Summary
في الأكسدة البيوكيميائية الضوئية السريعة للبروتينات (IV-FPOP) هي تقنية بصمة البروتين الجذري ة الهيدروكسيل التي تسمح برسم خرائط بنية البروتين في بيئتها الأصلية. يصف هذا البروتوكول تجميع وإعداد نظام التدفق الميكرووتوني IV-FPOP.
Abstract
الأكسدة السريعة للبروتينات (FPOP) هي طريقة للهيدروكسيل للبروتين الجذري (HRPF) تستخدم لدراسة بنية البروتين ، وتفاعلات البروتين - ligand ، والتفاعلات بين البروتين والبروتين. FPOP يستخدم ليزر excimer KrF في 248 نانومتر لتحلل بأكسيد الهيدروجين لتوليد الجذور الهيدروكسيل التي بدورها تعديل أكسدة سلاسل الجانب الأحماض الأمينية التي يمكن الوصول إليها المذيبات. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتوسيع استخدام FPOP في التسمية التأكسدية في Caenorhabditis elegans (C. elegans)، بعنوان IV-FPOP. وقد استخدمت الديدان الخيطية الشفافة كأنظمة نموذجية للعديد من الأمراض البشرية. الدراسات الهيكلية في C. elegans بواسطة IV-FPOP ممكنة بسبب قدرة الحيوان على استيعاب بيروكسيد الهيدروجين، وشفافيتها إلى التشعيع بالليزر في 248 نانومتر، والطبيعة التي لا رجعة فيها للتعديل. يتم وصف تجميع نظام تدفق microfluidic لعلامات IV-FPOP ، ومعلمات IV-FPOP ، واستخراج البروتين ، والمعلمات المحسنة LC-MS / MS هنا.
Introduction
وقد استخدمت بصمة البروتين إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS) في السنوات الأخيرة لدراسة تفاعلات البروتين والتغيرات المطابقة. الهيدروكسيل البصمة البروتين الراديكالية (HRPF) طرق التحقيق في إمكانية الوصول إلى المذيبات البروتين عن طريق تعديل سلاسل الجانب من الأحماض الأمينية البروتين. وقد استخدمت طريقة HRPF، الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة من البروتينات (FPOP)1،للتحقيق في بنية البروتين في المختبر2،في الخلية (IC-FPOP)3،ومؤخرا في الجسم الحي (IV-FPOP)4. FPOP يستخدم ليزر excimer الطول الموجي 248 نانومتر من أجل توليد بسرعة الجذور هيدروكسيل عن طريق التحلل الضوئي من بيروكسيد الهيدروجين لتشكيل الجذور هيدروكسيل1. بدوره، يمكن لهذه الجذور تسمية 19 من أصل 20 الأحماض الأمينية على مقياس زمني ميكروثانية، أسرع من البروتينات يمكن أن تتكشف. على الرغم من أن تفاعل كل حمض أميني مع الجذور الهيدروكسيل يمتد 1000 أضعاف، فمن الممكن لتطبيع الأكسدة سلسلة الجانب عن طريق حساب عامل الحماية (PF)5.
منذ FPOP يمكن تعديل البروتينات أكسدة بغض النظر عن حجمها أو تسلسل الأولية، فإنه يثبت أن تكون مفيدة لدراسات البروتين في الخلية وفي الجسم الحي. IV-FPOP تحقيقات بنية البروتين في C. elegans بالمثل في المختبر ودراسات في الخلية4. C. elegans هي جزء من عائلة النيماتودا وتستخدم على نطاق واسع كنموذج لدراسة الأمراض البشرية. قدرة الدودة على الاستفادة من بيروكسيد الهيدروجين عن طريق الانتشار السلبي والنشط على حد سواء يسمح لدراسة بنية البروتين في أنظمة الجسم المختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، C. elegans هي مناسبة لIV-FPOP بسبب شفافيتها في الطول الموجي ليزر 248 نانومتر اللازمة لFPOP6. يسمح اقتران هذه الطريقة بالقياس الطيفي الكتلي لتحديد البروتينات المعدلة المتعددة باستخدام نهج البروتيوميك التقليدية من أسفل إلى أعلى.
في هذا البروتوكول، ونحن نصف كيفية تنفيذ IV-FPOP لتحليل بنية البروتين في C. elegans. يتطلب البروتوكول التجريبي تجميع وإعداد نظام التدفق الميكرووسيري لIV-FPOP المقتبس من Konermann et al7. بعد IV-FPOP، يتم تجانس العينات لاستخراج البروتين. عينات البروتين هي البروتين والبروتين ويتم تحليل الببتيدات بواسطة الكروماتوغرافي السائل (LC) MS جنبا إلى جنب، تليها القياس الكمي.
Protocol
1- جيم إليغانس للصيانة والثقافة
- زراعة ومزامنة مستعمرات الديدان إلى مرحلة اليرقات الرابعة (L4) بعد الإجراءات المختبرية القياسية8.
