseerde manier werkt6. De productie van liposomen met microfluïde apparaten wordt bereikt door een bottom-up nanoneerslagbenadering, die meer tijd en energie-efficiënt is omdat homogenisatieprocessen zoals extrusie en sonicatie overbodig zijn7. Typisch, een organische oplossing (bijvoorbeeld ethanol) van lipiden (en hydrofobe payload) wordt gemengd met een verkeerde niet-oplosmiddel (bijvoorbeeld water en hydrofiele payload). Naarmate het organische oplosmiddel zich mengt met het niet-oplosmiddel, wordt de oplosbaarheid voor de lipiden verminderd. De lipideconcentratie bereikt uiteindelijk een kritische concentratie waarbij het neerslagproces wordt geactiveerd7. Nanoprecipitates van lipiden groeien uiteindelijk in omvang en sluiten in een liposoom. De belangrijkste factoren voor de grootte en homogeniteit van de liposomen zijn de verhouding tussen het niet-oplosmiddel en oplosmiddel (d.w.z. water-naar-organische stroomsnelheidverhouding; FRR) en de homogeniteit van het oplosmiddel milieu tijdens de zelfassemblage van lipiden in liposomen8.
Efficiënt mengen van vocht in microfluidica is daarom essentieel voor de bereiding van homogene liposomen, en verschillende ontwerpen van mixers zijn gebruikt in verschillende toepassingen9. Gespreide visgraat micromixer (SHM) vertegenwoordigt een van de nieuwe generaties passieve mixers, die een hoge doorvoer (in het bereik van mL / min) met een lage verdunningsfactor mogelijk maakt. Dit is superieur aan traditionele microfluïde hydrodynamische mengapparaten8,10. De SHM heeft patroon visgraat groeven, die snel mengen vloeistoffen door chaotische advection9,11. De korte mengtijdschaal van SHM (< 5 ms, minder dan de typische aggregatietijdschaal van 10-100 ms) maakt zelfassemblage van lipide mogelijk in een homogene oplosmiddelomgeving, waardoor nanodeeltjes met uniforme grootteverdeling3,12worden geproduceerd.
De bereiding van LTSLs met microfluidics is echter niet zo eenvoudig in vergelijking met conventionele liposomale formuleringen als gevolg van het gebrek aan cholesterol8, zonder welke lipide bilayers gevoelig zijn voor door ethanol geïnduceerde interdigitatie13,14,15. Tot nu toe is het effect van restethanol presenteert tijdens de microfluïde productie van liposomen niet goed begrepen. De meerderheid van de gerapporteerde formuleringen zijn inherent resistent tegen interdigitatie (met cholesterol of onverzadigde lipiden)16, die in tegenstelling tot LTSLs zijn zowel verzadigd en cholesterol-vrij.
Het protocol hierin gebruikt SHM om LTSLs voor te bereiden op de levering van door de temperatuur geactiveerde geneesmiddelen. In de gepresenteerde methode hebben we ervoor gezorgd dat de microfluïde-voorbereide LTSLs nanoformaat (100 nm) en uniform (dispersity < 0.2) zijn door dynamische lichtverstrooiing (DLS). Verder hebben we DOX ingekapseld met behulp van de transmembraan ammoniumsulfaatgradiëntmethode (ook bekend als remote loading)17 als validatie van de integriteit van de LTSL lipide bilayer. Het laden op afstand van DOX vereist dat het liposoom een pH-gradiënt behoudt om een hoge inkapselingsefficiëntie (EE) te bereiken, wat waarschijnlijk niet zal gebeuren zonder een intacte lipidebilaag. In deze gepresenteerde methode, onderscheidend van typische microfluïde liposoom voorbereiding protocollen, een annealing stap is vereist voordat de ethanol wordt verwijderd om de remote laadvermogen mogelijk te maken; d.w.z. om de integriteit van de lipidebilaag te herstellen.
Zoals eerder vermeld, kunnen hydrofiele en hydrofobe payloads ook worden geïntroduceerd in de eerste oplossingen voor de gelijktijdige inkapseling van payloads tijdens de vorming van LTSLs. Als proof-of-concept, indocyanine groen (ICG), een FDA-goedgekeurde nabij-infrarood fluorescerende kleurstof, die ook een veelbelovende fotothermische agent, wordt ingevoerd om de eerste lipide mengsel en met succes samen geladen in de LTSLs. Een 808 nm laser wordt gebruikt om de DOX/ICG-loaded LTSLs te bestralen en met succes te induceren fotothermische verwarming-geactiveerde burst release van DOX binnen 5 min.
