Summary
このプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体装置を用いて、熱感知リポソームを調製するための最適化されたパラメータを提示する。また、リポソームへのドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封、および制御/誘発薬物放出のためのドキソルビシンの光熱誘発放出も可能になる。
Abstract
提示されたプロトコルは、ドキソルビシン(DOX)などの化学療法薬をロードすることができる低温感受性リポソーム(LTSLs)の高スループット連続調製を可能にする。これを達成するために、エタノール性脂質混合物および硫酸アンモニウム溶液を、ずらしたヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)マイクロ流体装置に注入する。この溶液は、SHMによって迅速に混合され、リポソームの自己集合体に均質な溶媒環境を提供する。収集されたリポソームは、まずアニールされ、次いで透析して残留エタノールを除去する。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、外部溶液のバッファー交換により硫酸アンモニウムpH勾配を確立します。その後、DOXは高いカプセル化効率(>80%)でリポソームに遠隔負荷されます。得られたリポソームは、Z平均直径100nmのサイズが均一である。それらは穏やかな温熱(42 °C)の存在の封入されたDOXの温度誘発の破裂解放が可能である。また、近赤外線レーザートリガDOX放出のために、インドシアニングリーン(ICG)をリポソームに共装することもできる。マイクロ流体アプローチにより、高スループット、再現性、拡張性に優れたLTSLの準備が可能になります。
Introduction
LTSL製剤は、化学療法薬ドキソルビシン(DOX)を送達するために開発された臨床的に関連するリポソーム製品であり、臨床的に達成可能な軽度の温熱療法(T≈ 41°C)1での効率的なバースト薬物放出を可能にする。LTSL製剤は、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、リソ脂質1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(MSPC;Mは「モノ」)およびPEGylatelated脂質1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000)を表す。相転移温度(Tm≈ 41°C)に達すると、リソリピッドとDSPE-PEG2000が共に膜細孔の形成を促進し、薬物2のバースト放出をもたらす。LTSLsの調製は、主にバルクトップダウンアプローチ、すなわち脂質膜水和および押出を使用する。臨床用途に十分な量と同じ特性を持つ大規模なバッチを再現可能に準備することは依然として困難です。
マイクロ流体はリポソームを調製する新しい技術であり、チューナブルナノ粒子サイズ、再現性、および拡張性3を提供する。製造パラメータが最適化されると、スループットは、ベンチスケール3、4、5で用意されたものと同じ特性で、並列化によってスケールアップすることができます。従来のバルク技術よりもマイクロ流体の主な利点は、小型化を通じて空間と時間の制御性が高い小さな液体量を処理する能力であり、6の連続的かつ自動化された方法で動作しながら、より速い最適化を可能にする。マイクロ流体デバイスを用いたリポソームの製造は、押出や超音波処理などの均質化プロセスが不要であるため、より時間とエネルギー効率が高いボトムアップナノ沈降アプローチによって達成される7。典型的には、脂質(例えばエタノール)の有機溶液(および疎水性ペイロード)は、混和性の非溶媒(例えば水および親水性ペイロード)と混合される。有機溶媒が非溶媒と混合すると、脂質に対する溶解度が低下する。脂質濃度は、最終的に沈殿プロセスが引き起こされる臨界濃度に達する7.最終的に脂質のナノ沈殿物は大きさに成長し、リポソームに近い。リポソームの大きさと均質性を左右する主な要因は、非溶媒と溶媒の比率(すなわち水性-有機流量比;;FRR)とリポソームへの脂質の自己集合中の溶媒環境の均質性を8にする。
マイクロ流体の効率的な混合は、したがって、均質なリポソームの調製に不可欠であり、および異なる用途9に使用されているミキサーの様々な設計。ずれたヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)は、低希釈因子で(mL /分の範囲で)高いスループットを可能にするパッシブミキサーの新世代の1つを表します。これは従来のマイクロ流体流体混合装置8、10に優れている。SHMは、カオスの対流9、11によって流体を迅速に混合するヘリンボーン溝をパターン化しました。SHMの短い混合タイムスケール(< 5 ms、典型的な凝集時間スケール10〜100 ms未満)は、均一な溶媒環境で脂質自己集合が起こり、均一なサイズ分布3、12のナノ粒子を生成することを可能にする。