- يوم تجربة IV-FPOP ، غسل الديدان L4 من المروج البكتيرية (OP50 E. coli)مع M9 المخزن المؤقت (0.02 M KH2PO4، 0.08 M Na2HPO4، 0.08 M NaCl ، 1 mM MgSO4).
- الحصول على 500 μL aliquots ~ 10،000 الديدان لكل عينة IV-FPOP.
2. تجميع نظام التدفق الميكروووووووووغرافي
- بدء تجميع نظام التدفق عن طريق قطع قطعة 2 سم من البروبيلين الإيثيلين المفلور (FEP) أنابيب (1/16 في القطر الخارجي (o.d.) × 0.020 في القطر الداخلي (i.d.)).
- باستخدام إبرة تشريح نظيفة، وتوسيع الأيه من أنابيب FEP من أجل جعل حفرة صغيرة في نهاية واحدة فقط، ~ 50 ملم في الطول. يجب أن تكون الحفرة كبيرة بما يكفي لتناسب قطعتين من السيليكا المنصهرة 360 ميكرومتر.
ملاحظة: لا تقم بتوسيع الطرف المعاكس حيث سيتم استخدام هذه النهاية فقط لتناسب الشعيرات الدموية منفذ. - مع قاطع السيراميك، وقطع قطعتين 15 سم من 250 ميكرون م السيليكا تنصهر. ستصبح هاتان القطعتان خطوط الغرس في نظام التدفق.
- باستخدام شريط لاصق ذاتي ، الشريط اثنين من 250 ميكرومتر i.d. الشعيرات الدموية معا ضمان أنها موازية لبعضها البعض ونهاياتها هي مسح 100 ٪.
ملاحظة: لضمان عدم سحق نهايات السيليكا المنصهرة بعد القطع ، وهي مستقيمة و100٪ مسح ضد بعضها البعض ، فمن المستحسن فحصها باستخدام عدسة مكبرة أو تحت مجهر ستيريو. - أدخل اثنين من الشعيرات الدموية المسجلة في فوهة الحفر المصنوعة يدويا من أنابيب FEP. دفع الشعيرات الدموية حتى حافة جدا من فوهة البركان المصنوعة يدويا.
تنبيه: للحفاظ على فعالية نظام التدفق، لا تدفع الماضي فوهة البركان المصنوعة يدويا(الشكل 1أ). - ضع نقطة صغيرة من راتنج الايبوكسي على سطح نظيف واخلطها مع إبرة تشريح.
- بسرعة، وذلك باستخدام نفس الإبرة، ووضع قطرة صغيرة من الراتنج في نهاية الشعيرات الدموية التأنق حيث أنها تتصل مع أنابيب FEP والسماح للراتنج لتجف، شنقا منفذ الجانب لأعلى، لبضع دقائق(الشكل 1a).
- في حين يجف الراتنج، وربط أنابيب FEP واثنين من الشعيرات الدموية معا، وقطع جديد 250 ميكرون i.d. الشعرية. الشعيرات الدموية الجديدة سوف تصبح الشعيرات الدموية منفذ نظام التدفق. يمكن حساب الطول المطلوب للشعيرات الدموية باستخدام المعادلة أدناه:
حيث l هو طول الشعرية ليتم قطعها في سنتيمترات، ر هو الوقت المطلوب رد الفعل في دقائق، و هو معدل التدفق في مل / دقيقة، وi.d. هو القطر الداخلي للعمود الشعري في سنتيمترات.
ملاحظة: بعد قطع الشعيرات الدموية منفذ، فحص نهايات ضمان أنها مستقيمة وليس سحقت. - مرة واحدة وقد جفت الراتنج، إدراج الشعرية الجديدة من خلال نهاية منفذ أنابيب FEP. يجب أن تكون النهايات الداخلية للشعيرات الدموية منفذ واثنين من الشعيرات الدموية غرس دافق ضد بعضها البعض داخل أنابيب FEP، وهذا يخلق خلط-T(الشكل 1b).
- ربط الشعيرات الدموية منفذ وأنابيب FEP مع راتنج الايبوكسي الطازجة كما هو موضح في الخطوات 2.6 و 2.7.
- السماح للراتنج لتجف بين عشية وضحاها ربط نظام التدفق معا. إعداد نظام التدفق microfluidic في اليوم التالي(الشكل 1c).
3. نظام التدفق Microfluidic لفي أفو FPOP
- أدخل أربعة أجهزة تحريك مغناطيسية داخل حقنة واحدة 5 مل. هذه الحقنة تصبح حقنة العينة. تمنع الستيرات المغناطيسية الديدان من الاستقرار داخل الحقنة خلال IV-FPOP(الشكل 2A).
- ملء اثنين من المحاقن 5 مل مع M9. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء داخل كل حقنة لأنها يمكن أن تؤثر على معدل التدفق وكفاءة الخلط.
