Summary
In vivo hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (IV-FPOP) er en hydroxyl radikal protein fodspor teknik, der giver mulighed for kortlægning af proteinstruktur i deres oprindelige miljø. Denne protokol beskriver samling og opsætning af IV-FPOP mikrofluidic flow system.
Abstract
Hurtig oxidation af proteiner (FPOP) er en hydroxylradikal proteinfootprinting (HRPF) metode, der anvendes til at studere proteinstruktur, protein-ligand interaktioner, og protein-protein interaktioner. FPOP anvender en KrF excimer laser ved 248 nm for fotolyse af hydrogenperoxid til at generere hydroxyl radikaler, som igen oxidativt ændre opløsningsmiddel-tilgængelige aminosyre sidekæder. For nylig har vi udvidet brugen af FPOP af in vivo oxidative mærkning i Caenorhabditis elegans (C. elegans), med titlen IV-FPOP. De gennemsigtige nematoder er blevet brugt som modelsystemer for mange sygdomme hos mennesker. Strukturelle undersøgelser i C. elegans af IV-FPOP er mulige på grund af dyrets evne til at tilføre hydrogenperoxid, deres gennemsigtighed over for laserbestråling ved 248 nm og ændringens uigenkaldelige karakter. Samling af et mikrofluidisk flowsystem til IV-FPOP-mærkning, IV-FPOP-parametre, proteinekstraktion og LC-MS/MS-optimerede parametre er beskrevet heri.
Introduction
Proteinfodaftryk kombineret med massespektrometri (MS) er blevet brugt i de senere år til at studere proteininteraktioner og kropsbygningsændringer. Hydroxyl radikalprotein fodaftryk (HRPF) metoder sonde protein solvent tilgængelighed ved at ændre protein aminosyre sidekæder. HRPF-metoden, hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP)1, er blevet anvendt til at sonde proteinstruktur in vitro2, in-cell (IC-FPOP)3, og senest in vivo (IV-FPOP)4. FPOP udnytter en 248 nm bølgelængde excimer laser for hurtigt at generere hydroxyl radikaler ved fotolyse af hydrogenperoxid til at danne hydroxyl radikaler1. Til gengæld kan disse radikaler mærke 19 ud af 20 aminosyrer på en mikrosekund tidsskala, hurtigere end proteiner kan udfolde sig. Selv om reaktiviteten af hver aminosyre med hydroxylradikaler strækker sig 1000 gange, er det muligt at normalisere sidekædeoxidation ved at beregne en beskyttelsesfaktor (PF)5.
Da FPOP oxidativt kan ændre proteiner uanset deres størrelse eller primære sekvens, viser det sig at være fordelagtigt for in-cell og in vivo protein undersøgelser. IV-FPOP-sondernes proteinstruktur i C. elegans på samme måde som in vitro- og incellestudier4. C. elegans er en del af nematode familien og er meget udbredt som en model til at studere sygdomme hos mennesker. Ormens evne til at optage brintoverilte ved både passiv og aktiv diffusion giver mulighed for undersøgelse af proteinstruktur i forskellige kropssystemer. Desuden er C. elegans velegnet til IV-FPOP på grund af deres gennemsigtighed ved den 248 nm laserbølgelængde, der er nødvendig for FPOP6. Kobling af denne metode til massespektrometri giver mulighed for identifikation af flere modificerede proteiner ved hjælp af traditionelle bottom-up proteomics tilgange.
I denne protokol beskriver vi, hvordan man udfører IV-FPOP til analyse af proteinstruktur i C. elegans. Forsøgsprotokollen kræver samling og opsætning af mikrofluidisk flowsystem til IV-FPOP tilpasset fra Konermann et al7. Efter IV-FPOP homogeniseres prøverne til proteinekstraktion. Proteinprøver proteolyseres, og peptider analyseres ved flydende kromatograf (LC) tandem MS, efterfulgt af kvantificering.
Protocol
1. C. elegans vedligeholdelse og kultur
- Vokse og synkronisere orme kolonier til deres fjerde larver (L4) fase efter standard laboratorieprocedurer8.
