Summary
섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.
Abstract
상해에 응하여 심장 섬유증은 상처 치유에 생리적인 반응입니다. 섬유증을 완화하는 섬유아세포 아류형을 연구하고 표적으로 하기 위한 노력이 이루어졌다. 그러나, 섬유아세포 연구는 활성화된 섬유아세포뿐만 아니라 정지를 확인하기 위해 보편적으로 허용되는 섬유아세포 마커의 부족으로 인해 방해받고 있다. 섬유아세포는 이질적인 세포 집단으로, 분리하고 특성화하기 가 어렵습니다. 제시된 프로토콜은 부상과 부상당한 마우스 하트에서 섬유 아세포와 근섬유 아세포를 풍부하게하는 세 가지 방법을 설명합니다. 섬유아세포를 분리하기 위해 표준적이고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 사용하면 항상성 및 섬유변조에서의 역할에 대한 연구가 가능해질 것입니다.
Introduction
심장 섬유 아세포, 중간 엽 기원의 세포는 항상성 동안 심장 아키텍처의 유지 보수 이외에 심장의 전기 전도 및 기계적 힘을 유지하는 데 중요한 역할을합니다1. 상해 다음, 이 세포는 활성화, 확장, 세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질을 생산2. 많은 전임상 연구는 부상당한 심혼의 구조적 무결성을 유지하는 중요한3 세포 조절제로서 섬유아세포를 밝혀3 뿐만 아니라 ECM 단백질의 확인되지 않은 생산 및 침착을 담당하는 주요 이펙터 세포, 뻣뻣한 흉터 형성 및 심부전의 결과로4. 섬유아세포는 세포의 이질적인 그룹으로, 프로 섬유성 부적응 특성으로부터 회복 기능을 해부하는 것이 어렵습니다. 최근, 심근 손상 에 따른 두 개의 뚜렷한 섬유아세포 아형의 기능적 이질성이 정의되어, 상이한 섬유아세포 아형을 분리하고 상처 치유에서 그들의 역할을 연구할 가능성을 나타낸다5.
순수한 섬유아세포 집단을 얻는 것은 수리및 섬유증에 있는 그들의 기능적인 역할을 delineating에서 결정적입니다. 그러나, 다른 세포 모형을 인식하는 다중 섬유아세포 마커의 존재는 실질적으로 순수한 섬유아세포 인구를 격리하는 것을 도전하게합니다 6. 몇몇 우아한 연구 결과는 부상과 부상당한 심근에서 심장 섬유아세포를 격리하는 영리한 쪽을 고안했습니다. 섬유아세포 농축의 가장 대중적이고 잘 확립된 방법은 효소 조직 소화7에따른 선택적 접착을 통해서이다.
부가적으로, 세포 표면 항원을 기초로 한 섬유아세포의 형광 활성화 세포 선별(FACS)은8에성공적으로 기술되었다. 연구에서, 효소 소화 에 이어, 중간 엽 세포는 계보 음성으로 분류되었다 (린 : Ter119-CD45-CD31-) 및 gp38 양성 (gp38+) 마우스 하트에서. Gp38+ve 세포는 col1α1 및 기타 중간엽 마커의 그들의 공동 발현에 기초하여 섬유아세포로 확인되었다. 대부분의 조직 소화는 페트리 접시에서 심실을 해부한 후에 완료되지만, 최근 연구는 섬유아세포9를포함하는 근세포 및 비근세포등을 분리하기 위해 좌심실의 직접 바늘 효소 관류의 사용을 조사하였다. 섬유아세포는 이 경우 선택적 부착에 의해 분리되었다.
이 프로토콜은 세 가지 방법을 사용하여 섬유아세포의 격리 및 농축을 설명합니다. 첫 번째는 효소 소화 다음 섬유 아세포의 선택적 접착을 포함 하는 이미 설립 된 방법. 두 번째 방법은 주로 근섬유 아세포를 발현하는 상해 유발 알파 평활근을 분리하는 데 사용된다. 세 번째 방법은 조혈 및 내피 세포의 효소 소화 심장 세포 현탁액의 순차적 자기 고갈을 포함한다. 고갈 다음, 섬유아세포/근섬유아세포는 자기 구슬을 사용하여 항원 MEFSK4의 존재에 기초하여 단리된다. 최근, MEFSK4는 활성화된 섬유아세포뿐만 아니라 정지에 존재하는 항원으로서 기술되어 섬유아세포 식별 및 격리에 적합한 마커가 되고 있다. 당연히 여기에 설명된 모든 방법에는 고유한 제한이 있습니다. 따라서 유량 분석, 면역 염색 및 반정량 적 실시간 PCR에 의해 단리된 세포 집단의 순도를 확인하는 것이 좋습니다. 그러나, 이러한 방법론은 에 확장 될 수 있고, 추가 마커는 중요한 실험을 위한 섬유아세포 및 myofibroblast 인구를 이용하기 전에 그밖 오염인구를 제외하기 위하여 추가될 수 있습니다.
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Protocol
이 연구는 엄격하게 건강의 국립 연구소의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 지지합니다. 밴더빌트 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회는 프로토콜을 승인 (프로토콜 번호: M1600076-01).
1. 심장 해부
- 솔루션 준비
- KHB 버퍼
- 교반 바를 사용하여, 900 mL의 DDI 물에 크렙스-헨셀리트 완충제(KHB) 분말 9.4 g을 천천히 용해시다.
참고: 버퍼는 너무 빨리 또는 너무 오래 교반하면 침전됩니다. KHB 완충제는 섬유아세포 분리 시 차가워야 합니다. - 추가 2.9 mM CaCl2 및 24 mM NaHCO3. pH를 7.2-7.3으로 조정하고 dH2O로 1L의 부피로 희석합니다.
- 멸균 필터(0.22 μm)를 사용하여 4°C에서 최대 4주 동안 보관하십시오. 얼음이나 4°C에서 분리된 상태로 보관하십시오.
