Summary
בשנת vivo מהיר חמצון פוטוכימי של חלבונים (IV-FPOP) הוא חלבון הידרוקסיל הקיצונית הטכניקה הדפסה המאפשרת מיפוי של מבנה החלבון בסביבתם הטבעית. פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה וההגדרה של מערכת הזרימה של מיקרופלואידיג IV-FPOP.
Abstract
חמצון מהיר של חלבונים (FPOP) הוא מכבש הידרוקסיל חלבון רדיקלי (HRPF) שיטה המשמשת לחקר מבנה החלבון, ליגניות חלבונים, אינטראקציות חלבונים חלבון. Fpop מנצל לייזר krf excimer ב 248 ננומטר עבור פוטוליזה של מי חמצן כדי ליצור רדיקלים הידרוקסיל אשר בתורו oxidatively לשנות הממס נגיש שרשראות חומצות אמינו בצד. לאחרונה, הרחבנו את השימוש ב-FPOP של vivo חמצוני בתוך האלבורדיטיס (ג. אלגיה), זכאי IV-fpop. הנמטודות השקופים שימשו כמערכות מודל עבור מחלות אנושיות רבות. מחקרים מבניים ב- C. אלגיה על ידי IV-fpop הוא אפשרי בשל יכולתו של בעל החיים לספיגה מימן חמצן, שקיפות שלהם להקרנה לייזר ב 248 ננומטר, ואת הטבע הבלתי הפיך של השינוי. הרכבה של מערכת זרימה מיקרופלואידיג עבור הוספת תיוג IV-FPOP, הרביעי-FPOP פרמטרים, חילוץ חלבונים, ו-LC-MS/MS פרמטרים ממוטבים מתוארים להלן.
Introduction
הדפסת מעטפת חלבונים מצמידים לספקטרומטר מסה (MS) שימש בשנים האחרונות כדי ללמוד אינטראקציות חלבונים ושינויים בשינויים. הידרוקסיל חלבון רדיקלי מכונות הדפסה (HRPF) שיטות לבדוק את החלבון הממס הנגישות על ידי שינוי חלבון שרשראות חומצות אמינו צד. השיטה HRPF, מהיר חמצון פוטוכימיקלים של חלבונים (FPOP)1, כבר שימש לחקור מבנה חלבון בתוך מבחנה2, בתא (IC-fpop)3, ולאחרונה vivo (IV-fpop)4. Fpop מנצל 248 ננומטר לייזר הexcimer הלייזר על מנת ליצור במהירות רדיקלים הידרוקסיל על ידי פוטוליזה של תחמוצת המימן ליצור רדיקלים הידרוקסיל1. בתורו, רדיקלים אלה יכולים לתייג 19 מתוך 20 חומצות אמינו בסולם הזמן מיקרושניות, מהר יותר מאשר חלבונים יכולים להתפתח. למרות, הפעילות החוזרת של כל חומצת אמינו עם רדיקלים הידרוקסיל מרחיב 1000-קיפול, ניתן לנרמל חמצון שרשרת בצד על ידי חישוב גורם הגנה (PF)5.
מאז FPOP יכול לoxidatively לשנות חלבונים ללא קשר לגודל או הרצף העיקרי שלהם, זה מוכיח להיות יתרון עבור התא במחקרים vivo חלבון. IV-FPOP בוחן את מבנה החלבון בג, בדומה למחקרים בעלי מבחנה ובתא4. ג. אלאנים הם חלק ממשפחת הנמטודה ומשמשים רבות כמודל לחקר מחלות אנושיות. היכולת של התולעת לספיגה של תחמוצת המימן על ידי דיפוזיה פסיבי ופעיל מאפשר ללמוד מבנה החלבון במערכות גוף שונות. בנוסף, ג. אלגיה מתאימים IV-fpop בשל שקיפות שלהם ב 248 לייזר ננומטר באורך הגל הדרוש עבור fpop6. זיווג של שיטה זו לספקטרומטר מסה מאפשר זיהוי של חלבונים שהשתנו מרובים באמצעות גישות מסורתיות מלמטה למעלה.
בפרוטוקול זה נתאר כיצד לבצע את IV-FPOP לניתוח מבנה החלבון בג. הפרוטוקול הנסיוני דורש את ההרכבה וההגדרה של מערכת זרימה מיקרופלואידיג עבור IV-FPOP המותאם מקונרמן ואח '7. לאחר IV-FPOP, דגימות הם הומוגניים עבור חילוץ החלבון. דגימות חלבון הן פרוטפוליד ו פפטידים מנתחים על ידי כרומטוגרף נוזלי (LC) טנדם MS, ואחריו כימות.