しかし、マイクロ流体を用いたLTSLsの調製は、コレステロール8の欠如による従来のリポソーム製剤に比べてそれほど簡単ではなく、脂質二重層がエタノール誘発間桁化を受けやすい13、14、15ではない。これまで、リポソームのマイクロ流体生産時に生じる残留エタノールの効果は十分に理解されていなかった。報告された製剤の大半は、本質的に、LTSLsとは異なり、飽和およびコレステロールフリーである(コレステロールまたは不飽和脂質を含む)間桁に耐性である。
本明細書に提示されるプロトコルは、温度誘発放出薬物送達のためのLTSLsを準備するためにSHMを使用する。この方法では、マイクロ流体調製LTSLsをナノサイズ(100 nm)および動的光散乱(DLS)によって均一(分散度<0.2)にすることを確認しました。さらに、LTSL脂質二重層の完全性の検証として、膜貫通アンモニウム硫酸勾配法(遠隔負荷とも呼ばれる)17を用いてDOXを封入した。DOXのリモートローディングでは、リポソームが高いカプセル化効率(EE)を達成するためにpH勾配を維持する必要があり、これはそのままの脂質二重層なしで起こる可能性は低い。この提示された方法では、典型的なマイクロ流体リポソーム調製プロトコルとは異なって、エタノールを除去して遠隔ローディング能力を可能にするために、アニーリングステップが必要である。すなわち、脂質二重層の完全性を回復する。
前述のように、親水性および疎水性ペイロードは、LTSLsの形成中にペイロードを同時にカプセル化するための初期溶液にも導入することができる。概念実証として、有望な光熱剤でもあるFDA承認の近赤外蛍光色素であるインドシアニングリーン(ICG)が最初の脂質混合物に導入され、LTSLsに共装することに成功しました。808 nmレーザーはDOX/ICG搭載LTSLsを照射し、5分以内にDOXの光熱加熱誘発バースト放出を誘発するのに使用される。
すべての機器と材料は、市販され、すぐに使用でき、カスタマイズの必要はありません。LTSLを処方するためのすべてのパラメータが最適化されているので、このプロトコルに従って、マイクロ流体の予備知識を持たない研究者は、熱感知薬送達システムの基礎となるLTSLsを準備することもできます。
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Protocol
1. 機器のセットアップ
- 次のようにシリンジポンプとSHMを組み立てます。
- ポンプネットワークケーブルを使用して、二次シリンジポンプの「コンピュータへ」ポート(ポンプ02、水溶液用)をマスターシリンジポンプの「ネットワークへ」ポート(ポンプ01、エタノール脂質溶液用)に接続します(図1、黄)。
- コンピュータの「RS232 シリアル」ポートにマスターポンプの「コンピュータへ」ポートを接続し、PC to Pump ネットワークケーブル (図1、青) を使用します。
- ナットとフェルールを使用して、SHMの各入口と出口にチューブを接続します。別のナットとフェルールと組合アセンブリを使用して、両方の入口のチューブの端子をメスルアーに変換します。入口の長いチューブにより、シリンジへの取り付けが容易になります(図2)。
- ポンプ制御ソフトウェアをセットアップします。
- マスターシリンジポンプと二次シリンジポンプのアドレスを、それぞれ「Ad:01」と「Ad:02」に、注射器ポンプの「セットアップ」ボタンを使用して割り当てます。これは初めて行う必要があります。
- コンピュータでポンプ制御ソフトウェアを開きます。2つのシリンジポンプは自動的に検出され、ビープ音が鳴ります。それ以外の場合は、[ポンプと検索ポンプ]をクリックして接続を更新します。(図3)。
- 「HSW ノルムジェクト 5 cc (Dia=12.45)」を選択して、直径を 12.45 (mm) に割り当てます。
- ポンプ01(エタノール脂質溶液)の場合は0.25 mL/分、ポンプ02の場合は0.75 mL/分(水溶液)に割り当てます。流量は総流量(TFR)1mL/分、水対エタノール間流量比(FRR)は3です。
- ボリュームを 5 mL より大きい値に割り当てます。
注: ターゲットの注入量は、チューブの空隙体積を考慮して、ロードされた液体ボリュームよりも大きく設定されています。 - 両方のポンプに対して INF (注入) モードを選択します。
- 設定を押して設定を確定します。
2. LTSLs を準備する
- LTSL10またはLTSL10-ICG脂質混合物を調製する(表1参照)。
