Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60909
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

Summary

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Abstract

Kardiyak fibrozis yaralanmaya yanıt olarak yara iyileşmesi için fizyolojik bir yanıttır. Fibrozisi azaltan fibroblast alt tiplerinin incelenmesi ve hedef altına inme çalışmaları yapılmıştır. Ancak, fibroblast araştırma quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar tanımlamak için evrensel olarak kabul edilebilir fibroblast belirteçleri eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Fibroblastlar heterojen hücre popülasyonuolup, onları izole etmek ve karakterize etmek zordur. Sunulan protokol, yaralanmamış ve yaralanan fare kalplerinden fibroblastve miyofibroblastları zenginleştirmek için üç farklı yöntem tanımlanmaktadır. Fibroblastları izole etmek için standart ve güvenilir bir protokol kullanmak, homeostazdaki rollerinin ve fibrozis modülasyonunun incelenmesini sağlayacaktır.

Introduction

Kardiyak fibroblastlar, mezenkimal kökenli hücreler, homeostaz sırasında kardiyak mimarinin bakımına ek olarak kalpte elektrikiletimi ve mekanik kuvvetlerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır1. Yaralanmadan sonra, bu hücreler aktive edilir, genişletilir ve ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleriüretir2. Birçok preklinik çalışmalar da yaralı bir kalp yapısal bütünlüğünü korumak kritik hücresel düzenleyiciler olarak fibroblastlar ortaya koymuştur3 yanı sıra kontrolsüz üretim ve ECM proteinlerin birikimisorumlu ana efektör hücreleri, sert yara oluşumu ve kalp yetmezliği ile sonuçlanan4. Fibroblastlar heterojen bir hücre grubudur, bu da reparatif fonksiyonlarını pro-fibrotik maladaptif özelliklerden ayırmakiçin zorlayıcı dır. Son zamanlarda, miyokardiyal yaralanma sonrası iki farklı fibroblast alt tipinin fonksiyonel heterojenliği tanımlanmış, farklı fibroblast alt tiplerini izole etme ve yara iyileşmesindeki rollerini inceleme olasılığıgösterilmiştir 5.

Saf fibroblast popülasyonu elde etmek, onarım ve fibrozisteki fonksiyonel rollerini ortaya§ almakta çok önemlidir. Ancak, diğer hücre tiplerini tanıyan birden fazla fibroblast belirteçlerinin varlığı önemli ölçüde saf fibroblastpopülasyonu 6izole etmek için zor olun. Çeşitli zarif çalışmalar yaralanmamış ve yaralanmalı miyokardyum kardiyak fibroblastlar izole etmek için akıllı yollar icat var. Fibroblastları zenginleştirmenin en popüler ve köklü yöntemi enzimatik doku sindirimini7takiben seçici yapışma yoluyla 7.

Ayrıca, hücre yüzeyi antijenlerine dayalı fibroblastların floresan aktive hücre sıralama (FACS) başarıyla tarif edilmiştir8. Çalışmada enzimatik sindirimitaki mezenkimal hücreler fare kalplerinden soy-negatif (Lin: Ter119−CD45−CD31− )ve gp38-pozitif (gp38+) olarak sıralandı. Gp38+ve hücrelerinin col1α1 ve diğer mezenkimal belirteçlerin ortak ekspresyonuna göre fibroblast olduğu doğrulandı. En doku sindirim petri çanak ventrikül dışarı diseksiyon sonra tamamlanmış olsa da, yeni bir çalışma da miyositler ve fibroblastlar içeren non-miyositizole etmek için sol ventrikül doğrudan iğne enzim perfüzyonu kullanımını araştırdı9. Fibroblastlar daha sonra bu durumda selektif yapışma ile izole edildi.

Bu protokol, fibroblastların izolasyonu ve zenginleşmesini üç yöntemle açıklar. İlki enzimatik sindirimi takiben fibroblastların seçici yapışmasını içeren zaten kurulmuş bir yöntemdir. İkinci yöntem öncelikle miyofibroblastları ifade eden yaralanmaya bağlı alfa düz kas izole etmek için kullanılır. Üçüncü yöntem hematopoetik ve endotel hücrelerinin enzim sindirilmiş kardiyak hücre süspansiyonunun sıralı, manyetik olarak tükenmesini içerir. Tükenmeden sonra fibroblastlar/miyofibroblastlar manyetik boncuklar kullanılarak mefsk4 antijeninin varlığına göre izole edilir. Son zamanlarda, MEFSK4 quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar üzerinde bir antijen mevcut olarak tarif edilmiştir, fibroblast tanımlama ve izolasyon için uygun bir belirteç yapma. Doğal olarak, burada açıklanan tüm yöntemlerin benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, akış analizi, immünboyama ve yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR ile izole hücre popülasyonunun saflığını kontrol etmek şiddetle tavsiye edilir. Ancak, bu metodolojiler üzerine genişletilebilir ve önemli deneyler için fibroblast ve miyofibroblast popülasyonları kullanmadan önce diğer kirletici popülasyonları dışlamak için ek belirteçler eklenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerileri kesinlikle onaylar. Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi protokolü onayladı (protokol numarası: M1600076-01).

