Summary
הפרוטוקול מציג את הפרמטרים אופטימיזציה עבור הכנת ליפוזומים תרמיים באמצעות המכשיר מיקרו מיקרופלולה המתלא. זה גם מאפשר משותף של דוקסורוביצין ו indocyanine ירוק ליפוזומים ושחרור פוטותרמי המופעל של דוקסורוביצין עבור שליטה מבוקרת/תרופה שהופעלה.
Abstract
הפרוטוקול המוצג מאפשר הכנה רציפה בתפוקה גבוהה של ליפוזומים בטמפרטורה נמוכה (LTSLs), המסוגלים לטעון תרופות כימותרפיות, כגון דוקסורוביצין (חמצון). כדי להשיג את זה, תערובת השומנים ethanolic ואת הפתרון אמוניום גופרתי מוזרק לתוך המכשיר מיקרופלוהעצם הסטה (SHM) מיקרומטר. הפתרונות מעורבבים במהירות על ידי SHM, מתן סביבת הממס הומוגנית עבור הרכבה עצמית ליפוזומים. ליפוזומים שנאספו מושקעים. לאחר מכן כדי להסיר אתנול שיורית מעבר הדרגתי של אמוניום גופרתי מבוסס באמצעות חילופי מאגרים של הפתרון החיצוני באמצעות כרומטוגרפיה של אי-הכללה בגודל. לאחר מכן, החמצון נטען מרחוק לתוך היפוזומים עם יעילות כימוס גבוהה (> 80%). ליפוזומים שהתקבלו הם הומוגנית בגודל עם קוטר Z ממוצע של 100 ננומטר. הם מסוגלים לשחרר את הטמפרטורה שחרור פרץ של חמצון כושל בנוכחות מכת חום קלה (42 ° c). Indocyanine ירוק (ICG) יכול גם להיות שיתוף טעון ליפוזומים עבור שחרור בלייזר קרוב-אינפרא אדום המופעל. הגישה המיקרופלואידיc מבטיחה תפוקה גבוהה, הכנה מדרגית ומדרגיים של LTSLs.
Introduction
הניסוח ltsl הוא המוצר הרלוונטי קלינית ליפוזומבית שפותחה כדי לספק את התרופה כימותרפיה דוקסורוביצין (חמצון) ומאפשר שחרור התרופה יעיל התפוצצות ב מכת חום מתון השגה (T ≈ 41 ° c)1. הניסוח של LTSL מורכב מ-1, 2-dipalmitoyl-sn-בגליקו-3-פוספולינולינה (dppc), הליסולפיד 1-stearoyl-2-הידרוxy-sn-גליליאו-3-פוספוליטיולין (mspc; M מייצג "מונו") ו PEGylated השומנים 1, 2-distearoyl-sn-גליקו-3-פוספואנתאנאואמין-N-[מתיקסי (פוליאתילן גליקול)-2000] (dspe-יתד2000). עם ההגעה לטמפרטורת המעבר שלב (Tm ≈ 41 ° c), lysolipid ו dspe-יתד2000 יחד להקל על היווצרות של נקבוביות הממברנה, וכתוצאה מכך שחרור פרץ של הסם2. הכנת ה-LTSLs משתמשת בעיקר בגישה מלמעלה-למטה, כלומר לחות ושחול השומנים. זה נשאר מאתגר להיות מוכן להכין אצוות גדולות עם מאפיינים זהים בכמויות מספיקות עבור יישומים קליניים3.
Microfluidics מיקרופלואידיקה היא טכניקה מתפתחים להכנת ליפוזומים, המציעה ננו-חלקיק size, מדרגיות ויכולת הרחבה3. לאחר שפרמטרי הייצור ממוטבים, ניתן לשנות את התפוקה באמצעות מקביליזציה, עם מאפיינים זהים לאלה המוכנים בסולם הספסל3,4,5. היתרון העיקרי של מיקרופלואידיקה מעל טכניקות בצובר קונבנציונאלי היא היכולת להתמודד עם כרכים נוזליים קטנים עם ישור גבוהה בחלל וזמן באמצעות המזעור, המאפשר אופטימיזציה מהירה יותר, תוך הפעלה באופן רציף ואוטומטי6. ייצור ליפוזומים עם התקנים מיקרופלואידים מושגת על ידי גישה nanoprecipitation מלמטה למעלה, שהיא יותר זמן ואנרגיה יעילה בגלל תהליכי המגון כגון שחול וsonication מיותרים7. בדרך כלל, פתרון אורגני (למשל אתנול) של שומנים (ו מטען הידרופובי) מעורבב עם miscible non-ממס (למשל מים ומטען הידרופילי). כמו הממס האורגני תערובות עם non-ממס, מסיסות עבור השומנים מופחת. ריכוז השומנים מגיע בסופו של דבר לריכוז קריטי שבו מופעל תהליך המשקעים7. Nanoprecipitates של שומנים בסופו של דבר לגדול בגודל וקרוב ליפוכמה. הגורמים העיקריים המסדירים את הגודל וההומוגניות של הליזומים הם היחס בין הבלתי ממס לבין הממס (כלומר יחס שיעור הזרימה מימית לאורגני; FRR) ואת ההומוגניות של סביבת הממס במהלך הרכבה עצמית של שומנים ליפוזומים8.
