Summary
Protokollen presenterer de optimaliserte parametrene for å forberede termosensitive liposomer ved hjelp av den forskjøvet fiskebeinmikromiksermikromiksermikrofluidics enheten. Dette tillater også samtidig kapsling av doksorubicin og indocyanine grønn inn i liposomer og fototermisk utløst frigjøring av doksorubicin for kontrollert / utløst narkotikautgivelse.
Abstract
Den presenterte protokollen muliggjør en høy gjennomstrømning kontinuerlig fremstilling av lav temperaturfølsomme liposomer (LTSLs), som er i stand til å laste kjemoterapeutiske legemidler, for eksempel doksorubicin (DOX). For å oppnå dette injiseres en etanolisk lipidblanding og ammoniumsulfatløsning i en forskjøvet fiskebeinmikromikser (SHM) mikrofluidisk enhet. Løsningene blandes raskt av SHM, noe som gir et homogent løsningsmiddelmiljø for liposomer selvmontering. Samlet liposomer er først annealed, deretter dialyzed å fjerne gjenværende etanol. En ammoniumsulfat pH-gradient er etablert gjennom bufferutveksling av den eksterne løsningen ved hjelp av størrelse utelukkelse kromatografi. DOX lastes deretter eksternt inn i liposomene med høy innkapslingseffektivitet (> 80 %). Liposomene som oppnås er homogene i størrelse med Z-gjennomsnittlig diameter på 100 nm. De er i stand til temperaturutløst utbrudd frigjøring av innkapslet DOX i nærvær av mild hypertermi (42 °C). Indocyanine grønn (ICG) kan også lastes inn i liposomene for nærinfrarød laserutløst DOX-utløser. Den mikrofluidiske tilnærmingen sikrer høy gjennomstrømning, reproduserbar og skalerbar fremstilling av LTSLs.
Introduction
LTSL formulering er et klinisk relevant liposomalt produkt som er utviklet for å levere kjemoterapeutisk legemiddel doksorubicin (DOX) og tillater effektiv burst narkotikafrigjøring ved klinisk oppnåelig mild hypertermi (T ‰ 41 °C)1. LTSL-formuleringen består av 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPPC), lysolipid 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylkolin (MSPC; M står for "mono") og PEGylated lipid 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksy(polyetylen glykol)-2000] (DSPE-PEG2000). Ved å nå faseovergangstemperaturen (Tm ‰ 41 °C) forenkler lysolipid en samlet og DSPE-PEG2000 sammen dannelsen av membranporer, noe som resulterer i en utbruddsfrigjøring av legemidlet2. Utarbeidelsen av LTSLer bruker primært en bulk ovenfra og ned tilnærming, nemlig lipid film hydrering og ekstrudering. Det er fortsatt utfordrende å reprodusere utre store partier med identiske egenskaper og i tilstrekkelige mengder for kliniske applikasjoner3.
Microfluidics er en fremvoksende teknikk for å forberede liposomer, og tilbyr justerbar nanopartikkelstørrelse, reproduserbarhet og skalerbarhet3. Når produksjonsparameterne er optimalisert, kan gjennomstrømningen skaleres opp ved parallellisering, med egenskaper som er identiske med de som er utarbeidet på benkeskala3,4,5. En stor fordel med mikrofluidics over konvensjonelle bulk teknikker er evnen til å håndtere små flytende volumer med høy kontrollerbarhet i rom og tid gjennom miniatyrisering, slik at raskere optimalisering, mens du opererer på en kontinuerlig og automatisert måte6. Produksjon av liposomer med mikrofluidiske enheter oppnås ved en nedenfra-opp nanonedbør tilnærming, som er mer tid og energieffektiv fordi homogenisering prosesser som ekstrudering og sonikering er unødvendig7. Vanligvis blandes en organisk løsning (f.eks. etanol) av lipider (og hydrofob nyttelast) med et feilfritt ikke-løsemiddel (f.eks. vann og hydrofil nyttelast). Ettersom det organiske løsningsmiddelet blandes med ikke-løsningsmiddelet, reduseres løseligheten for lipidene. Lipidkonsentrasjonen når til slutt en kritisk konsentrasjon der nedbørsprosessen utløses7. Nanoprecipitates av lipider til slutt vokse i størrelse og nær inn i en liposom. De viktigste faktorene som styrer størrelsen og homogeniteten til liposomene er forholdet mellom ikke-løsemiddel og løsningsmiddel (dvs. vandig-til-organisk strømningshastighetsforhold; FRR) og homogeniteten til løsningsmiddelmiljøet under selvmontering av lipider i liposomer8.
Effektiv væskeblanding i mikrofluidikk er derfor avgjørende for utarbeidelsen av homogene liposomer, og ulike design av miksere har blitt brukt i forskjellige applikasjoner9. Forskjøvet fiskebein mikromikser (SHM) representerer en av de nye generasjonene av passive miksere, noe som muliggjør høy gjennomstrømning (innenfor mL / min) med en lav fortynningsfaktor. Dette er bedre enn tradisjonelle mikrofluidiske hydrodynamiske blandeenheter8,10. SHM har mønstrede fiskebeinspor, som raskt blander væsker ved kaotisk advection9,11. Den korte blandetidsskalaen til SHM (< 5 ms, mindre enn den typiske aggregasjonstidsskalaen på 10–100 ms) gjør at lipidselvmontering kan forekomme i et homogent løsningsmiddelmiljø, som produserer nanopartikler med jevn størrelsesfordeling3,12.