1. Kalp Diseksiyonu

  1. Çözüm hazırlama
    1. KHB arabelleği
      1. Bir karıştırma çubuğu kullanarak, 900 mL DDI suda 900 mL'lik Krebs-Henseleit tampon (KHB) tozunu yavaşça çözün.
        NOT: Tampon çok hızlı veya çok uzun süre karıştırılırsa çökelecektir. Fibroblast izolasyonu sırasında KHB tamponu soğuk olmalıdır.
      2. 2,9 mM CaCl2 ve 24 mM NaHCO3ekleyin. pH'ı 7.2-7.3'e ayarlayın ve dH2O ile 1 L'lik bir hacme seyreltin.
      3. Steril filtre (0,22 μm) kullanarak 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın. İzolasyon süresi boyunca buzda veya 4 °C'de tutun.
    2. Kollajenaz sindirim kokteyli
      1. Fibroblast izolasyon u yuzden sindirim kokteyli hazırlayın. Kalp sayısına göre sindirim kokteylinin uygun hacmini belirleyin; 1 kalp başına 5 mL kokteyl.
      2. Üreticinin talimatlarına göre kollajenaz karışımı (Malzeme Tablosuna bakın) ve DNase I hazırlayın.
      3. Toplam sindirim kokteylinin 20 mL'si için 17,5 μL DNase I, 180 μL 1 M HEPES ve 500 μL kollajenaz ekleyin.
      4. 20 mL toplam hacim elde etmek için Ca2+ ve Mg2+ ile Hank'in Dengeli Tuz çözeltisi (HBSS) için yeterli hacim ekleyin.
    3. Kırmızı kan hücresi (RBC) lysis tampon
      1. Kalp sayısına (5 mL/kalp) göre gereken toplam hacmi belirleyin. DH2O kullanarak 10x RBC lysis stok tampon1x seyreltin.
    4. Fibroblast ortam: DMEM F-12'de %10 FBS
      1. L-glutamin ve HEPES ile DMEM-F12'ye %10 FBS ekleyin. 10 U/mL penisilin/streptomisin, 2,5 g/mL anti-mantar ve 2,5 g/mL mikoplazma profilaktik ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). 4 °C'de saklayın.
  2. Kalp diseksiyonu
    1. Diseksiyon sırasında kalpleri depolamak için her kuyuda 2 mL soğuk KHB ile buz üzerinde 6 kuyuluk bir plaka hazırlayın. Otoklavlı cerrahi makas ve forceps yararlanın.
    2. 12 haftalık veya daha büyük dozlarda izofluran aşırı dozda fareleri ötenazi ve servikal çıkış ile takip edin.
    3. Alternatif olarak, aktive fibroblast izolasyonu için, koroner arter ligasyonu10ile 12 haftalık farelerde miyokard infarktüsü indüklemek. Fareleri yaralanmadan 8-10 gün sonra ötenazi.
    4. % 70 etanol ve orient ile sprey vücut böylece ventral tarafı deneyci karşı karşıya. Paraziti önlemek için uzantıları sabitleyin veya dizginleyin.
    5. Karın deri ve kas açık kesin ama karaciğer piercing kaçının. Göğüs kafesini dikey olarak kesin ve kalbin delinmesini önlerken göğüs kafesini dikkatlice açın. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesmeye devam et.
    6. Forseps kullanarak, yavaşça göğüs kalbini kaldırın, herhangi bir akciğer veya kalp dışında bağlı aşırı doku keserek. Ventrikül çıkarın ve soğuk KHB ile 6 iyi plaka bir kuyuya yerleştirin. Tüm örnekler izole edilene kadar kalpleri bu şekilde kesmeye devam edin.
  3. Kalbin enzimatik dissosiyasyonu
    1. Forceps kullanarak, art arda sıkmak ve fazla kan kaldırmak için KHB kalp ajite. Kalbi temiz bir steril 10 cm2 tabağa aktarın. Tek bir kenar bıçak kullanarak, hızlı bir şekilde küçük parçalar halinde kalp kıyma.
    2. Kollajenaz sindirim kokteyli 1 mL ekleyin ve parçalar 1 mL mikropipet ile aktarmak için yeterince küçük olana kadar kıyma devam edin. Parçaları 1 mL mikropipetli 50 mL konik boruya aktarın. 2 mL kollajenaz sindirim kokteyli ile yıkama plakası 2x.
      NOT: Pipet ucunun bir kısmının kesilmesi, pipet ucuna yapışabilecek daha büyük kalp parçalarının toplanmasına yardımcı olabilir.
    3. 37 °C'de 30 dk sallayarak veya ajitasyon ile kuluçka konik tüp. Gerektiği gibi güvenli tüp. İçeriği homojen olana kadar 5 mL pipetle 10x'i yeniden askıya alın ve konik tüpü 37 °C'de 15 dakika boyunca döndürme veya ajitasyon ile kuluçkaya yatırın.
    4. Homojen olana kadar 10 mL pipet ile 10x'i yeniden askıya alın. Filtreyi 1-2 mL KHB tamponu ile ıslatarak 40 μm'lik bir hücre süzgecini yeni bir 50 mL konik tüpün üzerine uygulayın. Sindirim süspansiyonu için 25 mL KHB tampon ekleyin, yeniden askıya alın ve astarlanmış 40 μm hücresüzden süzün. Gerektiğinde filtreyi değiştirin.
      NOT: Filtrasyon yavaşladıkça, tüpü hafifçe dokunarak veya filtrenin alt tarafından süspansiyon çekmek için 1 mL mikropipet kullanmak hücre süspansiyonunun kısmen tıkanmış 40 μm hücreli bir süzgeçten geçmesine yardımcı olabilir.
    5. 10 dk. 400 x g ve 4 °C'de santrifüj. Oda sıcaklığında 2 dakika (RT) kuluçka.
    6. 10 dk. 400 x g ve RT'de santrifüj 10 dk. Supernatant'ı çıkarın ve 1 mL KHB tamponunda peleti yeniden sulayarak yıkayın.
    7. Yeni 50 mL konik tüp içine astarlı 40 μm hücresüz ile KHB tampon 9 mL ekleyin ve filtre. Santrifüj 400 x g ve RT 10 dakika.
    8. Supernatant çıkarın, fibroblast media veya PBS 1 mL resuspend, ve hücre numarasını belirlemek. Fibroblastlar aşağıda açıklanan üç farklı yöntemle izole edilebilir.