Alle instrumenten en materialen zijn commercieel beschikbaar, gebruiksklaar en zonder de noodzaak van maatwerk. Aangezien alle parameters voor het formuleren van LTSLs zijn geoptimaliseerd, volgens dit protocol, onderzoekers zonder voorkennis van microfluidics kon ook de LTSLs, die dient als basis van een thermogevoelig drug delivery systeem voor te bereiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uitrustingsopstelling
- Monteer de spuitpompen en SHM als volgt.
- Sluit de "To Computer"-poort van de secundaire spuitpomp (Pomp 02, voor waterige oplossing) aan op de "To Network"-poort van de hoofdspuitpomp (Pomp 01, voor ethanollipideoplossing) met behulp van Pomp to Pump-netwerkkabel(figuur 1, geel).
- Sluit de poort "To Computer" van de hoofdpomp aan op de "RS232 Serial"-poort van de computer met behulp van pc op pompnetwerkkabel(figuur 1, blauw).
- Sluit buizen aan op elk van de inhammen en uitlaten van de SHM met behulp van een moer en ferrule. Zet de terminal van de slang voor beide inhammen om in vrouwelijke Luer met behulp van een andere moer en ferrule en een unie vergadering. Langere slang van de inhammen maakt het gemakkelijker gehechtheid aan de spuiten(figuur 2).
- Stel de pompbesturingssoftware in.
- Wijs het adres van de hoofdspuitpomp en de secundaire spuitpomp toe aan respectievelijk 'Advertentie:01' en 'Advertentie:02', met de knop 'Setup' van de spuitpomp. Dit hoeft alleen maar voor de eerste keer te gebeuren.
- Open de pompbesturingssoftware op de computer. De twee spuitpompen moeten automatisch worden gedetecteerd, gevolgd door een piepend geluid. Klik anders op Pompen en Zoek naar pompen om de verbinding bij te werken. (Figuur 3).
- Geef diameter toe aan 12,45 (mm) door te kiezen voor "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia=12.45)".
- Wijs Tarief toe aan 0,25 mL/min voor pomp 01 (ethanol lipideoplossing) en 0,75 mL/min voor pomp 02 (waterige oplossing). De stroomsnelheden komen overeen met een totale stroomsnelheid (TFR) van 1 mL/min en water-tot-ethanol stroomsnelheid ratio (FRR) van 3.
- Volume toewijzen aan waarden boven 5 mL.
OPMERKING: Het beoogde infusievolume is groter dan het geladen vloeistofvolume, rekening houdend met het lege volume van de slang. - Selecteer de INF-modus (infusie) voor beide pompen.
- Druk op Set om de instellingen te bevestigen.
2. De LTSL's voorbereiden
- Bereid een LTSL10- of LTSL10-ICG-lipidemengsel voor (zie tabel 1).
- Trek 1 mL lipidemengsel en ten minste 3 mL (NH4)2SO4 oplossing met behulp van twee 5 mL Luer lock spuiten.
- Installeer de twee spuiten op de spuitpompen in de rechtopstaande positie door de loopflens van de spuit naar de spuithouder van de pomp te schuiven en de zuigerflens van de spuit naar het duwblok van de pomp te schuiven (figuur 4).
- Wikkel het uiteinde van de verwarmingstape met de waterige oplossing in de spuit. Wikkel het andere uiteinde van de verwarmingstape en temperatuursonde van de thermostaat rond de spuit met de lipideoplossing. Het is nuttig om deze stap te oefenen met lege spuiten op zijn plaats om het assemblageproces te vergemakkelijken (figuur 5A).
- Sluit de twee spuiten aan op de vrouwelijke Luer adapters van de overeenkomstige inhammen van de SHM. Zorg ervoor dat de spuiten met het lipidemengsel en (NH4)2SO4-oplossingen respectievelijk ethanolinlaat en waterige inlaat zijn aangesloten. Pas de dompelpositie aan om luchtbellen uit de spuiten te verwijderen (figuur 5B).
LET OP: Zorg ervoor dat de spuiten nog steeds veilig op de spuithouder van de pompen zijn geplaatst. - Verwarm de spuiten op tot boven de 51 °C met behulp van de verwarmingstape met behulp van een 10 s verwarmingssessie. Laat de thermostaat de temperatuur van de spuiten bijwerken. Herhaal deze stap in de volgende stappen om de temperatuur tijdens de infusie te behouden.
LET OP: Schakel de verwarmingstape na 10 s uit om temperatuuroverschrijding te voorkomen en laat de thermostaat de werkelijke temperatuur bijwerken. De verwarmingstape moet ook met zorg worden behandeld, omdat de temperatuur zeer snel stijgt. Verwarming kan continu de apparatuur en spuiten beschadigen, als gevolg van de vertraging van de thermostaat voor het bijwerken van de gemeten temperatuur. - Zodra de temperatuur boven de 51 °C ligt, voert u de spuitpompen uit door op Run All in de pompcontrolesoftware te drukken (figuur 3).