- 2つの5 mLルアーロックシリンジを用いて、1mLの脂質混合物と少なくとも3mLの(NH4)2SO4溶液を回収する。
- 2本の注射器を直立位置のシリンジポンプに取り付け、注射器のバレルフランジをポンプのシリンジリテーナーにスライドさせ、シリンジのプランジャーフランジをポンプのプッシャーブロックに取り付けます(図4)。
- 加熱テープの端を水溶液でシリンジに巻きます。加熱テープのもう一方の端とサーモスタットの温度プローブを脂質溶液でシリンジの周りに巻きます。アセンブリプロセスを容易にするために、空のシリンジを配置してこのステップを練習すると便利です(図5A)。
- SHMの対応する入口の女性ルアーアダプターに2本の注射器を接続します。脂質混合物と(NH4)2SO4溶液を含む注射器がそれぞれエタノール入口および水性入口に接続されていることを確認してください。プランジャの位置を調整して、シリンジから気泡を取り除きます(図5B)。
メモ:シリンジがポンプのシリンジリテーナーにしっかりと固定されていることを確認してください。 - 10 sの加熱セッションを使用して、加熱テープを使用して51°C以上に注射器を加熱します。サーモスタットに注射器の温度を更新させます。注入中の温度を維持するには、次の手順でこの手順を繰り返します。
注意: 温度のオーバーシュートを防ぎ、サーモスタットが実際の温度を更新できるように、10 s後に加熱テープをオフにします。加熱テープは、温度が非常に迅速に上昇するので、注意して処理する必要があります。連続的に加熱すると、測定温度を更新するためのサーモスタットの時間遅延により、機器およびシリンジが損傷する可能性があります。 - 温度が51 °Cを超えたら、ポンプ制御ソフトウェアで[すべて実行]を押してシリンジポンプを実行します(図3)。
- 流体の流れが気泡や漏れがないことを確認します。排出口から液体の初期量(約0.5mL)を廃棄物として処分します。
注:この初期廃棄物量は明確ではなく、液体がチューブとSHMを通ってコンセントに移動する流体の体積であるセットアップの内部容積に依存します。 - リポソームサンプルとして残りの液体をマイクロ遠心管またはビジューバイアルに回収します。
- 注射器のどちらかの液体がほとんど空の場合は、注入を一時停止/停止します。
注:ポンプは、注射器が空のときに正確に位置を検出しない可能性があるため、手動で停止する必要があります。 - 収集したリポソーム溶液を60°Cの水浴に入れ、1.5時間アニールします。
注:このステップは、リポソームへの薬物のロードを可能にするために不可欠です。 - 透析チューブにソリューションを転送します。240 mMの1 L(NH4) 2SO4で37°Cで少なくとも4時間の溶液を透析し、精製リポソームを得た。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。この工程におけるリポソームはリン脂質の5mMである。精製されたリポソームは4°Cで保存することができる。 - 繰り返し使用するためにSHMを洗浄するには、脱イオン水、エタノール、窒素ガスで乾燥してSHMを順次洗い流します。
3. 膜貫通pH勾配によるLTSLsへのDOXのリモートローディング
- サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて、LTSLsの外用緩衝液をHEPES緩衝生理食糸(HBS)に交換し、膜貫通pH勾配を確立する。
- SEC 列の上部に合計 25 mL の HBS を追加して、列を準備します。すべての溶出剤が柱を通して溶出し、溶出剤を処分できるようにします。
- ステップ2.12から調製した1mLの透析リポソームをカラムに加え、溶出した部分を処分する。
- 1.5 mLのHBSをカラムに追加し、溶出します。
- 3 mLのHBSをカラムに追加し、3 mLの溶出を集めます。
注: ここでプロトコルを一時停止できます。リポソームは、このステップで収集され、リン脂質の1.67 mMにある。バッファー交換リポソームは4°Cで保存することができる。
- ドキソルビシン(DOX)を使用してLTSLをインキュベートし、LTSLを精製します。
- DOX溶液を1:20 DOX-リン脂質モル比でビジューバイアルに含まれるバッファー交換リポソーム溶液(1.67 mmol)の1 mLに添加します。これは、1 mg/mL DOX溶液(83.4 μmol)の48.4 μLを添加することで達成できます。
- 37 °Cの水浴にビジューバイアルを1.5時間入れ、DOXをリポソームに装填できるようにします。
- 10 μL のリポソームと 170 μL の HBS と 20 μL の 1% (v/v) トリトン X-100 溶液を黒の 96 ウェルプレートに混ぜます。3つの井戸のために繰り返します。これらの井戸は、DOX含有量を「浄化前」に対応する。
