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Biology

एडल्ट कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट और माओफीब्रोब्लास्ट का अलगाव और लक्षण वर्णन

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60909
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

Summary

फाइब्रोब्लास्ट की शुद्ध आबादी प्राप्त करना घाव की मरम्मत और फाइब्रोसिस में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित एक विस्तृत विधि है जो फाइब्रोब्लास्ट और मायोफिब्रोब्लास्ट को अघायल और घायल माउस दिलों से अलग करने के लिए है, जिसके बाद प्रतिकार, आरटीपीसीआर, फ्लोरेसेंस-असिस्टेड सेल छंटाई द्वारा उनकी शुद्धता और कार्यक्षमता का लक्षण वर्णन किया जाता है, और कोलेजन जेल संकुचन।

Abstract

चोट के जवाब में कार्डियक फाइब्रोसिस घाव भरने के लिए एक शारीरिक प्रतिक्रिया है। फाइब्रोसिस को कम करने वाले फाइब्रोब्लास्ट उपप्रकारों का अध्ययन करने और उन्हें लक्षित करने के प्रयास किए गए हैं । हालांकि, फाइब्रोब्लास्ट अनुसंधान शांत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट की पहचान करने के लिए सार्वभौमिक स्वीकार्य फाइब्रोब्लास्ट मार्कर की कमी के कारण रुकावट आई है । फाइब्रोब्लास्ट एक विषम कोशिका आबादी है, जिससे उन्हें अलग-थलग और विशेषता देना मुश्किल हो जाता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में अघायल और घायल माउस दिलों से फाइब्रोब्लास्ट और मायोफीब्रोब्लास्ट को समृद्ध करने के लिए तीन अलग-अलग तरीकों का वर्णन किया गया है। फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए एक मानक और विश्वसनीय प्रोटोकॉल का उपयोग करने से होमोस्टोसिस के साथ-साथ फाइब्रोसिस मॉड्यूलेशन में उनकी भूमिकाओं का अध्ययन संभव हो जाएगा।

Introduction

कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट, मेसेनचिमल मूल की कोशिकाएं, होमोस्टोसिस1के दौरान हृदय वास्तुकला के रखरखाव के अलावा दिल में विद्युत चालन और यांत्रिक बलों को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। चोट के बाद, इन कोशिकाओं को सक्रिय, विस्तार, और बाह्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन2का उत्पादन कर रहे हैं । कई प्रीक्लिनिकल अध्ययनों से फाइब्रोब्लास्ट को महत्वपूर्ण सेलुलर नियामकों के रूप में उजागर किया गया है जो घायल हृदय3 की संरचनात्मक अखंडता के साथ-साथ ईसीएम प्रोटीन के अनियंत्रित उत्पादन और जमाव के लिए जिम्मेदार मुख्य प्रभावक कोशिकाओं को बनाए रखते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कठोर निशान गठन और हृदय विफलता4होती है। फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं का एक विषम समूह है, जिससे प्रो-फाइब्रोटिक मैल्अनुकूलित गुणों से उनके पुनर्विचार कार्य को विच्छेदन करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। हाल ही में, मायोकार्डियल चोट के बाद दो अलग-अलग फाइब्रोब्लास्ट उपप्रकारों की कार्यात्मक विषमता को परिभाषित किया गया है, जो विभिन्न फाइब्रोब्लास्ट उपप्रकारों को अलग करने और घाव भरने में उनकी भूमिका का अध्ययन करनेकीसंभावना का संकेत देता है 5।

एक शुद्ध फाइब्रोब्लास्ट आबादी प्राप्त करना मरम्मत और फाइब्रोसिस में उनकी कार्यात्मक भूमिका को कम करने में महत्वपूर्ण है। हालांकि, कई फाइब्रोब्लास्ट मार्कर की उपस्थिति जो अन्य सेल प्रकारों को पहचानती है, इसे काफी हद तक शुद्ध फाइब्रोब्लास्ट आबादी6को अलग करना चुनौतीपूर्ण बनाती है। कई सुरुचिपूर्ण अध्ययनों ने अघायल और घायल मायोकार्डियम से कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए चतुर तरीके तैयार किए हैं। फाइब्रोब्लास्ट को समृद्ध करने की सबसे लोकप्रिय और सुस्थापित विधि एंजाइमैटिक ऊतक पाचन7के बाद चयनात्मक आसंजन के माध्यम से है।

इसके अतिरिक्त, सेल सतह एंटीजन पर आधारित फाइब्रोब्लास्ट की फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस) को सफलतापूर्वक8वर्णित किया गया है। अध्ययन में, एंजाइमैटिक पाचन के बाद, मेसेंचिमल कोशिकाओं को मानस-नकारात्मक (लिन: Ter119−CD45− CD31−) और gp38-positive (gp38+)माउस दिलों से हल किया गया था।−− GP38+ ve कोशिकाओं को col1α1 और अन्य मेसेनचिमल मार्कर की उनकी सह-अभिव्यक्ति के आधार पर फाइब्रोब्लास्ट होने की पुष्टि हुई थी। हालांकि पेट्री डिश में वेंट्रिकल को विच्छेदन करने के बाद अधिकांश ऊतक पाचन पूरा हो गया है, हाल ही में हुए एक अध्ययन में मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स को अलग करने के लिए बाएं वेंट्रिकल के प्रत्यक्ष सुई एंजाइम पेरिकफ्यूजन के उपयोग की जांच की गई है जिसमें फाइब्रोब्लास्ट9शामिल हैं। फिर इस मामले में चुनिंदा आसंजन से फाइब्रोब्लास्ट अलग-थलग पड़ गए।

यह प्रोटोकॉल तीन तरीकों का उपयोग करके फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और संवर्धन का वर्णन करता है। पहला एक पहले से ही स्थापित विधि है जिसमें एंजाइमैटिक पाचन के बाद फाइब्रोब्लास्ट के चयनात्मक आसंजन को शामिल किया गया है। दूसरी विधि का उपयोग मुख्य रूप से चोट-प्रेरित अल्फा चिकनी मांसपेशी को अलग करने के लिए किया जाता है जो मायोफेब्रोब्लास्ट को व्यक्त करता है। तीसरी विधि में एक एंजाइम-डाइजेस्ट कार्डियक सेल निलंबन हेमेटोपोइटिक और एंडोथेलियल कोशिकाओं की अनुक्रमिक, चुंबकीय कमी शामिल है। कमी के बाद, चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके एंटीजन एमईएफएसके4 की उपस्थिति के आधार पर फाइब्रोब्लास्ट/मायोफीब्रोब्लास्ट अलग-थलग कर दिए जाते हैं। हाल ही में, MEFSK4 को शांत करने के साथ-साथ सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट पर मौजूद एंटीजन के रूप में वर्णित किया गया है, जिससे यह फाइब्रोब्लास्ट पहचान और अलगाव के लिए एक उपयुक्त मार्कर बन गया है। स्वाभाविक रूप से, यहां वर्णित सभी तरीकों की अनूठी सीमाएं हैं। इसलिए प्रवाह विश्लेषण, इम्यूनोस्टेनिंग और अर्ध-मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा अलग-थलग पड़े सेल आबादी की शुद्धता की जांच करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। हालांकि, इन पद्धतियों पर विस्तार किया जा सकता है, और महत्वपूर्ण प्रयोगों के लिए फाइब्रोब्लास्ट और myofibroblast आबादी का उपयोग करने से पहले अन्य दूषित आबादी को बाहर करने के लिए अतिरिक्त मार्कर जोड़े जा सकते हैं।