Utarbeidelsen av LTSLs med mikrofluidics er imidlertid ikke så enkelt sammenlignet med konvensjonelle liposomale formuleringer på grunn av mangel på kolesterol8, uten noe som lipidbilag er utsatt for etanol-indusert interdigitation13,14,15. Inntil nå, effekten av gjenværende etanol presenterer under mikrofluidisk produksjon av liposomer har ikke blitt godt forstått. Flertallet av de rapporterte formuleringene er iboende motstandsdyktige mot interdigitalisering (som inneholder kolesterol eller umettede lipider)16, som i motsetning til LTSLs er både mettet og kolesterolfri.
Protokollen som presenteres her bruker SHM til å forberede LTSLs for temperaturutløst levering av legemidler. I den presenterte metoden sørget vi for at mikrofluidiske preparerte LTSLer er nano-størrelse (100 nm) og uniform (dispersitet < 0,2) ved dynamisk lysspredning (DLS). Videre innkapslet vi DOX ved hjelp av transmembrane ammoniumsulfat gradient metode (også kjent som ekstern lasting)17 som en validering av integriteten til LTSL lipid bilayer. Ekstern lasting av DOX krever liposom for å opprettholde en pH-gradient for å oppnå høy innkapslingeffektivitet (EE), noe som er usannsynlig å skje uten en intakt lipidbilayer. I denne presenterte metoden, karakteristisk fra typiske mikrofluidiske liposomforberedelsesprotokoller, er det nødvendig med et annealing-trinn før etanolfjernes for å aktivere den eksterne lasteevnen; det vil si for å gjenopprette integriteten til lipidbilayer.
Som nevnt tidligere kan hydrofile og hydrofobe nyttelaster også introduseres til de første løsningene for samtidig innkapsling av nyttelaster under dannelsen av LTSLs. Som et konseptbevis, indocyanine grønn (ICG), en FDA-godkjent nær-infrarød fluorescerende farge, som også er et lovende fototermisk middel, introduseres til den første lipidblandingen og vellykket co-lastet inn i LTSLs. En 808 nm laser brukes til å bestråle DOX / ICG-lastet LTSLs og vellykket indusere fototermisk oppvarming utløst burst utgivelsen av DOX innen 5 min.
Alle instrumenter og materialer er kommersielt tilgjengelige, klare til bruk, og uten behov for tilpasning. Siden alle parametrene for å formulere LTSLs har blitt optimalisert, etter denne protokollen, forskere uten forkunnskaper om mikrofluidics kan også forberede LTSLs, som fungerer som grunnlag for en termosensitiv narkotika leveringssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oppsett av utstyr
- Monter sprøytepumpene og SHM som følger.
- Koble "Til datamaskin" -porten til den sekundære sprøytepumpen (Pumpe 02, for vandig løsning) til "Til nettverk" -porten til hovedsprøytepumpen (Pumpe 01, for etanollipidoppløsning) ved hjelp av pumpen til pumpenettverkskabelen (Figur 1, gul).
- Koble "Til datamaskin" -porten til hovedpumpen til "RS232 Serial" -porten på datamaskinen ved hjelp av PC til pumpenettverkskabel (Figur 1, blå).
- Koble slangen til hver av innløpene og uttakene til SHM ved hjelp av en mutter og glød. Konverter terminalen på slangen for begge viker til kvinnelige Luer ved hjelp av en annen mutter og ferrule og en union montering. Lengre slange av inntakene gir lettere feste til sprøytene (Figur 2).
- Konfigurer pumpekontrollprogramvaren.
- Tilordne adressen til hovedsprøytepumpen og den sekundære sprøytepumpen til henholdsvis "Ad:01" og "Ad:02", ved hjelp av "Setup"-knappen på sprøytepumpen. Dette trenger bare å gjøres for første gang.
- Åpne pumpekontrollprogramvaren på datamaskinen. De to sprøytepumpene skal registreres automatisk, etterfulgt av en pipelyd. Ellers klikker du på Pumper og søker etter pumper for å oppdatere tilkoblingen. (Figur 3).
- Tilordne diameter til 12,45 (mm) ved å velge "HSW Norm-Ject 5 cc (Dia = 12,45)".
- Tilordne hastighet til 0,25 ml/min til pumpe 01 (etanollipidoppløsning) og 0,75 ml/min til Pumpe 02 (vandig oppløsning). Strømningshastigheten tilsvarer en total strømningshastighet (TFR) på 1 ml/min og vandig-til-etanol strømningshastighetsforhold (FRR) på 3.
- Tilordne volum til alle verdier over 5 ml.
MERK: Det målrettede infusjonsvolumet er stilt inn som større enn det lastede væskevolumet med tanke på det annullerte volumet av slangen. - Velg INF(infusjonsmodus) for begge pumpene.
- Trykk på Sett for å bekrefte innstillingene.
2. Klargjør LTSLs
- Klargjør en LTSL10- eller LTSL10-ICG lipidblanding (se tabell 1).
- Trekk ut 1 ml lipidblanding og minst 3 ml (NH4)2SO4 oppløsning ved hjelp av to 5 ml luerlåssprøyter.
- Monter de to sprøytene på sprøytepumpene i oppreist stilling ved å skyve sylinderflensen på sprøyten til sprøyteholderen på pumpen, og stempelflensen på sprøyten til pumpens pusherblokk (Figur 4).
- Pakk enden av varmebåndet til sprøyten med den vandige oppløsningen. Pakk den andre enden av varmebåndet og temperatursonden til termostaten rundt sprøyten med lipidoppløsningen. Det er nyttig å øve dette trinnet med tomme sprøyter på plass for å lette monteringsprosessen (Figur 5A).