ערבוב של נוזלים יעילים במיקרופלואידיקה, ולכן חיוני להכנת ליפוזומים אחידים, ועיצובים שונים של מיקסרים המועסקים ביישומים שונים9. מיקרומטר האדרה (SHM) מייצג אחד הדורות החדשים של מערבלי פאסיביים, המאפשרים תפוקה גבוהה (בטווח של mL/min) עם גורם דילול נמוך. זה מעולה למיקרו-פלואידיג הידרודינמי ערבוב התקנים8,10. SHM יש בדוגמת חריצים אדרה, אשר מערבבים במהירות נוזלים לפיכאוטי 9,11. ציר הזמן ערבוב קצר של shm (< 5 אלפיות הראשונה, פחות מקנה המידה האופייני התקופה של 10 – 100 ms) מאפשר הרכבה עצמית השומנים להתרחש בסביבה ממיסים הומוגנית, הפקת חלקיקים עם התפלגות גודל אחיד3,12.
הכנת ltsls עם microfluidigis, עם זאת, לא פשוט לעומת ניסוחים ליפוזומליים קונבנציונאלי בשל העדר כולסטרול8, ללא השומנים bilayers רגישים המושרה אתנול הנגרמת13,14,15. עד היום, ההשפעה של שיורית אתנול מציג במהלך ייצור מיקרופלואידים של ליפוזומים לא הבינו היטב. רוב הניסוחים המדווחים הם עמידים בפני מיסודם כדי להבדיל (המכיל כולסטרול או בלתי רווי שומנים)16, אשר בניגוד ltsls הן רווי ונטול כולסטרול.
הפרוטוקול המוצג במסמך זה משתמש ב-SHM כדי להכין את LTSLs עבור מסירת התרופות המופעלת באמצעות טמפרטורה. בשיטה המוצגת, אנו מובטחים את LTSLs המוכן למיקרופלואידים (100 ננומטר) ומדים (דיסטיבסיטה < 0.2) על ידי פיזור אור דינמי (DLS). יתרה מזו, אנו כילנו את החמצון באמצעות שיטת מעבר הצבע אמוניום גופרתי (הידוע גם כטעינה מרחוק)17 כאימות של השלמות של השומנים של ltsl. הטעינה מרחוק של החמצון דורש ליפוכמה כדי לשמור על הדרגתי pH כדי להשיג את היעילות אנקפסולציה גבוהה (EE), אשר סביר לקרות ללא שלמות השומנים שלמים. בשיטה זו הציג, במיוחד מפני ליפופלואידיג טיפוסי מסוימים פרוטוקולי הכנה, צעד ריפוי נדרש לפני האתנול מוסר כדי לאפשר את יכולת הטעינה מרחוק; i.e. כדי לשחזר את היושרה של bilayer השומנים.
כפי שהוזכר קודם לכן, ניתן להציג מטענים הידרופילי והידרופובי גם לפתרונות הראשוניים לעטיפת המים הסימולטני של מטענים במהלך היווצרות LTSLs. כהוכחה-of-קונספט, indocyanine ירוק (ICG), מאושר על ידי ה-FDA צבע פלורסנט באמצעות אינפרא אדום, שהוא גם סוכן פוטותרמי מבטיח, הוא הציג את תערובת השומנים הראשונית בהצלחה משותפת לתוך LTSLs. לייזר 808 ננומטר משמש לשחרור האנטי-והחמצון הטעון/ICG, ולגרום בהצלחה לשחרר את החימום התרמי המופעל בתוך 5 דקות.
כל המכשירים והחומרים זמינים באופן מסחרי, מוכן לשימוש וללא צורך בהתאמה אישית. מאז כל הפרמטרים לניסוח ltsls בעקבות פרוטוקול זה, חוקרים ללא ידע מוקדם של מיקרופלואידיקה יכול גם להכין את ה-ltsls אשר משמש כבסיס למערכת שילוח התרופות התרמורגיש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנת ציוד
- הכנס את משאבות המזרק ואת SHM כדלקמן.
- לחבר את היציאה "אל המחשב" של משאבת מזרק משני (משאבת 02, עבור פתרון מימית) כדי "אל הרשת" הנמל של המשאבה מזרק מאסטר (משאבה 01, עבור פתרון השומנים אתנול) באמצעות משאבה למשאבת כבל רשת (איור 1, צהוב).
- חבר את היציאה "למחשב" של המשאבה הראשית ליציאת "RS232 Serial" של המחשב באמצעות מחשב כדי לשאוב כבל רשת (איור 1, כחול).
- לחבר אבובים לכל אחד אינלטס ושקעים של shm באמצעות אגוז ו ferrule. להמיר את הטרמינל של אבובים עבור שניהם מאפשרים הנשי Luer באמצעות עוד אגוז ופרשול והרכבה האיחוד. אבובים ארוכים יותר של אינלטס מאפשר מצורף קל יותר מזרקים (איור 2).
- הגדר את תוכנת בקרת המשאבה .
- הקצה את הכתובת של משאבת המזרק הראשי ואת משאבת המזרק המשני ל "Ad: 01" ו-"Ad: 02", בהתאמה, באמצעות כפתור "ההתקנה" של משאבת המזרק. זה צריך להיעשות רק. בפעם הראשונה
- פתח את תוכנת בקרת המשאבה במחשב. שני משאבות מזרק צריך להיות מזוהה באופן אוטומטי, ואחריו צליל צפצוף. אחרת, לחץ על משאבות וחפש משאבות כדי לעדכן את החיבור. (איור 3).
- הקצה קוטר ל 12.45 (מ"מ) על ידי בחירת" Hsw נורמה-פרוייקט 5 Cc (Dia = 12.45) ".
- שיעור הקצאה כדי 0.25 mL/min עבור משאבה 01 (האתנול פתרון השומנים) ו 0.75 mL/min עבור משאבה 02 (פתרון מימית). שיעורי הזרימה מקבילים לקצב הזרימה הכולל (TFR) של 1 mL/min ויחס קצב הזרימה (FRR) מימית לאתנול של 3.
- הקצה את עוצמת הקול לכל ערך מעל 5 מ ל.