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Protocol

यह अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों की प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों को कड़ाई से बरकरार रखता है । वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल संख्या: M1600076-01) को मंजूरी दे दी ।

1. हार्ट विच्छेदन

  1. समाधान की तैयारी
    1. केएचबी बफर
      1. एक हलचल बार का उपयोग करना, धीरे-धीरे डीडीआई पानी के 900 मीटर में क्रेब्स-हेंसेलिट बफर (KHB) पाउडर के 9.4 ग्राम को भंग करें।
        नोट: बफर अगर बहुत जल्दी या बहुत लंबे समय के लिए उभारा वर्षा होगी । फाइब्रोब्लास्ट अलगाव के दौरान KHB बफर ठंडा होना चाहिए।
      2. 2.9 mM CaCl2 और 24 mM NaHCO3जोड़ें । पीएच को 7.2-7.3 पर समायोजित करें और डीएच2ओ के साथ 1 एल की मात्रा में पतला करें।
      3. बाँझ फिल्टर (0.22 माइक्रोन) का उपयोग करके, 4 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अलगाव की अवधि के लिए बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. कोलेजेनेज़ पाचन कॉकटेल
      1. पाचन कॉकटेल फाइब्रोब्लास्ट अलगाव के दिन तैयार करें। दिलों की संख्या के अनुसार पाचन कॉकटेल की उचित मात्रा निर्धारित करें; 1 दिल प्रति कॉकटेल के 5 mL ।
      2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोलेजेनेज़ मिश्रण (सामग्री की तालिकादेखें) और DNase I तैयार करें।
      3. कुल पाचन कॉकटेल के 20 mL के लिए, DNase I के 17.5 μL, 1 एम HEPES के 180 μL, और एक खाली 50 mL शंकुट्यूब के लिए कोलेजेनेज के 500 μL जोड़ें।
      4. 20 मिलीग्राम कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए सीए2 + और एमजी 2+ के साथ हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) की पर्याप्त मात्रा जोड़ें।
    3. लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) लिसिस बफर
      1. दिलों की संख्या (5 mL/दिल) के आधार पर आवश्यक कुल मात्रा निर्धारित करें । 10x आरबीसी लिसिस स्टॉक बफर को डीएच2ओ का उपयोग करके 1x तक पतला करें।
    4. फाइब्रोब्लास्ट मीडिया: डीएमईएम एफ-12 में 10% एफबीएस
      1. एल-ग्लूटामाइन और हेप्स के साथ डीएमईएम-एफ12 में 10% एफबीएस जोड़ें। 10 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, २.५ μg/mL एंटी फंगल, और २.५ μg/mL mycoplasma रोगनिरोधी जोड़ें (सामग्री की मेजदेखें) । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. हृदय विच्छेदन
    1. विच्छेदन के दौरान दिलों को स्टोर करने के लिए प्रति अच्छी तरह से ठंडे KHB के 2 mL के साथ बर्फ पर एक 6 अच्छी तरह से थाली तैयार करें । ऑटोक्लेव सर्जिकल कैंची और संदंश का उपयोग करें।
    2. आइसोफ्लोरीन ओवरडोज से 12 सप्ताह या उससे अधिक उम्र के चूहों को इच्छामृत्यु दें, और सर्वाइकल अव्यवस्था के साथ पालन करें।
    3. वैकल्पिक रूप से, सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट अलगाव के लिए, कोरोनरी धमनी लिगेशन10द्वारा 12 सप्ताह पुराने चूहों में मायोकार्डियल इंफेक्शन को प्रेरित करें। चोट के बाद चूहों को 8-10 दिन इच्छामृत्यु दें।
    4. 70% इथेनॉल और ओरिएंट के साथ स्प्रे बॉडी इसलिए वेंट्रल साइड प्रयोगकर्ता का सामना कर रहा है। हस्तक्षेप को रोकने के लिए उपांगों को पिन या नियंत्रित करें।
    5. पेट की त्वचा और मांसपेशियों को खुला काट लें लेकिन लिवर को छेदने से बचें। उरोस्थि की ओर खड़ी कटौती करें, और दिल के भेदी से बचते हुए छाती को ध्यान से खोलें। दिल को बेनकाब करने के लिए रिबकेज के माध्यम से काटना जारी रखें।
    6. संदंश का उपयोग करना, धीरे-धीरे दिल को छाती से बाहर निकालें, दिल के बाहर से जुड़े किसी भी फेफड़े या अतिरिक्त ऊतक को काट दें। वेंट्रिकल निकालें और ठंडे KHB के साथ 6 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से जगह है । जब तक सभी नमूनों को अलग-थलग नहीं कर दिया जाता तब तक दिलों को विच्छेदन करते रहें।
  3. दिल का एंजाइमैटिक विच्छेदन
    1. संदंश का उपयोग करना, अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए KHB में दिल को बार-बार निचोड़ें और उत्तेजित करें। दिल को एक साफ बाँझ 10 सेमी2 प्लेट में स्थानांतरित करें। एक ही किनारे ब्लेड का उपयोग करना, जल्दी से छोटे टुकड़ों में दिल कीमा ।
    2. कोलेजेनेज पाचन कॉकटेल के 1 mL जोड़ें और जब तक टुकड़े 1 mL माइक्रोपाइपेट के साथ स्थानांतरित करने के लिए काफी छोटे हैं, तब तक कीमा जारी रखें। 1 एमएल माइक्रोपाइपेट के साथ 50 एमएल शंकुई ट्यूब पर टुकड़े स्थानांतरित करें। कोलेजेनेज पाचन कॉकटेल के 2 mL के साथ प्लेट 2x धोएं।
      नोट: पिपेट टिप के एक हिस्से को काटने से दिल के बड़े टुकड़े इकट्ठा करने में मदद मिल सकती है जो अन्यथा पिपेट टिप में फंस सकते हैं।
    3. कमाल या आंदोलन के साथ 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट शंकुट्यूब। जरूरत के अनुसार सुरक्षित ट्यूब। 5 एमएल पाइप्ट के साथ 10x को फिर से निलंबित करें जब तक कि सामग्री समरूप न हो जाए, और रोटेशन या आंदोलन के साथ 15 सीन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शंकुई ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    4. समरूप होने तक 10 मीटर पाइप के साथ 10x को फिर से निलंबित करें। एक नया 50 मीटर शंकुई ट्यूब के शीर्ष पर KHB बफर के 1-2 mL के साथ फिल्टर गीला करके एक 40 μm सेल छलनी प्राइम। पाचन निलंबन, पुनर्निलंबित, और एक प्राइम्ड 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फिल्टर करने के लिए KHB बफर के 25 mL जोड़ें। जरूरत के अनुसार फ़िल्टर बदलें।
      नोट: के रूप में छानने का काम धीमा, हल्के से दोहन ट्यूब या फिल्टर के नीचे से निलंबन आकर्षित करने के लिए एक 1 mL माइक्रोपाइपेट का उपयोग करने में मदद कर सकते है सेल निलंबन एक आंशिक रूप से अवरुद्ध ४० μm सेल छलनी के माध्यम से गुजरती हैं ।
    5. 10 00 x ग्राम और 10 00 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें। 1x आरबीसी लाइसिस बफर (5 मीटर/दिल) में पैलेट को हटा दें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
    6. 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और 10 00 के लिए आरटी. सुपरनेटेंट निकालें फिर केएचबी बफर के 1 mL में गोली को फिर से निलंबित करके धोएं।
    7. नए 50 मीटर शंकुई ट्यूब में प्राइम्ड 40 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से KHB बफर और फ़िल्टर के 9 mL जोड़ें। 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और 10 मिन के लिए आरटी।
    8. सुपरनेट निकालें, फाइब्रोब्लास्ट मीडिया या पीबीएस के 1 एमएल में फिर से सस्पेंड करें, और सेल नंबर निर्धारित करें। फाइब्रोब्लास्ट नीचे वर्णित तीन अलग-अलग तरीकों से अलग किया जा सकता है।