2. Fibroblastların Tek Hücreli Süspansiyondan İzolasyon

  1. Fibroblast izolasyonu: diferansiyel kaplama (Şekil 1)
    1. Kuyu başına 2 mL fibroblast media ekleyerek ve iyi alt kapsayacak şekilde plaka girdap 6-iyi bir plaka hazırlayın.
    2. Kalp başına 1 mL'lik ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın. Plaka 1 mL hücre süspansiyon u olabilir ki bir kalp (teorik olarak) iyi başına kaplanmış ediliyor. Örneğin, 6 mL'lik ortamda altı kalp yeniden askıya alınır, ardından kuyu başına 1 mL hücre süspansiyonu ile altı kuyuya kaplanır.
    3. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için girdap plakası. Kuyu başına 5 mL'ye kadar toplam hacim için kuyu başına 1-2 mL ek bir ortam ekleyin ve 37 °C'de 4 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    4. Fibroblastlar 4 saat sonra seçici yapışma ile ayrılacak. Ekli hücreleri 2 mL PBS ile yıkayın ve kuyu başına 2-4 mL steril fibroblast media ekleyin. 37 °C'de inküler. Her 2-4 günde bir ortam değiştirin.
  2. Fibroblast İzolasyon: GFP muhabiri fare modeli kullanılarak FACS (Şekil 1)
    1. FACS arabelleği
      1. Ca2+ ve Mg2+olmadan dPBS'de %5 fetal sığır serumunun (FBS) 15 mL'sini hazırlayın. Buzda veya 4°C'de saklayın.
    2. FC bloker çözümü
      1. 0,5 μL FC bloker (saflaştırılmış anti-fare CD16/CD32) 25 μL FACS (1:50 seyreltme) hazırlayın. Numune başına 25 μL FC bloker çözeltisi gereklidir. Buzda veya 4 °C'de saklayabilirsiniz.
    3. Numune hazırlama ve antikor boyama
      NOT: Antikor seyreltmeleri önceden hazırlanabilir, ancak bu ışık veya ısıya maruz kalma riski olabilir.
      1. 7AAD veya Ghost boya mor 510 2x FACS tampon gerekli seyreltme hazırlayın. Antikorlar ve seyreltmeler için Tablo 1'e bakınız.
      2. FC antikor bölgesinin FC reseptörüne spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için 25 μL FC bloker çözeltisinde 500.000 yeni izole edilmiş hücreyi yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka.
      3. Hücre süspansiyonunun 25°L'lik son hacmine 7AAD veya Ghost boya sımen 510 antikor ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 30-60 dakika kuluçka.
      4. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. 4°C'de 5 dk için 500 x g santrifüj.
      5. FACS tamponunun (300 μL) önerilen akış sitometrisi örnek hacminde peleti resuspend ve akış sitometri tüpüne aktarın.
    4. Floresan aktive hücre sıralama (FACS)
      NOT: GFP-αSMA muhabiri fareler Dr Ivo Kalajzic bir katkı vardı11. Bu fare alfa düz kas hücresi altında GFP ifade (αSMA) organizatörü. αSMA aktif fibroblastların (miyofibroblastlar) bir belirteci olarak kullanılmıştır12.
      1. Aktive fibroblast (αSMA ifade miyofibroblast) izolasyonu için, koroner arter ligasyonu ile 12 haftalık GFP-αSMA farelerde miyokard infarktüsünü indükler. Fareleri yaralanmadan 8-10 gün sonra kurban edin.
      2. Yaralı farelerin kalplerinden tek hücreli süspansiyon sonrasında, yeşil floresan protein (GFP) için αSMA+ve fibroblastları sıralayın. GFP kanalında arka plan sinyalini telafi sonrası ayarlamak için lekesiz yaralanmamış fibroblastlar kullanın.
      3. 7AAD-ve/GFP+ve hücreleri veya Ghost boya mor 510-ve/GFP+ve hücreleri ve αSMA+ve miyofibroblastları ifade eden GFP'yi sıralayarak canlı GFP+ve hücreleri için kapı. Fibroblast ortamda hücreleri toplamak.
  3. Fibroblast izolasyonu: fibroblastların manyetik boncuk bazlı izolasyonu (Şekil 1)
    1. Denklik tamponu