הערה: אמצעי העירוי הייעודי מוגדר כגדול יותר מנפח הנוזל שנטען בהתחשב בנפח הריק של האבובים. - בחר מצב INF (אינפוזיה) עבור שני המשאבות.
- לחץ על הגדר כדי לאשר את ההגדרות.
2. הכן את הסגן
- להכין תערובת LTSL10 או LTSL10-ICG השומנים (ראה טבלה 1).
- משיכת 1 מ ל של תערובת ליפיד ולפחות 3 מ ל (NH4)2SO4 פתרון באמצעות שני 5 מזרקים מנעולים לנעול.
- התקן את שני מזרקים על משאבות מזרק בתנוחה זקופה על ידי הזזת מקורבות החבית של המזרק לפלטה מזרק של המשאבה, ואת הבוכנה של המזרק לחסום הדוחס של המשאבה (איור 4).
- עטוף את קצה קלטת החימום למזרק עם התמיסה הימית. לעטוף את הקצה השני של הקלטת החימום ואת הטמפרטורה בדיקה של התרמוסטט סביב המזרק עם פתרון השומנים. מועיל לתרגל שלב זה עם מזרקים ריקים במקום על מנת להקל על תהליך ההרכבה (איור 5א).
- לחבר את שני מזרקים לתוך מתאמי luer נקבה של אינלטס המתאימים של shm. ודא שהזרקים המכילים את תערובת השומנים ו (NH4)2כך4 פתרונות מחוברים כניסת אתנול ו מימית, בהתאמה. כוונן את מיקום הבוכנה כדי להסיר בועות אוויר מן הזרקים (איור 5ב).
הערה: ודא שהזרקים עדיין ממוקמים באופן מאובטח על מחזיק המזרק של המשאבות. - לחמם את הזרקים מעל 51 ° צ' באמצעות קלטת חימום באמצעות חימום 10 s הפעלה. אפשר לתרמוסטט לעדכן את הטמפרטורה של הזרקים. חזור על שלב זה בשלבים הבאים כדי לשמור על הטמפרטורה במהלך העירוי.
התראה: כבה את קלטת החימום לאחר 10 s כדי למנוע הטמפרטורה לירות ולאפשר לתרמוסטט לעדכן את הטמפרטורה בפועל. סרט החימום צריך להיות גם מטופל בזהירות כאשר הטמפרטורה שלה עולה מהר מאוד. חימום ברציפות עלול לגרום נזק הציוד ומזרקים, עקב עיכוב הזמן של התרמוסטט לעדכון הטמפרטורה נמדד. - לאחר הטמפרטורה היא מעל 51 ° c, להפעיל את משאבות המזרק על ידי לחיצה על הפעל הכל בתוכנת בקרת המשאבה (איור 3).
- ודא כי זרימת הנוזלים היא ללא בועות אוויר וכל דליפה. היפטר מן הנפח ההתחלתי (סביב 0.5 mL) של נוזל משקע החשמל כפסולת.
הערה: נפח הפסולת הראשונית אינו מוגדר והוא תלוי בנפח הפנימי של הכיוונון, שהוא אמצעי האחסון של נוזל לנסיעה מהזרקים דרך אבובים ו-SHM לשקע. - לאסוף את שאר הנוזל כמו ליפוכמה דגימות לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה או בקבוקון יז.
- השהה/הפסק את האינפוזיה כאשר הנוזל בכל אחד מהמזרקים כמעט ריק.
הערה: משאבות צריך להיעצר באופן ידני, מאז המשאבות לא יכול במדויק לזהות את המיקום כאשר מזרקים ריקים. - מניחים את ליפוכי לאסוף כמה פתרונות באמבט מים 60 ° c כדי לספח עבור 1.5 h.
הערה: שלב זה חיוני לאפשר טעינת סמים ליפוזומים. - העבר את הפתרונות לצינורות דיאליזה. Dialyze הפתרונות נגד 1 L של 240 מ"מ (NH4)2כך4 ב 37 ° c עבור לפחות 4 h כדי להשיג ליפוזומים מטוהרים.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ליפוזומים בשלב זה הם ב 5 מ"מ של פוספוליפיד. ניתן לאחסן ליפוזומים מטוהרים ב -4 ° c. - כדי לנקות את SHM לשימוש חוזר, לשטוף את SHM ברצף עם מים מוכי, אתנול ויבש עם גז חנקן.
3. הטענת מרחוק של החמצון לתוך LTSLs באמצעות הדרגה של pH הטרנסרפידה
- החלפת מאגר חיצוני של LTSLs לתמיסת מלח באגירה (HBS) על ידי שימוש בנפח הדרה כרומטוגרפיה (SEC) כדי ליצור מעבר צבע pH טרנסרפידת.
- הוסף סכום של 25 מ ל של HBS לחלק העליון של עמודת SEC כדי להכין את העמודה. הניחו לכולם לעבור דרך הטור ולהשליך את המלטה.
- הוסף 1 מ ל של ליפוזומים דיאליזה, מוכן משלב 2.12, אל העמודה ולהיפטר האליוט.
- הוסף 1.5 mL של HBS לעמודה ולהיפטר האליוט.
- הוסף 3 מ ל של HBS לעמודה ולאסוף את 3 מ ל של elute.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ליפוזומים נאספים בשלב זה ונמצאים ב 1.67 מ"מ של פוספוליפיד. ניתן לאחסן ליפוזומים במאגר ב -4 ° c.
- . ולטהר את הדוקסורוביצין
- הוסף פתרון חמצון ב 1:20 חמצון-to-פוספוליפיד טוחנת יחס לתוך 1 מ ל של מאגר החלפת פתרון ליפוזומים (1.67 mmol) הכלול בקבוקון ביג. זה יכול להיות מושגת על ידי הוספת 48.4 μL של 1 מ"ג/mL חמצון פתרון (83.4 μמול).