- LTSL10-ICGを調製する場合は、リポソームの40 μLを160μLのDMSOと透明な96ウェルプレートに混ぜます。3つの井戸のために繰り返します。これらのウェルは、ICG含有量が「精製前」に対応する。
- ステップ3.1で説明したリポソーム溶液を精製する。
注: 後で精製するためにカラムを再利用するには、ステップ 3.1.1 を実行する前に、希釈した 0.5 M NaOH 溶液を 1 mL 追加して、フリー DOX からカラムをクリーニングします。赤の無料DOXは、素早く紫色の青と溶け出しを行います。 - 精製されたリポソーム溶液の30 μLを150 μLのHBSと20 μLの1%(v/v)トリトンX-100溶液を黒い96ウェルプレートに混ぜます。3つの井戸のために繰り返します。これらの井戸は、DOX含有量「精製後」に対応する。
- LTSL10-ICGの場合、精製されたリポソーム溶液の40μLをDMSOの160μLと透明な96ウェルプレートに混ぜ合わせます。3つの井戸のために繰り返します。これらのウェルは、ICG含有量「精製後」に相当する。
- マイクロプレートリーダー(λex = 485nm、λ = 590 nm)を用いて、精製前(ステップ3.2.3)および(ステップ3.2.5)後のウェルのDOX蛍光強度を測定します。
- 精製前後の蛍光強度の比を取り込んで、DOX(DOX EE)のカプセル化効率を算出します。
- マイクロプレートリーダー(600〜1000 nm)を使用して、精製前後のウェルのICG吸光度を測定します。
- ICG(ICG EE)のカプセル化効率を算出し、精製前後792nmでの吸光度の比をとり、精製中の希釈倍率(3回)を考慮に入れる。
4. ダイナミック光散乱(DLS)
- 50 μLのリポソーム溶液(ステップ2.12)を450μLの脱イオン水に添加します。
- DLS機器の内部にキュベットを入れ、メーカーの指示に従って測定を行います。
- 各サンプルの3つの測定値の平均Z平均直径と分散度を記録します。
5. 差動走査熱量測定(DSC)
- リポソーム試料の1mL(ステップ2.12)を0.5mL(最終脂質濃度10mM)に遠心フィルターユニットで濃縮した。固定角度ローターを使用して、7500 x gで約15分間スピンします。
- 20 μLの(NH4)2SO4溶液とリポソームサンプルを2つのそれぞれのDSCパンに移す。DSCサンプルプレスキットを使用して、DSCハーメチックリッドで鍋を密封します。
- 差動走査熱量計を用いて、1°C/分の加熱速度で30°Cから60°Cまでのサンプルを測定してください。
- 適切なソフトウェアでデータを分析します。最大勾配点の接線のx切片によって測定される相転移(融点)の発症として相転移温度(Tm)をとる。
6. ドキソルビシンの放出
- 湯浴を用いて、HBSを所定の温度(37または42°C)で予熱します。サンプルを焼き抜く氷水浴を準備します。
- 微小遠心分離管に1.9 mLのHBSに精製されたDOXを積載したリポソーム(ステップ3.2.5)を100μL加えます。指定温度の水浴にチューブを入れます。
- すぐに200 μLのサンプルをチューブから取り出し、すぐに氷水浴に入れ、その後の薬物放出を急いでください。このサンプルは、初期 (t = 0) の時間点に対応します。
- 200 μLのサンプルを、その後の時点(t = 5、10、15、30、60分)に引き出し、すぐに氷水浴に入れ、薬物放出を急いで消します。
- 各時点のサンプル50μLと150μLのHBSを黒い96ウェルプレートに混ぜます。プレートリーダーを使用してDOX蛍光強度を測定します。
- ステップ6.5で準備されたランダム選択された井戸に1%(v/v)トリトンX-100の20 μLを加えます。プレートリーダーを使用して、これらのウェルのDOX蛍光強度を測定します。これらの値は、完全リリース (t = ∞; 100% リリース) のタイム ポイントに対応します。
- 各時点 (I(t)) の蛍光強度を補間して放出される DOX の割合を計算し、初期 (I(0)) と比較して、完全に解放された値 (I(∞)) と比較してプロットします。
7. レーザー加熱とリリースのトリガ
- 水槽の温度を37°Cに設定し、温度を安定させます。
- 200 μL の DOX 搭載 LTSL10-ICG ([ICG] = 10 μg/mL) を透明の 96 ウェルプレートに加え、水浴に入れ、底部を水に浸しておいてください。
- レーザーシステムの電流を2.27 Aに設定し、レーザーシステムのコリメータを96ウェルプレートの表面より5cm上に垂直に置きます。
注意: レーザーシステムは、関連するレーザー安全対策に準拠して動作する必要があります。 - レーザーのスイッチを入れ、光ファイバー温度プローブを使用して毎分温度を監視します。