- Dagen for IV-FPOP eksperiment, vaske L4 orme fra bakterielle græsplæner (OP50 E. coli) med M9 buffer (0,02 M KH2PO4,0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
- Der anskaffes 500 μL aliquots af ~10.000 orme pr. IV-FPOP-prøve.
2. Samling af mikrofluidiske flowsystemer
- Flowsystemet startes ved at skære et stykke fluorholdiget ethylenpropyl (FEP)-rør (1/16 tommer i. ydre diameter (o.d.) x 0,020 tommer i. indvendig diameter (i.d.)).
- Ved hjælp af en ren dissekeringsnål skal du udvide i.d. af FEP-slangen for at lave et lille krater i den ene ende, ~50 mm i længden. Krateret skal være stort nok til at rumme to 360 μm o.d. stykker smeltet silica.
BEMÆRK: Udvid ikke den modsatte ende, da denne ende kun vil blive brugt til at passe til udløbskapillarus. - Med en keramisk fræser skæres to 15 cm stykker af 250 μm i.d. smeltet silica. Disse to stykker bliver flowsystemets infusionslinjer.
- Brug selvklæbende tape, tape de to 250 μm id kapillærer sammen sikre, at de er parallelle med hinanden, og deres ender er 100% skyllet.
BEMÆRK: For at sikre, at de sammensmeltede silicaender ikke knuses efter skæring, og at de er lige og 100 % skylles mod hinanden, anbefales det at undersøge dem ved hjælp af et forstørrelsesglas eller under et stereomikroskop. - Sæt de to tapede kapillærer ind i det håndlavede krater i FEP-slangen. Skub kapillærerne op til kanten af det håndlavede krater.
FORSIGTIG: For at opretholde flowsystemets effektivitet må det ikke skubbes forbi det håndlavede krater (figur 1a). - Placer en lille prik af epoxy harpiks på en ren overflade og blandes med en dissekere nål.
- Hurtigt, ved hjælp af samme nål, placere en lille dråbe harpiks i slutningen af infusion kapillærer, hvor de forbinder med FEP slanger og lad harpiksen tørre, hængende outlet-side op, i et par minutter (Figur 1a).
- Mens harpiksen tørrer, binder FEP slangen og to kapillærer sammen, skæres en ny 250 μm i.d. kapillær. Den nye kapillær bliver udløbskapillær af flowsystemet. Kapillærens ønskede længde kan beregnes ved hjælp af ligningen nedenfor:
Hvor l er længden af kapillær, der skal skæres i centimeter, t er den ønskede reaktionstid i minutter, f er strømningshastigheden i ml / min, og i.d. er den indre diameter af kapillær i centimeter.
BEMÆRK: Efter skæring af udløbskapillary, undersøge enderne sikre, at de er lige og ikke knust. - Når harpiksen er tørret, indsættes den nye kapillær gennem FEP-slangens udløbsende. De indvendige ender af udløbskapillær og de to infusionskapillærer skal flugte mod hinanden inde i FEP slangen, dette skaber blanding-T (Figur 1b).
- Bind udløbskapillær og FEP-slangen med frisk epoxyharpiks som beskrevet i trin 2.6 og 2.7.
- Lad harpiksen tørre strøm natten binder flowsystemet sammen. Opsæt mikrofluidistflowsystemet næste dag (Figur 1c).
3. Mikrofluidisflowsystem til in vivo FPOP
- Sæt fire magnetiske omrørere ind i en 5 ml sprøjte. Denne sprøjte bliver prøvesprøjten. De magnetiske omrørere forhindrer ormene i at slå sig ned inde i sprøjten under IV-FPOP (Figur 2A).
- Fyld de to 5 ml sprøjter med M9. Sørg for, at der ikke er luftbobler inde i hver sprøjte, da de kan påvirke strømningshastigheden og blandeeffektiviteten.
- Tilslut en Luer adapter til hver 5 ml sprøjte, der sikrer, at de er fingertætte og fastgjorte.