- מניחים את בקבוקון הביז באמבט מים בגובה 37 ° c בשביל 1.5 h כדי לאפשר לחמצון להיטען ליפוזומים.
- מערבבים 10 μL של ליפוזומים עם 170 μL של HBS ו-20 μL של 1% (v/v) טריטון X-100 פתרון שחור 96-צלחת הבאר. . אני חוזר בשביל שלוש בארות הבארות הללו מתאימות לתוכן החמצון "לפני הטיהור".
- במקרה של הכנת LTSL10-ICG, לערבב 40 μL של ליפוזומים עם 160 μL של DMSO בצלחת 96 ברורה-באר. . אני חוזר בשביל שלוש בארות הבארות הללו מתאימות לתוכן ICG "לפני הטיהור".
- לטהר את הפתרון ליפופי כמתואר בשלב 3.1.
הערה: כדי לעשות שימוש חוזר בטור לטיהור עתידי, נקה את הטור מהחמצון החופשי על-ידי הוספה ראשונה של 1 מ ל של פתרון מדולל 0.5 M NaOH לפני ביצוע שלב 3.1.1. החמצון החופשי באדום יהפוך לסגול-כחול ולאורך הטור במהירות. - מערבבים 30 μL של הפתרון ליפוזומים מטוהרים עם 150 μL של HBS ו 20 μL של 1% (v/v) טריטון X-100 פתרון שחור 96-צלחת הבאר. . אני חוזר בשביל שלוש בארות בארות אלו מתאימות לתוכן החמצון "אחרי הטיהור".
- במקרה של LTSL10-ICG, לערבב 40 μL של הפתרון ליפוזומים מטוהרים עם 160 μL של DMSO ב ברור 96 בצלחת. . אני חוזר בשביל שלוש בארות בארות אלה מתאימות ל "לאחר טיהור" התוכן ICG.
- למדוד את העוצמה הפלואורסצנטית חמצון של הבארות לפני (שלב 3.2.3) ואחרי (שלב 3.2.5) טיהור, באמצעות קורא מיקרופלייט (λex = 485 ננומטר, λem = 590 nm).
- לחשב את יעילות האנקפסולציה של החמצון (חמצון) על ידי נקיטת היחס של עוצמות הקרינה לפני ואחרי הטיהור.
- למדוד את ספיגת ICG של הבארות לפני ואחרי טיהור, באמצעות קורא מיקרופלייט (600 כדי 1000 nm).
- לחשב את היעילות אנקפסולציה של ICG (ICG EE) על ידי נקיטת היחס של ספיגת בשנת 792 ננומטר לפני ואחרי טיהור, לוקח בחשבון את פקטור דילול (3 פעמים) במהלך הטיהור.
4. פיזור אור דינאמי (DLS)
- הוסף 50 μL של פתרון ליפוזומים (שלב 2.12) עד 450 μL של מים מפוהים.
- הניחו את הקובט בתוך כלי DLS ובצעו את המדידה בהתאם להוראות היצרן.
- הקלט את הקוטר ממוצע Z ומפזר שלוש מדידות לכל דוגמה.
5. הקלורימטר סריקה דיפרנציאלית (DSC)
- רכזו 1 מ ל של דגימות ליפוזומים (שלב 2.12) עם יחידת מסנן צנטריפוגלי כדי 0.5 mL (ריכוז השומנים הסופי של 10 מ"מ). באמצעות רוטור קבוע זווית, ספין ב 7500 x g עבור כ 15 דקות.
- העבר 20 μL של (NH4)2SO4 הפתרון ודגימות ליפוזומים לשני מחבתות DSC בהתאמה. לאטום את הסירים עם מכסים DSC ההרמטיות באמצעות ערכת העיתונות לדוגמה DSC.
- מדוד את המדגם מ 30 ° צ' עד 60 ° צ' בקצב חימום של 1 ° צ'/מזערי באמצעות הקלורימטר סריקה דיפרנציאלי.
- נתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה. קח את טמפרטורת המעבר שלב (Tm) כמו תחילתה של המעבר שלב (התכה השיא), אשר נמדד על ידי חיתוך x של הטנגנס של נקודת השיפוע המקסימלי.
6. שחרור דוקסורוביצין
- מחממים את HBS בטמפרטורה ייעודית (37 או 42 ° c) באמצעות אמבט מים. להכין אמבט מים קרח עבור הכנת דגימות.
- הוסף 100 μL של ליפוזומים מטוהרים שנטענו על ידי חמצון (שלב 3.2.5) לתוך 1.9 mL של HBS בצינור מיקרוצנטריפוגה. הניחו את הצינור באמבט המים של הטמפרטורה המיועדת.
- לסגת מיד 200 μL של דגימות מהצינור ולמקם אותו במהירות באמבט מים הקרח כדי להרוות כל שחרור התרופה הבאה. דוגמה זו מקבילה לנקודת הזמן הראשונית (t = 0).
- משיכת 200 μL של דגימות בנקודות הזמן העוקבות (t = 5, 10, 15, 30, 60 דקות) ובמהירות למקם אותו באמבט מים הקרח כדי להרוות כל שחרור התרופה.
- מערבבים 50 μL של מדגם של כל נקודת זמן עם 150 μL של HBS בצלחת שחור 96-באר. מדדו את עוצמת הזריחה של החמצון באמצעות קורא לוחית.
- הוסף 20 μL של 1% (v/v) טריטון X-100 לבארות נבחרות אקראיות שהוכנו בשלב 6.5. מדדו את האינטנסיביות הפלואורסצנטית של החמצון של בארות אלה באמצעות קורא לוחית. ערכים אלה מקבילים לנקודת הזמן של שחרור מלא (t = ∞; 100%).