- قم بتوصيل محول Luer بكل حقنة 5 مل لضمان أنها ضيقة الإصبع ومؤمنة في مكانها.
- إرفاق كل حقنة إلى صمام واحد 3-2. يجب إرفاق الحقنة بالمنفذ الأوسط للصمام(الشكل 2B).
- قم بتأمين كل حقنة 5 مل إلى مضخة الحقنة المزدوجة وضبط طوق التوقف الميكانيكي لمنع الضغط على الحقنة من كتلة الدفع. نضع في اعتبارنا إضافة التحريك المغناطيسي عند وضع طوق التوقف.
- إرفاق كل نهاية الشعيرات الدموية infusing من نظام تدفق microfluidic محلية الصنع إلى الميناء العلوي من كل صمام 3-2 باستخدام الجوز flangeless السوبر، الأكمام FEP، وflangeless سوبر ferrule(الشكل 2B).
- إلى ما تبقى من فتح ميناء من صمام 3-2 (ميناء أسفل)، نعلق 10 سم 450 ميكرون م i.d. الشعرية باستخدام الجوز flangeless سوبر، الأكمام FEP، وflangeless سوبر فيرلوس(الشكل 2B). هذه الشعيرات تصبح الشعيرات الدموية عينة سحب.
- بدء تدفق مضخة والتحقق من جميع الاتصالات من نظام تدفق microfluidic للتسرب البصرية. تدفق ما لا يقل عن ثلاثة أحجام حقنة باستخدام معدل التدفق التجريبي. يعتمد معدل التدفق النهائي على نافذة تشعيع الليزر وتردد الليزر وحجم كسر صفر الاستبعاد.
ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول، تم حساب معدل تدفق نهائي قدره 375.52 ميكرولتر/دقيقة من نافذة تشعيع ليزر من 2.55 ملم، و250 ميكرومتر من السيليكا المنصهرة، وكسر استبعاد صفر، وتردد 50 هرتز.- يتم وضع علامة على مسار التدفق من خلال الأسهم على مقبض صمام 3-2. يمكن إعادة تعبئة كل حقنة يدويًا عن طريق تحريك مقبض الصمام من موضع الطرد إلى وضع السحب.
ملاحظة: يمكن إصلاح التسريبات في صمام 3-2 عن طريق إعادة الشد الجوز flangeless السوبر أو استبدال أي من اتصالات صمام (الجوز flangeless السوبر، الأكمام FEP، أو فريلاريس سوبر ferrule). التسريبات في خلط-T تتطلب إعادة تجميع نظام تدفق microfluidic (الخطوات 2.1 إلى 2.11).
- يتم وضع علامة على مسار التدفق من خلال الأسهم على مقبض صمام 3-2. يمكن إعادة تعبئة كل حقنة يدويًا عن طريق تحريك مقبض الصمام من موضع الطرد إلى وضع السحب.
- نقل نظام تدفق microfluidic إلى مقاعد البدلاء التجريبية وتأمين الشعيرات الدموية منفذ إلى مرحلة تشع باستخدام 360 ميكرون o.d. اتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ(الشكل 2C, D).
- باستخدام أخف نطاق ًا بعيد المدى ، احرق طلاء السيليكا المنصهرة في نافذة تشعيع الليزر. تنظيف الطلاء المحروق باستخدام الأنسجة الخالية من الوبر والميثانول.
ملاحظة: البديل بين دورات حرق ودورات تنظيف الميثانول لتجنب الإفراط في تسخين الشعيرات الدموية كما يمكن أن تذوب الحرارة الزائدة و / أو كسر الشعيرات الدموية. - ضع كتلة التحريك المغناطيسي فوق حقنة 5 مل التي تحتوي على التحريك المغناطيسي. ضبط سرعة وموقف كتلة التحريك المغناطيسي بحيث التحريك المغناطيسي داخل حقنة 5 مل تدور ببطء وباستمرار.
4. في أفو FPOP
- بدوره على ليزر excimer KrF والسماح للثراترون للاحماء.
تنبيه: الليزر ينبعث إشعاع مرئي وغير مرئي في الطول الموجي 248 نانومتر التي يمكن أن تضر العينين. يجب ارتداء حماية العين المناسبة قبل تشغيل الليزر وفتح نافذة الخروج من الحزمة. - قياس طاقة الليزر على تردد 50 هرتز لما لا يقل عن 100 نبضة عن طريق وضع جهاز الاستشعار البصري عند نافذة الخروج من الحزمة.
ملاحظة: لهذا البروتوكول، تم استخدام نافذة تشعيع 2.55 مم مع طاقة ليزر من 150 ± 2.32 ميغاجول. - الحصول على تقريب 10،000 الديدان (500 ميكرولتر) وسحب العينة يدويا في حقنة العينة.
- ملء حقنة العينة مع 2.5 مل من المخزن المؤقت M9 لحجم عينة النهائي من 3 مل. تأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء في حقنة العينة.