Protocol
1. ס. אלאנים תחזוקה ותרבות
- הגדל וסנכרן מושבות תולעים לזחלים הרביעי שלהם (L4) בעקבות הליכים מעבדתיים סטנדרטיים8.
- היום של הניסוי IV-FPOP, לשטוף תולעים L4 ממדשאות בקטריאלי (OP50 E. coli) עם M9 מאגר (0.02 M KH2PO4, 0.08 M Na2Hpo4, 0.08 m הנאל, 1 מ"מ mgso 4).4
- השג 500 μL של ~ 10,000 בדיקת תולעים לכל IV-FPOP לדוגמה.
2. מערכת זרימה מיקרופלואידיג
- הפעל את מערכת הזרימה הרכבה על ידי גזירה של 2 ס מ פיסת פרופילן אתילן מחולק (FEP) צינורות (1/16 בתוך. קוטר חיצוני (מנת יתר) x 0.020 ב. קוטר פנימי (זיהוי)).
- באמצעות המחט ניקוי נקי, להרחיב את הזהות של אבובים FEP כדי ליצור מכתש קטן בקצה אחד בלבד, ~ 50 mm אורך. המכתש צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים 2 360 יקרומטר פיסות של סיליקה מותך.
הערה: אין להרחיב את הקצה הנגדי מכיוון שקצה זה ישמש רק להתאמת נימי השקע. - עם חותך קרמי, גזור 2 15 ס מ חתיכות של 250 יקרומטר לזהות התמזגו סיליקה. שתי היצירות הללו יהפכו לקווי הפיזור של מערכת הזרימה.
- באמצעות הדבקה עצמית, הקלטת את נימי הזיהוי של 2 250 יקרומטר יחד ומבטיחים שהם מקבילים זה לזה והקצוות שלהם הם 100%.
הערה: כדי להבטיח את הקצוות סיליקה התמזגו לא נמחץ לאחר חיתוך, ו הם ישרים ו 100% הסמיק אחד נגד השני, מומלץ לבדוק אותם באמצעות זכוכית מגדלת או תחת מיקרוסקופ סטריאו. - הכנס את שני נימים מודבק למכתש בעבודת יד של אבובים FEP. דחפו את הנימים עד לקצה של המכתש בעבודת יד.
התראה: כדי לשמור על יעילות מערכת הזרימה, אל תדחף את הלוע מעבר למכתש עבודת-יד (איור 1a). - מניחים נקודה קטנה של שרף אפוקסי על משטח נקי ומערבבים עם מחט מבתר.
- במהירות, באמצעות המחט זהה, מניחים טיפה קטנה של שרף בסוף נימים לפיזור שבו הם מתחברים עם אבובים FEP ולאפשר שרף להתייבש, תלוי לשקע-בצד למעלה, במשך כמה דקות (איור 1a).
- בעוד שרף מתייבש, קשירה צינורות fep ושני נימים יחד, לחתוך חדש 250 יקרומטר זיהוי נימי. הקפילר החדש יהפוך. לנימי הזרם של מערכת הזרימה ניתן לחשב את האורך הרצוי של הנימים באמצעות המשוואה הבאה:
כאשר אני אורך של נימי להיות חתוך בסנטימטרים, t הוא זמן התגובה הרצוי בדקות, f הוא שיעור הזרימה mL/min, ו-זיהוי הוא הקוטר הפנימי של נימי בסנטימטרים.
הערה: לאחר חיתוך נימי השקע, בדוק את הקצוות המבטיחים שהם ישרים ולא מרוסקים. - לאחר שרף יש מיובש, להכניס את נימי חדש דרך הקצה לשקע FEP צינור. החלק הפנימי של נימי שקע ושני נימי המים צריכים להיות מיושרים זה נגד זה בתוך אבובים FEP, זה יוצר את ערבוב T (איור 1b).
- אגד את נימי שקע ו FEP אבובים עם שרף אפוקסי טרי כפי שמתואר בשלבים 2.6 ו 2.7.
- הניחו לשרף היבש לאגד את מערכת הזרימה יחד. הגדר את מערכת הזרימה המיקרופלואידיג למחרת (איור 1c).
3. מערכת זרימה מיקרופלואידיג בvivo FPOP
- הכנס 4 משטירים מגנטיים בתוך 5 מזרק mL. מזרק זה הופך למזרק לדוגמה. הרימרים המגנטיים מונעים מהתולעים להתיישב בתוך המזרק במהלך IV-FPOP (איור 2A).
- מלא את שני 5 מ"ל מזרקים עם M9. ודא כי אין בועות אוויר בתוך כל מזרק כפי שהם יכולים להשפיע על קצב הזרימה ואת היעילות ערבוב.