- Koble de to sprøytene til de kvinnelige Luer-adapterne til de tilsvarende inntakene til SHM. Pass på at sprøytene som inneholder lipidblandingen og (NH4)2SO4-løsninger er henholdsvis tilkoblede etanolinntak og vandig inntak. Juster stempelposisjonen for å fjerne luftbobler fra sprøytene (Figur 5B).
MERK: Pass på at sprøytene fortsatt er godt plassert på sprøyteholderen på pumpene. - Varm opp sprøytene til over 51 °C ved hjelp av varmebåndet ved hjelp av en 10 s oppvarmingsøkt. La termostaten oppdatere temperaturen på sprøytene. Gjenta dette trinnet i følgende trinn for å opprettholde temperaturen under infusjonen.
FORSIKTIG: Slå av varmebåndet etter 10 s for å unngå overskytende temperaturer og la termostaten oppdatere den faktiske temperaturen. Varmebåndet bør også håndteres med forsiktighet når temperaturen stiger veldig raskt. Oppvarming kan skade utstyr og sprøyter kontinuerlig, på grunn av tidsforsinkelsen av termostaten for oppdatering av den målte temperaturen. - Når temperaturen er over 51 °C, kjører du sprøytepumpene ved å trykke Kjør alle i pumpekontrollprogramvaren (Figur 3).
- Sørg for at væskestrømmen er fri for luftbobler og lekkasje. Kast det opprinnelige volumet (ca. 0,5 ml) væske fra uttaket som avfall.
MERK: Dette første avfallsvolumet er ikke bestemt og avhenger av det interne volumet av oppsettet, som er volumet for væske å reise fra sprøytene gjennom slangen og SHM til uttaket. - Samle resten av væsken som liposom prøver i en microcentrifuge rør eller bijou hetteglass.
- Sett infusjonen på pause/stopp når væsken i en av sprøytene er nesten tom.
MERK: Pumpene bør stoppes manuelt, siden pumpene kanskje ikke nøyaktig registrerer posisjonen når sprøytene er tomme. - Plasser de innsamlede liposomløsningene i et 60 °C vannbad til anneal i 1,5 timer.
MERK: Dette trinnet er viktig for å muliggjøre stofflasting i liposomene. - Overfør løsningene til dialyserør. Dialyze løsningene mot 1 L på 240 mM (NH4)2SO4 ved 37 °C i minst 4 timer for å oppnå rensede liposomer.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Liposomer på dette trinnet er på 5 mM fosfolipid. Renset liposomer kan lagres ved 4 °C. - For å rengjøre SHM for gjentatt bruk, skyll SHM sekvensielt med deionisert vann, etanol og tørk med nitrogengass.
3. Ekstern lasting av DOX i LTSLs ved transmembrane pH gradient
- Utveksle ekstern buffer av LTSLer til HEPES-bufret saltvann (HBS) ved hjelp av størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) for å etablere en transmembrane pH-gradering.
- Legg til totalt 25 ml HBS øverst i en SEC-kolonne for å klargjøre kolonnen. La alt eluent elute gjennom kolonnen og kaste eluate.
- Tilsett 1 ml dialysed liposomer, utarbeidet fra trinn 2.12, til kolonnen og kast elute.
- Tilsett 1,5 ml HBS i kolonnen og kast elutten.
- Tilsett 3 ml HBS i kolonnen og samle 3 ml elute.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Liposomer samles på dette trinnet og er på 1,67 mM fosfolipid. Buffer utvekslet liposomer kan lagres ved 4 °C.
- Inkuber LTSLs med doksorubicin (DOX) og rense LTSLs.
- Legg til DOX-oppløsning i 1:20 DOX-til-fosfolipid molar ratio i 1 ml buffer-utvekslet liposomer løsning (1,67 mmol) som finnes i et bijou hetteglass. Dette kan oppnås ved å tilsette 48,4 μL av 1 mg/ml DOX-oppløsning (83,4 μmol).
- Plasser bijou hetteglasset i et 37 ° C vannbad i 1,5 h for å tillate DOX lasting inn i liposomene.
- Bland 10 μL av liposomene med 170 μL HBS og 20 μL på 1 % (v/v) Triton X-100-oppløsning i en svart 96-brønnplate. Gjenta for tre brønner. Disse brønnene tilsvarer "før rensing" DOX-innhold.
- Ved forberedelse av LTSL10-ICG, bland 40 μL av liposomene med 160 μL DMSO i en klar 96-brønnplate. Gjenta for tre brønner. Disse brønnene tilsvarer "før rensing" ICG-innhold.
- Rens den liposomme løsningen som beskrevet i trinn 3.1.
MERK: Hvis du vil gjenbruke kolonnen for fremtidig rensing, rengjør du kolonnen fra gratis DOX ved først å legge til 1 ml fortynnet 0,5 M NaOH-løsning før du utfører trinn 3.1.1. Gratis DOX i rødt vil bli fiolett-blå og elute gjennom kolonnen raskt. - Bland 30 μL av renset liposomoppløsning med 150 μL HBS og 20 μL på 1 % (v/v) Triton X-100-oppløsning i en svart 96-brønnplate. Gjenta for tre brønner. Disse brønnene tilsvarer "etter rensing" DOX-innhold.
- Ved LTSL10-ICG blandes 40 μL av renset liposomoppløsning med 160 μL DMSO i en klar 96-brønnplate. Gjenta for tre brønner. Disse brønnene tilsvarer "etter rensing" ICG-innhold.
- Mål DOX fluorescensintensiteten til brønnene før (trinn 3.2.3) og etter (trinn 3.2.5) rensing, ved hjelp av en mikroplateleser (λex = 485 nm, λem = 590 nm).