- 교반 바를 사용하여, 900 mL의 DDI 물에 크렙스-헨셀리트 완충제(KHB) 분말 9.4 g을 천천히 용해시다.
- 콜라게나아제 소화 칵테일
- 섬유아세포 분리의 날 소화 칵테일을 준비하십시오. 마음의 수에 따라 소화 칵테일의 적절한 볼륨을 결정; 1 심부 당 칵테일 5 mL.
- 콜라게나아제 블렌드(재료 표참조)와 DNase I을 제조업체의 지시에 따라 준비하십시오.
- 총 소화 칵테일 20 mL의 경우 DNase I 17.5 μL, 1 M HEPES 180 μL, 500 μL의 콜라게나아제를 빈 50 mL 원추형 튜브에 추가하십시오.
- Ca2+ 및 Mg2+와 함께 행크의 균형 소금 용액(HBSS)을 충분히 첨가하여 총 부피를 20mL로 얻을 수 있습니다.
- 적혈구 (RBC) 라기 완충제
- 하트 수(5mL/heart)를 기준으로 필요한 총 부피를 결정합니다. dH2O를 사용하여 10x RBC 용해 스톡 버퍼를 1x로 희석합니다.
- 섬유 아세포 매체 : DMEM F-12에서 10 % FBS
- L-글루타민과 HEPES를 사용하여 DMEM-F12에 10% FBS를 추가합니다. 10 U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2.5 μg/mL 항진균제, 2.5 μg/mL 마이코플라즈마 예방을 추가합니다(재료 표참조). 4 °C에서 보관하십시오.
- KHB 버퍼
- 심장 해부
- 해부 하는 동안 마음을 저장 하는 잘 당 차가운 KHB의 2 mL얼음에 6 잘 접시를 준비 합니다. 오토클레이브 수술 가위와 집게를 활용합니다.
- 이소플루란 과다 복용에 의해 생쥐를 12주 이상 안락사시키고, 자궁경부 탈구를 따른다.
- 대안적으로, 활성화된 섬유아세포 분리를 위해, 관상동맥 결찰에 의해 12주령 마우스에서 심근경색을 유도한다10. 마우스를 안락사 8-10 부상 후 일.
- 70% 에탄올과 방향을 가진 몸을 분무하여 복부 측이 실험자와 마주보고 있습니다. 간섭을 방지하기 위해 부속물을 고정하거나 억제합니다.
- 복부 피부와 근육을 잘라 하지만 간 관통 하지 마십시오. 흉골쪽으로 수직으로 자르고 심장의 피어싱을 피하면서 흉부를 조심스럽게 엽니다. 심장을 노출하기 위해 흉곽을 통해 절단 계속.
- 집게를 사용하여 가슴에서 심장을 부드럽게 들어 올려 심장 외부에 부착 된 폐 또는 과잉 조직을 제거하십시오. 심실을 제거하고 차가운 KHB가있는 6 웰 플레이트 중 하나에 놓습니다. 모든 샘플이 분리 될 때까지 이 방법으로 마음을 해부하십시오.
- 심장의 효소 해리
- 집게를 사용하여, 반복적으로 짜내고 과잉 혈액을 제거하기 위해 KHB에 있는 심혼을 교반합니다. 깨끗한 멸균 10cm2 접시에 심장을 전송합니다. 하나의 에지 블레이드를 사용하여 심장을 작은 조각으로 빠르게 잘라내보며.
- 콜라게나아제 소화 칵테일 1mL를 넣고 1mL 마이크로파이펫으로 옮길 수 있을 만큼 작을 때까지 계속 다듬습니다. 1 mL 마이크로 파이펫으로 50 mL 원엽 튜브로 조각을 옮김. 콜라게나아제 소화 칵테일 2 mL로 2x 세척 접시.
참고: 파이펫 팁의 일부를 잘라내면 파이펫 팁에 끼어있을 수 있는 더 큰 심장 조각을 수집하는 데 도움이 될 수 있습니다. - 37°C에서 원원관을 30분 동안 흔들거나 교반하여 배양합니다. 필요에 따라 튜브를 고정하십시오. 내용이 균일해질 때까지 5 mL 파이펫으로 10x를 다시 중단하고, 회전 또는 교반으로 15분 동안 37°C에서 원유 튜브를 배양합니다.
- 균일할 때까지 10mL 파이펫으로 10x를 다시 일시 중단합니다. 새로운 50 mL 원엽 튜브 위에 KHB 완충제 의 1-2 mL로 필터를 적시시킴으로써 40 μm 세포 스트레이너를 프라임. 25 mL의 KHB 버퍼를 분해 현탁액에 넣고, 40 μm 세포 스트레이너를 통해 재중단하고, 걸링합니다. 필요에 따라 필터를 변경합니다.
참고: 여과속도가 느려짐에 따라 튜브를 가볍게 두드리거나 1mL 마이크로파이펫을 사용하여 필터 밑면에서 현탁액을 그릴 수 있으며 셀 서스펜션이 부분적으로 차단된 40 μm 셀 스트레이너를 통과하는 데 도움이 될 수 있습니다. - 400 x g 및 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리. 상급체를 제거하고 1 x RBC 용해 완충액 (5 mL / 심장)에서 펠릿을 다시 놓습니다. 실온(RT)에서 2분 동안 배양합니다.
- 400 x g및 RT에서 10 분 동안 원심 분리. 상급제를 제거한 다음 KHB 버퍼 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 씻어 내십시오.
- KHB 버퍼 9 mL을 추가하고 새로운 50 mL 원엽 튜브에 프라이밍 40 μm 세포 스트레이너를 통해 필터. 400 x g의 원심분리기와 RT를 10분 동안.
- 상판체를 제거하고, 섬유아세포 또는 PBS의 1 mL에서 재중단하고, 세포 수를 결정한다. 섬유아세포는 아래에 기재된 3가지 다른 방법에 의해 단리될 수 있다.