- חבר מתאם Luer לכל מזרק 5 mL ומבטיח שהם צמודים ומאובטחים במקומם.
- . חברו כל מזרק לשסתום 3-2 אחד המזרק צריך להיות מוצמד ליציאה האמצעית של השסתום (איור 2B).
- Secure כל מזרק ל 5 מ ל למשאבת מזרק כפול ולהתאים את הצווארון לעצור מכני כדי למנוע את הלחץ על המזרק מבלוק דוחס. זכור את התוספת של השטירים המגנטיים בעת הגדרת הצווארון לעצור.
- לצרף כל הקצה נימי מערכת זרימת מיקרופלואידיג תוצרת בית לנמל העליון של כל שסתום 3-2 באמצעות אגוז ללא מוצא סופר, FEP שרוול, ו ferang, ללאהחלקה (איור 2B).
- ליציאה שנותרה פתוחה של שסתום 3-2 (הנמל התחתון), לצרף 10 ס מ 450 יקרומטר זיהוי נימי באמצעות אגוז ללא כמות סופר, שרוול fep, ו-סופר flangelessהחלקה (איור 2b). נימים אלה הופכים לנימים לדוגמה הנסוגים.
- הפעל את זרימת המשאבה ובדוק את כל החיבורים של מערכת הזרימה המיקרופלואידיג לדליפות חזותיות. זרימה לפחות שלושה אמצעי אחסון באמצעות קצב הזרימה הנסיוני. שיעור הזרימה הסופי תלוי בחלון הקרנה של לייזר, בתדר לייזר ובאמצעי אחסון שבריר של אפס-הכללה.
הערה: עבור פרוטוקול זה, קצב הזרימה הסופי של 375.52 μl/min חושב מחלון הקרנה לייזר של 2.55 מ"מ, 250 יקרומטר זיהוי התמזגו סיליקה, אפס שבר הדרה, ו 50 תדירות Hz.- נתיב הזרימה מסומן על-ידי החיצים בנקודת האחיזה לשסתום 3-2. כל מזרק יכול להיות ממולא ידנית על ידי הזזת ידית השסתום מהמיקום הגירוש לתנוחת הנסיגה.
הערה: הדלפות על שסתום 3-2 יכול להיות קבוע על ידי התעסקות מחדש את האגוז חסר הנעל סופר או להחליף את כל החיבורים שסתומים (אגוז בלתי מסודר במיוחד, FEP שרוול, או שלטון סופר האור). הדלפות על ערבוב-T דורשים הרכבה של מערכת הזרימה microflu, מיקרופלואידיג (שלבים 2.1 עד 2.11).
- נתיב הזרימה מסומן על-ידי החיצים בנקודת האחיזה לשסתום 3-2. כל מזרק יכול להיות ממולא ידנית על ידי הזזת ידית השסתום מהמיקום הגירוש לתנוחת הנסיגה.
- להעביר את מערכת הזרימה microflu, מיקרופלואידים לספסל ניסיוני ולאבטח את משקע החשמל לשלב מקרין באמצעות 360 יקרומטר מנת יתר פלדת אל-חלד (איור 2C, d).
- באמצעות מצית לטווח ארוך, לצרוב את הציפוי של סיליקה התמזגו בחלון הקרנה לייזר. נקו את הציפוי הצרוב בעזרת רקמה נטולת סיבים ומתנול.
הערה: לסירוגין בין מחזורי שריפת ומחזורי ניקוי מתנול כדי למנוע חימום יתר את הנימי כמו חום עודף יכול להמיס ו/או לשבור את הנימים. - מקמו את גוש הניצנים המגנטי מעל מזרק 5 מ ל המכיל את הרימרים המגנטיים. כוונן את המהירות והמיקום של בלוק הטירר המגנטי כך שהבלדרים המגנטיים בתוך 5 מזרק mL מסתובבים לאט ובהתמדה.
4. ב vivo FPOP
- הפעל את לייזר KrF excimer ולאפשר לתיראטרון להתחמם.
התראה: הלייזר פולט קרינה גלויה ובלתי נראית ב248-גל ננומטר שיכול לפגוע בעיניים. יש לענוד את הגנת העין הנכונה לפני הפעלת הלייזר ופתיחת חלון יציאת הקרן. - מדוד את אנרגיית הלייזר בתדר של 50 הרץ לפחות 100 פולסים על ידי הצבת החיישן האופטי בחלון יציאת הקרן.
הערה: עבור פרוטוקול זה, חלון 2.55 מ"מ הקרנה בשימוש עם אנרגיית לייזר של 150 ± 2.32 mJ. - השג approximatively 10,000 תולעים (500 μL) ולמשוך באופן ידני את המדגם לתוך המזרק לדוגמה.