2. एकल सेल निलंबन से फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव

  1. फाइब्रोब्लास्ट अलगाव: अंतर चढ़ाना(चित्रा 1)
    1. अच्छी तरह से प्रति फाइब्रोब्लास्ट मीडिया के 2 mL जोड़कर और अच्छी तरह से नीचे कवर करने के लिए थाली घूमता द्वारा एक 6 अच्छी तरह से थाली तैयार करें ।
    2. प्रति दिल मीडिया के 1 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन की प्लेट 1 मिलीएल ऐसी कि एक दिल (सैद्धांतिक रूप से) को प्रति अच्छी तरह से चढ़ाया जा रहा है। उदाहरण के लिए, छह दिलों को मीडिया के 6 मिलील में फिर से निलंबित किया जाएगा, फिर प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के 1 mL के साथ छह कुओं में चढ़ाया जाएगा ।
    3. कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए भंवर प्लेट। प्रति अच्छी तरह से 5 मीटर तक की कुल मात्रा के लिए प्रति अच्छी तरह से एक अतिरिक्त 1-2 mL मीडिया जोड़ें, और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. फाइब्रोब्लास्ट 4 घंटे के बाद चयनात्मक आसंजन से अलग हो जाएगा । मीडिया को हटाकर असंबद्ध और मृत कोशिकाओं को हटा दें । पीबीएस के 2 mL के साथ संलग्न कोशिकाओं को धोएं और प्रति अच्छी तरह से 2-4 mL बाँझ फाइब्रोब्लास्ट मीडिया जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर शंखनाद तक इनक्यूबेट। हर 2-4 दिन में मीडिया बदलें।
  2. फाइब्रोब्लास्ट आइसोलेशन: एफएसीएस एक GFP रिपोर्टर माउस मॉडल का उपयोग कर(चित्रा 1)
    1. FACS बफर
      1. सीए2 + और एमजी 2+के बिना डीबीएस में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 15 मिलील तैयार करें। बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. एफसी अवरोधक समाधान
      1. एफएसीएस (1:50 कमजोर पड़ने) के 25 माइक्रोन में 0.5 माइक्रोन एफसी अवरोधक (शुद्ध एंटी-माउस सीडी16/सीडी32) तैयार करें। प्रति सैंपल एफसी ब्लॉकर सॉल्यूशन के 25 माइक्रोन की जरूरत है। बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. नमूना तैयारी और एंटीबॉडी धुंधला
      नोट: एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को पहले से तैयार किया जा सकता है, लेकिन इससे प्रकाश या तापमान जोखिम का खतरा हो सकता है।
      1. 7AAD या घोस्ट डाये वायलेट 510 तैयार करें जो 2x एफएसीएस बफर में आवश्यक कमजोर पड़ने का कारण है। एंटीबॉडी और कमजोर के लिए टेबल 1 देखें।
      2. एफसी एंटीबॉडी क्षेत्र के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को एफसी रिसेप्टर को रोकने के लिए एफसी अवरोधक समाधान के 25 माइक्रोन में 500,000 ताजा अलग-थलग कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। आरटी में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
      3. सेल निलंबन के 25 μL की अंतिम मात्रा में 7AAD या घोस्ट डाये वायलेट 510 एंटीबॉडी जोड़ें। अंधेरे में बर्फ पर 30-60 मिन के लिए इनक्यूबेट।
      4. FACS बफर के 1 mL में फिर से निलंबित करके धोलें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
      5. FACS बफर (300 μL) के अनुशंसित प्रवाह साइटोमेट्री नमूना मात्रा में पैलेट को फिर से निलंबित करें और साइटोमेट्री ट्यूब प्रवाह में स्थानांतरित करें।
    4. फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS)
      नोट: GFP-αSMA रिपोर्टर चूहों डॉ इवो Kalajzic11से एक योगदान थे । यह माउस अल्फा स्मूथ मांसपेशी सेल (αSMA) प्रमोटर के तहत GFP व्यक्त करता है। αSMA सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट (myofibroblasts)12के एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है ।
      1. सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट (αSMA मायोफीब्रोब्लास्ट व्यक्त करने) अलगाव के लिए, कोरोनरी धमनी लिगेशन द्वारा 12 सप्ताह पुराने GFP-αSMA चूहों में मायोकार्डियल इंफेक्शन को प्रेरित करें। चोट के बाद 8-10 दिनों के चूहों का बलिदान करें।
      2. घायल चूहों के दिलों से एकल सेल निलंबन के बाद, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के लिए αSMA+ ve फाइब्रोब्लास्ट सॉर्ट करें। मुआवजे के बाद जीएफपी चैनल में पृष्ठभूमि संकेत सेट करने के लिए अदाग अघायल फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करें ।
      3. 7AAD-ve/GFP+ ve कोशिकाओं-veया भूत रंग े बैंगनी 510-ve/GFP-ve+ve कोशिकाओं के लिए गेटिंग द्वारा लाइव GFP+ ve कोशिकाओं के लिए गेट और αSMA+ve myofibroblasts व्यक्त GFP सॉर्ट । फाइब्रोब्लास्ट मीडिया में कोशिकाओं को लीजिए।