- Fastgør hver sprøjte til en enkelt 3-2 ventil. Sprøjten skal fastgøres til ventilens midterste port (Figur 2B).
- Fastgør hver 5 ml sprøjte til den dobbelte sprøjtepumpe, og juster den mekaniske stopkrave for at forhindre overtryk på sprøjten fra skubbeblokken. Vær opmærksom på tilsætningen af magnetomrørerne, når stophalse indstilles.
- Fastgør hver infusion kapillær ende af den hjemmelavede mikrofluidic flow system til den øverste port af hver 3-2 ventil ved hjælp af en super flangeless møtrik, FEP ærme, og super flangeless ferrule (Figur 2B).
- Til den resterende åbne port af 3-2 ventilen (nederste port), fastgør en 10 cm 450 μm i.d. kapillær ved hjælp af en super flangeless møtrik, FEP ærme, og super flangeless ferrule (Figur 2B). Disse kapillærer bliver den tilbagetrækning prøve kapillærer.
- Start pumpeflowet, og kontroller alle tilslutninger af mikrofluidistflowsystemet for visuelle lækager. Der flower mindst tre sprøjtevolumener ved hjælp af den eksperimentelle strømningshastighed. Den endelige strømningshastighed afhænger af laserbestrålingsvinduet, laserfrekvensen og et nul-udelukkelsesfraktionsvolumen.
BEMÆRK: For denne protokol blev der beregnet en endelig strømningshastighed på 375,52 μL/min. ud fra et laserbestrålingsvindue på 2,55 mm, 250 μm i.d. smeltet silica, nuludelukkelsesfraktion og 50 Hz-frekvens.- Flowbanen er markeret med pilene på 3-2 ventilhåndtaget. Hver sprøjte kan genopfyldes manuelt ved at flytte ventilhåndtaget fra udvisningspositionen til tilbagetrækningspositionen.
BEMÆRK: Utætheder ved 3-2 ventilen kan fastgøres ved at skrue super flangeless møtrikken eller erstatte nogen af ventilforbindelserne (super flangeless møtrik, FEP ærme eller super flangeless ferrule). Utætheder ved blanding-T kræver en genmontering af mikrofluidisk flowsystem (trin 2.1 til 2.11).
- Flowbanen er markeret med pilene på 3-2 ventilhåndtaget. Hver sprøjte kan genopfyldes manuelt ved at flytte ventilhåndtaget fra udvisningspositionen til tilbagetrækningspositionen.
- Flyt det mikrofluidiske flowsystem til forsøgsbænken, og fastgør udløbskapillæren til udstrålingsstadiet ved hjælp af en 360 μm o.d. forening af rustfrit stål (figur 2C,D).
- Brænd belægningen af det sammensmeltede silica ved laserbestrålingsvinduet ved hjælp af en langtrækkende lighter. Rengør den brændte belægning med fnugfrit væv og methanol.
BEMÆRK: Skift mellem brændende cyklusser og methanolrengøringscyklusser for at undgå overophedning af kapillæren, da overskydende varme kan smelte og/eller bryde kapillæren. - Placer magnetomrørerblokken over den 5 ml sprøjte, der indeholder magnetomrørerne. Juster hastigheden og placeringen af magnetomrørerblokken, så magnetomrørerne inde i 5 ml-sprøjten roterer langsomt og konstant.
4. In vivo FPOP
- Tænd for KrF excimer laserog lad thyratron at varme op.
FORSIGTIG: Laseren udsender synlig og usynlig stråling ved 248 nm bølgelængde, der kan skade øjnene. Der skal bæres ordentlig øjenbeskyttelse, før du tænder for laseren og åbner stråleudgangvinduet. - Mål laserenergien med en frekvens på 50 Hz i mindst 100 impulser ved at placere den optiske sensor ved stråleudgangvinduet.
BEMÆRK: Til denne protokol blev der anvendt et 2,55 mm bestrålingsvindue med en laserenergi på 150 ± 2,32 mJ. - Der anbringes ca. 10.000 orme (500 μL) og prøven trækkes manuelt ud i prøvesprøjten.
- Prøvesprøjten fyldes med 2,5 ml M9-buffer til et endeligt prøvevolumen på 3 ml. Sørg for, at der ikke kommer luftbobler ind i prøvesprøjten.
- Fyld den anden sprøjte med 3 ml 200 mM H2O2, igen for at sikre, at der ikke kommer luftbobler ind i sprøjten.
- For enden af udløbskapillæren anbring et konisk rør på 15 ml pakket ind i aluminiumsfolie indeholdende 6 ml på 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) og 1% dimethylsulfoxid for at slukke overskydende H2O2, hydroxylradikaler og hæmme henholdsvis methioninsulfoxid-reduktase.
- Start excimer laser fra software vinduet, vente på den første puls, og start prøven flow fra den dobbelte sprøjte.
BEMÆRK: Prøverne skal foretages i biologiske dubletter i tekniske treeksemplarer under tre prøver: laserbestråling med H 2O2 (prøve), ingen laserbestråling med H2O2 og ingen laserbestråling nr.2 - Hele prøven opsamles i 15 ml-tuben, mens prøveflowet aktivt overvåges for eventuelle visuelle lækager, da et vist modtryk fra prøvesprøjten nogle gange kan opbygges.
- Efter IV-FPOP tilsættes pelletorme ved centrifugering ved 805 x g i 2 min. Fjern dæmpningsopløsning, tilsættes 250 μL lysisbuffer (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF]). Prøven overføres til et rent mikrocentrifugerør, flashfryse og opbevares ved -80 °C, indtil prøven fordøjes.
5. Proteinekstraktion, rensning og proteolyse
- Optø frosne prøver på is og homogenisere ved sonikering i 10 s, efterfulgt af en 60 s isinkubation. Der kan være behov for flere lydrunder, homogenat kan observeres under et stereomikroskop ved at placere en prøveprøve prøveprøve på et mikroskopobjekt. Prøvehomogenisering er komplet, når små til ingen stykker af orme ses.
- Homogeniserede orme centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten samles i et rent mikrocentrifugerør.
- Prøven protein koncentrationer ved hjælp af en bicinchoninic syre assay (BCA assay) ved hjælp af producentens anvisninger.
BEMÆRK: Prøvekoncentrationen kan bestemmes ved hjælp af en hvilken som helst biokemisk proteinkoncentrationsanalyse efter eget valg. Husk reagenskompatibilitet med lysisbuffer (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Derudover kan en bufferfortynding være nødvendig. - Der anbringes 100 μg protein fra hver prøve, og der anbringes i rene mikrocentrifugerør.
- Dithiothreitol (DTT) tilsættes en 10 mM endelig koncentration for at reducere disulfidbindingerne i alle prøver. Vortex, spin ned, og inkuberprøver ved 50 °C i 45 min.
- Prøverne køles til stuetemperatur i 10 min.
- Der tilsættes iodoacetamid (IAs) til en 50 mM endelig koncentration til at alkylere reducerede restkoncentrationer. Vortex, spin ned, og inkubere prøver i 20 min ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- Umiddelbart efter alkylering udfældproteinprøven udfælds proteinprøven ved tilsætning af 4 bind 100% forkølet acetone og inkubering ved -20 °C natten over.
- Den næste dag, pellet protein udfældes ved centrifugering ved 16.000 x g i 10 min. Vask prøve pellet med 90% acetone, fjerne supernatant, og lad pellet tørre i 2-3 min.
- Re-suspendere proteinpellet i 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL). Trypsin tilsættes ved et endeligt forholdet mellem protease og protein på 1:50 (w/w) og prøverne fordøjes ved 37 °C natten over.
- Den næste dag slukke trypsin fordøjelsereaktion ved at tilføje 5% myresyre.
BEMÆRK: Der kræves mindst 0,5 μg peptider pr. prøve til LC-MS/MS-analyse (trin 6.1-6.5). Prøvens peptidkoncentrationer bestemmes ved hjælp af en kvantitativ kolorimetrisk peptidanalyse (se materialetabellen)som beskrevet i producentens protokol.
6. Højtydende væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS)
- Brug følgende LC-mobilfaser: Vand i 0,1 % FA (A) og ACN i 0,1 % FA (B).
- 0,5 μg peptider anbringes på en fældesøjle (180 μm × 20 mm), der indeholder C18 (5 μm, 100 Å), og prøven vaskes med 99 % opløsningsmiddel A og 1% B i 15 minutter ved 15 μL/min strømningshastighed.
- Separate peptider med en intern pakket søjle (0,075 mm id × 20 mm) med C18 omvendt fasemateriale (5 μm, 125 Å).
- Brug følgende analyseseparationsmetode: Gradienten blev pumpet ved 300 nL/min. i 120 min: 0−1 min, 3% B; 2−90 min, 10−45% B; 100−105 min,100% B; 106−120 min,3% B.
- Udfør dataindsamling af peptider i positiv iontilstand nano-elektrospray ionisering (nESI) ved hjælp af et massespektrometer med høj opløsning.
BEMÆRK: Til denne protokol blev der anvendt et uplc-instrumentpar med ultraperformance til et massespektrometer med høj opløsning. Dataafhængig erhvervelse blev udnyttet. M/z-scanningsområdet for MS1 var 3750-1500 ved 60.000 opløsning og 60 s dynamisk eksklusion. Ioner med opladningstilstande på +1 og >6 blev udelukket. Et automatisk gain control -mål (AGC) på 5,5e5 blev anvendt med en maksimal injektionstid på 50 ms og en intensitetstærskel på 5,5e4. Ioner udvalgt til MS2 blev udsat for højere energi kollisionsdissociation (HCD) fragmentering ved hjælp af 32% normaliseret kollision energi. Der blev fundet fragmentioner i spektrometeret med 15.000 opløsninger og et AGC-mål på 5,0e4.
7. Dataanalyse
- Søg tandem MS filer med en bottom-up proteomics analyse software mod C. elegans database.
- Indstil proteinanalyse søgeparametre som følger: en trypsin savnet spaltning, 375-1500 m / z peptid masseområde, fragment masse tolerance på 0,02, og prækursor massetolerance på 10 ppm. Carbamidomethylation er indstillet som en statisk modifikation, og alle kender hydroxyl radikale sidekæde ændringer9,10 som dynamisk. Peptid identifikation er etableret ved 95% tillid (medium) og restkoncentrationer ved 99% tillid (høj). Den falske registreringshastighed (FDR) er indstillet til en 1%.
- Eksportér data til en elektronisk database, og sammenfat omfanget af oxidation pr. peptid eller restkoncentration ved hjælp af ligningen nedenfor11:
BEMÆRK: Hvis eIC-området modificeres, er det ekstraherede ionkromatografiske område (EIC) af peptidet eller restproduktet med en oxidativ modifikation, og EIC-arealet er det samlede areal af samme peptid eller restkoncentrationer med og uden oxidativ modifikation.
Representative Results
I det mikrofluidiske flowsystem, der anvendes til IV-FPOP, holdes H2O2 og ormene adskilt indtil lige før laserbestråling. Denne adskillelse eliminerer opdeling af H2O2 ved endogen katalase og andre cellulære mekanismer12. Anvendelsen af en 250 μm i.d. kapillær viser en samlet prøvegenvinding på mellem 63-89 % på tværs af to biologiske replikater, mens 150 μm i.d. kapillær kun viser 21-31 % genfinding (figur 3A). Brugen af en større id kapillær (250 μm) fører til bedre ormflow under IV-FPOP og enkelt ormeflow (Figur 3B) sammenlignet med en mindre i.d. kapillær (150 μm) (Figur 3C). Kapillary på 150 μm i.d tillader ikke enkeltormeflow (figur 3C),og flere orme ses flyde sammen ved det laserbestrålingsvindue, hvilket reducerer mængden af lasereksponering pr. enkelt orm.
IV-FPOP er en kovalent mærkningsteknik, der sonderer tilgængelighed for opløsningsmidler i C. elegans. Figur 4A viser et repræsentativt ekstraheret ionkromatogrammer (EIC) af et FPOP-modificeret og umodificeret peptid. Hydroxylradikaletiketten ændrer kemien i oxidativt modificerede peptider, hvilket gør FPOP-modificerede peptider mere polære. I omvendt fase kromatografi, IV-FPOP modificerede peptider har tidligere retention gange end umodificerede peptider. MS/MS-fragmentering af isolerede peptider gør det muligt at identificere oxidativt modificerede restkoncentrationer (figur 4B).
IV-FPOP har vist sig at oxideativt modificeret i alt 545 proteiner på tværs af to biologiske replikater inden for C. elegans (Figur 5A,B). En fordel ved IV-FPOP som en proteinaftagende metode afhænger af teknikkens evne til at ændre proteiner i en række forskellige kropssystemer i ormene (Figur 5C). Denne metode vil gøre det muligt at sonde protein struktur og protein interaktioner uanset kropsvæv eller organ i ormen. Yderligere, tandem MS analyse bekræfter IV-FPOP sonder opløsningsmiddel tilgængelighed in vivo. Oxidationsmønsteret af varmechokproteinet 90 (Hsp90) i kompleks med myosinchaperonproteinet UNC-45 blev analyseret (Figur 6). MS/MS-analyse for Hsp90 viser fire oxidativt modificerede restkoncentrationer (figur 6C,D), det normaliserede omfang af FPOP-modifikation (ln(PF))5 angiver, at Hsp90's rest M698 er mindre opløsningsmiddeltilgængeligt end restkoncentrationer R697, E699 og E700, når den er bundet til UNC-45 (figur 6C). Disse forskelle i oxidation valideres af litteraturopløsningsmiddeltilgængelige overfladearealberegninger (SASA) (PDB 4I2Z13). Restprodukt M698 har en SASA-værdi på 0,03, som anses for at være en nedgravet restkoncentration sammenlignet med restkoncentrationer R697, E699 og E700 med højere SASA-værdier (figur 6C). kr.
Figur 1. In vivo FPOP mikrofluidic flow system skematisk. (A)De to infusionslinjer (orange) i IV-FPOP-flowsystemet vises inde i FEP-slangen (gul), den korrekte bindingsposition af epoxyharpiksen repræsenteres af den lyseblå cirkel. (B) Komplet samlet blanding-T dannet af de tre 250 μm i.d. kapillærer. Den korrekte harpiksbindingsposition for udløbskapillær en del af FEP-slangen repræsenteres af den lyseblå cirkel. cC) Det komplette samlede strømningssystem til covalent mærkning af C. elegansin vivo covalent . Før FPOP holdes orme adskilt fra H2O2 indtil lige før mærkningen. laserbestrålingsvinduet er vist med lyseblå, og laserstrålen repræsenteres af det lilla lyn. Tallene skal ikke skaleres. Dette tal er blevet ændret fra Espino et al.4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Mikrofluidisk system under IV-FPOP. (A) Repræsentativt billede af C. elegans inde i 5 ml sprøjten. Uden omrøring lægger ormene sig ned i bunden af sprøjten (til venstre). De magnetiske omrørere og omrørerblokken holder ormene i suspension under IV-FPOP-forsøgene (til højre). (B) Repræsentativt billede af en 5 ml sprøjte, infusion kapillær, og tilbagetrækning kapillær forbundet til 3-2 ventilen. 3-2 ventilhåndtaget vises i tilbagetrækningspositionen. (C) Microfluidic flow system under IV-FPOP, den magnetiske omrører blok er position over orme '5 ml sprøjte. (D) Udløbkapillær fastgjort til udstrålende fase. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Sammenligning af C. elegans flow og nyttiggørelse ved hjælp af to id kapillærer. (A) Procent genvinding af orme efter IV-FPOP for to biologiske replikater (BR) med 250 (grå) og 150 (sort) μm i.d. kapillærer. Fejllinjer beregnes ud fra standardafvigelsen på tværs af tekniske treeksemplarer. C. elganer, der strømmer gennem det laserbestrålede vindue gennem en 250 μm (B) og 150 μm (C), dvs. Ormene er mere tæt komprimeret i de mindre kapillær. Den 150 μm i.d. kapillær viser sammenklumpning af orme. Dette tal er blevet ændret fra Espino et al.4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Repræsentative LC-MS/MS-resultater efter IV-FPOP. (A) EIC af et FPOP modificeret peptid (rød) og umodificeret (blå). Det valgte peptid tilhører actin-1 protein. (B) MS/MS spektrum af dobbelt ladet umodificeret actin-1 peptid 317-327. (C) MS/MS spektrum af dobbelt ladet FPOP modificeret actin-1 peptid 317-327, i dette eksempel P323 blev oxidativt ændret (y5+ ion, red). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. IV-FPOP oxidativt ændrer proteiner inden for C. elegans. (A) Venn diagram af oxidativt modificerede proteiner i nærvær af 200 mM hydrogenperoxid ved 50 Hz på tværs af to biologiske replikater (BR), BR1 er i blå og BR2 er i gult. (B) Venn diagram af oxidativt modificerede proteiner identificeret i bestrålede prøver, hydrogenperoxid kontrol, og orm-only kontrol i BR2 på tværs af tekniske treeksemplarer. (C) Cirkeldiagram over oxidativt modificerede proteiner inden for forskellige C. elegans karrosserisystemer. Dette tal er blevet ændret fra Espino et al.4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Korrelering IV-FPOP ændringer til opløsningsmiddel tilgængelighed. (A) Myosin chaperon protein UNC-45 (grå) (FDB ID 4I2Z13) fremhæver to modificerede peptider identificeret ved LC / MS / MS analyse, 669−680 og 698−706 (grøn, venstre inset). UNC-45 er bundet til Hsp90 peptid fragment (blå). Oxidativt modificerede rester i dette fragment er vist i pinde (rød), og UNC-45 gengives som en overflade (højre indsat). (B) Tandem MS-spektre af UNC-45 peptid 669−680 (øverst) og 698−706 (nederst), der viser b- og y-ioner for tab af CO2, en FPOP-modifikation. (C) Den beregnede ln(PF) for de oxidativt modificerede Hsp90-restkoncentrationer, R697, M698, E699 og E700. Beregnede SASA-værdier for Hsp90 er angivet over hver rest. (D) Tandem MS-spektre til R697, M698, E699 og E700 med en +16 FPOP-modifikation. Dette tal er blevet ændret fra Espino et al.4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Det nuværende benchmark for undersøgelse af in vivo protein-protein interaktioner (PPI) er fluorescens resonans energioverførsel (FRET). I sin mest enkle form, denne teknik undersøgelser PPI ved energioverførsel mellem to molekyler, når de er i nærheden af hinanden15. I modsætning til MS teknikker, fret ikke har den beslutning at karakterisere konformationelle ændringer og interaktion steder på aminosyre niveau. Ms-baserede teknikker er i stigende grad blevet anvendt til studiet af PPI16. IV-FPOP er en HRPF-metode, der giver mulighed for in vivo protein strukturel analyse i C. elegans. For at kunne mærke C. elegans med IV-FPOP er det vigtigt at samle det mikrofluidiske flowsystem korrekt for at reducere prøvetabet. Kapillær på 250 μm i.d har vist sig at maksimere prøvegenvindingsammenlignet med mindre id-kapillærer4. Større id kapillærer er ikke blevet testet, men mikrofluidic flow system er designet ved hjælp af en kapillær med samme id som en kommercielt tilgængelige flow cytometri system til sortering af C. elegans. 17 Ormeprøvens størrelse er også vigtig, at en stikprøvestørrelse på mindre end ~10.000 pr. prøve før FPOP ikke giver proteinkoncentrationer, der er høje nok til LC-MS/MS-analyse. Højere prøvestørrelser (>10.000 orme) kan også bruges ved at justere den oprindelige startmængde (trin 4.5).