- Zorg ervoor dat de vloeistofstroom vrij is van luchtbellen en eventuele lekkages. Gooi het initiële volume (ongeveer 0,5 mL) vloeistof uit de uitlaat als afval.
OPMERKING: Dit initiële afvalvolume is niet definitief en is afhankelijk van het interne volume van de installatie, dat is het volume voor vloeistof om van de spuiten door de slang en SHM naar de uitlaat te reizen. - Verzamel de rest van de vloeistof als liposoommonsters in een microcentrifugebuis of bijou flacon.
- Pauzeer/stop de infusie wanneer de vloeistof in een van de spuiten bijna leeg is.
OPMERKING: De pompen moeten handmatig worden gestopt, omdat de pompen de positie wanneer de spuiten leeg zijn niet nauwkeurig kunnen detecteren. - Plaats de verzamelde liposoomoplossingen in een waterbad van 60 °C tot 1,5 uur.
OPMERKING: Deze stap is essentieel bij het inschakelen van het laden van geneesmiddelen in de liposomen. - Breng de oplossingen over naar dialysebuizen. Dialyze de oplossingen tegen 1 L van 240 mM (NH4)2SO4 bij 37 °C gedurende ten minste 4 uur om gezuiverde liposomen te verkrijgen.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Liposomen bij deze stap zijn op 5 mM fosfolipide. Gezuiverde liposomen kunnen worden opgeslagen bij 4 °C. - Om de SHM schoon te maken voor herhaald gebruik, spoel de SHM achtereenvolgens door met gedeïoniseerd water, ethanol en droog met stikstofgas.
3. Externe belasting van DOX in LTSLs door transmembraan pH-gradiënt
- Wissel externe buffer van LTSLs uit in HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) met behulp van size exclusion chromatografie (SEC) om een transmembraanpH-gradiënt vast te stellen.
- Voeg in totaal 25 mL HBS toe aan de bovenkant van een SEC-kolom om de kolom voor te bereiden. Laat alle eluent door de kolom lopen en gooi het eluaat weg.
- Voeg 1 mL dialyzed liposomen, bereid vanaf stap 2.12, toe aan de kolom en gooi de uitlijn weg.
- Voeg 1,5 mL HBS toe aan de kolom en gooi de uitlaris weg.
- Voeg 3 mL HBS toe aan de kolom en verzamel de 3 mL uituit.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. Liposomen worden verzameld bij deze stap en zijn op 1,67 mM fosfolipiden. Buffer uitgewisseldliposomen kunnen worden opgeslagen bij 4 °C.
- Incubeer LTSLs met doxorubicin (DOX) en zuiver LTSLs.
- Voeg DOX-oplossing toe in 1:20 DOX-to-fofolipide molverhouding in 1 mL buffer-exchanged liposomen oplossing (1,67 mmol) in een bijou flacon. Dit kan worden bereikt door toevoeging van 48,4 μL van 1 mg/mL DOX-oplossing (83,4 μmol).
- Plaats de bijou flacon gedurende 1,5 uur in een waterbad van 37 °C om DOX in de liposomen te kunnen laden.
- Meng 10 μL van de liposomen met 170 μL HBS en 20 μL van 1% (v/v) Triton X-100 oplossing in een zwarte 96-put plaat. Herhaal voor drie putten. Deze putten komen overeen met het "vóór zuivering" DOX-gehalte.
- Meng bij de voorbereiding van LTSL10-ICG 40 μL van de liposomen met 160 μL DMSO in een duidelijke 96-putplaat. Herhaal voor drie putten. Deze putten komen overeen met het "vóór zuivering" ICG-gehalte.
- Zuiver de liposoomoplossing zoals beschreven in stap 3.1.
OPMERKING: Om de kolom te hergebruiken voor toekomstige zuivering, reinigt u de kolom van gratis DOX door eerst 1 mL verdunde 0,5 M NaOH-oplossing toe te voegen voordat u stap 3.1.1 uitvoert. Gratis DOX in het rood zal worden violet-blauw en elute door de kolom snel. - Meng 30 μL van de gezuiverde liposomenoplossing met 150 μL HBS en 20 μL van 1% (v/v) Triton X-100 oplossing in een zwarte 96-put plaat. Herhaal voor drie putten. Deze putten komen overeen met het "nazuivering" DOX-gehalte.
- Meng in het geval van LTSL10-ICG 40 μL van de gezuiverde liposomenoplossing met 160 μL DMSO in een heldere 96-putplaat. Herhaal voor drie putten. Deze putten komen overeen met het "nazuivering" ICG-gehalte.
- Meet de DOX fluorescentieintensiteit van de putten vóór (stap 3.2.3) en na (stap 3.2.5) zuivering, met behulp van een microplate reader (λex = 485 nm, λem = 590 nm).