      NOT: Yalıtımlar için her zaman taze arabellek hazırlayın.
      1. PBS'de %0.5 BSA ve 2 mM EDTA hazırlayın. Kabın kapağına bir vakum takarak çözeltiyi karıştırarak tamponu degas edin.
        NOT: Karıştırma, vakumdan çıkarılan çözeltiden fazla gazı kaldırır, bu nedenle kabarcıklar kullanımda ayırma sütununu tıkamaz.
    2. Manyetik etiketleme: CD45+ hematopoetik hücreler
      1. 5 dk için 500 x g fare kalplerinden izole hücreleri santrifüj, sonra supernatant kaldırın.
      2. Hücre peletini 1 mL'lik denge tamponunda yeniden askıya alın. Hemositometre kullanarak hücreleri say.
      3. Hücre süspansiyonuna yukarıdaki gibi santrifüj edin ve hücre peletini 1 x 107 toplam hücre başına 90 μL denge tamponu halinde yeniden askıya alın. 1 x 107 toplam hücre başına 10 μL CD45+ manyetik boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4°C'de en az 15 dakika kuluçkaya yatırın.
      4. Hücreleri 1 x 107 toplam hücre başına 2 mL denge tamponu ekleyerek yıkayın, ardından 4°C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin.
      5. Supernatant çıkarın, bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak ve 2 mL denge tampon 1 x 107 toplam hücreleri yeniden askıya. 10'dan fazla7 hücre varsa, arabelleği doğrusal olarak ölçeklendirin. Hücre kümelerinin ayırma sütun matrisini tıkamasını önlemek için hücreleri 40 μm'lik bir filtreden geçirin.
    3. Manyetik ayırma: CD45+ hematopoetik hücreler
      1. Ayırma sütununu uygun bir ayırıcının manyetik alanına yerleştirin ve en az 3 mL PBS ile denge sütunu yerleştirin.
      2. Akışta (FT) etiketlenmemiş hücreleri toplayın ve 3 mL'lik denge arabelleğiyle sütun 3x yıkayın. FT ile yıkar toplamak. Sütunu 15 mL konik bir tüpüzerine yerleştirin.
      3. 5 mL'lik denge tamponu sütunun üzerine boru landırarak ve hücreleri kolonla birlikte verilen bir pistonla sıkıca dalan manyetik etiketli CD45+ hücreleri dışarı atın.
      4. Santrifüj eluent yanı sıra FT / yıkama fraksiyonları 500 x g. Hemositometre kullanarak hücreleri say.
    4. Manyetik etiketleme ve ayırma: CD31+ endotel hücreleri
      1. CD45+ manyetik etiketleme ve ayırma (bölüm 2.3.2-2.3.3) için tekrar protokol, CD31+ manyetik boncuklar CD45+ izolasyon dan FT ve yıkama bölümleri ile kuluçka için kullanmak dışında.
    5. Manyetik etiketleme ve ayırma: MEFSK4+ fibroblastlar
      1. MANYETIK boncuklar yerine MEFSK4 anti-besleyici-APC antikor kullanarak CD45+ manyetik etiketleme için protokolü tekrarlayın. 5 dk için 500 × g CD31+ izolasyon FT ve Yıkama kısımları santrifüj, sonra supernatant kaldırın. Hücre peletini 1 mL'lik denge tamponunda yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
      2. 1 x 107 hücre başına 10 μL MEFSK4 anti-besleyici-APC antikor ekleyin. 4 °C'de en az 15 dakika kuluçka.
      3. MEFSK4 antikor bağlı hücreleri 1 x 107 toplam hücre başına 5 mL denge tamponu ekleyerek yıkayın, ardından 5 000 x g'de 5 dk santrifüj edin.
      4. Kullanılan MEFSK4 anti-besleyici-APC antikor aynı hacmi kullanarak, anti-APC boncuklar supernatant çıkarın ve resuspend. 4 °C'de 15 dakika buz üzerinde kuluçka.
      5. 10 dk. 500 x g'da santrifüj, 1 x 107 toplam hücre başına 2 mL denge tamponu ile resuspend ve daha önce açıklandığı gibi manyetik ayırma ile devam edin (bölüm 2.3.3). Manyetik olarak ayrılmış MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve fibroblastlar saflık analizleri ve diğer downstream uygulamaları için kullanılabilir.