Korrekt samling af det mikrofluidiske flowsystem er vigtig. Utætheder i prøvevejen resulterer i en inkonsekvent strøm af orme eller H2O2. Ferrules, ærmer og 3-2 ventiler kan genbruges fra flere IV-FPOP eksperimenter, hvis korrekt rengjort efter hvert eksperiment. Vi anbefaler dog at samle et nyt mikrofluidisk flowsystem til hver biologisk replikat. Hvis mikrofluidics er korrekt samlet, ormene og H2O2 vil blande på blanding-T med minimalt modtryk. Som kvalitetskontrol (QC) af mikrofluidisk flowsystem anbefaler vi, at du tester blandingseffektiviteten ved hjælp af farvede farvestoffer. Det er vigtigt at overvåge bevægelsen af de magnetiske omrørere inde i ormen sprøjten under IV-FPOP, forkert prøve blanding på ormen sprøjten eller blanding-T kan resultere i modtryk forårsager lækager. Desuden fører dårlige blandingsforhold til store prøvetab, dårlig lasereksponering af orme ved laservinduet og tilstopning.
C. elegans vedligeholdelse er vigtig for at mindske baggrundsoxidation. Vi anbefaler, at ormene vokser ved lave temperaturer under lave stressforhold, da høje temperaturer kan påvirke den samlede baggrundsoxidation. Et kontrolprøvesæt af orme, ingen H2O2 og ingen laserbestråling, anbefales til alle IV-FPOP-forsøg for at tage højde for baggrundsoxidation på grund af laboratorievedligeholdelse. En af de nuværende begrænsninger af denne teknik er det samlede antal oxidativt modificerede peptider identificeret og det samlede antal rester oxideret pr peptid for at få højere protein strukturelle oplysninger. Selv om det ikke anbefales, en stigning i oxidative ændringer kunne opnås ved hjælp af højere koncentrationer af hydrogenperoxid. En stigning i hydrogenperoxid kan i væsentlig grad ændre vigtige biologiske veje samt føre til oxidation-induceret udfoldelse. Hvis hydrogenperoxidkoncentrationen for IV-FPOP øges, anbefales det at teste ormens levedygtighed og baggrundsoxidation, da koncentrationer på over 200 mM ikke er blevet testet.
Den beskrevne LC-MS/MS-protokol kan optimeres og ændres, så den opfylder MS QC fra andre laboratorier. Brugen af 2D-kromatografi teknikker har tidligere vist sig at øge identifikationen af oxidativt modificerede peptider og proteiner18. Ikke desto mindre anbefales proteinberigelsesteknikker, der er målrettet mod et bestemt protein af interesse, ikke, herunder, men ikke begrænset til, antistofudfældning eller pull-down-analyser. Disse teknikker kan skævheder i retning af en protein conformer, hvis epitop / bindende sted for proteinet er blevet oxidativt ændret ved IV-FPOP. Nye udviklinger i fodaftryk radikale reagenser, såsom sulfat radikal anion10 eller trifluormethylering19 kunne øge alsidigheden af IV-FPOP. Selv om det eneste mærkningsreagens, der er testet in vivo indtil videre, er brintoverilte, kan andre laseraktiverede radikaler optimeres. Brugen af andre radikaler skulle vise sig at være forenelig med ormen levedygtighed, celle gennemtrængelig, og 248 nm laser bølgelængde. På grund af brugen af C. elegans som modelsystem for mange sygdomme hos mennesker har IV-FPOP potentiale til at have en stærk indvirkning på studiet af proteinstrukturens rolle i sygdomspagenese.
Disclosures
Denne publikation blev skrevet i delvis opfyldelse af JAE Ph.D. afse. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af start-up midler fra University of Maryland, Baltimore og NIH 1R01 GM 127595 tildelt LMJ. Forfatterne takker Dr. Daniel Deredge for hans hjælp til at redigere manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
- Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
- Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
- Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
- Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
- Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
- Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).