  3. फाइब्रोब्लास्ट अलगाव: फाइब्रोब्लास्ट का चुंबकीय मनका आधारित अलगाव(चित्रा 1)
    1. समतुल्यता बफर
      नोट: हमेशा अलगाव के लिए ताजा बफर तैयार करें।
      1. पीबीएस में 05 प्रतिशत बीएसए और 2 एमएम ईटीए तैयार करें। कंटेनर के ढक्कन में वैक्यूम संलग्न करते समय समाधान को हिलाते हुए बफर को डेगास करें।
        नोट: सरगर्मी समाधान है कि तो वैक्यूम के माध्यम से हटा दिया जाता है जैसे कि बुलबुले उपयोग पर जुदाई कॉलम रोकना नहीं होगा से अतिरिक्त गैस निकालता है ।
    2. चुंबकीय लेबलिंग: CD45+ हेमेटोपोइटिक कोशिकाएं
      1. 5 00 x ग्राम पर चूहों के दिलों से अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को 5 00 x के लिए, फिर सुपरनेटेंट को हटा दें।
      2. समतुल्यता बफर के 1 mL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
      3. ऊपर के रूप में सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और प्रति 1 x 107 कुल कोशिकाओं प्रति 90 μL समतुल्यता बफर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। 1 x 107 कुल कोशिकाओं प्रति CD45+ चुंबकीय मोती के 10 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 15 min के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
      4. 1 x 107 कुल कोशिकाओं प्रति 2 mL समतुल्यता बफर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्री।
      5. अधिनायक को हटादें, हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को गिनें और समतुल्यता बफर के 2 mL में 1 x 107 कुल कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। यदि10 7 से अधिक कोशिकाएं मौजूद हैं, तो बफर लिलक् स स्केल करें। सेपरेशन कॉलम मैट्रिक्स को बंद करने से सेल एकत्रीकरण को रोकने के लिए 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं को पास करें।
    3. चुंबकीय पृथक्करण: CD45+ हेमेटोपोइटिक कोशिकाएं
      1. पीबीएस के कम से कम 3 एमएल के साथ एक उपयुक्त विभाजक और समतुल्य कॉलम के चुंबकीय क्षेत्र में जुदाई कॉलम रखें।
      2. प्रवाह (एफटी) में अवेलेबल कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और 3 मिलील संतुलन बफर के साथ कॉलम 3x धोएं। एफटी के साथ वॉश लीजिए। विभाजक से कॉलम निकालें। कॉलम को 15 mL शंकुट्यूब पर रखें।
      3. स्तंभ पर समतुल्यता बफर के 5 मिलील को पाइपकर और कॉलम के साथ आपूर्ति किए गए प्लंजर के साथ कोशिकाओं को मजबूती से आगे बढ़नेवाला करके चुंबकीय रूप से सीडी45+ कोशिकाओं को बाहर निकालें।
      4. सेंट्रलाइज एल्यूंट के साथ-साथ एफटी/वॉश अंश ५०० x gपर । हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    4. चुंबकीय लेबलिंग और जुदाई: CD31+ एंडोथेलियल कोशिकाएं
      1. सीडी 45+ चुंबकीय लेबलिंग और पृथक्करण (अनुभाग 2.3.2-2.3.3) के लिए प्रोटोकॉल दोहराएं, सिवाय इसके कि सीडी 31+ चुंबकीय मोतियों का उपयोग एफटी के साथ इनक्यूबेट करने और सीडी 45+ अलगाव से भागों को धोने के लिए करें।
    5. चुंबकीय लेबलिंग और जुदाई: MEFSK4+ फाइब्रोब्लास्ट
      1. चुंबकीय मोतियों के बजाय MEFSK4 एंटी फीडर-एपीसी एंटीबॉडी का उपयोग करसीडी 45+ चुंबकीय लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल दोहराएं। 5 मिन के लिए 500 × ग्राम पर CD31+ अलगाव से एफटी और धोने भागों को केंद्रावर्तित करें, फिर सुपरनेटेंट को हटा दें। समतुल्यता बफर के 1 mL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें, और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
      2. 1 x 107 कोशिकाओं प्रति MEFSK4 एंटी फीडर-एपीसी एंटीबॉडी के 10 माइक्रोन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 15 मिन के लिए इनक्यूबेट।
      3. 1 x 107 कुल कोशिकाओं प्रति समतुल्यता बफर के 5 mL जोड़कर MEFSK4 एंटीबॉडी बाध्य कोशिकाओं को धोएं, फिर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्री।
      4. MEFSK4 एंटी फीडर-एपीसी एंटीबॉडी का उपयोग करके, एंटी-एपीसी मोतियों में सुपरनेट ेंट और रिसस्पेंड निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
      5. 10 मिन के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेटेंट को हटाएं, प्रति 1 x 107 कुल कोशिकाओं के प्रति समतुल्यता बफर के 2 mL में फिर से निलंबित करें, और चुंबकीय अलगाव के साथ आगे बढ़ें जैसा कि पहले वर्णित (धारा 2.3.3.3)। चुंबकीय रूप से अलग+veMEFSK4 +ve/CD45-ve/CD31-ve फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग शुद्धता विश्लेषण और अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है ।-ve-ve