- למלא את המזרק לדוגמה עם 2.5 mL של מאגר M9 עבור נפח המדגם הסופי של 3 מ ל. ודא כי לא מוצגים בועות אוויר לתוך המזרק לדוגמה.
- למלא את המזרק השני עם 3 מ מ של 200 mM H2O2, שוב להבטיח לא בועות אוויר מוצגים לתוך המזרק.
- בסופו של משקע outlet, מניחים צינור 15 מ ל חרוט עטוף ברדיד אלומיניום המכיל 6 מ מ של 40 מ"מ N'-Diמתילתיואוראה (DMTU), 40 מ"מ N-tert-בוטיל-α-פנילטין (PBN), ו 1% diמתיל סולפוקסיד כדי להרוות עודף H2O2, רדיקלים הידרוקסיל, ולעכב את מתיונין סולפוקסיד רדוקטאז פעילות, בהתאמה.
- הפעל את לייזר excimer מחלון התוכנה, לחכות הדופק הראשון, ולהתחיל את זרימת לדוגמה ממזרק כפול.
הערה: יש להפעיל דגימות בכפילויות ביולוגיות בטריפליטים טכניים תחת 3 דוגמאות: הקרנה לייזר עם H2o2 (דוגמה),אין הקרנה לייזר עם h2o 2 וללא הקרנה לייזר לא H2o2 (שולטת), בהיקף של 9 דגימות לכל ערכה ביולוגית. - לאסוף את המדגם כולו 15 מ"ל שפופרת, בעוד באופן פעיל ניטור זרימת לדוגמה עבור כל הדלפות חזותיים כמו בלחץ האחורי כמה מזרק לדוגמה יכול לפעמים לבנות.
- בעקבות IV-FPOP, גלולה תולעים על ידי צנטריפוגה ב 805 x g עבור 2 דקות. להסיר פתרון כיבוי, להוסיף 250 μl של מאגר הליזה (8 M אוריאה, 0.5% sds, 50 MM hepes, 50 מ"מ הנאל, 1 מ"מ edta, 1 מ"מ פנילמתיל פלופקסיל [PMSF]). העבר את הדגימה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה נקיה, הקפא הבזק ואחסן בשעה-80 ° צ' עד לדגימת העיכול.
5. הפקת חלבון, טיהור והפרוטפוליזיס
- הפשרת דגימות קפואות על קרח והומוגון על ידי sonication עבור 10 s, ואחריו הדגירה של 60 s קרח. סיבובים מרובים של sonication עשויים להידרש, הומואכל ניתן לצפות תחת stereomicroscope על ידי הצבת 2 μl לדוגמה סדרת מחלקים בשקופית מיקרוסקופ. לדוגמה הומוגון מלאה כאשר לא נראים חתיכות קטנות של תולעים.
- צנטריפוגה הומוגניים תולעים ב 400 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ולאסוף את supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי.
- קביעת ריכוזי חלבון לדוגמה באמצעות שיטת החומצה הבינותית (שיטת BCA) באמצעות הוראות היצרן.
הערה: ניתן לקבוע ריכוז לדוגמה בעזרת כל החלטה של ריכוז חלבון ביוכימיים. זכור תאימות מגיב עם מאגר הליזה (8 שתנן M, 0.5% SDS, 50 מ"מ HEPES, 50 mM הנאקל, 1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ PMSF). בנוסף, ייתכן שיהיה צורך בדילול מאגר. - השג 100 μg של חלבון מכל מדגם ומקום בצינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים.
- הוסף dithiothreitol (DTT) לריכוז הסופי של 10 מ"מ כדי להפחית את איגרות החוב הדיסולניות בכל הדגימות. מערבולת, ספין למטה, ו הדגירה דגימות ב 50 ° c עבור 45 דקות.
- דגימות מגניבות לטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- הוספת יודרחאמיד (רשות העתיקות) לריכוז סופי של 50 מ"מ כדי לקבל שאריות מופחתת באיחור. מערבולת, ספין למטה, ו הדגירה דגימות עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
- מיד לאחר האלקיללציה, מזרז את דגימת החלבון על-ידי הוספת 4 כרכים של 100% אצטון מקורר ו-דגירה ב-20 ° c בלילה.
- למחרת, החלבון גלולה מזרז על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 10 דקות לשטוף את הגלולה לדוגמה עם 90% אצטון, להסיר supernatant, ולאפשר גלולה יבש עבור 2 – 3 דקות.
- מחדש להשעות את כדור החלבון ב 25 מילימטר טריס-HCl (1 μg/μL). הוסיפו טריפסין בפרוטאז האחרון ליחס החלבונים של 1:50 (w/w) ולעכל דגימות ב 37 ° c למשך הלילה.