- Bereken de inkapselingsefficiëntie van DOX (DOX EE) door de verhouding van de fluorescentieintensiteiten voor en na de zuivering in te nemen.
- Meet de ICG-absorptie van de putten voor en na zuivering met behulp van een microplaatlezer (600 tot 1000 nm).
- Bereken de inkapselingsefficiëntie van ICG (ICG EE) door de verhouding van de absorptie op 792 nm voor en na zuivering te nemen, rekening houdend met de verdunningsfactor (3 keer) tijdens de zuivering.
4. Dynamic Light Scattering (DLS)
- Voeg 50 μL liposomenoplossing (stap 2.12) toe aan 450 μL gedeïoniseerd water.
- Plaats de cuvette in het DLS-instrument en voer de meting uit volgens de instructies van de fabrikant.
- Noteer de gemiddelde Z-gemiddelde diameter en dispersie van drie metingen voor elk monster.
5. Differentiële scancalorimetrie (DSC)
- Concentraat 1 mL van de liposomen monsters (stap 2.12) met een centrifugale filter eenheid tot 0,5 mL (uiteindelijke lipide concentratie van 10 mM). Met behulp van een rotor met vaste hoek draait u ongeveer 15 min op 7500 x g.
- Breng 20 μL (NH4)2SO4-oplossing en liposomenmonsters over naar twee respectievelijke DSC-pannen. Sluit de pannen af met DSC hermetische deksels met behulp van de DSC sample press kit.
- Meet het monster van 30 °C tot 60 °C met een verwarmingssnelheid van 1 °C/min met behulp van een differentiële scancalorimeter.
- Analyseer de gegevens met de juiste software. Neem de faseovergangstemperatuur (Tm)als het begin van de faseovergang (smeltpiek), die wordt gemeten door de x-interceptie van de raaklijn van het punt van maximale helling.
6. Doxorubicin release
- Verwarm HBS voor bij de aangewezen temperatuur (37 of 42 °C) met behulp van een waterbad. Bereid een ijswaterbad voor om de monsters te blussen.
- Voeg 100 μL gezuiverde DOX-geladen liposomen (stap 3.2.5) toe in 1,9 mL HBS in een microcentrifugebuis. Plaats de buis in het waterbad van de aangewezen temperatuur.
- Trek onmiddellijk 200 μL monsters uit de buis en plaats deze snel in het ijswaterbad om eventuele daaropvolgende medicijnafgifte te blussen. Dit monster komt overeen met het initiële (t = 0) tijdspunt.
- Trek 200 μL monsters op de volgende tijdpunten (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) en plaats het snel in het ijswaterbad om eventuele drugsvrijgave te blussen.
- Meng 50 μL monster van elk tijdpunt met 150 μL HBS in een zwarte 96-putplaat. Meet de DOX fluorescentieintensiteit met behulp van een plaatlezer.
- Voeg 20 μL van 1% (v/v) Triton X-100 toe aan willekeurig geselecteerde putten bereid in stap 6.5. Meet de DOX fluorescentieintensiteit van deze putten met behulp van een plaatlezer. Deze waarden komen overeen met het volledig vrijgegeven (t = ∙; 100% release) tijdpunt.
- Bereken en plot het percentage DOX dat is vrijgegeven door de fluorescentieintensiteit van elke tijdpunten (I(t)) te interpoleren, vergeleken met de initiële (I(0)), en volledig vrijgegeven (I(∙)), waarde.
7. Laserverwarming en geactiveerde release
- Stel de temperatuur van het waterbad in op 37 °C en laat de temperatuur stabiliseren.
- Voeg 200 μL DOX geladen LTSL10-ICG ([ICG] = 10 μg/mL) toe aan een heldere 96-putplaat en plaats deze vervolgens in het waterbad, houd de bodem ondergedompeld in water.
- Stel de stroom van het lasersysteem in op 2,27 A. Plaats de collimator van het lasersysteem op 5 cm verticaal boven het oppervlak van de 96-putplaat, wat overeenkomt met een energieflux van 0,5 W/cm2 [Figuur 6].
LET OP: Het lasersysteem moet worden gebruikt in overeenstemming met relevante laserveiligheidsmaatregelen. - Schakel de laser in en controleer de temperatuur elke minuut met behulp van een glasvezeltemperatuursonde.
- Trek bij 5 en 10 min 10 μL laserbestraalde liposomen van de heldere 96-putplaat op en meng met 190 μL HBS voor drie putten in een zwarte 96-putplaat.
- Meng 10 μL van de liposomen met 170 μL HBS en 20 μL van 1% (v/v) Triton X-100 oplossing voor drie putten in een zwarte 96-put plaat. Deze putten komen overeen met de "100% vrijgegeven" DOX-inhoud. Meet de DOX fluorescerende intensiteit en bereken de DOX-release zoals beschreven in stap 6.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bereiding van LTSLs door microfluidics vereist de lipidesamenstelling van DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, molaire verhouding; LTSL10). Figuur 7A (links) toont het uiterlijk van as-prepared LTSL10 vanaf stap 2.9, als een duidelijke en niet-viskeuze vloeistof. LTSL10 formulering is ontwikkeld uit de conventionele formulering, LTSL4 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000, 86/10/4, molar ratio) sinds LTSL4 vormt een gel-achtige viskeuze monster, zoals aangegeven door de grote hoeveelheid luchtbellen gevangen in het monster (figuur 7A; rechts).
Dls-meting van LTSL10 (figuur 7B, rood) toonde aan dat de Z-Gemiddelde diameter en dispersie van LTSL10 respectievelijk 95,28 ± 7,32 nm en 0,100 ± 0,022 bedroegen, wat het succes van het experiment aangeeft. Figuur 7B (grijs) toont ook een suboptimaal monster, dat werd bereid bij 20 °C, waar grotere en meer verspreide liposomen werden verkregen.
Figuur 7C laat zien dat de DOX EE van LTSL10. DOX EE moet meestal rond de 80%. LTSLs bereid volgens de conventionele methode van lipide film hydratatie met extrusie (LF) zijn opgenomen voor vergelijking, bereid zoals elders beschreven18. DOX EE van LTSL4 (LF) en LTSL10 (LF) toonde een fatsoenlijke DOX-belasting van respectievelijk ongeveer 70% en 50%. Annealing van as-prepared LTSL10 (stap 2.11) is essentieel om DOX laden mogelijk te maken. Bij afwezigheid van de annealing stap, lage DOX EE (< 20%) was persistent, ongeacht de incubatietemperatuur (20 °C tot 42 °C) en de duur (1 tot 24 uur). Dit wees op het falen van LTSL10 om een transmembraan pH-gradiënt te behouden, waarbij DOX in plaats daarvan passief of door adsorptie werd geladen. Door de as-prepared LTSL10 te annealiseren, steeg de DOX EE aanzienlijk tot een gemiddelde van 85%, wat wijst op het succes van de remote loading van DOX en de aanwezigheid van het transmembraan pH-gradiënt.
Figuur 7D toont het DOX-releaseprofiel van LTSL10. Bij 37 °C was de afgifte van ingekapselde DOX over 60 min ongeveer 10%. Bij 42 °C daarentegen werd alle ingekapselde DOX binnen 5 minuten vrijgegeven, wat de temperatuurgevoeligheid van LTSL10 aantoonde. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen met LTSL10 (LF) als controle.
Figuur 8 toont de faseovergangstemperatuur (Tm)van LTSL10 die wordt gekenmerkt met behulp van differentiële scancalorimetrie (DSC). Stippellijnen als raaklijn van het punt van maximale helling, worden toegevoegd als een visueel hulpmiddel van de beginfase overgangstemperatuur (x-intercept van de raaklijn). LTSL10 kent een relatief brede faseovergang met een begin bij 41,6 °C en piek bij 42,6 °C. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen met LTSL10 (LF), wat wijst op een klein verschil tussen de bereidingstechnieken. Ter vergelijking: LTSL4 (LF) kent een lagere en scherpere faseovergang, in overeenstemming met de literatuur1.
Figuur 9 toont de karakterisering van LTSL10-ICG. Het effect van de initiële ICG-concentratie op de grootte (figuur 9A) en de laadefficiëntie van DOX en ICG (figuur 9B) zijn onderverdeeld in drie concentratiebereiken. Bij een lage ICG-concentratie (ICG-to-lipide molaire verhouding van 0,003; initiële concentratie van 60 μM ICG en 20 mM lipide), z-gemiddelde, dispersie en DOX EE waren vergelijkbaar met LTSL10 zonder ICG-belasting; ICG EE was ongeveer 75%. De efficiënte co-loading van DOX en ICG in LTSL10 kan worden bereikt bij deze ICG-concentratie. Bij intermediaire ICG-concentraties, terwijl de omvang en de spreiding van de monsters bevredigend waren, werden zowel DOX als ICG EE verminderd. In het bijzonder duidde de afname van DOX EE op de verstoring van het liposomale membraan en dus op de pH-gradiënt. Bij hoge ICG-concentraties werden opnieuw monsters gelled; DOX en ICG EE daalden beide aanzienlijk.
LTSL10-ICG werd bestraald met nabij-infrarood laser (sectie 7) om fotothermische verwarming te induceren en activeerde de release van DOX (figuur 10). Bij laserbestraling verwarmde het monster eerst tot 49,7 °C met een geleidelijke temperatuurvermindering. De daaropvolgende laserbestraling verhoogde de temperatuur tot 36,7 °C. Kwantificering van de vrijgegeven DOX gaf aan dat een volledige burst release van ingekapselde DOX werd bereikt na de eerste verwarmingscyclus. Dit was zoals verwacht, aangezien de temperatuur boven de 42 °C kwam, in overeenstemming met het DOX-releaseprofiel in figuur 7D. LtSL10 zonder ICG kan daarentegen geen fotothermische verwarming leveren en heeft DUS DOX niet vrijgegeven bij laserbestraling.
Figuur 1: Foto van de spuit pompen setup. De "To Network"-poort van de hoofdpomp (pomp 01) is bevestigd aan de "To Computer" van de secundaire pomp (Pomp 02; geel); de "To Computer"-poort van de hoofdpomp is bevestigd aan de RS-232-poort van de computer (blauw). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Foto van de SHM setup. (A) Geassembleerde weergave van de SHM setup. (B) Geëxplodeerde weergave van de SHM-instelling. Inhammen en uitlaten van de SHM zijn verbonden met buizen met behulp van een moer en ferrule. De slang van beide inhammen wordt uitgebreid door een langere slang met moer en ferrule aan elk uiteinde, beëindigd door een vrouwelijke Luer adapter met behulp van een unie assemblage. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Interface van de pompbesturingssoftware. De twee spuitpompen moeten automatisch worden gedetecteerd bij het starten van de software; anders, klik op Pompen in de linkerbovenhoek en Zoek naar pompen. Parameters die moeten worden geconfigureerd, worden gemarkeerd in rode vakken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Foto van de spuitpompen en installatie van een spuit. (A) Spuithouder beugel en spuit houder thumbscrew (2, een aan elke kant) van de spuitpomp (gele doos). Duwblok, verstel duimbemanning en drive-nut knop (witte knop links) van de spuitpomp (groene doos). (B) Positie van een geïnstalleerde spuit op de spuitpomp. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Foto van de montage van spuiten, verwarmingselement en SHM. (A) Montage van spuiten, verwarmingstape en thermostaat. (B) Montage van spuiten, verwarmingstape, thermostaat en SHM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Foto van de laser setup. (A) Foto van de vezel gekoppeld lasersysteem tijdens het gebruik. (B) Positie van de collimator 5 cm boven de 96-put plaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Karakterisering van LTSL10. (A) Foto van (links) LTSL10 en (rechts) LTSL4, vóór dialyse. LTSL10 verscheen als duidelijke en niet-viskeuze vloeistof, terwijl LTSL4 was gel-achtige en stroperige. b) Z-gemiddelde diameter en spreiding van 10 mM LTSL10 bereid bij 20 en 51 °C. Vaste staven en open cirkels (∙ geven respectievelijk z-gemiddelde diameter en dispersie aan. (C) DOX EE van LTSL4 (LF; wit), LTSL10 (LF; wit) en LTSL10 voor (grijs) en na annealing (rood). (D) DOX-afgifte van LTSL10 (cirkel) en LTSL10 (LF; kruis) bij 37 °C (zwart) en 42 °C (rood). Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten. p < 0,001; twee-tailed ongepaarde t-tests. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Thermische eigenschappen van LTSL10. Thermografen van LTSL4 (LF), LTSL10 (LF) en LTSL10 worden gekenmerkt door DSC. Stippellijnen worden toegevoegd als visueel hulpmiddel bij de overgangstemperatuur van de beginfase. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: Karakterisering van LTSL10-ICG. (A) Z-gemiddelde diameter (rood) en dispersie (blauw) van ICG-geladen LTSL10. (B) DOX EE (rood) en ICG EE (groen) van ICG-geladen LTSL10. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 10: Laser-geïnduceerde fotothermische verwarming leidde tot de release van DOX-geladen LTSL10 en LTSL10-ICG. (A) De temperatuur van bestraalde monsters en (B) DOX-afgifte van DOX-geladen LTSL10 (blauw) en LTSL10-ICG (rood) tijdens de laser-geïnduceerde fotothermische verwarming. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: Lipidemengsels, buffers en voorraadoplossingen.
| 20 mM LTSL10 lipidemengsel (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, molar ratio) |
Voor 1 mL van 20 mM LTSL10 lipide mengsel: Los 11,75 mg DPPC op met 210 μL MSPC-ethanolbouillon (5 mg/mL), 558 μL DSPE-PEG2000 ethanol (10 mg/mL) en 232 μL ethanol. Als alternatief kan een gelijkwaardige hoeveelheid MSPC (1,05 mg) en DSPE-PEG2000 (5,58 mg) als poeder worden toegevoegd. |
| 20 mM LTSL10-ICG lipidemengsel (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, molaire verhouding; ICG-to-lipide molaire verhouding = 0,003) |
Voor 1 mL van 20 mM ICG-loaded LTSL10 lipide mengsel: Los 11,75 mg DPPC op met 210 μL MSPC-ethanolbouillon (5 mg/mL), 558 μL DSPE-PEG2000 ethanol (10 mg/mL) en 46,5 μL ICG-ethanolbouillon (1 mg/mL) en 185,5 μL ethanol. Als alternatief kan een gelijkwaardige hoeveelheid MSPC (1,05 mg) en DSPE-PEG2000 (5,58 mg) als poeder worden toegevoegd. Bevat 60 μM ICG en 20 mM lipide. |
| 240 mM Ammoniumsulfaatoplossing (NH4)2SO4, pH 5.4 | Los 31,71 g (NH4)2SO4 per L gedeïoniseerd water op. De pH van de oplossing is native 5.4, extra pH-aanpassing is niet nodig. |
| Doxorubicinoplossing (DOX), 1 mg/mL | Los 1 mg DOX per mL gedeïoniseerd water op. |
| DSPE-PEG2000 ethanolbouillon, 10 mg/mL | Los 10 mg DSPE-PEG2000 per mL ethanol op. |
| HEPES-gebufferde zoutlijn (HBS), pH 7.4 | Los 8,0 g NaCl en 4.766 g HEPES per L van gedeïoniseerd water op. Pas de pH aan op 7,4 met een NaOH-oplossing van 2,5 M. |
| ICG ethanolvoorraad, 1 mg/mL | Los 1 mg ICG per mL ethanol op. |
| MSPC ethanolvoorraad, 5 mg/mL | Los 5 mg DPPC per mL ethanol op. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft de bereiding van lage temperatuurgevoelige liposomen (LTSLs) met behulp van een gespreide visgraatmicromixer (SHM). De LTSL10-formulering maakt het mogelijk om de temperatuur geactiveerde burst-release van doxorubicin binnen 5 minuten bij een klinisch haalbare hypertherische temperatuur van 42 °C. Indocyanine groen (ICG) kan ook worden meegeladen voor fotothermische verwarming veroorzaakt de release van DOX. De methode is gebaseerd op: i) zelfassemblage van fosfolipiden tot liposomen onder een gehomogeniseerd oplosmiddelmilieu dat wordt geboden door de snelle, chaotische vermenging van ethanol en ammoniumsulfaatoplossing in de SHM11; ii) het gloeien van de liposomen om de integriteit van de lipidebilaag te behouden die essentieel is voor het laden van DOX; en iii) het op afstand laden van DOX in LTSLs door een ammoniumsulfaatpH-gradiënt17. Aangezien de apparatuur die in dit protocol wordt gebruikt, per schap commercieel beschikbaar is en de parameters zijn geoptimaliseerd, is deze aanpak beheersbaar voor gebruikers zonder voorkennis of microfluidica-ervaring.
Een van de meest kritieke stappen binnen het protocol is ervoor te zorgen dat de hele assemblage goed is beveiligd en vloeistof goed kan worden toegediend (stap 2.5). Aangezien de reproduceerbaarheid van de zelfassemblage van liposomen afhankelijk is van een gehomogeniseerde oplosmiddelomgeving, zal elke instabiliteit, zoals het losmaken van spuiten of het binnenbrengen van luchtbellen, de stabiliteit van de vloeistofstroom verstoren en resulteren in suboptimale lipoomengrootte en dispersie. Dit is ook de reden achter stap 2.8, waarbij het volume, bestaande uit de vloeistof die aanvankelijk het kanaal bezet en voordat een stabiele stroom wordt bereikt, moet worden verwijderd.
Een tweede kritieke stap voor een succesvol experiment is de annealing stap, om hoge DOX EE (stap 2.11) mogelijk te maken. In cholesterolvrije liposomen zullen micellevormende membraancomponenten (d.w.z. MSPC en DSPE-PEG2000)zich ophopen aan graangrenzen met een hoge mate van defecten om een hoge membraankromming aan te passen2. Deze regelingen thermodynamisch voorstander van de vorming en stabiliseren membraan poriën, geopend liposomen, of tweelaagse schijven. De lage DOX EE van LTSL10 zonder annealing suggereerde dat poreuze structuren zelfs onder Tmbestonden , wat resulteerde in de afwezigheid van de pH-gradiënt die nodig is voor DOX-belasting (figuur 7C). De voortijdige vorming van poriën onder Tm werd niet waargenomen voor LTSLs bereid door lipidefilm (LTSL4 (LF) en LTSL10 (LF)), waar annealing niet nodig is. Bovendien vereisen cholesterolhoudende formuleringen die door microfluidica worden bereid, ook geen annealing8. Daarom wordt gespeculeerd dat de voortijdige vorming van poriën een gecombineerd effect is van de aanwezigheid van ethanol tijdens het preparaat en het gebrek aan cholesterol in de lipidebilaag. Structurele defecten in het tweelaagse membraan zijn gemeld te worden geëlimineerd door het gloeien van de liposomen boven Tm, waardoor lipide moleculen homogeen te herverdelen en gebreken worden gecorrigeerd19. Bovendien is het annealingproces een onomkeerbaar proces waarbij annealed liposomen die terugkeren naar een temperatuur onder Tm geen lekkende blaasjes19nabootsen , in overeenstemming met de annealed LTSL10.