3. अलग-थलग फाइब्रोब्लास्ट आबादी की शुद्धता और कार्यक्षमता विश्लेषण

  1. FACS जनसंख्या शुद्धता विश्लेषण: αSMA-GFP सेल विश्लेषण(चित्रा 2)
    1. एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए एफसी अवरोधक समाधान के 25 माइक्रोन में हौसले से अलग कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। आरटी में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
    2. वैकल्पिक: सेल निलंबन के लिए 7AAD या घोस्ट डाया वायलेट 510 के 25 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में बर्फ पर 30-60 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    3. FACS बफर के 1 mL में फिर से निलंबित करके धोलें। 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    4. FACS बफर के 50 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। सीडी 31-पीई, सीडी45-एपीसी, और AN2/NG2 एंटीबॉडी सीधे सेल निलंबन के लिए जोड़ें । बर्फ पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट(टेबल 1)।
    5. 1 एमसीएल एफएसीएस बफर में फिर से निलंबित करके धोएं। 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    6. अconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल कोशिकाओं के लिए गधा विरोधी चूहा AlexaFluor 405 माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें। बर्फ पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    7. FACS बफर के 1 mL में फिर से निलंबित करके धोलें। 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    8. FACS बफर (300 μL) के अनुशंसित प्रवाह साइटोमेट्री नमूना मात्रा में पैलेट को फिर से निलंबित करें और प्रवाह विश्लेषण के लिए एक लेबल प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: अलग फाइब्रोब्लास्ट पर MEFSK4 एंटीजन की अभिव्यक्ति की विशेषता के लिए FACS विश्लेषण धारा 3.3 में वर्णित है।
  2. फाइब्रोब्लास्ट शुद्धता विश्लेषण: इम्यूनोफ्लोरेसेंस(चित्रा 3ए)
    1. बीज 30,000 प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट (P0-P1) प्रति अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली और संस्कृति में रखा कवरस्लिप पर 80% confluent तक। या 400 x × g (एक विधि सीधे और समान रूप से एक 24 अच्छी प्लेट में एक कवरस्लिप पर कोशिकाओं को जमा करने के लिए इस्तेमाल किया) पर साइटोस्पिन द्वारा एक कवरस्लिप पर हल CD45+ और CD31+ कोशिकाओं (30,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से) ध्यान केंद्रित करें।
    2. 15 मिन के लिए ठंड एसीटोन के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। पीबीएस के साथ 3x बार धोएं।
    3. 10% बकरी सीरम में ब्लॉक स्लाइड। रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट स्लाइड(तालिका 2)।
    4. पीबीएस में स्लाइड 3x धोएं। 2 घंटे(तालिका 2)के लिए इनक्यूबेट माध्यमिक एंटीबॉडी।
    5. काउंटरदाग स्लाइड, और धीमी गति से फीका बढ़ते मीडिया में DAPI की एक बूंद के साथ माउंट ।
  3. FACS जनसंख्या शुद्धता विश्लेषण: MEFSK4 जांच(चित्रा 3बी)
    1. एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए एफसी अवरोधक समाधान के 25 माइक्रोन में हौसले से अलग कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। आरटी में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
    2. वैकल्पिक: सेल निलंबन के लिए 7AAD या घोस्ट डाया वायलेट 510 के 25 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में बर्फ पर 30-60 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    3. FACS बफर के 1 mL में फिर से निलंबित करके धोलें। 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    4. FACS बफर के 50 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। सीधे सेल निलंबन के लिए MEFSK4 एंटीबॉडी जोड़ें। बर्फ पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट (टेबल 1)।
    5. FACS बफर के 1 mL में फिर से निलंबित करके धोलें। 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    6. कोशिकाओं(तालिका 1)में चूहा आईजीजी-एपीसी जोड़ें। बर्फ पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    7. FACS बफर के 1 mL में फिर से निलंबित करके धोलें। 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    8. FACS बफर (300 μL) के अनुशंसित प्रवाह साइटोमेट्री नमूना मात्रा में पैलेट को फिर से निलंबित करें और प्रवाह विश्लेषण के लिए साइटोमेट्री ट्यूब प्रवाह में स्थानांतरित करें।
  4. फाइब्रोब्लास्ट शुद्धता विश्लेषण: अर्ध-मात्रात्मक वास्तविक समय आरटीपीसीआर(चित्रा 3सी)
    1. आरएनए अलगाव और अर्धमात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर
    2. फाइब्रोब्लास्ट के संवर्धन के बाद, आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करके आरएनए को अलग करें (सामग्री की तालिकादेखें)। निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक सीडीएनए संश्लेषण किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके पहला स्ट्रैंड डीएनए संश्लेषण पूरा करें।
    4. अर्धमात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर5प्रदर्शन करें ।
  5. फाइब्रोब्लास्ट कार्यक्षमता विश्लेषण: कोलेजन जेल संकुचन परख(चित्र4)
    1. कोलेजन समाधान
      1. डीएमईएम में 20 एमएम एचईपी और 44 एमएम नाहको3 तैयार करें। हेप्स और नाहको3के साथ डीएमईएम के प्रति 1 मिलीग्राम 1 चूहा कोलेजन 1.67 मिलीग्राम जोड़ें।
    2. टीजीएफ-पूरक डीएमईएम
      1. एंटीबायोटिक दवाओं और एंटी फंगल के साथ पूरक डीएमईएम में 10% एफबीएस तैयार करें। 1 एनजी/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए TGFο जोड़ें ।
    3. सेल/कोलेजन मिश्रण और चढ़ाना
      1. सेल निलंबन (P3-P5) तैयार करें और 3.3 x 105 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करें।
      2. 1 mL कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए पर्याप्त कोलेजन समाधान के लिए 3.3 x 105 कोशिकाओं के साथ निलंबन मात्रा जोड़ें।
        नोट: चूहा कोलेजन प्रकार 1 एकाग्रता अब १.५ मिलीग्राम/mL होना चाहिए ।
      3. एक ४८ अच्छी थाली में, बीज ३०० माइक्रोन सेल-कोलेजन मिश्रण प्रति अच्छी तरह से (~ 1 x १०५ कोशिकाओं/अच्छी तरह से) । 15-20 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जब तक जेल नहीं किया जाता।
      4. अच्छी दीवारों से जेल को अलग करने में मदद करने के लिए 30 जी सुई का उपयोग करें। टीजीएफएफके 600 माइक्रोन जोड़ें और एफबीएस ने प्रत्येक अच्छी तरह से DMEM को पूरक किया। 24 घंटे और ४८ घंटे में एक चिंतनशील स्कैनर पर छवि प्लेटें ।
        नोट: सभी इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग तीन लेजर (405 एनएम, 488 एनएम, और 640 एनएम) से लैस प्रवाह साइटोमेट्री मशीन पर किए गए थे। डेटा एक प्रवाह डेटा प्राप्त सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)का उपयोग कर प्राप्त किए गए । इसके अलावा डेटा विश्लेषण प्रवाह डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर किया गया था । AlexaFluor ४०५ और भूत डी वायलेट ५१० ४०५ एनएम लेजर के साथ उत्साहित थे और एक 450/50 बीपी और 525/50 बीपी फिल्टर का उपयोग कर एकत्र, क्रमशः । GFP और पीई ४८८ एनएम लेजर से उत्साहित थे और क्रमशः 530/30 बीपी और 575/26 बीपी फिल्टर का उपयोग कर एकत्र । या तो एपीसी या AlexaFluor ६४७ ६४० एनएम लेजर से उत्साहित था और एक 670/14 बीपी फिल्टर का उपयोग कर एकत्र । चार लेजर (405 एनएम, 488 एनएम, 561 एनएम और 640 एनएम) से लैस प्रवाह साइटोमेट्री मशीन(टेबल ऑफमैटेरियल) पर सभी सेल छंटाई प्रयोग किए गए थे। 7-AAD ५६१ एनएम लेजर का उपयोग कर उत्साहित था और एक 670/14 बीपी फिल्टर के साथ एकत्र किया । GFP और भूत उप वायलेट ५१० एक ही लेजर का उपयोग कर एकत्र किए गए/ सभी छंटाई प्रयोगों लक्ष्य कोशिकाओं की वृद्धि हुई बहाव व्यवहार्यता के लिए एक 17 साई दबाव विन्यास के साथ एक १०० उम नोजल का उपयोग किया ।