2. 단세포 현탁액에서 섬유아세포의 분리
- 섬유 아세포 절연 : 차동 도금(그림 1)
- 웰 당 2 mL의 섬유 아세포 매체를 추가하고 잘 바닥을 덮도록 플레이트를 소용돌이쳐 6 웰 플레이트를 준비합니다.
- 심장 당 1 mL의 미디어에서 세포를 다시 중단하십시오. 플레이트 1 mL의 세포 현탁액은 1심(이론적으로) 웰당 도금되도록 한다. 예를 들어, 6개의 하트는 6mL의 매질로 다시 매달린 다음, 웰당 1mL의 셀 서스펜션으로 6개의 웰로 도금됩니다.
- 소용돌이 판은 세포를 고르게 분배합니다. 웰당 최대 5 mL의 총 부피에 대해 웰당 1-2 mL 용지를 추가하고 4 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 섬유아세포는 4시간 후에 선택적 접착에 의해 분리될 것이다. PBS의 2 mL로 부착 된 세포를 세척하고 잘 당 2-4 mL 멸균 섬유 아세포를 추가합니다. 37°C에서 부유할 때까지 배양합니다. 2~4일마다 미디어를 변경합니다.
- 섬유아세포 격리: GFP 리포터 마우스 모델을 사용하는 FACS(그림 1)
- FACS 버퍼
- Ca2+ 및 Mg2+없이 dPBS에 5% 태아 소 혈청 (FBS)의 15 mL을 준비하십시오. 얼음이나 4°C에서 보관하십시오.
- FC 차단솔루션
- FACS 25 μL(1:50 희석)에서 0.5 μL FC 차단제(정제된 마우스 CD16/CD32)를 준비합니다. 시료당 FC 차단제 용액의 25 μL이 필요합니다. 얼음이나 4°C에서 보관하십시오.
- 시료 전처리 및 항체 염색
참고: 항체 희석은 미리 준비할 수 있지만 빛이나 온도 노출의 위험이 있습니다.- FACS 버퍼에서 필요한 희석의 2배인 7AAD 또는 고스트 염료 바이올렛(510)을 준비한다. 항체 및 희석은 표 1을 참조하십시오.
- FC 차단제 용액의 25 μL에서 500,000개의 갓 단리된 세포를 재중단하여 FC 항체 영역과 FC 수용체의 비특이적 결합을 방지한다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 7AAD 또는 고스트 염료 바이올렛 510 항체를 세포 현탁액의 최종 부피에 25 μL를 첨가합니다. 어둠 속에서 얼음에 30-60 분 동안 배양.
- FACS 버퍼의 1 mL로 다시 일시 중단 하 여 세척 하십시오. 500 x g의 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안.
- FACS 버퍼 (300 μL)의 권장 유량 세포 분석 샘플 부피에 펠릿을 다시 중단하고 유세포 분석 튜브로 옮김.
- 형광 활성화 세포 선별 (FACS)
참고: GFP-αSMA 기자 마우스는 이보 칼라지크 박사11의기여였다. 이 마우스는 알파 평활근 세포(αSMA) 프로모터 하에서 GFP를 발현한다. αSMA는 활성화된 섬유아세포(myofibroblasts)의 마커로서 사용되어왔다(12).- 활성화된 섬유아세포(αSMA 발현 myofibroblast)의 분리를 위해, 관상 동맥 결찰에 의해 12주 된 GFP-αSMA 마우스에서 심근 경색을 유도한다. 부상 후 8-10 일 마우스를 희생.
- 부상당한 마우스 심장으로부터 단세포 현탁액에 이어, 녹색 형광 단백질(GFP)을 위한αSMA+ve 섬유아세포를 정렬한다. 얼룩지지 않은 섬유아세포를 사용하여 GFP 채널 사후 보상의 배경 신호를 설정합니다.
- 살아있는GFP+ve 세포에 대한 게이트는 7AAD-ve/GFP+ve 세포 또는 고스트 염료 바이올렛 510-ve/GFP+ve 세포 및 αSMA+ve 근섬유아세포를 발현하는 GFP를 정렬하여.-ve-ve+ve 섬유아세포 매체에 세포를 수집합니다.
- FACS 버퍼
- 섬유 아세포 분리 : 섬유 아세포의 자기 비드 기반 절연(그림 1)
- 평형 버퍼
참고: 항상 격리를 위해 새 버퍼를 준비합니다.- PBS에서 0.5 % BSA 및 2 mM EDTA를 준비하십시오. 용기의 뚜껑에 진공을 부착하면서 용액을 교반하여 완충액을 탈기한다.
참고: 교반하면 용액에서 과도한 가스가 제거된 다음 진공을 통해 제거되어 기포가 사용 시 분리 열을 막지 않습니다.
- PBS에서 0.5 % BSA 및 2 mM EDTA를 준비하십시오. 용기의 뚜껑에 진공을 부착하면서 용액을 교반하여 완충액을 탈기한다.
- 자기 라벨링: CD45+ 조혈 세포
- 원심분리기는 500 x g에서 마우스 하트로부터 5분 동안 세포를 분리한 다음 상위를 제거한다.
- 평형 버퍼의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 상기와 같이 세포 현탁액을 원심분리하고 1 x 107총 세포당 90 μL 평형 완충액에서 세포 펠릿을 재중단한다. 총 셀 1x 10 x 10당 CD45+ 자기 비드 10 μL을 추가합니다. 잘 섞어서 4°C에서 적어도 15분 동안 배양합니다.
- 1 x 107 총 세포 당 2 mL 평형 버퍼를 추가하여 세포를 세척한 다음 4 °C에서 10 분 동안 500 x g에서 원심 분리기를 합니다.
- 상층을 제거하고 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고 평형 버퍼2 mL에서 최대 1 x 107 개의 총 세포를 다시 일시 중단하십시오. 10개 이상의7개 셀이 있는 경우 버퍼를 선형으로 확장합니다. 셀이 분리 컬럼 매트릭스를 막히는 것을 방지하기 위해 40 μm 필터를 통과합니다.