- לחשב ולהתוות את אחוז החמצון שפורסמו על ידי באינטרפולציה האינטנסיביות הפלואורסצנטית של כל נקודות זמן (אני (t), לעומת הראשונית (אני (0)), ושוחרר במלואו (I (∞)), ערך.
7. חימום לייזר ושחרור מופעל
- הניחו את טמפרטורת אמבט המים ל-37 ° c והניחו לטמפרטורה להתייצב.
- הוסף 200 μL של חמצון טעון LTSL10-ICG ([ICG] = 10 μg/mL) לצלחת 96-באר ברורה, ואז למקם אותו באמבט מים, לשמור על הקרקעית שקוע במים.
- הגדר את הזרם של מערכת הלייזר כדי 2.27 A. מניחים את המאצאו של מערכת הלייזר ב 5 ס מ אנכית מעל פני השטח של הצלחת 96-באר, אשר מתאים שטף האנרגיה של 0.5 W/cm2 [איור 6].
התראה: מערכת הלייזר צריכה להיות מופעלת בהתאם לאמצעים רלוונטיים לצורך בטיחות לייזר. - הפעל את הלייזר ונטר את הטמפרטורה כל דקה באמצעות הבדיקה של טמפרטורת סיבים אופטיים.
- ב 5 ו 10 דקות, משיכת 10 μL של לייזר לקרינה לפני הלייזר מן הצלחת 96-באר ברור ב ו לערבב עם 190 μL של HBS עבור שלוש בארות בלוח שחור 96-באר.
- מערבבים 10 μL של ליפוזומים עם 170 μL של HBS ו 20 μL של 1% (v/v) טריטון X-100 פתרון עבור שלוש בארות בלוח שחור 96-באר. הבארות הללו מתאימות לתוכן החמצון "100% שוחרר". מדדו את עוצמת הפלורסנט של החמצון ומחשבים את שחרור החמצון כמתואר בשלב 6.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנת LTSLs על ידי microfluiאידיקה דורש הרכב השומנים של DPPC/MSPC/DPPC-יתד2000 (80/10/10, היחס הטוחנת; LTSL10). איור 7A (משמאל ) מראה את המראה של LTSL10 מוכן משלב 2.9, כנוזל ברור ובלתי צמיגי. ניסוח LTSL10 מפותח מן הניסוח קונבנציונאלי, LTSL4 (DPPC/MSPC/DPPC-יתד2000, 86/10/4, יחס טוחנת) מאז LTSL4 צורות ג'ל כמו צמיגה, כפי שמצוין על ידי כמות גדולה של בועות אוויר לכוד במדגם (איור 7א; ימין).
DLS מדידה של LTSL10 (איור 7B, אדום) הראו כי קוטר Z ממוצע ומפזרים של LTSL10 היו 95.28 ± 7.32 nm ו 0.100 ± 0.022, בהתאמה, המציין את ההצלחה של הניסוי. איור 7ב (אפור) מציג גם מדגם תת-אופטימלי, שהוכן ב-20 ° c, שם הושגו ליפוזומים גדולים ומפוזרים.
איור 7ג מראה כי החמצון של LTSL10. בדרך כלל, יש להיות בסביבה 80%. LTSLs שהוכנו על ידי השיטה המקובלת של לחות הסרט השומנים עם שחול (LF) נכללים להשוואה, שהוכנו כמתואר במקום אחר18. הLTSL4 (lf) ו-LTSL10 (LF) הראו הטענת חמצון הגונה של כ-70% ו 50% בהתאמה. הריפוי של הLTSL10 (שלב 2.11) חיוני לאפשר טעינת חמצון. בהיעדר צעד הריפוי, חמצון נמוך EE (< 20%) היה עיקש, ללא קשר לטמפרטורת הדגירה (20 ° צ' עד 42 ° c) ומשך (1 עד 24 שעות). זה הצביע על כישלון של LTSL10 לשמור על מעבר הדרגתי pH ממברנה, שם חמצון נטען במקום פסיבי או על ידי ספיחה. על-ידי חישול הLTSL10 המוכן, הדבר הטוב ביותר עלה באופן משמעותי ל-85%, והצביע על הצלחת הטעינה המרוחקת של החמצון והנוכחות של מעבר הדרגתי ה-pH של הטרנסקרום.
איור 7ד מציג את הפרופיל שחרור החמצון של LTSL10. בשעה 37 ° c, שחרורו של החמצון הכמסת על 60 דקות היה כ -10%. לעומת זאת, בשעה 42 ° c, כל החמצון הכLTSL10 הופץ בתוך 5 דקות, והפגין את רגישות הטמפרטורה של. תוצאות דומות נצפו עם LTSL10 (LF) כפקד.
איור 8 מראה את טמפרטורת המעבר פאזה (Tm) של LTSL10 המאופיינת באמצעות הקלורימטר סריקה דיפרנציאלי (DSC). קווים מנוקדים כטנגנס של נקודת השיפוע המקסימלי, נוספים כעזר חזותי של טמפרטורת המעבר של שלב התחלתה (חיתוך x של הקו המשיק). LTSL10 יש מעבר שלב רחב יחסית עם תחילתה ב 41.6 ° c ו שיא ב 42.6 ° c. תוצאות דומות נצפו עם LTSL10 (LF), ומציע הבדל מזערי בין טכניקות ההכנה. כהשוואה, LTSL4 (LF) יש מעבר פאזה נמוך וחד יותר, בהסכמה עם הספרות1.
איור 9 מראה את האפיון של LTSL10-icg. השפעת ריכוז ICG הראשונית על גודל (איור 9א) וטעינת יעילות של חמצון ו icg (איור 9ב) מסווגים לשלושה טווחי ריכוז. בריכוז ICG נמוך (ICG-to-ליפיד יחס טוחנת של 0.003; הריכוז הראשוני של 60 μM ICG ו 20 מ"מ השומנים), Z-ממוצע, מפזרים ו חמצון הLTSL10 היו דומים מבלי לטעון ICG; ICG EE היה סביב 75%. הטעינה יעיל שיתוף של חמצון ו-ICG לתוך LTSL10 ניתן להשיג בריכוז ICG זה. בשנת ביניים ICG ריכוזי, בעוד גודל מפזרים את הדגימות היו משביע רצון, הן חמצון ו ICG EE הופחת. במיוחד, הירידה ב-"חמצון הנדסת החשמל" ציינה את השיבוש של קרום הליזומלי ובכך את הדרגתי. בריכוזים גבוהים של ICG, הדגימות שוב הגלו; חמצון ו-ICG EE הופחתו באופן משמעותי.
LTSL10-ICG היה לקרינה עם לייזר מקרוב אינפרא אדום (סעיף 7) כדי לגרום לחימום פוטותרמי והפעיל את שחרורו של חמצון (איור 10). עם הקרנה לייזר, המדגם התחמם לראשונה עד 49.7 ° c עם ירידה הדרגתית של הטמפרטורה. הקרנה לייזר שלאחר מכן הגדילה את הטמפרטורה עד 36.7 ° c. הכמת של החמצון המשוחרר הצביע על כך שחרור מוחלט של החמצון השחוק הושג לאחר מחזור החימום הראשון. זה היה צפוי מאז הטמפרטורה הגיע מעל 42 ° c, בהסכמה עם פרופיל שחרור החמצון המוצג באיור 7D. לעומת זאת, LTSL10 ללא ICG לא יכול לספק חימום פוטותרמי, ולכן לא שחרר את החמצון על הקרנה לייזר.
איור 1: צילום ההתקנה של משאבות המזרק. היציאה "אל הרשת" של המשאבה הראשית (משאבה 01) מחוברת "אל המחשב" של המשאבה המשנית (משאבה 02; צהוב); יציאת "למחשב" של המשאבה הראשית מצורפת ליציאת RS-232 של המחשב (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צילום ההתקנה SHM. (א) התאספו תצוגה של התקנת shm. (ב) התפוצצה בתצוגה של התקנת shm. Inlets ושקעים של SHM מחוברים אבובים באמצעות אגוז ו ferrule. אבובים של שני אינלטס מורחב על ידי אבובים ארוך יותר עם אגוז ו חזיות בכל קצה, מסתיימת על ידי מתאם luer נקבה באמצעות הרכבה האיחוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ממשק של תוכנת בקרת המשאבה. יש לזהות את שני משאבות המזרק באופן אוטומטי על-ידי ייזום התוכנה; אחרת, לחץ על משאבות בפינה השמאלית העליונה ולחפש משאבות. פרמטרים שיש לקבוע את תצורתם מסומנים בתיבות אדומות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: צילום של משאבות המזרק והתקנת מזרק. (A) מזרקמחזיקמעמד ומחזיק מזרק בורג אגודל (2, אחד בכל צד) של משאבת המזרק (קופסה צהובה). בלוק דוחס, בורג התאמה וכפתור כונן אגוז (לחצן לבן בצד שמאל) של משאבת המזרק (קופסה ירוקה). (ב) מיקום של מזרק מותקן על משאבת המזרק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: צילום של הרכבה של מזרקים, מחממים אלמנט ו SHM. (א) הרכבת של מזרקים, נייר דבק ותרמוסטט. (ב) הרכבת של מזרקים, נייר דבק, תרמוסטט, ו-shm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: צילום של מלכודת הלייזר. (א) צילום של סיבים מצמידים מערכת לייזר במהלך המבצע. (ב) מיקום של הקולמטאו 5 ס מ מעל צלחת 96-ובכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: אפיון LTSL10. (א) תצלום (משמאל) LTSL10 (ימין) LTSL4, לפני דיאליזה. LTSL10 הופיעה כנוזל ברור ובלתי-צמיגי, בעוד LTSL4 הייתה כמו ג'ל וצמיג. (ב) Z-בקוטר ממוצע ומפזרים 10 מ"מ של LTSL10 הוכנו ב 20 ו 51 ° c. ברים מוצקים ועיגולים פתוחים (○) מציינים קוטר ממוצע Z ומפזרים בהתאמה. (ג) החמצון הEE של LTSL4 (לבן), LTSL10 (אם; לבן), ו LTSL10 לפני (אפור) ולאחר ריפוי (אדום). (ד) שחרור החמצון של LTSL10 (מעגל) ו-LTSL10 (LF; חוצה) ב 37 ° צ' (שחור) ו 42 ° צ' (אדום). נתונים מייצגים ממוצע ± SD של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. p < 0.001; בדיקות דו-זנבי שאינן מזווג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: תכונות תרמיות של LTSL10. התרמוגרפים של LTSL4 (LF), LTSL10 (LF) ו-LTSL10 המאופיינת ב-DSC. קווים מנוקדים נוספים כעזר חזותי של טמפרטורת המעבר בשלב התחלתה. נתונים מייצגים את הממוצע של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: אפיון LTSL10-ICG. (A) Z-קוטר ממוצע (אדום) ו מפזרים (כחול) של icg-נטען LTSL10. (ב) חמצון (אדום) ו ICG ee (ירוק) של icg-נטען LTSL10. נתונים מייצגים את ממוצע ± SD של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: חימום פוטותרמי המושרה לייזר הפעיל את שחרורו של LTSL10 טעון חמצון ו LTSL10-ICG. (א) הטמפרטורה של דגימות שעברו הקרינה ו (ב) שחרור של חמצון טעון LTSL10 (כחול) ו LTSL10-icg (אדום) במהלך החימום פוטותרמי המושרה לייזר. נתונים מייצגים את ממוצע ± SD של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: תערובות ליפידים, מאגרים ופתרונות מניות.