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Representative Results

फ्लो गेटिंग योजना αSMA-GFP रिपोर्टर चूहों का उपयोग कर myofibroblast अलगाव का प्रदर्शन
अघायल दिलों ने αSMA-GFP रिपोर्टर माउस मॉडल में कोई पता लगाने योग्य GFP+ कोशिकाओं को नहीं दिखाया; इसलिए, वे जीएफपी चैनल के बाद मुआवजा(चित्रा 2)के पृष्ठभूमि संकेत के लिए एक गेट स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया । एमआई के बाद 10 दिनों में घायल बाएं वेंट्रिकल से जीएफपी अभिव्यक्ति की उपस्थिति के आधार पर αSMA+ कोशिकाओं को हल किया गया था। एंडोथेलियल (जीएफपी +/सीडी31 + कोशिकाओं का एक छोटा प्रतिशत; एसडी = 3.8% ± 0.0164; n = 5) और हेमेटोपोइटिक (GFP+/CD45+ कोशिकाएं; एसडी = 3.18% ± 0.0112; n = 5) कोशिकाओं को भी घायल αSMA-GFP माउस दिल(चित्रा 2ए)में GFP व्यक्त किया । हालांकि, GFP +/CD31-/CD45-कोशिकाओं AN2, एक pericyte मार्कर व्यक्त नहीं किया ।

अघायल (शांत) और घायल (सक्रिय, αSMA+GFP +) कोशिकाओं फाइब्रोब्लास्ट मार्कर व्यक्त
जीएफपी + कोशिकाओं αSMA-GFP चूहों से अलग αSMA, कोलेजन प्रकार 1 अल्फा-1 श्रृंखला (COL1α1), vimentin, और periostin व्यक्त जब IF विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया । चयनात्मक आसंजन द्वारा अलग-थलग किए गए अघायल फाइब्रोब्लास्ट्स ने विमेंटिन व्यक्त किया लेकिन सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट मार्कर की अभिव्यक्ति प्रदर्शित नहीं की: αSMA, पेरियोस्टिन, और COL1α1(चित्रा 3ए)। दोनों अघायल और सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट ने फ्लो एनालिसिस(चित्रा 3बी)द्वारा विश्लेषण किए जाने पर MEFSK4 एंटीजन व्यक्त किया। बेघायल चूहों दिलों से चुंबकीय रूप से अलग MEFSK4 + ve कोशिकाओं ने फाइब्रोब्लास्ट के मार्कर व्यक्त किए: Col1a1, pdgfrα, और periostin । इसके विपरीत, चुंबकीय रूप से अलग सीडी 45 और सीडी 31 सकारात्मक कोशिकाओं में फाइब्रोब्लास्ट मार्कर की नगण्य अभिव्यक्ति थी।

फाइब्रोब्लास्ट और मायोफीब्रोब्लास्ट ने कोलेजन को अनुबंधित करने की क्षमता का प्रदर्शन किया
कड़ी प्लास्टिक पर सेल संस्कृति में, फाइब्रोब्लास्ट को टीजीएफकी की उपस्थिति में कोलेजन जैल को अनुबंधित करने के लिए दिखाया गया है, जो संकुचन13,,14की अपनी कार्यात्मक क्षमता का प्रदर्शन करता है। फाइब्रोब्लास्ट की यह इन विट्रो विशेषता ऊतक मरम्मत के साथ-साथ अन्य जैविक प्रक्रियाओं के दौरान होने वाले संयोजी ऊतक संकुचन के समान है। दोनों अघायल फाइब्रोब्लास्ट, चयनात्मक आसंजन से अलग, और myofibroblasts, अलग और αSMA-GFP चूहों से हल, कोलेजन अनुबंध करने की क्षमता का प्रदर्शन किया(चित्रा 4)।

Figure 1
चित्रा 1: तीन अलग अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर फाइब्रोब्लास्ट अलगाव की योजनाबद्ध। (क)अंतर चढ़ाना,(बी)जीएफपी + कोशिका की छंटाई αSMA सकारात्मक कोशिकाओं की छंटाई, और(सी)फाइब्रोब्लास्ट के चुंबकीय मनका आधारित अलगाव । अंतर चढ़ाना के बाद संस्कृति में कोशिकाओं के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एमआई के बाद αSMA-GFP चूहों दिलों से अलग एकल कोशिकाओं का FACS विश्लेषण। (A)प्रतिनिधि FACS गेटिंग योजना GFP + कोशिकाओं का सह-व्यक्त सीडी31, CD45, या ΑSMA-GFP चूहों से AN2 मायोकार्डियल इंफ्रॉक्शन (एमआई) के 10 दिन बाद दिल घायल हो गया । (ख)एमआई के बाद के दिलों के लिए प्रस्तुत FACS डेटा का चित्रमय मात्राकरण; n = 5 प्रयोगस्वतंत्र रूप से किए गए (***पी एंड एलटी; 0.0001 के रूप में तुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA का उपयोग कर गणना की गई)। यह आंकड़ा सरस्वती एट अल10से अनुकूलित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: अघायल और घायल चूहों के दिलों से अलग फाइब्रोब्लास्ट की शुद्धता विश्लेषण। (A)अघायल, या घायल αSMA-GFP चूहों FACS द्वारा हल के दिल से सेल आबादी (P0) के इम्यूनोफ्लोरेंस धुंधला । दोनों अघायल और सक्रिय कोशिकाओं को इस तरह के COL1α1, और vimentin के रूप में फाइब्रोब्लास्ट (FB) मार्कर, व्यक्त करते हैं, लेकिन हेमेटोपोइटिक मार्कर सीडी 45 या एंडोथेलियल मार्कर CD31 नहीं। घायल αSMA-GFP चूहों दिल से अलग कोशिकाओं सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट मार्कर, αSMA, और periostin, जो अघायल चूहों दिलों से अलग कोशिकाओं में मौजूद नहीं थे व्यक्त की । नाभिक को डीपीआई के साथ दाग दिया गया था, एन = 3 प्रयोग स्वतंत्र रूप से किए गए थे। स्केल बार = 100 माइक्रोन(बी)प्रतिनिधि FACS ने फाइब्रोब्लास्ट मार्कर एमईएफ-एसके4 की अभिव्यक्ति को दिखाने वाले अघायल और सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट (पी 3-पी5) के हिस्टोग्राम को ओवरले किया। नकारात्मक नियंत्रण के लिए, चूहा आईजीजी का उपयोग किया गया था, एन = 2 प्रयोग स्वतंत्र रूप से किए गए थे। (C) कोल1α1, Pdgfrα,और Postn टेप के सापेक्ष गुना परिवर्तन अघायल MEKSK4 + ve फाइब्रोब्लास्ट में, n = 3 प्रयोगस्वतंत्र रूप से किया गया (* पी एंड एलटी; ०.०५ के रूप में तुकी के कई तुलना परीक्षण के साथ दो तरह से ANOVA का उपयोग कर गणना) । (क) और (ख) सरस्वती एट अल10से अनुकूलित हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अघायल और घायल माउस दिलों से अलग फाइब्रोब्लास्ट का कार्यात्मक लक्षण वर्णन। अघायल और घायल सक्रिय αSMA+ फाइब्रोब्लास्ट (P3-P5) की उपस्थिति में कोलेजन जेल संकुचन का प्रतिनिधि आंकड़ा। ग्राफ 24 एच और संकुचन के 48 घंटे के बाद प्रारंभिक जेल क्षेत्र में प्रतिशत परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है जब अघायल और घायल सक्रिय αSMA+ फाइब्रोब्लास्ट के साथ इनक्यूबेटेड, एन = 2 प्रयोगस्वतंत्र रूप से किए गए थे। यह आंकड़ा सरस्वती एट अल10से अनुकूलित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एंटीबॉडी सेल टारगेट कमजोर पड़ना
7AAD मृत कोशिकाएं 1:1000
भूत दवाई वायलेट 510 मृत कोशिकाएं 1:1000
एपीसी-सीडी45 हेमेटोपोइटिक कोशिकाएं 1:200
पीई-सीडी31 एंडोथेलियल कोशिकाएं 1:200
विरोधी AN2/NG2 पेरिसाइट्स 1:11
गधा विरोधी चूहा एलेक्सा फ्लोर 405 सेकेंडरी एंटीबॉडी 1:100
एंटी फीडर सेल-एपीसी (MEFSK4) फाइब्रोब्लास्ट 1:100
चूहा आईजीजी-एपीसी आइसोटाइप कंट्रोल 1:100