- Beregn innkapslingseffektiviteten til DOX (DOX EE) ved å ta forholdet mellom fluorescensintensitetenfør og etter rensing.
- Mål ICG-absorbansen av brønnene før og etter rensing, ved hjelp av en mikroplateleser (600 til 1000 nm).
- Beregn innkapslingseffektiviteten til ICG (ICG EE) ved å ta forholdet mellom absorbansen ved 792 nm før og etter rensing, med tanke på fortynningsfaktoren (3 ganger) under rensingen.
4. Dynamisk lysspredning (DLS)
- Tilsett 50 μL liposomoppløsning (trinn 2,12) til 450 μL avdeionisert vann.
- Plasser cuvetten inne i DLS-instrumentet og utfør målingen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Registrer gjennomsnittlig Z-gjennomsnittlig diameter og dispergering av tre målinger for hver prøve.
5. Differensial skanning calorimetri (DSC)
- Konsentrat 1 ml liposomprøver (trinn 2,12) med en sentrifugal filterenhet til 0,5 ml (endelig lipidkonsentrasjon på 10 mM). Ved hjelp av en fast vinkelrotor, snurr på 7500 x g i ca. 15 min.
- Overfør 20 μL (NH4)2SO4 oppløsning og liposomprøver til to respektive DSC-panner. Forsegle pannene med DSC hermetiske lokk ved hjelp av DSC prøvetrykksett.
- Mål prøven fra 30 °C til 60 °C ved en oppvarmingshastighet på 1 °C/min ved hjelp av et differensialskannekalorimeter.
- Analyser dataene med riktig programvare. Ta faseovergangstemperaturen (Tm) som utbruddet av faseovergangen (smeltetopp), som måles ved x-avskjæring av tangent av punktet for maksimal helling.
6. Doxorubicin utgivelse
- Forvarm HBS ved angitt temperatur (37 eller 42 °C) ved hjelp av et vannbad. Forbered et isvannbad for å slukke prøvene.
- Tilsett 100 μL renset DOX-ladd liposomer (trinn 3.2.5) i 1,9 ml HBS i et mikrocentrifugerør. Plasser røret i vannbadet til den angitte temperaturen.
- Trekk umiddelbart 200 μL prøver fra røret og legg det raskt i isvannsbadet for å slukke eventuell etterfølgende legemiddelfrigjøring. Dette eksemplet tilsvarer det første (t = 0) tidspunktet.
- Trekk ut 200 μL prøver ved påfølgende tidspunkter (t = 5, 10, 15, 30, 60 min) og plasser det raskt i isvannsbadet for å slukke eventuell legemiddelfrigjøring.
- Bland 50 μL prøve av hvert tidspunkt med 150 μL HBS i en svart 96-brønnplate. Mål DOX fluorescensintensiteten ved hjelp av en plateleser.
- Tilsett 20 μL på 1 % (v/v) Triton X-100 i tilfeldige utvalgte brønner utarbeidet i trinn 6,5. Mål DOX fluorescensintensiteten til disse brønnene ved hjelp av en plateleser. Disse verdiene tilsvarer det fullstendig utgitte (t = ⭐; 100% frigjøring) tidspunkt.
- Beregn og plott prosentandelen av DOX utgitt ved å interpolere fluorescensintensiteten til hvert tidspunkt (I(t)), sammenlignet med den første (I(0)), og fullstendig utgitt (I()), verdi.
7. Laseroppvarming og utløst utløser
- Still inn vannbadtemperaturen til 37 °C og la temperaturen stabilisere seg.
- Tilsett 200 μL DOX-lastet LTSL10-ICG ([ICG] = 10 μg/ml) til en klar 96-brønnplate, og plasser den deretter i vannbadet, hold bunnen nedsenket i vann.
- Sett strømmen av lasersystemet til 2,27 A. Plasser kollimatoren til lasersystemet på 5 cm vertikalt over overflaten av 96-brønnplaten, noe som tilsvarer en energistrøm på 0,5 W/cm2 [Figur 6].
FORSIKTIG: Lasersystemet skal brukes i samsvar med relevante lasersikkerhetstiltak. - Slå på laseren og overvåk temperaturen hvert minutt ved hjelp av en fiberoptisk temperaturprobe.
- Ved 5 og 10 min, trekk 10 μL laser-bestråltliposomer fra den klare 96-brønnplaten på og bland med 190 μL HBS for tre brønner i en svart 96-brønnplate.
- Bland 10 μL av liposomene med 170 μL HBS og 20 μL på 1 % (v/v) Triton X-100-oppløsning for tre brønner i en svart 96-brønnplate. Disse brønnene tilsvarer dox-innholdet "100 % utgitt». Mål DOX fluorescerende intensitet og beregn DOX-utgivelsen som beskrevet i trinn 6.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utarbeidelsav LTSLs av mikrofluidics krever lipidsammensetningen av DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (80/10/10, molar ratio; LTSL10). Figur 7A (venstre) viser utseendet til som forberedt LTSL10 fra trinn 2.9, som en klar og ikke-viskøs væske. LTSL10 formulering er utviklet fra konvensjonell formulering, LTSL4 (DPPC / MSPC / DSPE-PEG2000, 86/10/4, molar ratio) siden LTSL4 danner en gel-lignende viskøs prøve, som angitt av den store mengden luftbobler fanget i prøven (Figur 7A; høyre).