- ביום שלמחרת, כיבוי הטריפסין תגובת העיכול על ידי הוספת 5% חומצה פורמית.
הערה: מינימום של 0.5 μg של פפטידים לכל מדגם נדרש עבור ניתוח LC-MS/MS (שלבים 6.1-6.5). קביעת ריכוזי פפטיד לדוגמה באמצעות שיטת הצביעה הכמותית (עיין בטבלת החומרים) כפי שמתואר בפרוטוקול היצרן.
6. ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית-טנדם המסה (LC-MS/MS)
- השתמש בשלבים הבאים של LC mobile: מים ב 0.1% הפא (A) ו-ACN ב-0.1% FA (ב).
- טעינת 0.5 μg של פפטידים על עמודת השמנה (180 יקרומטר × 20 מ"מ) המכיל סי18 (5 יקרומטר, 100 Å) ולשטוף את המדגם עם 99% ממס a ו-1% B עבור 15 דקות בשיעור 15 μl/דקות.
- פפטידים נפרדים באמצעות עמודה ארוזה בתוך הבית (0.075 מ"מ זיהוי × 20 מ"מ) עם סי18 השלב הפוכה חומר (5 μm, 125 Å).
- השתמש בשיטת ההפרדה האנליטית הבאה: מעבר הצבע נשאב ב-300 nL/min עבור 120 דקות: 0 כ 1 דקות, 3% B; 2-90 דקות, 10-45% B; 100-105 דקות, 100% B; 106-120 דק ', 3% ב
- לבצע רכישת נתונים של פפטידים במצב יון חיובי ננו-electrospray יינון (nesi) באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.
הערה: עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בכלי מכשיר LC ביצועים אולטרה-משתמשים לספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. נעשה שימוש ברכישה תלוית נתונים. טווח הסריקה m/z עבור MS1 היה 3750 – 1500 ב 60,000 רזולוציה ו-60 s הדרה דינמי. יוני בעלי מצבי חיוב של +1 ו-> 6 לא נכללו. בקרת רווח אוטומטי (AGC) היעד של 5.5 e5 שימש עם זמן הזרקה מקסימלית של 50 ms ו סף עוצמה של 5.5 e4. יוני שנבחרו לMS2 היו חשופים לפיצול של דיסוציאציה באנרגיה גבוהה יותר (HCD) באמצעות 32% אנרגיית התנגשות מנורמלת. יוני קטעים זוהו בספקטרומטר ה15,000 וברזולוציה של 5.0 e4 AGC.
7. ניתוח נתונים
- חיפוש קבצי MS טנדם עם תוכנת ניתוח מלמטה למעלה פרוטאומניקס נגד מסד הנתונים C. אלגיה .
- הגדר את פרמטרי החיפוש של ניתוח החלבון כהמשך: טריפסין אחד החמיץ מחשוף, 375 – 1500 m/z פפטיד טווח המסה, השבר סובלנות המסה של 0.02, ו עמידות המונית הקודמן של 10 דפים לדקה. Carbamidomלציה מוגדר כשינוי סטטי וכולם יודעים שינוי קיצוני הידרוקסיל שרשרת צד9,10 כדינאמי. זיהוי פפטיד נוצר ב 95% ביטחון (בינוני) ושאריות ב 99% ביטחון (גבוה). קצב גילוי השקר (רוזוולט) מוגדר 1%.
- ייצוא נתונים למסד נתונים אלקטרוני ולסכם את היקף החמצון לכל פפטיד או שאריות באמצעות המשוואה מתחת11:
הערה: כאשר אזור EIC שונה הוא אזור כרומטוגרפי שחולצו (EIC) של פפטיד או שאריות עם שינוי חמצוני, ואזור EIC הוא האזור הכולל של פפטיד זהה או שאריות עם וללא שינוי חמצוני.
Representative Results
במערכת הזרימה המיקרופלואידיג המשמשת עבור IV-FPOP, H2O2 והתולעים נשמרות מופרדות עד לפני הקרנה לייזר. הפרדה זו מבטלת את התמוטטות של H2O2 על ידי מנגנונים אנדוגני ומנגנוני סלולר אחרים12. השימוש בקפילר 250 יקרומטר מראה שחזור מדגם כולל בין 63 ל-89% על-פני שני משכפל ביולוגי, בעוד שהקפילר מספר 150 יקרומטר מראה רק 21 – 31%התאוששות (איור 3a). השימוש של נימי זיהוי גדול יותר (250 μm) מוביל לזרימת תולעת טובה יותר במהלך IV-FPOP וזרימת התולעת היחידה (איור 3B) בהשוואה לקפילר קטן יותר (150 μm) (איור 3b). הקפילר 150 יקרומטר לא מאפשר זרימת תולעת אחת (איור 3c) ותולעים מרובות נראים לזרום יחד בחלון הלייזר לייזר אשר מפחית את כמות החשיפה לייזר לכל תולעת בודדת.