तालिका 1: FACS रंगों और एंटीबॉडी।

प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ना
α-चिकनी मांसपेशी actin (αSMA) 1:1000
फाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट प्रोटीन 1 (FSP1) 1:250 1:100
कोल 1α1 1:1000
पेरिओस्टिन 1:100
विमेंटिन 1:200
सीडी31 1:250
सीडी45 1:250
सेकेंडरी एंटीबॉडी कमजोर पड़ना
बकरी विरोधी माउस एलेक्सा फ्लोर 488 1:200
बकरी विरोधी खरगोश-FITC 1:200
बकरी विरोधी खरगोश-Cy3 1:200
बकरी विरोधी चूहा एलेक्सा फ्लोर 488 1:200
बकरी विरोधी चूहा एलेक्सा फ्लोर 647 1:200

तालिका 2: इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी।

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Discussion

फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं का एक विषम समूह है, जिसकी पहचान मार्कर के विविध सेट द्वारा की जाती है। फाइब्रोब्लास्ट की पहचान करने के लिए जिन प्रोटीन मार्कर का इस्तेमाल किया गया है, वे डिस्कोइडिन डोमेन रिसेप्टर 2 (डीडीआर2), फाइब्रोनेक्टिन, विमेंटिन, कोलेजन I और III, और Thy115,,16,,17,,18,,19,,20हैं । जबकि विमेंटिन का उपयोग अघायल शांत हृदय फाइब्रोब्लास्ट की पहचान करने के लिए किया गया है, फाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट प्रोटीन 1, αSMA, और पेरिओस्टिन को चोट से प्रेरित सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट की पहचान करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें αSMA सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट6,,12,,21का पता लगाने के लिए सबसे आम मार्कर है । इसके अतिरिक्त, Tcf21 और MEFSK4 प्रोटीन ने घायल हृदय ऊतक में पाए जाने वाले दोनों शांत फाइब्रोब्लास्ट के साथ-साथ घायल माउस हार्ट्स21, 22,में पाए जाने वाले माओफीब्रोब्लास्ट सहित सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट को पहचानने में हाल ही में मान्यता प्राप्तकीहै ।

यह प्रोटोकॉल फाइब्रोब्लास्ट को अलग-थलग और समृद्ध करने और मायोफीब्रोब्लास्ट सहित सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट को समृद्ध करने के लिए तीन अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग करता है। फाइब्रोब्लास्ट की अधिमानतः प्लास्टिक का पालन करने की क्षमता अलगाव के लिए पहले दृष्टिकोण में उपयोग की जाती है। लिबरेज़ के साथ एंजाइमैटिक पाचन के बाद, कोशिकाओं के एकल सेल निलंबन को अधिमानतः पालन करने के लिए प्लास्टिक की डिश पर वरीयता प्राप्त किया जाता है। पेट्री व्यंजनों की पॉलीस्टीरिन सतह का पालन करने के लिए कई गैर-फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं की अक्षमता हमें पकवान से सभी मीडिया को हटाने और फाइब्रोब्लास्ट की अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी के साथ रहने की अनुमति देती है। इस तकनीक का उपयोग करने की एक चेतावनी है, हालांकि फाइब्रोब्लास्ट अधिमानतः पॉलीस्टीरिन डिश का पालन करेंगे, कुछ दूषित गैर-फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं भी संलग्न हो सकती हैं, जिससे कोशिकाओं की गैर-समरूप आबादी हो सकती है।

दूसरी आइसोलेशन तकनीक अन्य कोशिकाओं से मायोफीब्रोब्लास्ट व्यक्त करने वाले αSMA को अलग करने के लिए FACS का उपयोग करती है। यहां नियोजित ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में, जीएफपी को विशेष रूप से αSMA के साथ व्यक्त किया जाता है, इसलिए αSMA युक्त myofibroblasts GFP की फ्लोरोसेंट क्षमताओं के माध्यम से एक FACS मशीन द्वारा पता लगाया जा सकता है। यह अलगाव प्रक्रिया हमें कोशिकाओं की आबादी प्राप्त करने में सक्षम बनाती है जो लगभग 99% myofibroblast है। इन कोशिकाओं के शुद्धता विश्लेषण ों का व्यापक वर्णन सरस्वती एट अल10ने किया है ।

तीसरी आइसोलेशन तकनीक मेफस्क4 व्यक्त सेल के चुंबकीय मनका आधारित पृथक्करण द्वारा अघायल और सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट दोनों को अलग करने का एक कुशल तरीका है। एक एकल सेल निलंबन को एंटी-सीडी45 और एंटी-सीडी31 चुंबकीय मोतियों से बांधने की अनुमति देकर और चुंबकीय क्षेत्र प्रभावों के कारण मैट्रिक्स में स्थिर हो जाते हैं, इससे किसी भी हेमेटोपोइटिक के साथ-साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति मिलती है जो दूषित हो सकती हैं फाइब्रोब्लास्ट अलगाव। के रूप में MEFSK4 हाल ही में एक विश्वसनीय मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है फाइब्रोब्लास्ट की पहचान करने के लिए, एक एंटीबॉडी है कि MEFSK4 व्यक्त कोशिकाओं को बांध जाएगा लागू करने में सक्षम है । एंटीबॉडी के लिए एक चुंबकीय मनका बाध्यकारी करने के बाद, एक जटिल है कि फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव की अनुमति देता है बनाने, चुंबकीय मनका सेल परिसर एक चुंबकीय क्षेत्र में एक मैट्रिक्स के माध्यम से पारित किया जाता है, और एक अत्यधिक समृद्ध फाइब्रोब्लास्ट आबादी प्राप्त की है । इक्का-दुक्का फाइब्रोब्लास्ट आबादी की शुद्धता का आकलन इम्यूनोस्टेनिंग, आरटीपीसीआर और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ों द्वारा किया जाना चाहिए।