DLS-måling av LTSL10 (figur 7B, rød) viste at Z-Gjennomsnittlig diameter og dispergering av LTSL10 var 95,28 ± 7,32 nm og 0,100 ± 0,022, henholdsvis, noe som indikerer suksessen til eksperimentet. Figur 7B (grå) viser også en suboptimal prøve, som ble utarbeidet ved 20 °C, hvor større og mer spredte liposomer ble oppnådd.
Figur 7C viser at DOX EE for LTSL10. DOX EE bør vanligvis være rundt 80%. LTSLs utarbeidet av den konvensjonelle metoden for lipidfilmhydrering med ekstrudering (LF) er inkludert for sammenligning, utarbeidet som beskrevet andre steder18. DOX EE hos LTSL4 (LF) og LTSL10 (LF) viste anstendig DOX-lasting på henholdsvis rundt 70 % og 50 %. Annealing av as-forberedt LTSL10 (trinn 2.11) er avgjørende for å aktivere DOX lasting. I fravær av annealing trinn, lav DOX EE (< 20%) var vedvarende, uavhengig av inkubasjonstemperatur (20 °C til 42 °C) og varighet (1 til 24 timer). Dette indikerte svikt i LTSL10 for å opprettholde en transmembrane pH gradient, der DOX i stedet ble lastet passivt eller av adsorpsjon. Ved å gjøre det ferdigstillet LTSL10 økte DOX EE betydelig til et gjennomsnitt på 85 %, noe som indikerer suksessen til den eksterne lastingen av DOX og tilstedeværelsen av transmembranen sh-gradient.
Figur 7D viser DOX-utgivelsesprofilen til LTSL10. Ved 37 °C var frigjøringen av innkapslet DOX over 60 min ca. 10 %. I motsetning, ved 42 °C, ble alle innkapslede DOX utgitt innen 5 minutter, noe som viser temperaturfølsomheten til LTSL10. Lignende resultater ble observert med LTSL10 (LF) som kontroll.
Figur 8 viser faseovergangstemperaturen (Tm) av LTSL10 karakterisert ved hjelp av differensialskanningskalorimetri (DSC). Stiplede linjer som tangent av punktet for maksimal helling, legges til som et visuelt middel av den innsette fase overgangstemperaturen (x-avskjæring av tangentlinjen). LTSL10 har en relativt bred faseovergang med utbruddet ved 41,6 °C og topp ved 42,6 °C. Lignende resultater ble observert med LTSL10 (LF), noe som tyder på en liten forskjell mellom tilberedningsteknikkene. Til sammenligning har LTSL4 (LF) en lavere og skarpere faseovergang, i samsvar medlitteraturen 1.
Figur 9 viser karakteriseringen av LTSL10-ICG. Effekten av innledende ICG-konsentrasjon på størrelse (figur 9A) og lasting effektivitet av DOX og ICG (Figur 9B) er kategorisert i tre konsentrasjonsområder. Ved lav ICG-konsentrasjon (ICG-til-lipid molar ratio på 0,003; innledende konsentrasjon på 60 μM ICG og 20 mM lipid), z-gjennomsnitt, dispergering og DOX EE var lik LTSL10 uten ICG-lasting; ICG EE var rundt 75%. Effektiv samlasting av DOX og ICG i LTSL10 kan oppnås ved denne ICG-konsentrasjonen. Ved mellomliggende ICG-konsentrasjoner, mens størrelsen og spredningen av prøvene var tilfredsstillende, ble både DOX og ICG EE redusert. Spesielt indikerte reduksjonen i DOX EE forstyrrelsen av liposomalmembranen og dermed pH-gradienten. Ved høye ICG-konsentrasjoner ble prøvene igjen gelled; DOX og ICG EE ble begge signifikant redusert.
LTSL10-ICG ble bestrålt med nærinfrarød laser (avsnitt 7) for å indusere fototermisk oppvarming og utløste utgivelsen av DOX (Figur 10). Ved laserbestråling vardet prøven først opp til 49,7 °C med en gradvis temperaturreduksjon. Etterfølgende laserbestråling økte temperaturen til 36,7 °C. Kvantifisering av den frigjorte DOX indikerte at en fullstendig burst-frigjøring av innkapslet DOX ble oppnådd etter den første varmesyklusen. Dette var som forventet siden temperaturen nådde over 42 °C, i samsvar med DOX-frigjøringsprofilen vist i figur 7D. LtsL10 uten ICG kan derimot ikke gi fototermisk oppvarming, og slapp dermed ikke DOX ved laserbestråling.