- ملء الحقنة الثانية مع 3 مل من 200 mM H2O2، مرة أخرى ضمان عدم إدخال فقاعات الهواء في الحقنة.
- في نهاية الشعيرات الدموية منفذ، وضع أنبوب مخروطي 15 مل ملفوفة في رقائق الألومنيوم التي تحتوي على 6 مل من 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN), و 1% dimethyl sulfoxide لإرواء الزائدة H2O2,الجذور الهيدروكسيل, وتمنع الميثيونين كبريتيد reductase النشاط, على التوالي.
- بدء ليزر excimer من نافذة البرنامج، والانتظار للنبض الأول، وبدء تدفق العينة من الحقنة المزدوجة.
ملاحظة: يجب تشغيل العينات في التكرارات البيولوجية في ثلاثيات التقنية تحت 3 عينات الظروف: تشعيع الليزر مع H2O2 (عينة)، لا تشعيع الليزر مع H2O2 ولا تشعيع الليزر لا H2O2 (الضوابط)، ويبلغ مجموعها إلى 9 عينات لكل مجموعة بيولوجية. - جمع العينة بأكملها في أنبوب 15 مل، في حين رصد بنشاط تدفق العينة لأي تسرب البصرية وبعض الضغط مرة أخرى من حقنة العينة يمكن أن تتراكم في بعض الأحيان.
- بعد IV-FPOP، الديدان بيليه عن طريق الطرد المركزي في 805 × ز لمدة 2 دقيقة إزالة محلول إخماد، إضافة 250 ميكرولتر من محلول المحلول المؤقت (8 M اليوريا، 0.5٪ SDS، 50 mM HEPES، 50 mM NaCl، 1 mM EDTA، 1 mm phenylميثيل سولفونسيل فلوريد (PMSF]). نقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق نظيفة، وتجميد فلاش، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى عملية الهضم عينة.
5. استخراج البروتين، وتنقية، وتخليط البروتين
- تذوب العينات المجمدة على الجليد والتجانس عن طريق سونيكيشن لمدة 10 ق، تليها حضانة الجليد 60 ق. قد تكون هناك حاجة إلى جولات متعددة من سونيكيشن، يمكن ملاحظة التجانس تحت ستيريوالمجهر عن طريق وضع 2 μL العينة aliquot على شريحة المجهر. اكتمال تجانس العينة عندما ينظر إلى صغيرة إلى أي قطعة من الديدان.
- الديدان المتجانسة الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية وجمع supernatant في أنبوب الطرد المركزي microالطرد المركزي نظيفة.
- تحديد تركيزالبروتين عينة باستخدام حمض bicinchoninic ازى (BCA المقاس) باستخدام تعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: يمكن تحديد تركيز العينة باستخدام أي فحص تركيز البروتين الكيميائي الحيوي من الاختيار. ضع في اعتبارك توافق الكاشف مع المخزن المؤقت للليسي (8 M urea ، 0.5٪ SDS ، 50 mM HEPES ، 50 mM NaCl ، 1 mM EDTA ، 1 mM PMSF). بالإضافة إلى ذلك، قد يكون تخفيف المخزن المؤقت ضروريًا. - الحصول على 100 ميكروغرام من البروتين من كل عينة ومكان في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة النظيفة.
- إضافة dithiothreitol (DTT) إلى تركيز نهائي 10 mM للحد من سندات ثنائي الكبريتيد في جميع العينات. دوامة، تدور إلى أسفل، وعينات الاحتضان في 50 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- عينات باردة لدرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- إضافة iodoacetamide (IAA) إلى تركيز نهائي 50 M إلى الألكلات تقليل المخلفات. دوامة، تدور إلى أسفل، وعينات الاحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.
- مباشرة بعد الألكيلية، وعجل عينة البروتين عن طريق إضافة 4 مجلدات من 100٪ الأسيتون المبردة مسبقا واحتضان في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، بروتين بيليه يعجل عن طريق الطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة 10 دقيقة. غسل بيليه عينة مع 90٪ الأسيتون، وإزالة supernatant، والسماح بيليه لتجف لمدة 2-3 دقيقة.
- إعادة تعليق بيليه البروتين في 25 mM Tris-HCl (1 ميكروغرام/ميكرولتر). إضافة التربسين في نسبة البروتياز النهائي إلى البروتين من 1:50 (ث / ث) وهضم العينات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي إرواء رد فعل الهضم التربسين عن طريق إضافة 5٪ حمض الفورميك.
ملاحظة: هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 0.5 ميكروغرام من الببتيدات لكل عينة لتحليل LC-MS/MS (الخطوات 6.1-6.5). تحديد تركيزات الببتيد عينة باستخدام قياس الببتيد الملون الكمي (انظر جدول المواد)كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة.
6. عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (LC-MS / MS)
- استخدم المراحل المتنقلة التالية LC: المياه في 0.1٪ FA (A) و ACN في 0.1٪ FA (B).