- 자기 분리 : CD45+ 조혈 세포
- 적절한 분리기의 자기장에 분리 컬럼을 배치하고 PBS의 3 mL 이상을 가진 평형 컬럼.
- 유관통(FT)에서 라벨이 지정되지 않은 셀을 수집하고 3 mL의 평형 버퍼로 컬럼을 3x 세척합니다. FT로 워시마를 수집합니다. 15mL 원엽 튜브에 컬럼을 놓습니다.
- 자기 라벨이 붙은 CD45+ 셀을 열에 5 mL의 평형 버퍼를 파이펫팅하고 컬럼과 함께 제공되는 플런저로 셀을 단단히 떨어 뜨게합니다.
- 원심 분리기 용리액뿐만 아니라 500 x g의FT / 세척 분획 . 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 자기 라벨링 및 분리: CD31+ 내피 세포
- CD45+ 자기 라벨링 및 분리 (섹션 2.3.2-2.3.3)에 대한 반복 프로토콜, CD31+ 자기 구슬을 사용하여 FT와 배양하고 CD45+ 절연에서 세척 부분을 제외하고.
- 자기 라벨링 및 분리: MEFSK4+ 섬유아세포
- 자기 비드 대신 MEFSK4 안티 피더-APC 항체를 사용하여 CD45+ 자기 라벨링에 대한 반복 프로토콜. CD31 + 500 × g에서 + 5 분 동안 격리된 FT 및 세척 부분을 원심 분리한 다음 상급을 제거하십시오. 1 mL의 평형 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
- MEFSK4 안티피더-APC 항체를 1 x 107 세포당 10 μL을 첨가합니다. 4°C에서 적어도 15분 동안 배양한다.
- MEFSK4 항체 결합 세포를 1 x 107 총 세포당 5 mL의 평형 버퍼를 추가한 다음 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기를 세척하십시오.
- MEFSK4 안티 피더-APC 항체를 동일한 부피를 사용하여 상류를 제거하고 안티-APC 비드에서 다시 중단합니다. 4 °C에서 15 분 동안 얼음에 배양하십시오.
- 500 x g에서 10 분 동안 원심 분리. 상판을 제거하고 1 x 107 총 셀 당 2 mL의 평형 버퍼에서 다시 중단하고 앞에서 설명한 대로 자기 분리를 진행합니다 (섹션 2.3.3). 자기로 분리된 MEFSK4+ve/CD45-ve/CD31-ve 섬유아세포는 순도 분석 및 기타 다운스트림 애플리케이션에 사용될 수 있습니다.
- 평형 버퍼
3. 고립 된 섬유 아세포 인구의 순도와 기능 분석
- FACS 인구 순도 분석: αSMA-GFP 세포 분석(그림 2)
- 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 Fc 차단제 용액의 25 μL에서 갓 단리된 세포를 재중단한다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 선택 사항: 셀 서스펜션에 7AAD 또는 고스트 염료 바이올렛 510의 25 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 얼음에 30-60 분 동안 배양.
- FACS 버퍼의 1 mL로 다시 일시 중단 하 여 세척 하십시오. 500 x g의 원심분리기5분.
- FACS 버퍼의 50 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. CD31-PE, CD45-APC 및 AN2/NG2 항체를 세포 현탁액에 직접 추가합니다. 얼음에 15 분 동안 배양(표 1).
- 1 mL FACS 버퍼로 다시 일시 중단하여 세척하십시오. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 당나귀 항래트 알렉사플루오르 405 이차 항체를 비공액 1차 항체로 표지된 세포에 첨가한다. 얼음에 30 분 동안 배양.
- FACS 버퍼의 1 mL로 다시 일시 중단 하 여 세척 하십시오. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- FACS 버퍼(300 μL)의 권장 유량 세포분석 샘플 부피에 펠릿을 다시 일시 중단하고 유량 분석을 위해 표지된 유량 세포분석 튜브로 옮김을 전달합니다.
참고: 단리섬유아세포상에서 MEFSK4 항원의 발현을 특성화하는 FACS 분석은 섹션 3.3에 기재되어 있다.
- 섬유아세포 순도 분석: 면역형광(그림 3A)
- 종자 30,000 원발 섬유아세포(P0-P1)는 24개의 웰 플레이트 및 배양물에 배치된 커버슬립에 웰당 80% 동조할 때까지. 또는 400 x × g에서 사이토 스핀에 의해 커버 슬립에 CD45+ 및 CD31+ 세포 (잘 당 30,000 셀)를 농축하십시오 (세포를 24 웰 플레이트의 커버 슬립에 직접 균일하게 증착하는 데 사용되는 방법).
- 차가운 아세톤으로 세포를 15분 동안 고정합니다.
- 10% 염소 세럼에 슬라이드를 차단합니다. 하룻밤 1 차 항체와 배양 슬라이드(표 2).
- PBS에서 슬라이드를 3x 세척합니다. 2 시간 동안 이차 항체를 배양(표 2).
- 슬라이드를 방지하고, 디페이즈 장착 용지에 DAPI 한 방울로 장착합니다.
- FACS 인구 순도 분석: MEFSK4 프로빙(그림 3B)
- FC 차단제 용액의 25 μL에서 새로 단리된 세포를 재중단하여 항체의 비특이적 결합을 방지한다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 선택 사항: 셀 서스펜션에 7AAD 또는 고스트 염료 바이올렛 510의 25 μL을 추가합니다. 어둠 속에서 얼음에 30-60 분 동안 배양.
- FACS 버퍼의 1 mL로 다시 일시 중단 하 여 세척 하십시오. 500 x g의 원심분리기5분.
- FACS 버퍼의 50 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. MEFSK4 항체를 세포 현탁액에 직접 추가합니다. 얼음에 15 분 동안 인큐베이션 (표 1).
- FACS 버퍼의 1 mL로 다시 일시 중단 하 여 세척 하십시오. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- 쥐 IgG-APC를 세포에 추가합니다(표1). 얼음에 30 분 동안 배양.