Figur 1: Bilde av oppsettet av sprøytepumper. "Til nettverk" -porten til hovedpumpen (Pumpe 01) er festet til "Til datamaskin" på den sekundære pumpen (Pump 02; gul); "Til datamaskin" -porten til hovedpumpen er festet til RS-232-porten på datamaskinen (blå). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fotografi av SHM-oppsettet. (A) Montert visning av SHM-oppsettet. (B) Eksplodert visning av SHM-oppsettet. Viker og utsalg av SHM er koblet til rør ved hjelp av en mutter og ferrule. Slangen av begge vikene utvides med en lengre slange med mutter og glød i hver ende, avsluttet av en kvinnelig Luer-adapter ved hjelp av en unionsforsamling. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Grensesnittet til pumpekontrollprogramvaren. De to sprøytepumpene skal registreres automatisk ved initiering av programvaren; Ellers klikker du på Pumper øverst til venstre og Søk etter pumper. Parametere som skal konfigureres, er uthevet i røde bokser. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Fotografi av sprøytepumpene og installasjon av en sprøyte. (A) Sprøyteholderbrakett og sprøyteholder skruer (2, en på hver side) av sprøytepumpen (gul boks). Trykkkloss, justeringstommelskrue og drivmutterknapp (hvit knapp til venstre) på sprøytepumpen (grønn boks). (B) Posisjon av en installert sprøyte på sprøytepumpen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Fotografi av montering av sprøyter, varmeelement og SHM. (A) Montering av sprøyter, varmebånd og termostat. (B) Montering av sprøyter, varmebånd, termostat og SHM. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Fotografi av laseroppsettet. (A) Fotografi av fiberkoblet lasersystem under drift. (B) Posisjonen til collimator 5 cm over 96-brønnplaten. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Karakterisering av LTSL10. (A) Fotografi av (venstre) LTSL10 og (høyre) LTSL4, før dialyse. LTSL10 dukket opp som klar og ikke-viskøs væske, mens LTSL4 var gellignende og viskøs. (B) Z-gjennomsnittlig diameter og dispergering av 10 mM LTSL10 utarbeidet ved 20 og 51 °C. Solide stolper og åpne sirkler (○) indikerer henholdsvis Z-gjennomsnittlig diameter og dispersitet. (C) DOX EE av LTSL4 (LF; hvit), LTSL10 (LF; hvit) og LTSL10 før (grå) og etter annealing (rød). (D) DOX-frigjøring av LTSL10 (sirkel) og LTSL10 (LF; kryss) ved 37 °C (svart) og 42 °C (rød). Data representerer gjennomsnittlig ± SD for minst tre uavhengige eksperimenter. p < 0,001; to-tailed unpaired t-tester. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Termiske egenskaper ltsl10. Termografer av LTSL4 (LF), LTSL10 (LF) og LTSL10 preget av DSC. Stiplede linjer legges til som et visuelt hjelpemiddel for overgangstemperaturen i innfelt fase. Data representerer gjennomsnittet for minst tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Karakterisering av LTSL10-ICG. (A) Z-gjennomsnittlig diameter (rød) og dispergering (blå) av ICG-lastet LTSL10. (B) DOX EE (rød) og ICG EE (grønn) av ICG-lastet LTSL10. Data representerer gjennomsnittet ± SD for minst tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 10: Laserindusert fototermisk oppvarming utløste utgivelsen av DOX-lastet LTSL10 og LTSL10-ICG. (A) Temperaturen på bestrålte prøver og (B) DOX-frigjøring av DOX-lastet LTSL10 (blå) og LTSL10-ICG (rød) under laserindusert termisk fotooppvarming. Data representerer gjennomsnittet ± SD for minst tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Lipidblandinger, buffere og lagerløsninger.
| 20 mM LTSL10 lipidblanding (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, molarforhold) |
For 1 ml LTSL10 lipidblanding: Oppløs 11,75 mg DPPC med 210 μL MSPC etanollager (5 mg/ml), 558 μL DSPE-PEG2000 etanollager (10 mg/ml) og 232 μl etanol. Alternativt kan tilsvarende mengde MSPC (1,05 mg) og DSPE-PEG2000 (5,58 mg) tilsettes som pulver. |
| 20 mM LTSL10-ICG lipidblanding (DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000; 80/10/10, molarforhold; ICG-til-lipid molar ratio = 0,003) |
For 1 mL of 20 mM ICG-loaded LTSL10 lipid mixture: Oppløs 11,75 mg DPPC med 210 μL MSPC etanollager (5 mg/ml), 558 μL DSPE-PEG2000 etanollager (10 mg/ml) og 46,5 μL ICG etanollager (1 mg/ml) og 185,5 μl etanol. Alternativt kan tilsvarende mengde MSPC (1,05 mg) og DSPE-PEG2000 (5,58 mg) tilsettes som pulver. Inneholder 60 μM ICG og 20 mM lipid. |
| 240 mM Ammoniumsulfatoppløsning (NH4)2SO4, pH 5.4 | Oppløs 31,71 g (NH4)2SO4 per L avdeionisert vann. PH av løsningen er opprinnelig 5.4, ytterligere pH justering er ikke nødvendig. |
| Doksorubicinoppløsning (DOX), 1 mg/ml | Oppløs 1 mg DOX per ml deionisert vann. |
| DSPE-PEG2000 etanol lager, 10 mg/ml | Oppløs 10 mg DSPE-PEG2000 per ml etanol. |
| HEPES-bufret saltvann (HBS), pH 7.4 | Løs opp 8,0 g NaCl og 4,766 g HEPES per L avdeionisert vann. Juster pH til 7,4 med 2,5 M NaOH-løsning. |
| ICG etanol lager, 1 mg /ml | Oppløs 1 mg ICG per ml etanol. |
| MSPC etanol lager, 5 mg/ml | Oppløs 5 mg DPPC per ml etanol. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver utarbeidelsen av lav temperaturfølsomme liposomer (LTSLer) ved hjelp av en forskjøvet fiskebeinmikromikser (SHM). LTSL10-formuleringen muliggjør temperaturutløst utbruddsfrigjøring av doksorubicin innen 5 minutter ved en klinisk oppnåelig hypertermisk temperatur på 42 °C. Indocyanine grønn (ICG) kan også lastes samtidig for fototermisk oppvarming utløst utgivelsen av DOX. Metoden er avhengig av: (i) selvmontering av fosfolipider i liposomer under et homogenisert løsningsmiddelmiljø gitt av den raske, kaotiske blandingen av etanol og ammoniumsulfatløsning i SHM11; (ii) annealing av liposomene for å bevare integriteten til lipidbilayer avgjørende for DOX lasting; og (iii) ekstern lasting av DOX i LTSLs ved en ammoniumsulfat pH-gradient17. Siden utstyret som benyttes i denne protokollen er kommersielt tilgjengelig utenfor hyllen og parametrene er optimalisert, kan denne tilnærmingen håndteres for brukere uten forkunnskaper eller mikrofluidikkerfaring.