- قم بتحميل 0.5 ميكروغرام من الببتيدات على عمود فخ (180 ميكرومتر × 20 مم) يحتوي على C18 (5 ميكرون، 100 Å) وغسل عينة مع 99٪ مذيب A و 1٪ B لمدة 15 دقيقة بمعدل تدفق 15 ميكرولتر/دقيقة.
- الببتيدات منفصلة باستخدام عمود معبأة في المنزل (0.075 ملم i.d. × 20 ملم) مع المواد المرحلة العكسية C18 (5 ميكرون، 125 Å).
- استخدام طريقة الفصل التحليلية التالية: تم ضخ التدرج عند 300 ديسيلتر/دقيقة لمدة 120 دقيقة: 0-1 دقيقة، 3% B؛ 2-90 دقيقة، 10-45% ب; 100-105 دقيقة، 100% ب؛ 106-120 دقيقة، 3% ب.
- تنفيذ الحصول على البيانات من الببتيدات في وضع الأيون الايون الموجب نانو الكهربرذاذ التأيون (nESI) باستخدام مطياف كتلة عالية الدقة.
ملاحظة: لهذا البروتوكول، تم استخدام ثنائي أداة LC فائقة الأداء (UPLC) إلى مطياف كتلة عالي الدقة. واستُخدم اقتناء البيانات المعتمدة على البيانات. كان نطاق المسح m/z لـ MS1 3750-1500 بدقة 60,000 و60 ثانية استبعاد ديناميكي. تم استبعاد الأيون اتّسال تُستبعد حالات الشحن من +1 و>6. تم استخدام هدف التحكم التلقائي في الكسب (AGC) البالغ 5.5e5 مع الحد الأقصى لوقت الحقن البالغ 50 مللي ثانية وعتبة الكثافة 5.5e4. تعرضت الأيونات المختارة لـ MS2 لتفتيت الانفصام التصادمي (HCD) بالطاقة العالية باستخدام طاقة الاصطدام العادية بنسبة 32٪ . تم الكشف عن الأيونات الشظايا في الطيف مع 15،000 القرار وهدف AGC 5.0e4.
7 - تحليل البيانات
- البحث عن ملفات MS جنبا إلى جنب مع برنامج تحليل proteomics من أسفل إلى أعلى ضد قاعدة بيانات C. elegans.
- تعيين معلمات البحث تحليل البروتين على النحو التالي: واحد trypsin غاب الانقسام، 375-1500 م/ ز نطاق كتلة الببتيد، جزء التسامح الشامل من 0.02، والسلائف التسامح الشامل من 10 جزء في المليون. يتم تعيين Carbamidomethylation كتعديل ثابت وجميع يعرف هيدروكسيل التعديلات الراديكالية سلسلة جانبية9،10 كما ديناميكية. يتم تحديد الببتيد عند الثقة بنسبة 95٪ (متوسطة) والبقايا عند الثقة بنسبة 99٪ (عالية). يتم تعيين معدل الاكتشاف الزائف (FDR) بنسبة 1٪
- تصدير البيانات إلى قاعدة بيانات إلكترونية وتلخيص مدى الأكسدة لكل ببتيد أو بقايا باستخدام المعادلة أدناه11:
ملاحظة: حيث منطقة EIC المعدلة هي المنطقة الكروماتوغرافية الأيونية المستخرجة (EIC) من الببتيد أو بقايا مع تعديل الأكسدة، ومنطقة EIC هي المساحة الإجمالية لنفس الببتيد أو بقايا مع وبدون التعديل التأكسدي.
Representative Results
في نظام التدفق الميكروfluidic المستخدمة لIV-FPOP، H2O2 ويتم الاحتفاظ الديدان منفصلة حتى قبل التشعيع بالليزر. هذا الفصل يلغي انهيار H2O2 بواسطة كاتالاز الذاتية وغيرها من الآليات الخلوية12. يُظهر استخدام الشعيرات الدموية 250 ميكرومتر ية الانتعاش الكلي للعينة بين 63-89% عبر اثنين من النسخ البيولوجية، في حين أن الشعيرات الدموية التي تبلغ 150 ميكرومتر تظهر فقط الانتعاش بنسبة 21-31%(الشكل 3A). يؤدي استخدام ورم ٍ لاد أكبر (250 ميكرومتر) إلى تدفق أفضل للدودة أثناء تدفق الديدان الوريدية وأحادية الدودة(الشكل 3B)بالمقارنة مع ورم ٍ شعري أصغر (150 ميكرومتر)(الشكل 3C). لا يسمح الشعيرات الدموية 150 ميكرون أحادية لتدفق دودة واحدة(الشكل 3C)وينظر إلى الديدان متعددة تتدفق معا في نافذة الليزر تشعيع مما يقلل من كمية التعرض بالليزر لكل دودة واحدة.