| 20 מ"מ LTSL10 תערובת השומנים (DPPC/MSPC/DPPC-PEG2000; 80/10/10, יחס טוחנת) |
עבור 1 מ ל של תערובת 20 מ"מ LTSL10 ליפיד: התמוססות 11.75 מ"ג של DPPC עם 210 μL של מניות האתנול MSPC (5 מ"ג/mL), 558 μL DPPC-PEG2000 מניות אתנול (10 מ"ג/mL), ו 232 μL של אתנול. לחילופין, כמות שווה ערך של MSPC (1.05 mg) ו DSPE-PEG2000 (5.58 mg) ניתן להוסיף כמו אבקה. |
| 20 מ"מ LTSL10-ICG תערובת השומנים (DPPC/MSPC/DPPC-PEG2000; 80/10/10, היחס הטוחנת; היחס הטוחנת ICG-to-ליפיד = 0.003) |
עבור 1 מ ל של 20 מ"מ העמיסו ICG LTSL10 תערובת השומנים: התמוססות 11.75 מ"ג של DPPC עם 210 μL של מלאי אתנול MSPC (5 מ"ג/mL), 558 μL DPPC-PEG2000 מניות אתנול (10 מ"ג/ml), ו 46.5 μL של מלאי אתנול של ICG (1 מ"ג/mL) ו-185.5 μL של אתנול. לחילופין, כמות שווה ערך של MSPC (1.05 mg) ו DSPE-PEG2000 (5.58 mg) ניתן להוסיף כמו אבקה. מכיל 60 μM של ICG ו 20 מ"מ של השומנים. |
| 240 מ"מ תמיסה אמוניום סולפט (NH4)2SO4, pH 5.4 | התמוססות 31.71 g של (NH4)2כך4 לכל היותר של מים מפוהים. ה-pH של הפתרון הוא מקורי 5.4, התאמת pH נוספת אינה נדרשת. |
| פתרון דוקסורוביצין (חמצון), 1 מ"ג/mL | התמוססות 1 מ ג של החמצון עבור מים מפוהים. |
| מלאי האתנול DSPE-PEG2000, 10 מ"ג/mL | לפזר 10 מ"ג של DSPE-PEG2000 לכל mL של אתנול. |
| מתמיסת מלח באגירה (HBS), pH 7.4 | התמוססות 8.0 g של נרוג ו-4.766 גרם של HEPES לכיוון מים מייהים. התאם את ה-pH ל 7.4 עם הפתרון 2.5 M NaOH. |
| מניות של האתנול ICG, 1 מ"ג/mL | התמוססות 1 מ"ג של ICG לכל mL של אתנול. |
| מניות האתנול MSPC, 5 מ"ג/mL | לפזר 5 מ ג DPPC לכל mL של אתנול. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המוצג מתאר את הכנת ליפוזומים בטמפרטורה נמוכה (LTSLs) באמצעות מיקרומטר העצם (SHM) הרציף. הניסוח LTSL10 מאפשר שחרור מופעל טמפרטורה פרץ של דוקסורוביצין בתוך 5 דקות בטמפרטורה ימותרפיה קלינית השגה של 42 ° c. Indocyanine ירוק (ICG) יכול גם להיות שותף טעון עבור חימום פוטותרמי עורר את שחרורו של חמצון. השיטה מסתמכת על: (i) הרכבה עצמית של פוספוליפידים ליפוזומים תחת סביבת הממיסים המהומוגניים המסופקים על ידי ערבוב מהיר, כאוטי של אתנול ו אמוניום סולפט פתרון ב SHM11; (ii) ריפוי של ליפוזומים כדי לשמר את השלמות של הבילאייר השומנים החיוניים לטעינת החמצון; ו (iii) הטעינה מרחוק של החמצון לתוך LTSLs על ידי מעבר הדרגתי אמוניום סולפט17. מאז הציוד מנוצל בפרוטוקול זה הוא זמין מסחרית המדף ואת הפרמטרים הם אופטימיזציה, גישה זו היא לניהול עבור משתמשים ללא ידע מראש או חוויה מיקרופלואידיקה.
אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא להבטיח שכל ההרכבה מאובטחת כראוי והנוזל יכול להיות מוחדרת כראוי (שלב 2.5). מאחר והאי של ההרכבה העצמית של ליפוזומים מסתמך על סביבת מסות הומוגניים, כל חוסר יציבות, כגון dislodgement של מזרקים או הקדמה של בועות אוויר, יפריע ליציבות זרימת הנוזלים ולתוצאה מיטבית ליפופי גודל ומפזרים. זהו גם הרציונל מאחורי שלב 2.8, שבו נפח, המורכב הנוזל בתחילה הכובש את הערוץ ולפני זרימה יציבה הגיע, יש להיפטר.