3. İzole Fibroblast Popülasyonunun Saflık ve İşlevsellik Analizi

  1. FACS popülasyon saflık analizi: αSMA-GFP hücre analizi (Şekil 2)
    1. Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için 25 μL Fc bloker çözeltisinde yeni izole edilmiş hücreleri yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka.
    2. İsteğe bağlı: hücre süspansiyonuna 25 μL 7AAD veya Ghost boya mor 510 ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 30-60 dakika kuluçka.
    3. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. 5 dk için 500 x g santrifüj.
    4. 50 μL FACS tamponunda peleti yeniden askıya alın. CD31-PE, CD45-APC ve AN2/NG2 antikorlarını doğrudan hücre süspansiyonuna ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika kuluçka (Tablo 1).
    5. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
    6. Eşeği anti-rat AlexaFluor 405 ikincil antikor unconjugated primer antikor ile etiketlenmiş hücrelere ekleyin. Buz üzerinde 30 dakika kuluçka.
    7. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
    8. FACS tamponunun (300 μL) önerilen akış sitometrisi numune hacminde peleti resuspend ve akış analizi için etiketli akış sitometri tüpüne aktarın.
      NOT: Mefsk4 antijeninin izole fibroblastlar üzerindeki ekspresyonunu karakterize eden FACS analizi bölüm 3.3'te tanımlanmıştır.
  2. Fibroblast saflık analizi: immünoresans (Şekil 3A)
    1. Tohum 30.000 primer fibroblastlar (P0-P1) kapaklar üzerinde iyi başına 24 iyi plaka ve kültür% 80 konfluent yerleştirilir. Veya 400 x × g (bir 24 iyi plaka bir coverslip üzerine hücreleri doğrudan ve eşit olarak yatırmak için kullanılan bir yöntem) 400 x × g (bir coverslip tarafından coverslip üzerinde sıralanmış CD45+ ve CD31+ hücreleri (kuyu başına 30.000 hücre) konsantre.
    2. Hücreleri 15 dk soğuk aseton ile düzeltin.
    3. %10 keçi serumundaki slaytları bloke edin. Bir gecede primer antikorlar içeren kuluçka slaytları(Tablo 2).
    4. Slaytları PBS'de 3 x yıkayın. 2 saat boyunca inkübat sekonder antikorlar (Tablo 2).
    5. Counterstain slaytlar ve yavaş soluk montaj ortamda DAPI bir damla ile monte.
  3. FACS nüfus saflık analizi: MEFSK4 probing (Şekil 3B)
    1. Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için FC bloker çözeltisinin 25 μL'lik yeni izole hücrelerini yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka.
    2. İsteğe bağlı: hücre süspansiyonuna 25 μL 7AAD veya Ghost boya mor 510 ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 30-60 dakika kuluçka.
    3. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. 5 dk için 500 x g santrifüj.
    4. 50 μL FACS tamponunda peleti yeniden askıya alın. DOĞRUDAN hücre süspansiyonuna MEFSK4 antikorekleyin. Buz üzerinde 15 dakika kuluçka (Tablo 1).
    5. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
    6. Hücrelere fare IgG-APC ekleyin (Tablo 1). Buz üzerinde 30 dakika kuluçka.
    7. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
    8. FACS tamponunun önerilen akış sitometrisi numune hacminde (300 μL) pelleti resuspend ve akış analizi için akış sitometri tüpüne aktarın.
  4. Fibroblast saflık analizi: yarı kantitatif gerçek zamanlı rtPCR (Şekil 3C)
    1. RNA izolasyonu ve yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR
    2. Fibroblastların zenginleştiriminin ardından RNA izolasyon kiti kullanarak RNA'yı izole edin (bkz. Malzeme Tablosu). Üreticinin talimatlarına uyun.
    3. Üreticinin talimatlarına uyarak cDNA sentez kiti (Bkz. Malzemeler Tablosu)kullanarak ilk iplikçik DNA sentezini tamamlayın.
    4. Yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR5gerçekleştirin.
  5. Fibroblast işlevsellik analizi: kollajen jel kontraktilite tahlil (Şekil 4)
    1. Kollajen çözeltisi
      1. DMEM'de 20 mM HEPES ve 44 mM NaHCO3 hazırlayın. HEPES ve NaHCO3ile DMEM 1 mL başına tip 1 sıçan kollajen 1.67 mg ekleyin.
    2. TGFβ destekli DMEM
      1. DMEM antibiyotik ve anti-mantar ile birlikte% 10 FBS hazırlayın. TGFβ'yı 1 ng/mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
    3. Hücre/kollajen karışımı ve kaplama
      1. Hücre süspansiyonu (P3-P5) hazırlayın ve 3.3 x 105 hücre elde etmek için gerekli hacmi belirleyin.
      2. 1 mL toplam hacim elde etmek için yeterli kollajen çözeltisi için 3,3 x 105 hücreleri ile süspansiyon hacmi ekleyin.
        NOT: Sıçan kollajen tip 1 konsantrasyonu şimdi 1.5 mg/mL olmalıdır.
      3. Bir 48 iyi plaka, tohum 300 ° L hücre-kollajen karışımı başına iyi (~ 1 x 105 hücre / iyi). 37 °C'de 15-20 dk jöleye kadar kuluçkaya yatırın.
      4. Kuyu duvarlarından jel ayırmak için 30 G iğne kullanın. Her kuyuya 600 μL TGFβ ve FBS destekli DMEM ekleyin. 24 saat ve 48 saat aynaklı bir tarayıcıda görüntü plakaları.
        NOT: Tüm İmmünofloresans deneyleri üç lazer (405 nm, 488 nm ve 640 nm) ile donatılmış bir akış sitometri makinesi nde yapıldı. Veriler, akış verisi edinme yazılımı(Tablo Of Materials)kullanılarak elde edilmiştir. Daha fazla veri analizi akış veri analizi yazılımı kullanılarak yapılmıştır. AlexaFluor 405 ve Ghost Dye Violet 510 405 nm lazer ile heyecanlı ve 450/50 BP ve 525/50 BP filtre kullanılarak toplanan, sırasıyla. GFP ve PE 488 nm lazer tarafından heyecanlı ve 530/30 BP ve 575/26 BP filtreleri kullanılarak toplanan, sırasıyla. Ya APC veya AlexaFluor 647 640 nm lazer tarafından heyecanlı ve 670/14 BP filtre kullanılarak toplanan. Tüm hücre sıralama deneyleri dört lazer (405 nm, 488 nm, 561 nm ve 640 nm) ile donatılmış bir akış sitometri makinesi(Malzeme Tablosu)üzerinde yapılmıştır. 7-AAD 561 nm lazer kullanarak heyecanlı ve 670/14 BP filtre ile toplanan. GFP ve Ghost Boya Violet 510 yukarıda açıklandığı gibi aynı lazer / filtre kombinasyonları kullanılarak toplanmıştır. Tüm sıralama deneyleri hedef hücrelerin daha düşük canlılığı için 17 psi basınç yapılandırması ile 100 um meme kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ΑSMA-GFP muhabiri fareler kullanılarak miyofibroblast izolasyonu gösteren akış şeması
Yaralanmamış kalpler αSMA-GFP muhabiri fare modelinde tespit edilebilir GFP+ hücreleri göstermedi; bu nedenle, gfp kanalının arka plan sinyali için bir geçit kurmak için kullanılmıştır sonra-tazminat (Şekil 2). αSMA+ hücreleri MI'den 10 gün sonra yaralı sol ventrikülden GFP ekspresyonunun varlığına göre sıralandı. Endotel (GFP+/CD31+ hücrelerinin küçük bir yüzdesi; SD = %3.8 ± 0.0164; n = 5) ve hematopoetik (GFP+/CD45+ hücreleri; SD = %3.18 ± 0.0112; n = 5) hücreleri de yaralı αSMA-GFP fare kalplerinde GFP ifade(Şekil 2A). Ancak, GFP+/CD31-/CD45- hücreleri bir perisit belirteci olan AN2'yi ifade etmediler.