IV-FPOP هو تقنية وضع العلامات الكوفانت التي تحقق إمكانية الوصول المذيبات في C. elegans. ويبين الشكل 4A ممثل استخراج الكروماتوجرام اتية (EIC) من الببتيد المعدلة وغير المعدلة FPOP. التسمية الراديكالية هيدروكسيل يغير كيمياء الببتيدات المعدلة أكسدة، مما يجعل الببتيدات المعدلة FPOP أكثر قطبية. في الكروماتوغرافيا المرحلة العكسية، الببتيدات المعدلة IV-FPOP لديها أوقات الاحتفاظ في وقت سابق من الببتيدات غير المعدلة. MS / MS تجزئة الببتيدات المعزولة يسمح لتحديد المخلفات المعدلة الأكسدية(الشكل 4B).
وقد أظهرت IV-FPOP إلى تعديل أكسدة ما مجموعه 545 البروتينات عبر اثنين من النسخ البيولوجية داخل C. elegans (الشكل 5A, B). تعتمد ميزة IV-FPOP كطريقة بصمة البروتين على قدرة التقنية على تعديل البروتينات في مجموعة متنوعة من أنظمة الجسم داخل الديدان(الشكل 5C). هذه الطريقة من شأنها أن تسمح للتحقيق بنية البروتين وتفاعلات البروتين بغض النظر عن أنسجة الجسم أو الجهاز داخل الدودة. علاوة على ذلك ، يؤكد تحليل MS الترادفي ة IV-FPOP إمكانية الوصول إلى المذيبات في الجسم الحي. تم تحليل نمط أكسدة بروتين صدمة الحرارة 90 (Hsp90) في معقدة مع بروتين الشاسين الميوسين UNC-45(الشكل 6). تحليل MS/MS لHsp90 يظهر أربع مخلفات معدلة أكسدة(الشكل 6C, D),المدى العادي لتعديل FPOP (ln (PF))5 يشير إلى Hsp90 بقايا M698 لتكون أقل المذيبات يمكن الوصول إليها من المخلفات R697, E699, و E700 عندما ملزمة UNC-45(الشكل 6C). يتم التحقق من صحة هذه الاختلافات في الأكسدة من خلال حسابات مساحة سطح المذيبات الأدبية (SASA) (PDB 4I2Z13). بقايا M698 لديه قيمة SASA من 0.03 التي تعتبر بقايا مدفونة بالمقارنة مع المخلفات R697، E699، وE700 مع قيم SASA أعلى(الشكل 6C). 14
الشكل 1 - ما إذا كانت هناك نسبة في جهاز الفيفو FPOP microfluidic تدفق نظام التخطيطي. (أ)يتم عرض الخطين المنضوين (البرتقالي) من نظام تدفق IV-FPOP داخل أنابيب FEP (الأصفر)، يتم تمثيل الموضع الملزم الصحيح لراتنج الايبوكسي من خلال الدائرة الزرقاء الفاتحة. (ب)كاملة مجمعة خلط-T شكلتها الشعيرات الدموية 3 250 ميكرومتر. يتم تمثيل الموقف الصحيح ربط الراتنج من الشعيرات الدموية منفذ إلى أنابيب FEP من قبل الدائرة الزرقاء الخفيفة. (C)نظام التدفق تجميعها كاملة في التسمية الكوفالين ة من C. elegans. قبل FPOP، يتم الاحتفاظ الديدان منفصلة من H2O2 حتى قبل وضع العلامات فقط. وتظهر نافذة تشعيع الليزر باللون الأزرق الفاتح ويتم تمثيل شعاع الليزر بواسطة الصاعقة الأرجوانية. الأرقام ليست للتحجيم. وقد عُدِّل هذا الرقم من إسبينو وآخرون4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 - ما إذا كانت هناك نسبة نظام ميكروونيتي خلال IV-FPOP. (أ)صورة تمثيلية لـ C. elegans داخل حقنة 5 مل. دون تحريك ، تستقر الديدان في الجزء السفلي من الحقنة (يسار). التحريك المغناطيسي وكتلة التحريك إبقاء الديدان في التعليق خلال التجارب IV-FPOP (يمين). (ب)صورة تمثيلية لمحقنة 5 مل، وغرس الشعيرات الدموية، وسحب الشعيرات الدموية المتصلة بصمام 3-2. يتم عرض مقبض صمام 3-2 في موقف الانسحاب. (C)نظام التدفق الميكروونيتي خلال IV-FPOP، كتلة التحريك المغناطيسي هو الموقف فوق حقنة الديدان 5 مل. (D)تأمين الشعيرات الدموية منفذ إلى مرحلة تشع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 - ما إذا كانت هناك نسبة مقارنة تدفق C. elegans والاسترداد باستخدام اثنين من الشعيرات الدموية. (أ)في المائة من الانتعاش من الديدان بعد IV-FPOP لاثنين من النسخ البيولوجية (BR) مع 250 (رمادي) و 150 (أسود) ميكرون i.d. الشعيرات الدموية. يتم حساب أشرطة الخطأ من الانحراف المعياري عبر triplicates التقنية. C. elgans تتدفق من خلال نافذة الليزر تشع من خلال 250 ميكرومتر(B)و 150 ميكرومتر(C)i.d. الشعيرات الدموية. الديدان هي أكثر إحكاما في الشعيرات الدموية الصغيرة. ويظهر الشعيرات الدموية التي تبلغ 150 ميكرومتر ًا متكتلًا من الديدان. وقد عُدِّل هذا الرقم من إسبينو وآخرون4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 - ما إذا كانت هناك نسبة نتائج LC-MS/MS التمثيلية التالية IV-FPOP. (أ)EIC من الببتيد المعدلFPOP (أحمر) وغير معدلة (الأزرق). الببتيد المحدد ينتمي إلى بروتين أكتين-1. (ب)MS / MS الطيف من الاكتين غير المعدلة مشحونة بشكل مضاعف-1 الببتيد 317-327. (C)MS / MS الطيف من FPOP مشحونة بشكل مضاعف الفعل المعدلة-1 الببتيد 317-327، في هذا المثال تم تعديل P323 أكسدة (ص5+ أيون، أحمر). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 - ما إذا كانت هناك نسبة IV-FPOP تعديل البروتينات المؤكسدة داخل C. elegans. (A)مخطط فين من البروتينات المعدلة أكسدة في وجود 200 mM بيروكسيد الهيدروجين في 50 هرتز عبر اثنين من النسخ البيولوجية (BR)، BR1 هو باللون الأزرق وBR2 هو باللون الأصفر. (B)مخطط Venn للبروتينات المعدلة أكسدة المحددة في عينات مشعع، والسيطرة على بيروكسيد الهيدروجين، ومكافحة دودة فقط في BR2 عبر ثلاثيات التقنية. (C)مخطط دائري للبروتينات المعدلة بشكل تأكسدي داخل أنظمة الجسم C. elegans المختلفة. وقد عُدِّل هذا الرقم من إسبينو وآخرون4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 - ما إذا كانت هناك نسبة ربط التعديلات IV-FPOP إلى إمكانية الوصول إلى المذيبات. (أ)بروتين ميوسين هابرون UNC-45 (رمادي) (PDB ID 4I2Z13)تسليط الضوء على ببتيدين معدلين تم تحديدهما بواسطة تحليل LC/MS/MS، 669-680 و698-706 (أخضر، مدخول أيسر). ومن ضم UNC-45 إلى الجزء الببتيد Hsp90 (الأزرق). وتظهر المخلفات المعدلة أكسدية داخل هذه القطعة في العصي (الأحمر)، ويتم تقديم UNC-45 كسطح (inset الحق). (ب)أطياف MS الترافسان من الببتيد UNC-45 669-680 (أعلى) و 698-706 (أسفل) تظهر ب- و y-الأيون لفقدان CO2،وهو تعديل FPOP. (C)ln (PF) المحسوبة للمخلفات المعدلة بشكل تأكسدي Hsp90، R697، M698، E699، وE700. يتم الإشارة إلى قيم SASA المحسوبة لـ Hsp90 فوق كل بقايا. (D)أطياف MS جنباإلى دفق لR697، M698، E699، وE700 تظهر +16 FPOP التعديل. وقد عُدِّل هذا الرقم من إسبينو وآخرون4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
المعيار الحالي لدراسة في التفاعلات البروتين والبروتين الحي (PPI) هو نقل الطاقة بالرنين الفلورسينس (FRET). في أبسط أشكاله، هذه التقنية تدرس PPI عن طريق نقل الطاقة بين جزيئين عندما تكون على مقربة من بعضها البعض15. على عكس تقنيات MS، لا تملك FRET القرار لتوصيف التغيرات المطابقة ومواقع التفاعل على مستوى الأحماض الأمينية. وقد استخدمت تقنيات MS القائمة على نحو متزايد لدراسة PPI16. IV-FPOP هو أسلوب HRPF الذي يسمح للتحليل الهيكلي في البروتين الحي في C. elegans. من أجل تسمية C. elegans بنجاح بواسطة IV-FPOP ، من المهم تجميع نظام التدفق الميكروونيتي بشكل صحيح للحد من فقدان العينة. وقد أظهرت الشعيرات الدموية 250 ميكرون i.d. لتعظيم استرداد العينة بالمقارنة مع أصغر i.d. الشعيرات الدموية4. لم يتم اختبار الشعيرات الدموية الأكبر حجماً، غير أن نظام التدفق الميكروواني مصمم باستخدام الشعيرات الدموية بنفس الـ i.d. كنظام قياس مجرى التدفق المتاح تجارياً لفرز C. elegans. 17 حجم عينة دودة مهم أيضا، وحجم عينة أقل من ~ 10،000 لكل عينة قبل FPOP لا تسفر عن تركيزات البروتين عالية بما يكفي لتحليل LC-MS /MS. ويمكن أيضاً استخدام أحجام عينات أعلى (أكثر من 000 10 دودة) عن طريق ضبط حجم البداية الأولي (الخطوة 4.5).