צעד קריטי שני לניסוי מוצלח הוא שלב הריפוי, כדי לאפשר הנדסת חמצון גבוהה (שלב 2.11). ב ליפוזומים נטול כולסטרול, micelle להרכיב רכיבים ממברנה (כלומר MSPC ו DSPE-יתד2000) יצטברו בגבולות תבואה עם מידה גבוהה של פגמים כדי להכיל עקמומיות קרום גבוה2. הסדרים אלה באופן תרמודינמי לטובת היווצרות וייצוב נקבוביות קרום, פתח ליפוזומים, או בילאייר דיסקים. החמצון הנמוך של LTSL10 ללא הריפוי הציע כי מבנים נקבובי קיים גם מתחת Tm, וכתוצאה מכך היעדר מעבר הדרגתי הנדרש עבור העמסה חמצון (איור 7ג). היווצרות מוקדם של נקבוביות מתחת Tm לא נצפתה עבור ltsls שהוכנו על ידי סרט השומנים (LTSL4 (lf) ו LTSL10 (lf)), כאשר הריפוי אינו נדרש. יתר על כן, ניסוחים המכילים כולסטרול שהוכנו על ידי microfluiאידיקה גם לא דורשים ריפוי8. זה, לכן, העריך כי היווצרות מוקדם של נקבוביות היא השפעה משולבת של נוכחות של אתנול במהלך ההכנה וחוסר כולסטרול ביליפיד. פגמים מבניים בתוך קרום bilayer דווחו להיות מסולק על ידי ריפוי ליפוזומים מעל Tm, המאפשר מולקולות השומנים להפיץ בתקיפות הומוגנליות ופגמים לתיקון19. בנוסף, תהליך הריפוי הוא תהליך בלתי הפיך שבו היפוזומים שחזרו לטמפרטורה מתחת Tm אינם מחדש דליפה שלפוחיות19, בהסכמה עם הLTSL10.
טבעה של הכנת המיקרופלואידיג של ליפוכמה הוא תהליך nanoprecipitation, אשר דורש שני miscible ממיסים עם מסיסות ייחודי עבור ליפידים: בדרך כלל, אתנול (כמו ממיס השומנים) ופתרון מימית (כמו שומנים בלתי מומס). כך, הנוכחות של אתנול הוא בלתי נמנע. לכן, ניסוחים רגישים או נוטים הנגרמת אלכוהול המושרה13, כגון ליפוזומים ללא כולסטרול20, עשוי לדרוש שינוי של ניסוח או אופטימיזציה מחדש של הפרוטוקול. כפי שהוכח עם הכנת LTSL4, הושג הג הצמיגה ביותר, (איור 7א), שהיה קרוב לוודאי בשל היווצרות ג'ל הבין-מבין לשלב15. לעומת זאת, LTSL10, עם הריכוז הפולימרי הגבוה יותר שלה, המונע מהאינטרדיטציה21, הוכן בהצלחה. כתוצאה מכך יש לבצע הליך להסרת אתנול; כאן, הוא הוסר פשוט על ידי דיאליזה. בעוד שימוש בטכניקות טיהור רציפה כגון סינון זרימה (יכולת להסרת האתנול והחלפת מאגר) פותחו22,23, היישום שלהם (כשבב אחד או מודולרי) הם מעבר למטרה של פרוטוקול זה. עם זאת, בעתיד, אנו מצפים אלה עיצובים מודולרי או סטנדרטית להיות אופטימיזציה וגדל בזמינות, לייעל את תהליך הייצור microfluidic.
הגבלה נוספת של הפרוטוקול היא הפסד לדוגמה בשל המרחק הנסיעה של הנוזלים, כלומר נפח הפסולת הראשונית (שלב 2.8), כמו גם את החלק האחרון של פתרונות כי היה מוזרק אבל לא להגיע לשקע. הפסדים אלה לדוגמה הם כמעט בלתי נמנעים ועשויים לתרום לחלק משמעותי של נפח ההכנה בייצור בקנה מידה, במיוחד כאשר נפח קטן או דוגמאות יקרות הם להיות מוכנים. בעת הצורך, התאוששות שומנים בדם יכול להיות כימות על ידי ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה-הסלע שיטת גילוי פיזור אור המאפשר כימות מהירה של ריכוזי השומנים24. עם זאת, לאחר שהתהליך ממוטב ומוקטן, כגון באמצעות מזרק או מאגר נוזלים גדול יותר, התפוקה עשויה להיות מוגדלת והפסדים לדוגמה יהיו פחות משמעותיים.
ההבדל העיקרי בין שיטה זו לבין שיטת ההכנה הקיימת היא שליזומים מורכבים באופן עצמאי בסביבת ממיסים הנמצאת בשליטה גבוהה ורציפה. שיטת הסרט השומנים הוא תהליך ייצור אצווה והוא דורש גודל הומוגון. בעוד מאוד ריאלי בסולם הספסל, זה נשאר מאתגרת כדי לשנות את הייצור הקליני. בתוך טכניקות המיקרופלואידים הקיימות, למשל, הידרופלואידיג הידרו דינמי התמקדות, SHM מציע ציר זמן ערבוב קצר יותר11 ותפוקה גדולה יותר (בטווח של mL/min) עם גורם דילול נמוך; על אף הכנתו של LTSLs לא דווח על שימוש במכשירים מיקרופלואידים אחרים עד כה. היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא התפוקה הגבוהה, הייצור הדרגי של ליפוזומים תרמו-רגישים.
עד כה, פרוטוקול המיקרופלואידיג שלנו מציע ייצור רציף של LTSL10 עם יכולת טעינת סמים. מדים אחרים מאשר חמצון ו-ICG הם גם כן קיימא. עם זאת, הסרת אתנול על ידי דיאליזה, העמסה מרחוק של סמים, וטיהור על ידי העמודה SEC להישאר כתהליכי אצווה הם צווארי בקבוק של התהליך ניסוח כללי. פיתוח עתידי יוכל להתמקד בגישות מיקרופלואידיסי (כגון סינון זרימה) כדי לשפר את התפוקה של תהליכי הזרם האלה ולהגביר את המדרגיות של הפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לסרטן הערמונית בריטניה (CDF-12-002 מלגת), ואת המועצה למחקר פיסי מדעי הנדסה (EPSRC) (EP/M008657/1) עבור מימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer - Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