Yaralanmamış (quiescent) ve yaralı (aktive, αSMA+GFP+) hücreleri fibroblast belirteçlerini ifade
ΑSMA-GFP farelerinden izole edilen GFP+ hücreleri IF analizi ile analiz edildiğinde αSMA, kollajen tip 1 alfa-1 zinciri (COL1α1), vimentin ve periostin ifade edilir. Selektif yapvın izole ettiği yaralanmamış fibroblastlar vimentini ifade eder, ancak aktive fibroblast belirteçlerinin ekspresyonu gösterilmemiştir: αSMA, periostin ve COL1α1 (Şekil 3A). Hem yaralanmamış hem de aktif fibroblastlar akış analizi ile analiz edildiğinde MEFSK4 antijenini ifade ettiler (Şekil 3B). Yaralanmamış fare kalplerinden manyetik olarak izole edilmiş MEFSK4+ve hücreleri fibroblastların işaretlerini ifade eder: Col1a1, pdgfrα ve periostin. Buna karşılık, manyetik izole CD45 ve CD31 pozitif hücreler fibroblast belirteçleri ihmal edilebilir ekspresyonu vardı.

Fibroblastlar ve miyofibroblastlar kollajen sözleşme yeteneğini gösterdi
Sert plastik hücre kültüründe, fibroblastlar TGFβ varlığında kollajen jeller sözleşme gösterilmiştir, daralma onların fonksiyonel yeteneğini gösteren13,14. Fibroblastların bu in vitro karakteristiği, doku onarımı sırasında meydana gelen bağ dokusu kontraksiyonuna ve diğer biyolojik işlemlere çok benzer. Selektif adezyon ile izole edilen yaralanmamış fibroblastlar ve αSMA-GFP farelerinden izole edilen ve sıralanan miyofibroblastlar kollajen leziz olma yeteneğini göstermiştir(Şekil 4).

Figure 1
Şekil 1: Fibroblast izolasyon şeması üç farklı yaklaşım kullanılarak. (A) diferansiyel kaplama, (B) GFP+ αSMA pozitif hücrelerin hücre sıralaması ve (C) fibroblastların manyetik boncuk bazlı izolasyonu. Diferansiyel kaplamayı takiben kültürdeki hücrelerin temsili parlak alanı. Ölçek çubuğu = 50 μM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: MI'den sonra αSMA-GFP fare kalplerinden izole edilen tek hücrelerin FACS analizi. (A) ΑSMA-GFP farelerinden CD31, CD45 veya AN2'yi birlikte ifade eden GFP+ hücrelerini gösteren temsilci FACS gating şeması miyokard enfarktüsünden (MI) 10 gün sonra kalpleri yaralamaktadır. (B) MI sonrası kalpler için sunulan FACS verilerinin grafiksel niceliği; n = 5 deney bağımsız olarak gerçekleştirildi (***p < 0.0001 Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak hesaplandı). Bu rakam Saraswati ve ark.10'danuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Yaralanmamış ve yaralanan fare kalplerinden izole edilen fibroblastların saflık analizleri. (A) Yaralanmamış veya FACS tarafından sıralanmış αSMA-GFP farelerin kalbinden hücre popülasyonlarının (P0) immünororeskence boyanması. Yaralanmamış ve aktive edilmiş hücreler COL1α1 ve vimentin gibi fibroblast (FB) belirteçlerini ifade eder, ancak hematopoetik marker CD45 veya endotel belirteci CD31'i ifade etmez. Yaralı αSMA-GFP fare kalplerinden izole edilen hücreler, yaralanmamış fare kalplerinden izole edilen hücrelerde bulunmayan aktif fibroblast belirteçleri αSMA ve periostini ifade etti. Çekirdekler DAPI ile boyandı, n = 3 deneyleri bağımsız olarak yapıldı. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Temsilci FACS, fibroblast belirteci MEF-SK4'ün ekspresyonunu gösteren yaralanmamış ve aktif leştirilmiş fibroblastların (P3-P5) histogramını yerle bir eder. Negatif kontrol için sıçan IgG kullanıldı, n = 2 deneyleri bağımsız olarak yapıldı. (C) Yaralanmamış MEKSK4+ve fibroblastlarında Col1α1, Pdgfrαve Postn transkriptlerinin göreceli kıvrım değişimi, n = 3 deneyleri bağımsız olarak yapılmıştır (*p < Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanan 0.05). (A) ve (B) Saraswati ve ark.10'danuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Yaralanmamış ve yaralanmış fare kalplerinden izole edilen fibroblastların fonksiyonel karakterizasyonu. Yaralanmamış ve yaralanmalı αSMA+ fibroblastlar (P3-P5) varlığında kollajen jel kontraksiyonunun temsili figürü. Grafik, yaralanmamış ve yaralanmalı αSMA+ fibroblastlar ile inkübe edildiğinde 24 saat ve 48 h daralma sonrası ilk jel alanındaki yüzde değişimini temsil eder, n = 2 deneyleri bağımsız olarak yapılmıştır. Bu rakam Saraswati ve ark.10'danuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Antikor Hücre Hedefi Seyreltme
7AAD Ölü hücreler 1:1000
Hayalet boya menekşe 510 Ölü hücreler 1:1000
APC-CD45 Hematopoetik hücreler 1:200
PE-CD31 Endotel hücreleri 1:200
anti-AN2/NG2 Perisitler 1:11
Eşek anti-sıçan alexa flor 405 İkincil Antikor 1:100
Anti-besleyici hücreleri-APC (MEFSK4) Fibroblastlar 1:100
Sıçan IgG-APC Isotip Kontrolü 1:100

Tablo 1: FACS boyaları ve antikorları.