- FACS 버퍼의 1 mL로 다시 일시 중단 하 여 세척 하십시오. 400 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.
- FACS 버퍼(300 μL)의 권장 유량 세포 분석 샘플 부피에 펠릿을 다시 일시 중단하고 유량 분석을 위해 유세포 분석 튜브로 옮김을 전달합니다.
- 섬유아세포 순도 분석: 반정량 실시간 rtPCR(그림 3C)
- RNA 절연 및 반정적 실시간 PCR
- 섬유아세포의 농축에 이어, RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 분리하였다(물질표참조). 제조업체의 지침을 따르십시오.
- cDNA 합성 키트(재료 표참조)를 사용하여 첫 번째 가닥 DNA 합성을 완료하십시오.
- 반정적 실시간 PCR5를수행합니다.
- 섬유아세포 기능 분석: 콜라겐 겔 수축성 분석(그림 4)
- 콜라겐 용액
- DMEM에서 20 mM HEPES 및 44 mM NaHCO3을 준비하십시오. HEPES 및 NaHCO3와함께 DMEM 1 mL 당 1 형 1 래트 콜라겐 1.67 mg을 추가하십시오.
- TGFβ 보충 DMEM
- 항생제와 항진균제로 보충된 DMEM에서 10% FBS를 준비하십시오. TGFβ를 최종 농도 1 ng/mL에 추가합니다.
- 세포/콜라겐 혼합물 및 도금
- 셀 서스펜션(P3-P5)을 준비하고 3.3 x 105 셀을 얻기 위해 필요한 부피를 결정합니다.
- 3.3 x 105 셀로 서스펜션 볼륨을 충분한 콜라겐 용액에 추가하여 총 부피를 1mL로 얻을 수 있습니다.
참고: 쥐 콜라겐 타입 1 농도는 이제 1.5 mg/mL이 되어야 합니다. - 48 개의 웰 플레이트에서, 잘 당 세포 콜라겐 믹스의 씨앗 300 μL (~1 x 105 세포 / 웰). 겔화될 때까지 15-20분 동안 37°C에서 배양합니다.
- 30G 바늘을 사용하여 젤을 우물 벽에서 분리하십시오. TGFβ 및 FBS 보충제 DMEM을 각각 잘 600 μL더합니다. 24 시간 및 48 h의 반사 스캐너의 이미지 플레이트.
참고: 모든 면역형광 실험은 3개의 레이저(405 nm, 488 nm 및 640 nm)를 갖춘 유세포분석 기계에서 수행되었다. 데이터는 흐름 데이터 획득소프트웨어(자료표)를사용하여 획득되었습니다. 추가 데이터 분석은 유동 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 알렉사플루어 405및 고스트 염료 바이올렛 510은 405 nm 레이저로 흥분하고 각각 450/50 BP 및 525/50 BP 필터를 사용하여 수집되었다. GFP 및 PE는 488 nm 레이저에 의해 흥분되었고 각각 530/30 BP 및 575/26 BP 필터를 사용하여 수집되었다. APC 또는 AlexaFluor 647은 640 nm 레이저에 의해 흥분되었고 670/14 BP 필터를 사용하여 수집되었다. 모든 세포 선별 실험은 4개의 레이저(405Table of Materialsnm, 488 nm, 561 nm 및 640 nm)를 갖춘 유세포분석기(재료표)에서 수행하였다. 7-AAD는 561 nm 레이저를 사용하여 흥분시키고 670/14 BP 필터로 수집했다. GFP 및 고스트 염료 바이올렛 510은 전술한 바와 동일한 레이저/필터 조합을 사용하여 수집되었다. 모든 선별 실험은 표적 세포의 다운스트림 생존가능성을 높이기 위해 17psi 압력 구성을 가진 100 um 노즐을 활용하였다.
- 콜라겐 용액
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Representative Results
αSMA-GFP 리포터 마우스를 사용하여 근섬유아세포 격리를 입증하는 유동 게이팅 방식
αSMA-GFP 리포터 마우스 모델에서 부상당한 하트는 검출 가능한GFP+ 세포를 나타내지 않았다; 따라서, 이들은 GFP 채널 사후 보상의 배경 신호에 대한 게이트를 확립하는 데사용되었다(그림 2). αSMA+ 세포는 MI 다음 10일 후 부상당한 좌심실으로부터의 GFP 발현의 존재에 기초하여 분류되었다. 내피의 작은 비율 (GFP +/CD31+ 세포; SD = 3.8% ± 0.0164; n = 5) 및 조혈 (GFP +/CD45+ 세포; SD = 3.18% ± 0.0112; n = 5) 세포는 또한 부상당한 αSMA-GFP 마우스 하트에서 GFP를 발현하였다(도2A). 그러나, GFP+/CD31-/CD45-세포는 AN2, pericyte 마커를 발현하지 않았다.
미마모(정지) 및 부상(활성화, αSMA+GFP+) 세포 발현 섬유아세포 마커
αSMA-GFP 마우스로부터 분리된 GFP+ 세포는 IF 분석에 의해 분석될 때 αSMA, 콜라겐 타입 1 알파-1 사슬(COL1α1), 비멘틴 및 골막신을 발현하였다. 선택적 부착에 의해 단리된 비멘틴은 비멘틴을 발현하지만 활성화된 섬유아세포 마커의 발현을 나타내지 않았다: αSMA, 골막, 및 COL1α1(도 3A). 손상되지 않은 섬유아세포와 활성화된 섬유아세포 모두 유동 분석에 의해 분석될 때 MEFSK4 항원을 발현하였다(도3B). 부상되지 않은 마우스 심장으로부터 자기적으로 단리된 MEFSK4+ve 세포는 섬유아세포의 마커를 발현하였다: Col1a1, pdgfrα, 및 골막신. 대조적으로, 자기 단리된 CD45 및 CD31 양성 세포는 섬유아세포 마커의 무시할 수 있는 발현을 가졌다.