التجميع السليم لنظام التدفق الميكرووتوني مهم. التسريبات في مسار العينة تؤدي إلى تدفق غير متناسق من الديدان أو H2O2. يمكن إعادة استخدام الصمامات المنظّمة من الصمامات الوريدية والنصف من تجارب IV-FPOP المتعددة إذا تم تنظيفها بشكل صحيح بعد كل تجربة. ومع ذلك، نوصي بتجميع نظام تدفق ميكرووتوني جديد لكل تكرار بيولوجي. إذا تم تجميع microfluidics بشكل صحيح ، فإن الديدان وH2O2 سيختلطان عند الخلط - T مع الحد الأدنى من ضغط الظهر. كما مراقبة الجودة (QC) من نظام التدفق microfluidic، ونحن نوصي اختبار كفاءة خلط باستخدام الأصباغ الملونة. من المهم مراقبة حركة الستيرات المغناطيسية داخل حقنة الدودة أثناء IV-FPOP ، أو خلط العينة غير السليم في حقنة الدودة أو خلط T يمكن أن يؤدي إلى ضغط الظهر مما تسبب في تسرب. وبالإضافة إلى ذلك، تؤدي ظروف الخلط السيئة إلى خسائر كبيرة في العينة، وضعف التعرض للديدان بالليزر عند نافذة الليزر، وانسدادها.
C. elegans صيانة مهم من أجل تقليل الأكسدة الخلفية. نوصي بزراعة الديدان في درجات حرارة منخفضة في ظل ظروف منخفضة الإجهاد حيث يمكن أن تؤثر درجات الحرارة المرتفعة على أكسدة الخلفية الإجمالية. ويوصى بمجموعة عينة تحكم من الديدان فقط، لا H2O2 ولا تشعيع الليزر، لجميع التجارب IV-FPOP لحساب أكسدة الخلفية بسبب الصيانة المختبرية. واحدة من القيود الحالية لهذه التقنية هو العدد الإجمالي للببتيدات المعدلة الأكسدية التي تم تحديدها والعدد الإجمالي للمخلفات المؤكسدة لكل ببتيد من أجل الحصول على معلومات هيكلية أعلى البروتين. على الرغم من عدم التوصية، يمكن تحقيق زيادة في التعديلات التأكسدية باستخدام تركيزات أعلى من بيروكسيد الهيدروجين. زيادة في بيروكسيد الهيدروجين يمكن أن يغير بشكل كبير المسارات البيولوجية الهامة وكذلك يؤدي إلى التتكشف الناجمعن الأكسدة. إذا تم زيادة تركيز بيروكسيد الهيدروجين لIV-FPOP، فمن المستحسن لاختبار قابلية دودة وأكسدة الخلفية كما تركيزات أعلى من 200 mM لم يتم اختبارها.
يمكن تحسين بروتوكول LC-MS/MS الموصوف وتعديله لتلبية MS QC من المختبرات الأخرى. وقد ثبت سابقا استخدام تقنيات الكروماتوغرافيا 2D لزيادة تحديد الببتيدات المعدلة أكسدة والبروتينات18. ومع ذلك، لا ينصح تقنيات إثراء البروتين التي تستهدف بروتين معين من الفائدة، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر هطول الأمطار المضادة للأجسام أو المقالات المنسدلة. هذه التقنيات يمكن أن تنحاز إلى واحد متوافق البروتين إذا تم تعديل موقع epitope / ملزمة من البروتين أكسدة IV-FPOP. التطورات الجديدة في البصمة الكواشف الراديكالية، مثل الأنيون الراديكالي كبريتات10 أو ثلاثي فلوروميثيليشن19 يمكن أن تزيد من براعة IV-FPOP. على الرغم من أن كاشف الوسم الوحيد الذي تم اختباره في الجسم الحي حتى الآن هو بيروكسيد الهيدروجين ، إلا أنه يمكن تحسين الجذور الأخرى التي يتم تنشيطها بالليزر. وينبغي أن يثبت استخدام الجذور الأخرى لتكون متوافقة مع قابلية الدودة، نفاذية الخلية، والطول الموجي ليزر 248 نانومتر. بسبب استخدام C. elegans كنظام نموذجي للعديد من الأمراض البشرية ، فإن IV-FPOP لديه القدرة على أن يكون له تأثير قوي في دراسة دور بنية البروتين في مسببات الأمراض.
Disclosures
وقد كتب هذا المنشور في الوفاء الجزئي لشهادة دكتوراه جاي. ولا يعلن صاحبا البلاغ أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من خلال صناديق بدء التشغيل من جامعة ماريلاند وبالتيمور وNIH 1R01 GM 127595 الممنوحة لLMJ. يشكر المؤلفون الدكتور دانيال ديردج على مساعدته في تحرير المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
- Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
- Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
- Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
- Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
- Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
- Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).