IV-FPOP היא טכניקת תיוג קוולנטי המגששים נגישות הממס בג. איור 4A מראה נציג מחולץ יון כרומאטוגרמות (eic) של fpop שונה ו פפטיד שאינו משתנה. התווית הרדיקלי הידרוקסיל משנה את הכימיה של פפטידים ששונו oxidatively, ובכך עושה FPOP שונה פפטידים יותר קוטבי. בשלב הפוך כרומטוגרפיה, IV-FPOP שונה פפטידים יש זמני שמירה מוקדם יותר מאשר פפטידים שעברו שינוי. הפיצול MS/MS של פפטידים מבודדים מאפשר זיהוי של שאריות oxidatively שונה (איור 4B).
IV-FPOP הראה oxidatively שונה סך של 545 חלבונים על פני שני משכפל ביולוגי בתוך C. אלגיה (איור 5א, ב). יתרון של IV-FPOP כמו חלבון שיטת הדפסה מסתמך על היכולת של הטכניקה לשנות חלבונים במגוון מערכות הגוף בתוך התולעים (איור 5C). שיטה זו תאפשר לחקור מבנה חלבונים ואינטראקציות חלבונים ללא קשר לרקמת גוף או איבר בתוך התולעת. יתר על כן, ניתוח MS טנדם מאשרת IV-FPOP בדיקות נגישות הממס ב vivo. תבנית החמצון של חלבון הלם חום 90 (Hsp90) מורכב עם המלווה רירן על חלבון UNC-45 נותח (איור 6). ניתוח MS/MS עבור Hsp90 מראה ארבעה משקעים oxidatively שונה (איור 6C, D), את היקף מנורמל של שינוי fpop (in (PF))5 מציין Hsp90's שאריות M698 להיות ממיס פחות נגיש מאשר שאריות R697, E699, ו E700 כאשר מאוגד ל-UNC-45 (איור 6c). הבדלים אלה בחמצון מאומתים לפי חישובי שטח השטח הנגיש לספרות (PDB 4I2Z13). לשאריות M698 יש ערך סאסא של 0.03 הנחשב לשאריות קבורות בהשוואה לשקעים R697, E699 וE700 עם ערכי סאסא גבוהים יותר (איור 6C). מיכל בן 14
איור 1. ב-vivo FPOP מיקרופלואידיג מערכת זרימה סכימטי. (א) שני קווי הפיוזינג (כתום) של הרביעי-fpop מערכת זרימה מוצגים בתוך אבובים fep (צהוב), המיקום המחייב הנכון של שרף האפוקסי מיוצג על ידי המעגל הכחול האור. (ב) להשלים התאספו ערבוב-T נוצר על ידי נימי זיהוי יקרומטר 3 250. המיקום הנכון של הכריכה שרף של שקע הפורקן לצינורות FEP מיוצגת על ידי המעגל הכחול האור. (ג) מערכת הזרימה המלאה התאספו לתיוג vivo קוולנטי של הג. לפני FPOP, תולעים נשמרים מופרדים H2O2 עד רק לפני תיוג; חלון הקרנה של הלייזר מוצג בכחול בהיר וקרן הלייזר מיוצגת על ידי הברק הסגול. . המספרים לא מקשקשים איור זה השתנה מ-Espino et al.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. מערכת מיקרופלואידיג במהלך IV-FPOP. (א) תמונה מייצגת של ס. אלאנים בתוך מזרק 5 מ ל. ללא ערבוב, התולעים להתיישב בתחתית המזרק (משמאל). הנימרים המגנטיים ובלוק העור מחזיקים את התולעים ההשעיה במהלך ניסויי IV-FPOP (מימין). (ב) תמונה מייצגת של מזרק של 5 מ ל, החדרת נימי, ונסיגה קפילר המחוברים לשסתום 3-2. נקודת האחיזה לשסתום 3-2 מוצגת בתנוחת הנסיגה. (ג) מערכת זרימה מיקרופלואידיג במהלך IV-fpop, בלוק העור המגנטי הוא עמדה מעל מזרק ה-mL של התולעים. (ד) Outlet קפילר מאובטח לשלב המקרין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