Et av de mest kritiske trinnene i protokollen er å sikre at hele enheten er riktig sikret og væske kan gjøres riktig infundert (trinn 2.5). Siden reproduserbarheten av selvmontering av liposomer er avhengig av et homogenisert løsningsmiddelmiljø, vil enhver ustabilitet, som oppløsning av sprøyter eller innføring av luftbobler, forstyrre stabiliteten i væskestrømmen og resultere i suboptimal liposom størrelse og spredning. Dette er også begrunnelsen bak trinn 2.8, hvor volumet, bestående av væsken som først okkuperte kanalen og før en stabil strømning er nådd, skal kastes.
Et annet kritisk skritt for et vellykket eksperiment er det annealing trinn, for å aktivere høy DOX EE (trinn 2.11). I kolesterolfrie liposomer vil micelledannende membrankomponenter (dvs. MSPC og DSPE-PEG2000) akkumuleres ved korngrenser med høy grad av defekter for å imøtekomme en høy membrankrumning2. Disse arrangementene favoriserer termodynamisk formasjonen og stabiliserer membranporer, åpnet liposomer eller tolayer plater. Den lave DOX EE av LTSL10 uten annealing antydet at porøse strukturer eksisterte selv under Tm, noe som resulterer i fravær av pH gradient kreves for DOX lasting (Figur 7C). Den for tidlige dannelsen av porer under Tm ble ikke observert for LTSLs utarbeidet av lipidfilm (LTSL4 (LF) og LTSL10 (LF)), hvor annealing ikke er nødvendig. Videre krever kolesterolholdige formuleringer tilberedt av mikrofluidics heller ikke annealing8. Det er derfor spekulert i at den for tidlige dannelsen av porer er en kombinert effekt av tilstedeværelsen av etanol under preparatet og mangelen på kolesterol i lipidbilayer. Strukturelle defekter i bilayer membranen har blitt rapportert å bli eliminert ved annealing liposomer over Tm,slik at lipid molekyler å omfordele homogent og defekter som skal korrigeres19. I tillegg er annealingprosessen en irreversibel prosess der annealed liposomer tilbake til en temperatur under Tm ikke gjenskape lekkende vesikler19, i forhold til annealed LTSL10.
Arten av mikrofluidisk fremstilling av liposom er en nanonedbørsprosess, som krever to blandbare løsemidler med særegen løselighet for lipidene: vanligvis etanol (som lipidløsningsmiddel) og vandig løsning (som lipid ikke-løsemiddel). Dermed er tilstedeværelsen av etanol uunngåelig. Derfor kan formuleringer som er følsomme eller utsatt for alkoholindusert interdigitation13, for eksempel kolesterolfrie liposomer20,kreve endring av formuleringen eller reoptimalisering av protokollen. Som demonstrert med fremstilling av LTSL4 ble den svært viskøse gelen oppnådd,(figur 7A), som sannsynligvis skyldtes dannelsen av en interdigitalert gelfase15. På den annen side ble LTSL10, med sin høyere polymerkonsentrasjon som forhindrer interdigitalasjon21,utarbeidet med hell. Følgelig må en etanol fjerning prosedyre også utføres; her ble det fjernet bare ved dialyse. Mens on-chip kontinuerlig rensing teknikker som tangential flyt filtrering (i stand til både etanol fjerning og buffer utveksling) er utviklet22,23, deres implementering (som en-chip eller modulær) er utenfor målet med denne protokollen. Likevel forventer vi i fremtiden at disse modulære eller standardiserte designene skal optimaliseres og økes i tilgjengelighet, og effektiviserer den mikrofluidiske produksjonsprosessen.
En annen begrensning av protokollen er prøvetapet på grunn av reiseavstanden til væskene, nemlig det første avfallsvolumet (trinn 2,8) samt den siste brøkdelen av løsninger som ville bli injisert, men som ikke ville nå uttaket. Disse prøvetapene er nesten uunngåelige og kan bidra til en betydelig del av forberedelsesvolumet ved benkeskalaproduksjon, spesielt når et lite volum eller dyrebare prøver skal tilberedes. Når det er nødvendig, kan lipidutvinningen kvantifiseres ved høy ytelse flytende kromatografi-fordampende lysspredningsdetektormetode som muliggjør rask kvantifisering av lipidkonsentrasjoner24. Men når prosessen er optimalisert og skalert opp, for eksempel ved hjelp av en større sprøyte eller væskereservoar, kan gjennomstrømningen bli ytterligere skalert opp og prøvetap ville være mindre signifikant.
Hovedforskjellen mellom denne metoden og den eksisterende forberedelsesmetoden er at liposomer er selvmontert i et kontrollerbart løsningsmiddelmiljø på en høy gjennomstrømning, kontinuerlig måte. Lipidfilmmetoden er en batchproduksjonsprosess og krever størrelsehomogenisering. Selv om det er svært mulig i en benkeskala, er det fortsatt utfordrende å skalere opp for klinisk produksjon. Innenfor eksisterende mikrofluidiske teknikker, for eksempel mikrofluidisk hydrodynamisk fokusering, tilbyr SHM en kortereblandetidsskala 11 og en større gjennomstrømning (i størrelsesorden ml /min) med lavere fortynningsfaktor; til tross for at tilsammen utarbeidelsen av LTSLs ikke er rapportert å bruke andre mikrofluidiske enheter så langt. Den store fordelen med vår tilnærming er den høye gjennomstrømningen, skalerbar produksjon av termosensitive liposomer.