De aard van microfluïde werking van liposoom is een nanoneerslagproces, dat twee miscible oplosmiddelen met onderscheidende oplosbaarheid voor de lipiden vereist: meestal ethanol (als lipideoplosmiddel) en waterige oplossing (als lipide niet-oplosmiddel). Zo is de aanwezigheid van ethanol onvermijdelijk. Daarom kunnen formuleringen die gevoelig zijn of gevoelig zijn voor door alcohol geïnduceerde interdigitatie13, zoals cholesterolvrije liposomen20, modificatie van de formulering of heroptimalisatie van het protocol vereisen. Zoals aangetoond met de voorbereiding van LTSL4, werd de zeer viskeuze gel verkregen , (figuur 7A), die waarschijnlijk te wijten was aan de vorming van een interdigitated gel fase15. Aan de andere kant werd LTSL10, met zijn hogere polymeerconcentratie die interdigitatie21voorkomt, met succes voorbereid. Bijgevolg moet ook een procedure voor het verwijderen van ethanol worden uitgevoerd; hier werd het gewoon verwijderd door dialyse. Terwijl on-chip continue zuiveringstechnieken zoals tangentiële stroomfiltratie (geschikt voor zowel ethanol verwijdering en buffer uitwisseling) zijn ontwikkeld22,23, de uitvoering ervan (als een-chip of modulair) zijn buiten het doel van dit protocol. Desalniettemin verwachten we dat deze modulaire of gestandaardiseerde ontwerpen in de toekomst worden geoptimaliseerd en meer beschikbaar zijn, waardoor het microfluïdeproductieproces wordt stroomlijnd.
Een andere beperking van het protocol is het monsterverlies als gevolg van de reisafstand van de vloeistoffen, namelijk het oorspronkelijke afvalvolume (stap 2.8) en het laatste deel van de oplossingen die zouden worden geïnjecteerd, maar niet de uitlaat zou bereiken. Deze monsterverliezen zijn bijna onvermijdelijk en kunnen bijdragen tot een aanzienlijk deel van het voorbereidingsvolume bij de productie op bankschaal, vooral wanneer een klein volume of kostbare monsters moeten worden voorbereid. Indien nodig kan het lipideherstel worden gekwantificeerd door hoogwaardige vloeistofchromatografie-verdampingslichtverstrooiingsdetectormethode die snelle kwantificering van lipideconcentratiesmogelijk maakt 24. Echter, zodra het proces is geoptimaliseerd en opgeschaald, zoals met behulp van een grotere spuit of vloeistof reservoir, de doorvoer kan verder worden opgeschaald en monster verliezen zou minder significant zijn.
Het belangrijkste verschil tussen deze methode en de bestaande bereidingsmethode is dat liposomen op een krachtige, continue manier zelf worden geassembleerd in een controleerbare oplosmiddelomgeving. De lipide film methode is een batch productieproces en vereist grootte homogenisatie. Hoewel zeer haalbaar op een bankschaal, blijft het een uitdaging om op te schalen voor klinische productie. Binnen bestaande microfluïde technieken, bijvoorbeeld microfluïsche hydrodynamische scherpstelling, biedt SHM een korteremengtijdschaal 11 en een grotere doorvoer (in het bereik van mL/min) met een lagere verdunningsfactor; niettegenstaande de voorbereiding van LTSLs is niet gemeld met behulp van andere microfluïde apparaten tot nu toe. Het grote voordeel van onze aanpak is de hoge doorvoer, schaalbare productie van thermogevoelige liposomen.
Tot nu toe biedt ons microfluïdeprotocol continue productie van LTSL10 met mogelijkheden voor het laden van geneesmiddelen. Payloads anders dan DOX en ICG zijn ook levensvatbaar. Echter, ethanol verwijdering door dialyse, drug op afstand laden, en zuivering door SEC kolom blijven als batch processen en zijn de knelpunten van het totale formuleringsproces. Toekomstige ontwikkeling zou zich kunnen richten op het gebruik van microfluïde benaderingen (zoals tangentiale stroomfiltratie) om de doorvoer van deze downstreamprocessen te verbeteren en de schaalbaarheid van het protocol te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Prostate Cancer UK (CDF-12-002 Fellowship), en de Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP/M008657/1) voor financiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer - Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