. איור 3 השוואת שחזור של C. אלגיה באמצעות שני נימי זיהוי. (א) אחוז שחזור של תולעים לאחר IV-fpop עבור שני משכפל ביולוגי (BR) עם 250 (אפור) ו 150 (שחור) יקרומטר מזהה נימים. קווי שגיאה מחושבים מסטיית התקן בין הטריליטים הטכניים. ג. אלגים זורמים באמצעות חלון לייזר מקרין דרך מ250 יקרומטר (ב) ו 150 יקרומטר (C) זיהוי נימים. התולעים הדוקים יותר. בנימים הקטנים יותר הקפילר 150 יקרומטר מראה. הופעות של תולעים איור זה השתנה מ-Espino et al.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. התוצאות של הנציג LC-MS/MS בעקבות IV-FPOP. (א) eic של פפטיד fpop שונה (אדום) ולא שונתה (כחול). הפפטיד שנבחר שייך חלבון actin-1. (ב) MS/ms הספקטרום של טעונה כפליים לא שונו actin-1 פפטיד 317-327. (ג) ms/ms ספקטרום של fpop שונה כפליים actin-1 פפטיד 317-327, בדוגמה זו P323 היה oxidatively שונה (y5+ יון, אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5. IV-FPOP oxidatively משנה חלבונים בתוך ג ' אלגיה. (א) דיאגרמת חיתוך קבוצות של חלבונים oxidatively ששונו בנוכחות של חמצן 200 mM מימן ב 50 הרץ על פני שני משכפל ביולוגי (BR), BR1 הוא כחול BR2 הוא צהוב. (ב) דיאגרמת חיתוך קבוצות של חלבונים מoxidatively ששונו, המזוהים בדגימות שעברו הקרינה, בקרת מי חמצן, ושליטה בתולעת בלבד ב-BR2 על-פני טרילקטים טכניים. (ג) תרשים עוגה של חלבונים מoxidatively ששונו בתוך מערכות גוף C. אלגיה שונות. איור זה השתנה מ-Espino et al.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6. לגבי שינויי הסדר של IV-FPOP לנגישות הממס. (א) רירן מלווה על חלבון UNC-45 (אפור) (מזההPDB 4I2Z13) הדגשת שני פפטידים ששונו המזוהים באמצעות ניתוח LC/ms/ms, 669-680 ו-698-706 (ירוק, שמאל שמאלי). UNC-45 מאוגד למקטע Hsp90 פפטיד (כחול). Oxidatively שינוי משקעים בתוך קטע זה מוצגים מקלות (אדום), ו-UNC-45 הוא מעובד כמשטח (שיבוץ הימני). (ב) טנדם MS ספקטרום של UNC-45 פפטיד 669-680 (למעלה) ו 698-706 (למטה) מראה B-ו-y-יונים עבור אובדן CO2, שינוי fpop. (ג) המחושב LN (PF) עבור שאריות Hsp90 oxidatively שהשתנו, R697, M698, E699 ו-E700. ערכי סאסא מחושבים עבור Hsp90 מסומנים מעל לכל שאריות. (ד) טנדם R697, M698, E699, ו E700 מציג + 16 fpop שינוי. איור זה השתנה מ-Espino et al.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
בחינת ביצועים הנוכחי למחקר של vivo חלבון-חלבון אינטראקציות (PPI) הוא העברת אנרגיה בתהודה הקרינה הפלואורסצנטית (לדאוג). בצורתו הפשוטה ביותר, טכניקה זו מחקרים PPI על ידי העברת אנרגיה בין שתי מולקולות כאשר הם בסמיכות אחד לשני15. בניגוד לטכניקות MS, אין לפרט את הרזולוציה לאפיין את השינויים והאינטראקציה של התאמות ברמת חומצת האמינו. טכניקות מבוססות MS כבר שימוש יותר ויותר למחקר של PPI16. IV-FPOP היא שיטת HRPF המאפשרת בניתוח vivo חלבון מבניים בג . כדי לתייג בהצלחה את C. אלגיה על ידי IV-fpop, חשוב להרכיב כראוי את מערכת הזרימה microflu, כדי להפחית את ההפסד לדוגמה. הקפילר 250 יקרומטר הראו למקסם את ההתאוששות לדוגמה בהשוואה נימים זיהוי קטן יותר4. נימי זיהוי גדולים יותר לא נבדקו, עם זאת מערכת הזרימה microfluidic מיועדת באמצעות נימי עם זהות זהה כמערכת cy, מסחרית הזרימה הזמינה מערכת למיון של C. אלגיה. 17 התולעת גודל לדוגמה חשוב גם, גודל מדגם של פחות מ-~ 10,000 לכל מדגם לפני fpop אינו תשואה ריכוזי חלבון גבוה מספיק עבור ניתוח LC-MS/ms. ניתן להשתמש במידות דוגמאות גבוהות יותר (תולעים > 10000) גם על-ידי התאמת אמצעי האחסון ההתחלתי (שלב 4.5).