किसी भी अन्य तकनीक के साथ, इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीकों के साथ सीमाएं हैं। चयनात्मक आसंजन प्रोटोकॉल और चुंबकीय मनका आधारित अलगाव की सीमा यह है कि ये विधियां शांत और सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट के बीच अंतर नहीं करती हैं। सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट को समृद्ध करने के लिए, अलगाव मायोकार्डियल इंफेक्शन के बाद 8-10 दिनों तक किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, अन्य फाइब्रोब्लास्ट मार्कर के साथ अलगाव की शुद्धता की जांच करना महत्वपूर्ण है। MEFSK4-पॉजिटिव फाइब्रोब्लास्ट शुद्धता केवल आरटीपीसीआर द्वारा प्रदर्शित की गई है, अन्य फाइब्रोब्लास्ट मार्कर और मार्कर के साथ (इम्यूनोस्टेनिंग और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा) का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है जो हेमेटोपोइटिक (सीडी45) सहित दूषित सेल प्रकारों को पहचानते हैं, एंडोथेलियल (सीडी31), और पेरिसाइट्स (एएन2)। यदि संभव हो तो, अन्य फाइब्रोब्लास्ट विशिष्ट मार्कर का उपयोग फाइब्रोब्लास्ट आबादी को आगे सॉर्ट या चुंबकीय रूप से अलग करने के लिए किया जा सकता है।

मायोफीब्रोब्लास्ट को अलग करने और सॉर्ट करने के लिए αSMA-GFP चूहों का उपयोग करना एक सक्रिय फाइब्रोब्लास्ट आबादी प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है। हालांकि, प्रवाह विश्लेषण में हेमेटोपोइटिक और एंडोथेलियल कोशिकाओं का नगण्य प्रतिशत देखा गया है। इस तकनीक में सुधार करने के लिए, सीडी45 +ve/CD31+ve और AN2 + ve कोशिकाओं को GFP+ve/αSMA+ve सेल छंटाई से बाहर रखा जाना चाहिए । चूंकि αSMA myofibroblasts का एक व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं मार्कर है, αSMA-GFP रिपोर्टर माउस मॉडल एक मूल्यवान उपकरण है जिसे मायोकार्डियल चोटों के संदर्भ में मायोफीब्रोब्लास्ट का अध्ययन करने के लिए शोषण किया जाना चाहिए।

कई महत्वपूर्ण समस्या निवारण कदम हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए । यदि कोशिका व्यवहार्यता और उपज प्रभावित होती है तो पाचन समय को कम किया जा सकता है। पाचन मिश्रण को हिलाने के लिए एक हलचल बार का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है। पाचन मिश्रण को धीरे-धीरे उत्तेजित करने के लिए ट्यूब को घुमाव पर या मिलाते हुए इनक्यूबेटर में सुरक्षित किया जाना चाहिए। 5 मिलीआर या 10 मिलील पिपेट के साथ पचाए गए ऊतक 10x को फिर से निलंबित करना कोशिकाओं के उचित विजन के लिए महत्वपूर्ण है।

यदि कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा हल या विश्लेषण किया जा रहा है तो एकल कोशिका निलंबन के उचित लाल रक्त कोशिका लिसिस का उपयोग किया जाना चाहिए। चुंबकीय मनका अलगाव के लिए, कॉलम में किसी भी हवा के बुलबुले की शुरूआत को रोकने के लिए बफर का degassing आवश्यक है। चुंबकीय मनका कोशिका अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले कॉलम को विभिन्न चुंबकीय मनका-संयुग्मित कोशिकाओं के बीच पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, सीडी45+ कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक नए कॉलम का उपयोग किया जाना चाहिए, जिसे सीडी 45+ कोशिकाओं के एल्यूशन के बाद छोड़ दिया जाना चाहिए, फिर सीडी 31+ सेल अलगाव के लिए एक और नया। हमारे हाथों में, हमने अलग/हल किए गए फाइब्रोब्लास्ट में पेरिसाइट्स का संदूषण नहीं देखा है । हालांकि, MEFSK4 को पेरिसाइट्स22को पहचानने के लिए दिखाया गया है । इसलिए एकल कोशिकाओं से पेरिसाइट्स (एएन2) को सुलझाने/चुंबकीय रूप से कम करने के लिए एक अतिरिक्त कदम का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है । हालांकि इस प्रोटोकॉल 12 सप्ताह पुराने चूहों में मान्य है, तकनीक छोटे या पुराने चूहों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक αSMA-GFP चूहों के लिए डॉ इवो कलाजिक का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के राष्ट्रीय आयुर्विज्ञान संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या R01GM118300 (एसएस), राष्ट्रीय जैव चिकित्सा इमेजिंग और एनआईएच के बायोइंजीनियरिंग संस्थान के तहत समर्थन दिया गया था । पुरस्कार संख्या R21EB019509 (P.P.Y.) के तहत, और पुरस्कार संख्या 17SDG33630187 (एसएस) के तहत अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के वैज्ञानिक विकास अनुदान । फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण VUMC फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन में किए गए थे जो वेंडरबिल्ट इंगराम कैंसर सेंटर (P30 CA68485) और वेंडरबिल्ट पाचन रोग अनुसंधान केंद्र (DK058404) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) Sigma Aldrich A9528
Bovine Serium Albumin (BSA) Sigma 9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES Life technologies 11330057
Dnase I(20U/mL) BioRad 7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ Gibco 13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-023-CV
1M HEPES Corning 25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder Sigma K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) Invivogen ant-mpp
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer Miltenyi 130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) Molecular Probes A1310 dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC BD Bioscience 559864 dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE BD Bioscience 553373 dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31 BD Biosciences 553370 dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45 BD Biosciences 553076 dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1 MD Bioproducts 203002 dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) Tonbo Biosciences 13-0870 dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029 dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3 Southern Biotech 4050-02 dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC Jackson Immunoresearch Laboratories 711-165-152 dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647 Thermo-Fisher A21247 dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin Santa Cruz SC67233 dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin Sigma Aldrich V2258 dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA) Sigma Aldrich A2547 dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1) Millipore 07-2274 07-2274 dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-052-301
CD31 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) Miltenyi Biotec 130-102-900 dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads Miltenyi Biotec 130-090-855
Rat IgG-APC Miltenyi Biotec 130-103-034 dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405 Abcam ab175670 dilution = 1:100
anti-AN2/NG2 Miltenyi Biotec 130-097-455 dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter Thermo Scientific 723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish Corning 430167
10 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11E
40 µm Cell Strainer Fisherbrand 22363547
5 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11D
50 mL Conical Tube Falcon 352070
6-well Plate Corning 3506
Flow Cytometry Tubes Falcon 352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade PAL 62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit Qaigen 74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit Ambion AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit BioRad 1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) BD Biosciences

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References

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Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., Saraswati, S. Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts. J. Vis. Exp. (157), e60909, doi:10.3791/60909 (2020).

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