섬유아세포와 근섬유아세포는 콜라겐을 수축하는 능력을 입증했습니다.
강성 플라스틱에 대한 세포 배양에서, 섬유아세포는 TGFβ의 존재 에서 콜라겐 겔을 수축하는 것으로 나타났으며, 수축13,,14의기능적 능력을 입증한다. 섬유아세포의 이 시험관내 특성은 조직 수선 및 다른 생물학적 과정 동안 일어나는 결합 조직 수축과 매우 유사합니다. 선택적 부착에 의해 분리된 미손상 섬유아세포와 αSMA-GFP 마우스로부터 분리되고 분류된 근섬유아세포는 모두 콜라겐을 수축하는 능력을 입증하였다(그림4).
그림 1: 세 가지 다른 접근법을 사용하여 섬유아세포 분리의 회로도. (A)차동 도금,(B)GFP+ 세포 분류αSMA 양성 세포, 및(C)섬유아세포의 자기 비드 계 분리. 배양시 세포의 대표적인 밝은 필드는 차동 도금에 이어. 배율 표시줄 = 50 μM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: MI다음에 αSMA-GFP 마우스 심장으로부터 단리된 단일 세포의 FACS 분석. (a)αSMA-GFP 마우스로부터 CD31, CD45 또는 AN2를 공동 발현하는 GFP+ 세포를 시술하는 대표적인 FACS 게이팅 방식은 심근경색(MI) 10일 후 심장을 다쳤다. (B)MI 후 하트에 대해 제시된 FACS 데이터의 그래픽 정량화; n = 5개의 실험을 독립적으로 수행하였다(*p&0.0001 은 Tukey의 다중 비교 시험과 단방향 ANOVA를 사용하여 계산하였다). 이 그림은 사라스와티 외10에서적응 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 부상을 입지 않고 부상을 입은 마우스 심장으로부터 분리된 섬유아세포의 순도 분석. (a)FACS에 의해 분류된 부상, 또는 부상당한 αSMA-GFP 마우스로부터 세포 집단(P0)의 면역형광 염색. 다부상 및 활성화된 세포는 COL1α1 및 비멘틴과 같은 섬유아세포(FB) 마커를 발현하지만, 조혈 마커 CD45 또는 내피 마커 CD31은 아니다. 부상당한 αSMA-GFP 마우스 심장으로부터 분리된 세포는 활성화된 섬유아세포 마커, αSMA 및 periostin을 발현하였고, 이는 미비한 마우스 심장으로부터 분리된 세포에 존재하지 않았다. 핵을 DAPI로 염색하였고, n=3실험을 독립적으로 수행하였다. 스케일 바 = 100 μm.(B)대표적인 FACS는 미공아아세포 및 활성화된 섬유아세포(P3-P5)의 히스토그램을 오버레이하여 섬유아세포 마커 MEF-SK4의 발현을 나타낸다. 음성 대조를 위해, 랫트 IgG를 사용하였고, n=2 실험을 독립적으로 수행하였다. (C) Col1α1, Pdgfrα및 포스트n 전사체의 상대적 배 변화는 부상을 입지 않은 MEKSK4+ve 섬유아세포에서, n=3개의 실험을 독립적으로 수행하였다(*p< 0.05 Tukey의 다중 비교 시험과 양방향 ANOVA를 사용하여 계산된 바와 같이). (A) 및 (B) 사라스와티 외10에서적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 부상을 입지 않고 부상당한 마우스 하트로부터 분리된 섬유아세포의 기능적 특성. 부상 및 부상 활성화 αSMA+ 섬유 아세포의 존재에서 콜라겐 겔 수축의 대표적인 모습 (P3-P5). 그래프는 부상되지 않고 부상당한 활성 αSMA+ 섬유아세포로 배양되었을 때 24 시간 및 48 h의 수축 후 초기 겔 영역에서의 백분율 변화를 나타내며, n = 2 실험을 독립적으로 수행하였다. 이 그림은 사라스와티 외10에서적응 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항 체 | 셀 대상 | 희석 |
| 7AAD | 죽은 세포 | 1:1000 |
| 유령 염료 바이올렛 510 | 죽은 세포 | 1:1000 |
| APC-CD45 | 조혈 세포 | 1:200 |
| PE-CD31 | 내피 세포 | 1:200 |
| 안티 AN2 / NG2 | Pericytes | 1:11 |
| 당나귀 안티 쥐 알렉사 플루오르 405 | 이차 항체 | 1:100 |
| 안티 피더 셀 -APC (MEFSK4) | Fibroblasts | 1:100 |
| 쥐 IgG-APC | 아이소타입 제어 | 1:100 |
표 1: FACS 염료 및 항체.
| 1 차 항체 | 희석 | |
| α-평활근 액틴(αSMA) | 1:1000 | |
| 섬유 아세포 특정 단백질 1 (FSP1)1:250 | 1:100 | |
| COL 1α1 | 1:1000 | |
| 페리오스티인 | 1:100 | |
| 비멘틴 (주) | 1:200 | |
| CD31 | 1:250 | |
| CD45 | 1:250 | |
| 이차 항체 | 희석 | |
| 염소 안티 마우스 알렉사 플루어 488 | 1:200 | |
| 염소 안티 토끼 FITC | 1:200 | |
| 염소 안티 토끼 Cy3 | 1:200 | |
| 염소 안티 쥐 알렉사 플루어 488 | 1:200 | |
| 염소 안티 쥐 알렉사 플루어 647 | 1:200 | |
표 2: 면역형광 1차 및 이차 항체.