Så langt tilbyr vår mikrofluidiske protokoll kontinuerlig produksjon av LTSL10 med stofflastingsevne. Nyttelaster enn DOX og ICG er også levedyktige. Etanolfjerning ved dialyse, fjernlasting av legemidler og rensing av SEC-kolonnen forblir imidlertid som batchprosesser og er flaskehalsene i den generelle formuleringsprosessen. Fremtidig utvikling kan fokusere på å utnytte mikrofluidiske tilnærminger (som tangential flytfiltrering) for å forbedre gjennomstrømningen av disse nedstrømsprosessene og øke protokollens skalerbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Prostatakreft UK (CDF-12-002 Fellowship), og Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) (EP / M008657 / 1) for finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Lipoid | PC 16:0/16:0 (DPPC) | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2000) | Lipoid | PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE) |
|
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MSPC) | Avanti Polar Lipid | 855775P-500MG | Distributed by Sigma-Adrich; also known as Lyso 16:0 PC (Not to be confused with 14:0/18:0 PC, which is also termed MSPC) |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375-100G | |
| Adapters, Female Luer Lock to 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-624 | Requires 2 units. For the inlets |
| Adapters, Union Assembly, 1/4"-28UNF | IDEX Health & Science | P-630 | Requires 2 units. (One unit included 2 nuts and 2 ferrules) |
| Ammonium Sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | 31119-1KG-M | |
| Bijou vial | VWR | 216-0980 | 7 mL, clear, polystyrene vial |
| Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801008 | 10 kDa MWCO, Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Heraeus Megafuge 8R | With HIGHConic III Fixed Angle Rotor |
| Cuvette | Fisher Scientific | 11602609 | Disposable polystyrene cuvette, low volume, for DLS measurement |
| Dialysis Kit - Pur-A-Lyzer Maxi | Sigma-Aldrich | PURX12015-1KT | 12-14 kDa MWCO |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34943-1L-M | |
| DLS Instrument | Malvern Panalytical | Zetasizer Nano ZS90 | |
| Doxorubicin Hydrochloride (DOX) | Apollo Scientific | BID0120 | |
| DSC Instrument | TA Instruments | TA Q200 DSC | |
| DSC Tzero Hermetic Lids | TA Instruments | 901684.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Pans | TA Instruments | 901683.901 | For DSC measurement |
| DSC Tzero Sample Press Kit | TA Instruments | 901600.901 | For DSC measurement |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | Absolute, ≥99.8% |
| FC-808 Fibre Coupled Laser System | CNI Optoelectronics Tech | FC-808-8W-181315 | FOC-01-B Fiber Collimator included. |
| Ferrule, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-200 | For the outlet |
| Fibre Optic Temperature Probe | Osensa | PRB-G40 | |
| Glass Staggered Herringbone Micromixer (SHM) | Darwin Microfluidics | Herringbone Mixer - Glass Chip | |
| Heating Tape | Omega | DHT052020LD | Can be replaced by other syringe heater such as "HTC" or "SRT series" for slower heating. Manual wiring to a 3-pin plug required for 240V models |
| Indocyanine Green | Adooq | A10473-100 | Distributed by Bioquote Limited (U.K.) |
| Luer-lock Syringe, 5 mL | VWR | 613-2043 | Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3-piece syringes, O.D. 12.45 mm |
| Microplate Reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | Installed with 485 nm (exictation) and 590 nm (emission) filters |
| Microplate, 96-well, Black, Flat-bottom | ThermoFisher Scientific | 611F96BK | For fluorescence measurement in microplate reader |
| Microplate, 96-well, Clear, Flat-bottom | Grenier | 655101 | For absorbance measurement microplate reader |
| Nut, 1/4"-28UNF to 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-245 | For the outlet |
| PC to Pump Network Cable for Aladdin, 7ft | World Precision Instruments | NE-PC7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump control software - SyringePumpPro Software License for 2 | World Precision Instruments | SYRINGE-PUMP-PRO-02 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Pump to Pump Network Cable for Aladdin, 7 ft | World Precision Instruments | NE-NET7 | Optional: Syringe pumps can be operated manually |
| Size exclusion chromatography (SEC) column | GE Life Science | 17085101 | Sephadex G-25 resin in PD-10 Desalting Columns |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-M | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Syringe Pumps & Cable (DUAL-PUMP-NE-1000) | World Precision Instruments | ALADDIN2-220/AL1000-220 | |
| Thermostat Temperature Controller | Inkbird | ITC-308 | Can be replaced by other syringe heater kit/thermostat |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Tubing, ETFE (1/16" OD) | IDEX Health & Science | 1516 | |
| USB To RS-232 Converter | World Precision Instruments | CBL-USB-232 | Optional: For computer without RS-232 port |
| Water Bath | Grant Instruments Ltd. | JB Nova 12 |
References
- Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin. Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).
- Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).
- Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
- Chen, D., et al. Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).
- Forbes, N., et al. Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring. International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).
- Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).
- Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content. International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).
- Suh, Y. K., Kang, S. A. Review on Mixing in Microfluidics. Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).
- Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).
- Stroock, A. D. Chaotic Mixer for Microchannels. Science. 295 (5555), 647-651 (2002).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Patra, M., et al. Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers. Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).
- Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine. Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).
- Lu, J., Hao, Y., Chen, J. Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary. Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).
- Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes. Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).
- Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).
- Sadeghi, N., et al. Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).
- Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).
- Komatsu, H., Okada, S. Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes. BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation. Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).
- Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions. Pharmaceutical Research. , (2005).
- Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes. Pharmaceutics. 8 (3), 29 (2016).
- Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device. Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).