הרכבה נכונה של מערכת הזרימה המיקרופלואידיסי חשובה. דליפות במסלול המדגם תוצאה של זרימה לא עקבית של תולעים או H2O2. הכללים, שרוולים, ו 3-2 שסתומים ניתן להשתמש מידי ניסויים מרובים IV-FPOP אם ניקה כראוי לאחר כל ניסוי. עם זאת, אנו ממליצים להרכיב מערכת זרימה מיקרופלואידיג חדשה עבור כל שכפול ביולוגי. אם המיקרופלואידיקה מורכב כראוי, התולעים ו-H2O2 יהיה לערבב ב ערבוב-T עם לחץ הגב מינימלי. כמו בקרת איכות (QC) של מערכת הזרימה microflu, מומלץ לבדוק את היעילות ערבוב באמצעות צבעים צבעוניים. חשוב לנטר את התנועה של השטירים המגנטיים בתוך מזרק התולעת במהלך IV-FPOP, מדגם לא תקין ערבוב על מזרק תולעת או ערבוב-T יכול לגרום ללחץ בחזרה גרימת דליפות. בנוסף, תנאי ערבוב עניים להוביל הפסדים לדוגמה גדולה, חשיפה לייזר עניים של תולעים בחלון הלייזר, וסתימת.
ג. אלגיה היא חשובה כדי להקטין את חמצון הרקע. אנו ממליצים לגדל את התולעים בטמפרטורות נמוכות תחת תנאי לחץ נמוך כמו טמפרטורות גבוהות יכול להשפיע על חמצון הרקע הכולל. מערכת לדוגמה שליטה של תולעים בלבד, לא H2O2 ו לא הקרנה לייזר, מומלץ עבור כל הניסויים IV-fpop לחשבון על חמצון הרקע בשל תחזוקת מעבדה. אחת המגבלות הנוכחיות של טכניקה זו היא המספר הכולל של פפטידים מoxidatively ששונו והמספר הכולל של שאריות תחמוצת לכל פפטיד על מנת להשיג מידע מבני חלבון גבוה יותר. למרות שלא מומלץ, עלייה בשינויים חמצוני יכול להיות להשיג באמצעות ריכוזים גבוהים יותר של מי חמצן מימן. עלייה של חמצן מימן יכול לשנות באופן משמעותי מסלולים ביולוגיים חשובים, כמו גם להוביל חמצון המושרה התגלגלות. אם הריכוז מימן מי חמצן עבור IV-FPOP הוא גדל, מומלץ לבדוק את הכדאיות התולעת ואת חמצון הרקע כמו ריכוזים גבוה יותר מ 200 מ"מ לא נבדקו.
פרוטוקול LC-MS/MS המתואר יכול להיות אופטימיזציה ושונה כדי לפגוש את ה-QC MS של מעבדות אחרות. השימוש בטכניקות 2D-כרומטוגרפיה הוצגה בעבר כדי להגביר את הזיהוי של פפטידים oxidatively שונה וחלבונים18. ובכל זאת, טכניקות העשרה חלבונים המכוונות חלבון מסוים של עניין אינם ממליצים, כולל אך לא רק משקעים של נוגדנים או משיכה למטה. טכניקות אלה יכול להטיה לעבר חלבון אחד לשעבר אם האתר אפירופה/איגוד של החלבון כבר oxidatively שונה על ידי IV-FPOP. ההתפתחויות החדשות ב-footprinting דפסה ריאגנטים רדיקלי, כגון אנעל הרדיקלי סולפט10 או trifluoromethylation19 יכול להגדיל את רב-תכליתיות של IV-fpop. למרות רק תיוג מגיב רק בvivo עד כה הוא חמצן מימן, רדיקלים אחרים המופעל לייזר יכול להיות אופטימיזציה. השימוש ברדיקלים אחרים צריך להוכיח שהוא תואם לכדאיות של תולעת, חדירות תאים, ואת אורך הגל לייזר 248 ננומטר. בשל השימוש C. אלגיה כמערכת מודל עבור מחלות אנושיות רבות, IV-fpop יש את הפוטנציאל יש השפעה חזקה בלימוד התפקיד של מבנה החלבון בפתוגנזה המחלה.
Disclosures
פרסום זה נכתב במימוש חלקי של התזה בדוקטורט של ג'אי. המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי סטארט-up כספים מאוניברסיטת מרילנד, בולטימור ו-NIH 1R01 GM 127595 הוענק ל-LMJ. המחברים מודים לד ר דניאל Deredge על עזרתו בעריכת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
- Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
- Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
- Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
- Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
- Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
- Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).