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Discussion
섬유아세포는 다양한 마커 세트로 확인된 이종 세포 그룹입니다. 섬유아세포를 식별하는 데 사용된 단백질 마커는 디스코이딘 도메인 수용체 2(DDR2), 피브로넥틴, 비멘틴, 콜라겐 I 및 III, 및 Thy115,,16,,17,,18,,19,,20이다. 비멘틴은 손상되지 않은 정지성 심장 섬유아세포, 섬유아세포 특이적 단백질 1, αSMA 및 페리오신을 식별하는 데 사용되어 왔지만, αSMA는 활성화된 섬유아세포6,,12,,21을검출하는 가장 일반적인 마커인 상해 유발 활성화 섬유아세포를 식별하는 것으로 나타났다. 또한, Tcf21 및 MEFSK4 단백질은 부상당한 마우스 하트21,,22에서발견되는 근섬유아세포뿐만 아니라 손상되지 않은 심장 조직에서 발견되는 정지성 섬유아세포 모두를 인식하는 데 서 최근 인정을 받고 있다.
이 프로토콜은 섬유아세포와 근섬유아세포를 포함한 활성화된 섬유아세포와 활성화된 섬유아세포를 분리하고 풍부하게 하기 위한 세 가지 접근법을 활용합니다. 섬유아세포의 플라스틱부착 능력은 분리를 위한 첫 번째 접근법에 사용됩니다. 해방효소로 효소 소화에 이어, 세포의 단세포 현탁액은 우선적으로 부착하기 위해 플라스틱 접시에 씨를 뿌린다. 많은 비 섬유 아세포 세포가 페트리 요리의 폴리스티렌 표면에 부착 할 수 없기 때문에 접시에서 모든 매체를 제거하고 섬유 아세포의 비교적 순수한 인구로 남을 수 있습니다. 이 기술을 사용하는 주의 사항은 섬유 아세포가 폴리스티렌 접시에 우선적으로 부착되지만 일부 오염 된 비 섬유 아세포 세포는 부착되어 비 균질한 세포 집단을 남길 수 있습니다.
두 번째 격리 기술은 FACS를 사용하여 다른 세포로부터 myofibroblasts를 발현하는 αSMA를 분리합니다. 여기에서 채택된 형질전환 마우스 모델에서, GFP는 αSMA와 함께 독점적으로 발현되므로 αSMA를 함유하는 근섬유아세포는 GFP의 형광 기능을 통해 FACS 기계에 의해 검출될 수 있다. 이 격리 절차는 우리가 대략 99% myofibroblast인 세포의 인구를 장악하는 것을 가능하게 합니다. 이 세포의 순도 분석은 사라스와티 외10에의해 광범위하게 기술되었습니다.
세 번째 절연 기술은 MEFSK4 발현 세포의 자기 비드 기반 분리에 의해 부상되지 않은 섬유 아세포를 모두 분리하는 효율적인 방법입니다. 단일 세포 현탁액이 항 CD45 및 항 CD31 자기 비드에 결합하고 자기장 효과로 인해 매트릭스에 고정되도록 함으로써, 이것은 오염되었을 수 있는 내피 세포뿐만 아니라 임의의 조혈세포의 분리를 허용하였다. 섬유 아세포 격리. MEFSK4는 최근 섬유아세포를 식별하는 신뢰할 수 있는 마커로 사용되고 있기 때문에, MEFSK4 발현 세포에 결합하는 항체를 적용할 수 있다. 자기 비드를 항체에 결합한 후, 섬유아세포의 분리를 허용하는 복합체를 생성하고, 자기 비드 세포 복합체는 자기장에서 매트릭스를 통과하고, 고도로 농축된 섬유아세포 집단이 수득된다. 단리된 섬유아세포 집단의 순도는 면역 염색, RTPCR 및 유세포 분석으로 평가되어야 한다.
다른 기술과 마찬가지로 이 원고에 설명된 기술에는 제한이 있습니다. 선택적 접착 프로토콜 및 자기 비드 계 절연의 한계는 이러한 방법이 정지 및 활성 섬유아세포 를 구별하지 않는다는 것이다. 활성화 된 섬유 아아아아아를 풍부하게하기 위해 심근 경색 후 8-10 일 동안 격리를 수행해야합니다. 또한, 다른 섬유아세포 마커와 함께 격리의 순도를 확인하는 것이 중요하다. MEFSK4 양성 섬유아세포 순도는 RTPCR에 의해서만 입증되었으며, 조혈(CD45)을 포함한 오염 세포 유형을 인식하는 다른 섬유아세포 마커 및 마커로 (면역 염색 및 유세포 분석으로) 테스트하는 것이 좋습니다. 내피 (CD31) 및 pericytes (AN2). 가능하면, 다른 섬유아세포 특이적 마커는 섬유아세포 집단을 더 분류하거나 자기적으로 격리하는 데 사용될 수 있다.
αSMA-GFP 마우스를 사용하여 근섬유아세포를 분리하고 분류하는 것은 활성화된 섬유아세포 집단을 얻는 신뢰할 수 있는 기술이다. 그러나, 조혈 및 내피 세포의 무시할 만한 백분율은 유동 분석에서 관찰되었다. 이 기술을 개선하려면 CD45+ve/CD31+ve 및 AN2+ve 셀을 GFP+ve/αSMA+ve 셀 분류에서 제외해야 합니다. αSMA는 myofibroblasts의 널리 받아들여지는 마커이기 때문에, αSMA-GFP 기자 마우스 모형은 심근 상해의 맥락에서 근섬유 아세포를 공부하기 위하여 이용되어야 하는 귀중한 공구입니다.
고려해야 할 몇 가지 중요한 문제 해결 단계가 있습니다. 세포 생존력과 수율이 영향을 받는 경우 소화 시간을 감소시킬 수 있습니다. 교반 바는 세포 생존에 영향을 미치기 때문에 소화 혼합물을 교반하는 데 사용해서는 안됩니다. 튜브는 로커 또는 흔들리는 인큐베이터에 고정되어 소화 혼합물을 부드럽게 교반해야합니다. 5 mL 또는 10 mL 파이펫으로 소화 된 조직을 10 x 다시 중단하는 것은 세포의 적절한 해리에 매우 중요합니다.
세포가 유세포 측정에 의해 분류되거나 분석될 경우 단일 세포 현탁액의 적절한 적혈구 포액을 활용해야 합니다. 자기 비드 절연의 경우, 버퍼의 탈기는 컬럼에 기포가 들어가지 않도록 하는 데 필수적입니다. 자기 비드 세포 절연에 사용되는 컬럼은 다른 자기 비드 컨쥬게이스 셀 간에 재사용해서는 안됩니다. 예를 들어, CD45+ 셀을 용출 한 후 폐기해야 하는 CD45+ 셀을 분리한 다음 CD31+ 셀 격리를 위해 새 열을 사용해야 합니다. 우리의 손에, 우리는 고립되고 분류된 섬유아세포에 있는 pericytes의 오염을 본 적이 없습니다. 그러나, MEFSK4는22를인식하는 것으로 나타났다. 따라서 단일 세포에서 PERICYTES (AN2)를 분류 / 자기 고갈하는 추가 단계를 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 12주 령 마우스에서 검증되더라도, 기술은 더 젊거나 오래된 마우스를 위해 이용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 αSMA-GFP 마우스에 대한 박사 이보 Kalajzic 감사하고 싶어. 이 간행물에 보고된 연구는 국립 보건원의 국립 의학 연구소에 의해 지원되었다 (NIH) 수상 번호 R01GM118300 (S.S.), NIH의 생물 의학 이미징 및 생명 공학의 국립 연구소 수상 번호 R21EB019509 (P.P.Y.) 및 수상 번호 17SDG33630187 (S.S.)에 따라 미국 심장 협회의 과학자 개발 보조금. 유세포 분석 분석은 밴더빌트 잉그람 암 센터(P30 CA68485)와 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터(DK058404)가 지원하는 VUMC 유동 세포분석 공유 리소스에서 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetone | |||
| Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) | Sigma Aldrich | A9528 | |
| Bovine Serium Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | |
| Calcium chloride | |||
| Citrate Buffer | |||
| Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) | Roche Applied Science | ||
| DAPI | |||
| DDI water | |||
| DI water | |||
| DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES | Life technologies | 11330057 | |
| Dnase I(20U/mL) | BioRad | 7326828 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 13190-144 | |
| 70% Ethanol | |||
| FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16000044 | |
| 10% goat serum | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-023-CV | |
| 1M HEPES | Corning | 25-060-Ci | |
| Krebs-Henseleit Buffer powder | Sigma | K3753 | |
| Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) | Invivogen | ant-mpp | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | |||
| 10x Red Blood Cell Lysis Buffer | Miltenyi | 130-094-183 | |
| Slow-fade Mounting Media | |||
| Sodium azide | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| TGFβ | |||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Type 1 Rat Collagen | |||
| Antibodies | |||
| 7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) | Molecular Probes | A1310 | dilution = 1:1000; RRID = |
| CD45-APC | BD Bioscience | 559864 | dilution = 1:200; RRID = AB_398672 |
| CD31-PE | BD Bioscience | 553373 | dilution = 1:200; RRID = AB_394819 |
| CD31 | BD Biosciences | 553370 | dilution = 1:250; RRID = AB_394816 |
| CD45 | BD Biosciences | 553076 | dilution = 1:250; RRID = AB_394606 |
| COL 1α1 | MD Bioproducts | 203002 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) | Tonbo Biosciences | 13-0870 | dilution = 1:1000; RRID = |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11029 | dilution = 1:200; RRID = AB_138404 |
| Goat anti-rabbit-Cy3 | Southern Biotech | 4050-02 | dilution = 1:200; RRID = AB_2795952 |
| Goat anti-rabbit-FITC | Jackson Immunoresearch Laboratories | 711-165-152 | dilution = 1:200; RRID = AB_2307443 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | dilution = 1:200; RRID = AB_2534074 |
| Goat anti-rat Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | A21247 | dilution = 1:200; RRID = AB_141778 |
| Periostin | Santa Cruz | SC67233 | dilution = 1:100; RRID = AB_2166650 |
| Vimentin | Sigma Aldrich | V2258 | dilution = 1:200; RRID = AB_261856 |
| α-smooth muscle actin (αSMA) | Sigma Aldrich | A2547 | dilution = 1:1000; RRID = AB_476701 |
| Fibroblast specific protein 1 (FSP1) | Millipore 07-2274 | 07-2274 | dilution = 1:100; RRID = AB_10807552 |
| CD45 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| CD31 Magnetic Beads | Miltenyi Biotec | 130-087-418 | |
| Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) | Miltenyi Biotec | 130-102-900 | dilution = 1:100; RRID = AB_2660619 |
| anti-APC Beads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Rat IgG-APC | Miltenyi Biotec | 130-103-034 | dilution = 1:100; RRID = AB_2661598 |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor405 | Abcam | ab175670 | dilution = 1:100 |
| anti-AN2/NG2 | Miltenyi Biotec | 130-097-455 | dilution = 1:11; RRID = AB_2651235 |
| Other Materials | |||
| 0.22 µm Filter | Thermo Scientific | 723-2520 | |
| 10 cm2 Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 10 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11E | |
| 40 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| 5 mL Pipet | Fisherbrand | 13-678-11D | |
| 50 mL Conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well Plate | Corning | 3506 | |
| Flow Cytometry Tubes | Falcon | 352058 | |
| Forceps | |||
| Rocker | |||
| Single Edge Blade | PAL | 62-0177 | |
| Surgical Scissors | |||
| GFP-αSMA Reporter Mice | |||
| MACS Separator Magnetic Field | |||
| MACS Separation Column | |||
| Coverslips | |||
| Qaigen Rneasy Mini Kit | Qaigen | 74104 | |
| Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit | Ambion | AM1931 | |
| BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit | BioRad | 1708891 | |
| 48-well Plate | |||
| 30G Needle | |||
| 3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) | BD Biosciences | ||
| 4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) | BD Biosciences | ||
| Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) | BD Biosciences |
References
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
- Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
- Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
- Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
- Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
- Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
- Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
- Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
- Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
- Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
- Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).