Primer Antikor Seyreltme
α-düz kas aktin (αSMA) 1:1000
Fibroblast özgü protein 1 (FSP1)01:250 1:100
COL 1α1 1:1000
Periostin 1:100
Vimentin 1:200
CD31 1:250
CD45 1:250
İkincil Antikor Seyreltme
Keçi anti-fare Alexa Fluor 488 1:200
Keçi anti-tavşan-FITC 1:200
Keçi anti-tavşan-Cy3 1:200
Keçi anti-sıçan Alexa Fluor 488 1:200
Keçi anti-sıçan Alexa Flor 647 1:200

Tablo 2: İmmünofluoresans primer ve sekonder antikorlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fibroblastlar, çeşitli belirteçler kümesi ile tanımlanan heterojen bir hücre grubudur. Fibroblastları tanımlamak için kullanılan protein belirteçleri diskoidin etki alanı reseptörü 2 (DDR2), fibronektin, vimentin, kollajen I ve III ve Thy115,16,17,18,19,20. Vimentin yaralanmamış quiescent kardiyak fibroblastlar tanımlamak için kullanılırken, fibroblast spesifik protein 1, αSMA, ve periostin yaralanmaya bağlı aktive fibroblastlar tanımlamak için gösterilmiştir, αSMA aktif fibroblastlar tespit etmek için en yaygın belirteç olmak6,12,21. Ayrıca, Tcf21 ve MEFSK4 proteinleri yaralanmamış kardiyak dokuda bulunan hem quiescent fibroblastlar hem de yaralı fare kalplerinde bulunan miyofibroblastlar da dahil olmak üzere aktif fibroblastlar tanıma da son tanıma kazanmıştır21,22.

Bu protokol, fibroblastları ve miyofibroblastlar dahil aktif fibroblastları izole etmek ve zenginleştirmek için üç farklı yaklaşım kullanmaktadır. Fibroblastın plastiğe tercihen yapışma yeteneği izolasyon için ilk yaklaşımda kullanılır. Liberaz ile enzimatik sindirim sonrasında, hücrelerin tek hücreli süspansiyon tercihen uymak için plastik bir çanak üzerinde tohumlu. Birçok non-fibroblast hücrelerinin Petri yemeklerinin polistiren yüzeyine yapışamaması, tüm ortamları yemekten çıkarmamıza ve göreceli olarak saf bir fibroblast popülasyonuna sahip olmamızı sağlar. Bu tekniği kullanarak bir uyarı fibroblastlar tercihen polistiren çanak yapışacak olsa da, bazı kontamine olmayan fibroblast hücreleri de ekleyebilir, hücrelerin homojen olmayan bir nüfus bırakarak.

İkinci izolasyon tekniği, miyofibroblastları ifade eden αSMA'yı diğer hücrelerden ayırmak için FACS kullanır. Burada kullanılan transgenik fare modelinde, GFP sadece αSMA ile birlikte ifade edilir, bu nedenle αSMA içeren miyofibroblastlar GFP'nin floresan yetenekleri aracılığıyla bir FACS makinesi tarafından tespit edilebilir. Bu izolasyon prosedürü bize yaklaşık% 99 miyofibroblast hücre popülasyonu elde etmek için olanak sağlar. Bu hücrelerin saflık analizleri Saraswati ve ark.10tarafından kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır.

Üçüncü izolasyon tekniği mefsk4 ifade hücrenin manyetik boncuk bazlı ayrılması ile hem yaralanmamış hem de aktif fibroblastları izole etmenin etkili bir yoludur. Tek bir hücre süspansiyonanti-CD45 ve anti-CD31 manyetik boncuk bağlamak ve manyetik alan etkileri nedeniyle bir matris immobilize olmak için izin vererek, bu kontamine olabilir herhangi bir hematopoetik yanı sıra endotel hücrelerinin ayrılmasına izin fibroblast izolasyonu. MEFSK4 son zamanlarda fibroblastları tanımlamak için güvenilir bir belirteç olarak kullanıldığından, MEFSK4 ifade hücreleri bağlanacak bir antikor uygulanabilir. Bir manyetik boncuk antikora bağlandıktan sonra, fibroblastların izolasyonuna izin veren bir kompleks oluşturarak, manyetik boncuk hücre kompleksi manyetik alandaki bir matristen geçirilir ve yüksek oranda zenginleştirilmiş fibroblast popülasyonu elde edilir. İzole fibroblast popülasyonunun saflığı immünboyama, RTPCR ve akış sitometri analizleri ile değerlendirilmelidir.

Diğer tekniklerde olduğu gibi, bu el yazmasında da açıklanan tekniklerde de sınırlamalar vardır. Selektif yapışma protokolü ve manyetik boncuk bazlı izolasyon sınırlaması, bu yöntemlerin quiescent ve aktive fibroblastlar arasında ayrım yapmamasıdır. Aktif fibroblastları zenginleştirmek için miyokard enfarktüsünden 8-10 gün sonra izolasyon yapılmalıdır. Ayrıca, diğer fibroblast belirteçleri ile izolasyon saflığını kontrol etmek önemlidir. MEFSK4-pozitif fibroblast saflığı sadece RTPCR tarafından gösterilmiştir, hematopoetik (CD45) dahil olmak üzere kontamine hücre tiplerini tanıyan diğer fibroblast belirteçleri ve belirteçleri ile (immünboyama ve akış sitometri analizi) test etmek için tavsiye edilir, endotel (CD31) ve perisitler (AN2). Mümkünse, diğer fibroblast özgü belirteçleri daha fazla sıralamak veya manyetik fibroblast popülasyonu izole etmek için kullanılabilir.