- 5分と10分で、透明な96ウェルプレートからレーザー照射リポソーム10μLを引き出し、黒い96ウェルプレートの3つの井戸に対して190 μLのHBSと混合します。
- 170 μL の HBS と 20 μL の 1% (v/v) トリトン X-100 溶液を黒の 96 ウェルプレートに 3 つのウェルに対して 10 μL 混合します。これらの井戸は「100%リリース」DOXコンテンツに対応しています。DOX蛍光強度を測定し、ステップ6.7で説明されているようにDOX放出を計算します。
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Representative Results
マイクロ流体によるLTSLsの調製には、DPPC/MSPC/DSPE-PEG 2000(80/10/10、モル比;)LTSL10)。図7A(左)は、ステップ2.9から、透明で非粘性の液体として、そのまま調製したLTSL10の外観を示す。LTSL10製剤は、LTSL4(DPPC/MSPC/DSPE-PEG 2000、86/10/4、モル比)から開発され、サンプル中に閉じ込められた大量の気泡によって示されるように、ゲル状の粘性サンプルを形成します(図7A;右)。
LTSL10のDLS測定(図7B、赤色)は、LTSL10のZ平均直径および分散率がそれぞれ95.28±7.32nm及び0.100±0.022であることを示し、実験の成功を示した。図7B(グレー)はまた、20°Cで調製した最適でない試料を示し、そこでより大きく、より分散したリポソームが得られた。
図 7Cは、LTSL10 の DOX EE を示しています。DOX EEは通常約80%でなければなりません。押出による脂質膜水和(LF)の慣用方法で調製したLTSLsは、比較のために含まれ、18の他の場所で説明したように調製される。LTSL4(LF)とLTSL10(LF)のDOX EEは、それぞれ約70%と50%のまともなDOX負荷を示しました。DOXローディングを可能にするには、準備中のLTSL10(ステップ2.11)のアニーリングが不可欠です。アニーリングステップがない場合、低DOX EE(< 20%)インキュベーション温度(20°C〜42°C)および持続時間(1〜24時間)に関係なく持続した。これは、LTSL10が膜貫通pH勾配を維持できなかったことを示し、DOXは代わりに受動的または吸着によって装填された。同程度のLTSL10をアニーリングすることにより、DOX EEは85%の平均に有意に増加し、DOXのリモートローディングの成功と膜貫通pH勾配の存在を示した。
図 7Dは LTSL10 の DOX リリース プロファイルを示しています。37°Cで、60分にわたる封入されたDOXの放出は約10%であった。これに対し、42°Cでは、封入されたDOXの全てが5分以内に放出され、LTSL10の温度感度を実証した。同様の結果は、コントロールとしてLTSL10(LF)を用いて観察された。
図8は、示差走査熱量測定(DSC)を用いて特徴付けられるLTSL10の相転移温度(Tm)を示す。点線は最大勾配の点の接線として、発症相転移温度(接線のx切片)の視覚的な助けとして追加される。LTSL10は、41.6 °Cで発症し、42.6 °Cでピークを迎え、比較的広い相転移を有する。同様の結果がLTSL10(LF)で観察され、調製技術のわずかな違いが示唆された。比較として、LTSL4(LF)は、文献1と一致して、より低く、よりシャープな相転移を有する。
図9はLTSL10-ICGの特徴付けを示す。初期ICG濃度のサイズ(図9A)およびDOXおよびICGの負荷効率(図9B)の効果は、3つの濃度範囲に分類される。低いICG濃度(ICG対脂質モル比0.003、初期濃度60μM ICGおよび20mM脂質)において、Z平均、分散性およびDOX EEはICG負荷を伴わないLTSL10と同様であった。ICG EEは約75%であった。DOXとICGのLTSL10への効率的な共装を、このICG濃度で達成することができます。中間ICG濃度では、サンプルのサイズおよび分散性は満足であったが、DOXおよびICG EEの両方が減少した。特に、DOX EEの減少は、リポソーム膜の破壊を示し、したがって、pH勾配を示した。高いICG濃度では、サンプルは再びゲル化した。DOXおよびICG EEはいずれも有意に減少した。
LTSL10-ICGを近赤外線レーザー(セクション7)で照射し、熱熱加熱を誘発し、DOXの放出を引き起こした(図10)。レーザー照射の際、サンプルはまず温度を徐々に下げて49.7 °Cまで加熱しました。その後のレーザー照射により、温度は36.7 °Cに上昇した。放出されたDOXの定量化は、カプセル化されたDOXの完全なバースト放出が最初の加熱サイクルの後に達成されたことを示した。これは、図7Dに示すDOX放出プロファイルと一致して、温度が42°Cを超えて到達したので予想通りであった。これに対し、ICGを使用しないLTSL10は光熱加熱を提供できないため、レーザー照射時にDOXを放出しませんでした。
図1:注射器ポンプのセットアップの写真。マスターポンプ(ポンプ01)の「ネットワークへ」ポートは、二次ポンプ(ポンプ02;黄色)の「コンピュータへ」に取り付けられています。マスターポンプの「コンピュータへ」ポートは、コンピュータのRS-232ポート(青色)に接続されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SHMセットアップの写真(A) SHM セットアップの組み立てビュー。(B) SHM セットアップの分解ビュー。SHMの入口および出口はナットおよびフェルールを使用して管に接続される。両方の入口の管は、両端にナットとフェルールを備えた長いチューブによって拡張され、ユニオンアセンブリを使用してメスのLuerアダプタによって終了します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ポンプ制御ソフトウェアのインタフェース。2つのシリンジポンプは、ソフトウェアを発する際に自動的に検出される必要があります。それ以外の場合は、左上隅にある[ポンプ] をクリックし、[ポンプを検索]をクリックします。設定するパラメータは赤いボックスで強調表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:シリンジポンプの写真とシリンジの設置。(A) シリンジリテーナブラケットとシリンジリテーナーの蝶ネジ(2、両側に1本)のシリンジポンプ(黄色の箱)。シリンジポンプ(緑色のボックス)のプッシャーブロック、調整つまみねじ、ドライブナットボタン(左側の白いボタン)(B) シリンジポンプに取り付けたシリンジの位置。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:注射器、発熱体およびSHMの組み立て写真。(A) シリンジ、加熱テープ、サーモスタットの組み立て(B) シリンジ、加熱テープ、サーモスタット、SHMの組み立てこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:レーザーセットアップの写真。(A) 動作中の光ファイバ結合レーザシステムの写真。(B) コリメータの位置は96ウェルプレートより5cm上。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: LTSL10 の特性化(A) 透析前の(左)LTSL10と(右)LTSL4の写真。LTSL10は透明で非粘性液体として現れ、LTSL4はゲル状で粘性であった。(B)20および51°Cで調製したLTSL10の10mMのZ平均直径および分散率。固体棒と開いた円(○)は、それぞれZ平均直径と分散度を示す。(C)LTSL4のDOX EE(LF;白)、LTSL10(LF;白)、およびアニール前(灰色)およびアニーリング後(赤)のLTSL10。(D) 37 °C (黒) および 42 °C (赤) で LTSL10 (円) および LTSL10 (LF; クロス) を放出する DOX。データは、少なくとも3つの独立した実験の平均±SDを表す。p < 0.001;二尾の非対のt検定。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8: LTSL10の熱特性DSCによって特徴付けられるLTSL4(LF)、LTSL10(LF)およびLTSL10のサーモグラフ。点線は、発症相転移温度の視覚的な助けとして追加されます。データは、少なくとも3つの独立した実験の平均を表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:LTSL10-ICGの特性評価(A)ICG搭載LTSL10のZ平均直径(赤色)および分散度(青色)(B) ICG 搭載 LTSL10 の DOX EE (赤) および ICG EE (緑)データは、少なくとも3つの独立した実験の平均±SDを表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:レーザーによる光熱加熱がDOX搭載LTSL10およびLTSL10-ICGの放出を引き起こした。(A) レーザーによる光熱加熱時に、照射されたサンプルの温度と(B)DOXのDOX放出によるDOX搭載LTSL10(青色)およびLTSL10-ICG(赤色)データは、少なくとも3つの独立した実験の平均±SDを表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:脂質混合物、バッファー、およびストック溶液
| 20 mM LTSL10脂質混合物 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, モル比) |
20 mM LTSL10脂質混合物の1 mLの場合: MSPCエタノールストック210 μL(5 mg/mL)、558 μL DSPE-PEG2000エタノールストック(10 mg/mL)、232 μLのエタノールを含むDPPCの11.75mgを溶解します。 あるいは、同等量のMSPC(1.05mg)およびDSPE-PEG2000(5.58mg)を粉末として添加することができます。 |
| 20 mM LTSL10-ICG脂質混合物 (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, モル比; ICG-脂質モル比 = 0.003) |
20 mM ICG 搭載 LTSL10脂質混合物の 1 mL の場合: 210 μLのMSPCエタノールストック(5 mg/mL)、558 μL DSPE-PEG2000エタノールストック(10 mg/mL)、ICGエタノールストック46.5μL(1mg/mL)、185.5μLのエタノールを含むDPPCの11.75mgを溶解します。 あるいは、同等量のMSPC(1.05mg)およびDSPE-PEG2000(5.58mg)を粉末として添加することができます。 ICG60μMと20mMの脂質を含みます。 |
| 240 mM 硫酸アンモニウム溶液 (NH4)2SO4, pH 5.4 | 脱イオン水の1Lあたり31.71g(NH4)2SO4を溶解する。 溶液のpHは、天然に5.4であり、追加のpH調整は必要ありません。 |
| ドキソルビシン溶液(DOX)、1mg/mL | 脱イオン水1mL当たり1mgのDOXを溶解する。 |
| DSPE-PEG2000エタノールストック、10 mg/mL | 1mLのエタノールあたり10mgのDSPE-PEG2000を溶解する。 |
| ヘペス緩衝生理液(HBS)、pH 7.4 | 脱イオン水の1L当たり8.0gのNaClと4.766gのHEPESを溶解します。 2.5 M NaOH溶液でpHを7.4に調整します。 |
| ICGエタノールストック、1 mg/mL | エタノール1mL当たり1mgのICGを溶解する。 |
| MSPCエタノールストック、5 mg/mL | エタノールの1mL当たり5mgのDPPCを溶解する。 |
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Discussion
提示されたプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)を用いた低温感受性リポソーム(LTSLs)の調製を記述する。LTSL10製剤は42 °Cの臨床的に達成可能な高体温で5分以内にドキソルビシンの温度誘発バースト放出を可能にする。また、DOXの放出を引き起こした光熱加熱のために、インドシアニングリーン(ICG)を共装することもできる。この方法は、(i)SHM11におけるエタノールと硫酸アンモニウム溶液の迅速で混沌とした混合によって提供される均質化溶媒環境下でのリポソームへのリン脂質の自己集合体に依存する。(ii) DOXローディングに必須の脂質二重層の完全性を維持するためにリポソームのアニーリング;(iii) 硫酸アンモニウムpH勾配によるLTSLsへのDOXの遠隔ローディング17.このプロトコルで利用される装置は市販され、パラメータが最適化されているので、このアプローチは、事前の知識やマイクロ流体の経験のないユーザーのために管理可能です。
プロトコル内で最も重要な手順の 1 つは、アセンブリ全体が適切に保護され、流体を適切に注入できるようにすることです (手順 2.5)。リポソームの自己集合性は均質化された溶媒環境に依存するため、シリンジの外流や気泡の導入などの不安定性は流体の流れの安定性を乱し、最適以下をもたらすリポソームの大きさと分散性。これは、ステップ2.8の背後にある根拠でもあり、流路を最初に占有する流体からなる体積は安定した流れに達する前に、廃棄されるべきである。
実験を成功させるための第2の重要なステップは、高いDOX EEを可能にするアニーリングステップです(ステップ2.11)。コレステロールフリーリポソームでは、ミセル形成膜成分(すなわちMSPCおよびDSPE-PEG2000)は、高い膜湾曲を収容するために高い欠陥を有する粒界に蓄積する。これらの配置は熱力学的に形成を支持し、膜細孔、開いたリポソーム、または二重層ディスクを安定化させる。アニールなしのLTSL10の低いDOX EEは、多孔質構造がTm以下でも存在することを示唆し、その結果、DOXローディングに必要なpH勾配が存在しなかった(図7C)。Tm未満の細孔の早期形成は、アニール処理が必要ない脂質膜(LTSL4(LF)およびLTSL10(LF)によって調製されたLTSLに対しては認められなかった。さらに、微小流体によって調製されたコレステロール含有製剤も、アニール処理を必要としない8.したがって、毛穴の早期形成は、調製中のエタノールの存在と脂質二重層におけるコレステロールの欠如の組み合わせ効果であると推測される。二重層膜内の構造欠陥は、リポソームをTm以上にアニールすることによって排除されると報告されており、脂質分子が均質に再分配され、欠陥が修正されるように19。さらに、アニーリングプロセスは、アニールされたリポソームがTm未満の温度に戻る不可逆的なプロセスであり、アニールLTSL10と一致して漏れやすい小胞19を再現しない。
リポソームの微小流体調製の性質は、脂質に対して特有の溶解性を有する2つの混和性溶媒を必要とするナノ沈降プロセスである:典型的には、エタノール(脂質溶媒として)および水溶液(脂質非溶媒として)。したがって、エタノールの存在は避けられない。したがって、コレステロール無しリポソーム20のようなアルコール誘発間質化13に敏感またはアルコール誘導性の高い製剤は、プロトコールの処方または再最適化の改変を必要とし得る。LTSL4の調製で示されるように、高粘性ゲルが得られた(図7A)、これは、ディジタトインゲル相15の形成に起因する可能性が高い。一方、LTSL10は、21の間桁間を防止する高い高分子濃度を有し、正常に調製した。その結果、エタノール除去手順も実行する必要があります。ここでは、透析だけで除去されました。接線流ろ過(エタノール除去と緩衝液交換の両方が可能)などのオンチップ連続精製技術は22,23に開発されていますが、その実装(ワンチップまたはモジュラー)は、このプロトコルの目的を超えています。しかし、将来的には、これらのモジュラー設計または標準化された設計が最適化され、可用性が向上し、マイクロ流体の生産プロセスが合理化されることを期待しています。
プロトコルのもう一つの制限は、液体の移動距離、すなわち初期廃棄物量(ステップ2.8)と注入されるが出口に到達しないソリューションの最後の一部によるサンプル損失です。これらのサンプル損失はほとんど避けず、特に少量または貴重なサンプルを準備する場合に、ベンチスケールの生産で準備量のかなりの部分に寄与する可能性があります。必要に応じて、脂質濃度24の迅速な定量を可能にする高速液体クロマトグラフィー蒸発光散乱検出器法により脂質回収を定量化することができた。ただし、より大きなシリンジや流体貯蔵器を使用するなど、プロセスを最適化してスケールアップすると、スループットをさらにスケールアップでき、サンプルの損失はそれほど大きくありません。
この方法と既存の調製方法の主な違いは、リポソームが高スループット、連続的に制御可能な溶媒環境で自己集合していることである。脂質膜法はバッチ製造工程であり、サイズ均質化が必要です。ベンチスケールで非常に実現可能ですが、臨床生産のためにスケールアップすることは依然として困難です。既存のマイクロ流体技術の中で、例えば、マイクロ流体流体力学的焦点をとって、SHMは、より低い希釈因子との短い混合タイムスケール11とより大きいスループット(mL/分の範囲)を提供する。LTSLsの調製にもかかわらず、これまで他のマイクロ流体デバイスを使用して報告されていません。当社のアプローチの主な利点は、高スループットでスケーラブルな熱感受性リポソームの生産です。
これまで、マイクロ流体プロトコルは、薬物負荷機能を備えたLTSL10の継続的な生産を提供します。DOXとICG以外のペイロードも実行可能です。しかし、透析によるエタノール除去、薬物遠隔負荷、SECカラムによる精製はバッチプロセスとして残り、製剤プロセス全体のボトルネックとなっています。将来の開発は、マイクロ流体アプローチ(接線流ろ過など)の活用に焦点を当て、これらの下流プロセスのスループットを向上させ、プロトコルのスケーラビリティを向上させる可能性がある。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
我々は、前立腺癌英国(CDF-12-002フェローシップ)、および工学物理科学研究評議会(EPSRC)(EP/M008657/1)に資金を提供してくれたことに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer - Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
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