Miyofibroblastları izole etmek ve sıralamak için αSMA-GFP fareleri kullanmak, aktif fibroblast popülasyonu elde etmek için güvenilir bir tekniktir. Ancak akış analizinde hematopoetik ve endotel hücrelerinin ihmal edilebilir bir yüzdesi gözlenmiştir. Bu tekniği geliştirmek için CD45+ve/CD31+ve AN2+ve hücreleri GFP+ve/αSMA+ve hücre sıralamasından dışlanmalıdır. αSMA miyofibroblastların yaygın olarak kabul gören bir belirteci olduğundan, αSMA-GFP muhabir fare modeli miyokardiyal yaralanmalar bağlamında miyofibroblastları incelemek için kullanılmasını gerektiren değerli bir araçtır.

Dikkate alınması gereken birkaç önemli sorun giderme adımları vardır. Hücre canlılığı ve verim etkilenirse sindirim süresi azaltılabilir. Bir karıştırma çubuğu sindirim karışımı karıştırmak için kullanılmamalıdır, Bu hücre canlılığını etkiler gibi. Tüp bir rocker veya hafifçe sindirim karışımı ajite etmek için sallayarak kuvöz de güvenli olmalıdır. Sindirilmiş dokunun 5 mL veya 10 mL pipetle 10x resucanedilmesi hücrelerin düzgün dissociasyonu için çok önemlidir.

Eğer hücreler akış sitometrisi tarafından sıralanacak veya analiz edilecekse, tek hücreli süspansiyonun uygun kırmızı kan hücresi lisisi kullanılmalıdır. Manyetik boncuk izolasyonu için, tampon gaz giderme sütunherhangi bir hava kabarcıkları girişini önlemek için gereklidir. Manyetik boncuk hücre izolasyonu için kullanılan sütun farklı manyetik boncuk konjuge hücreler arasında yeniden kullanılmamalıdır. Örneğin, CD45+ hücrelerinin elution sonra atılması gereken CD45+ hücreleri ayırmak için yeni bir sütun kullanılmalıdır, sonra CD31+ hücre yalıtımı için başka bir yeni bir. Elimizde izole/sıralanmış fibroblastlarda perisit kontaminasyonu görülmedi. Ancak, MEFSK4 perisit22tanımak için gösterilmiştir. Bu nedenle, perisitleri (AN2) tek hücrelerden ayırmak/manyetik olarak tüketmek için ek bir adım kullanılması önerilir. Bu protokol 12 haftalık farelerde doğrulansa da, bu teknik daha genç veya yaşlı fareler için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr. Ivo Kalaycı'ya αSMA-GFP fareleri için teşekkür etmek istiyorlar. Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIH) tarafından R01GM118300 (S.S.), Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve BIYOmühendislik Enstitüsü (S.S.) altında desteklenmiştir. Ödül Numarası R21EB019509 (P.P.Y.) ve Amerikan Kalp Derneği Bilim Adamı Geliştirme Hibe si 17SDG33630187 (S.S.) altında. Vanderbilt Ingram Kanser Merkezi (P30 CA68485) ve Vanderbilt Sindirim Hastalığı Araştırma Merkezi (DK058404) tarafından desteklenen VUMC Flow Sitometri Ortak Kaynak'ta akış sitometrisi analizleri yapıldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) Sigma Aldrich A9528
Bovine Serium Albumin (BSA) Sigma 9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES Life technologies 11330057
Dnase I(20U/mL) BioRad 7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ Gibco 13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-023-CV
1M HEPES Corning 25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder Sigma K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) Invivogen ant-mpp
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer Miltenyi 130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) Molecular Probes A1310 dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC BD Bioscience 559864 dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE BD Bioscience 553373 dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31 BD Biosciences 553370 dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45 BD Biosciences 553076 dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1 MD Bioproducts 203002 dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) Tonbo Biosciences 13-0870 dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029 dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3 Southern Biotech 4050-02 dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC Jackson Immunoresearch Laboratories 711-165-152 dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647 Thermo-Fisher A21247 dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin Santa Cruz SC67233 dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin Sigma Aldrich V2258 dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA) Sigma Aldrich A2547 dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1) Millipore 07-2274 07-2274 dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-052-301
CD31 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) Miltenyi Biotec 130-102-900 dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads Miltenyi Biotec 130-090-855
Rat IgG-APC Miltenyi Biotec 130-103-034 dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405 Abcam ab175670 dilution = 1:100
anti-AN2/NG2 Miltenyi Biotec 130-097-455 dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter Thermo Scientific 723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish Corning 430167
10 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11E
40 µm Cell Strainer Fisherbrand 22363547
5 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11D
50 mL Conical Tube Falcon 352070
6-well Plate Corning 3506
Flow Cytometry Tubes Falcon 352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade PAL 62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit Qaigen 74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit Ambion AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit BioRad 1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

Tags

Biyoloji Sayı 157 izolasyon αSMA floresan aktif hücre sıralama fibroblastlar miyofibroblast kollajen jel immünofülans MEFSK4
Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., … More

Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., Saraswati, S. Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts. J. Vis. Exp. (157), e60909, doi:10.3791/60909 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter