Summary
In vivo быстрое фотохимическое окисление белков (IV-FPOP) является гидроксиль радикальным протеином, который позволяет картировать структуру белка в их родной среде. Этот протокол описывает сборку и настройку системы микрофлюидирования IV-FPOP.
Abstract
Быстрое окисление белков (FPOP) является гидроксиловрадикальным протеиновым протеиновым методом, используемым для изучения структуры белка, белково-лигандовых взаимодействий и белково-белковых взаимодействий. FPOP использует эксимерный лазер KrF на уровне 248 нм для фотолиза перекиси водорода для генерации гидроксилевых радикалов, которые, в свою очередь, окисляют доступные аминокислотные боковые цепи растворителя. Недавно мы расширили использование FPOP in vivo окислительной маркировки в Caenorhabditis elegans (C. elegans), озаглавленный IV-FPOP. Прозрачные нематоды используются в качестве модельных систем для многих заболеваний человека. Структурные исследования в C. elegans IV-FPOP возможны из-за способности животного унифицировать перекись водорода, их прозрачности к лазерному облучению на 248 нм, и необратимого характера модификации. В настоящем и сводке микрофлюидной системы потока для маркировки IV-FPOP, параметров IV-FPOP, экстракции белка и ОПтимизированных параметров LC-MS/MS.
Introduction
Белок следы в сочетании с масс-спектрометрии (MS) был использован в последние годы для изучения белковых взаимодействий и конформационных изменений. Гидроксил радикальный белок след (HRPF) методы зонд белка платежеспособность доступности путем изменения белка аминокислоты боковых цепей. Метод HRPF, быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP)1, был использован для зондирования структуры белка в пробирке2, в клетке (IC-FPOP)3, и совсем недавно in vivo (IV-FPOP)4. FPOP использует 248 нм эксимерный лазер длиной волны для того, чтобы быстро генерировать гидроксиловые радикалы путем фотолиза перекиси водорода, чтобы сформировать гидроксиловые радикалы1. В свою очередь, эти радикалы могут маркировать 19 из 20 аминокислот в микросекундной временной шкале, быстрее, чем белки могут разворачиваться. Хотя реактивность каждой аминокислоты с гидроксиловыми радикалами простирается в 1000 раз, можно нормализовать окисление боковой цепи, вычислив защитный фактор (ПФ)5.
Так как FPOP может окислительно модифицировать белки независимо от их размера или первичной последовательности, это оказывается выгодным для в-клеточных и in vivo исследований белка. IV-FPOP зондирует структуру белка в C. elegans подобно in vitro и в клетке исследования4. C. elegans являются частью семейства нематод и широко используются в качестве модели для изучения заболеваний человека. Способность червя унифицировать перекись водорода как пассивной, так и активной диффузией позволяет изучать структуру белка в различных системах организма. Кроме того, C. elegans подходят для IV-FPOP из-за их прозрачности на 248 нм лазерной длины волны, необходимой для FPOP6. Присоединение этого метода к масс-спектрометрии позволяет выявить несколько модифицированных белков с использованием традиционных подходов протеомики снизу вверх.
В этом протоколе мы описываем, как выполнять IV-FPOP для анализа структуры белка в C. elegans. Экспериментальный протокол требует сборки и настройки микрофлюидной системы потока для IV-FPOP, адаптированной из Konermann et al7. После IV-FPOP образцы гомогенизированы для извлечения белка. Образцы белков протеолиза и пептиды анализируются с помощью жидкого хроматографа (LC) тандема MS, а затем количественной оценки.
Protocol
1. C. elegans техническое обслуживание и культура
- Выращивайте и синхронизируйте колонии червей до четвертой стадии личинок (L4) в соответствии со стандартными лабораторными процедурами8.
- День IV-FPOP эксперимент, мыть L4 червей из бактериальных газонов (OP50 E. coli) с m9 буфера (0.02 M KH2PO4, 0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 мМ MgSO4).
- Получите 500 аликвот из 10 000 червей на IV-FPOP образца.
2. Сборка системы микрожидкости
- Начните сборку системы потока, разрезав 2 см кусок фторированного этилена пропилена (FEP) трубки (1/16 дюйма внешнего диаметра (o.d.) x 0.020 дюйма внутреннего диаметра (т.д.)).
- Используя чистую рассекающую иглу, расширьте i.d. труб FEP, чтобы сделать небольшой кратер только на одном конце, 50 мм в длину. Кратер должен быть достаточно большим, чтобы соответствовать двум 360 мкм o.d. кусочки слиэтого кремния.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не расширяйте противоположный конец, так как этот конец будет использоваться только для того, чтобы соответствовать капилляру розетки. - С помощью керамического резака вырежьте два 15 см кусочка 250 мкм т.д. сливного кремния. Эти две части станут вливая линии системы потока.
- Используя самоклеящуюся ленту, лента два 250 мкм т.д. капилляры вместе обеспечения они параллельны друг другу и их концы 100% покраснел.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения сросшиеся концы кремнезема не измельчаются после резки, и прямые и 100% покраснел друг против друга, рекомендуется изучить их с помощью увеличительного стекла или под стерео микроскопом. - Вставьте два лентой капилляров в ручной кратер труб FEP. Нажмите капилляры до самого края кратера ручной работы.
ВНИМАНИЕ: Для поддержания эффективности системы потока, не проталкивайте кратер ручной работы(рисунок 1a). - Поместите небольшую точку эпоксидной смолы на чистую поверхность и смешайте с рассекающей иглой.
- Быстро, используя ту же иглу, место небольшую каплю смолы в конце вливая капилляры, где они соединяются с трубами FEP и позволяют смолы, чтобы высохнуть, висит розетки вверх, в течение нескольких минут (Рисунок 1a).
- В то время как мизанта высыхает, связывая трубки FEP и два капилляра вместе, вырежьте новый 250 мкм i.d. капилляр. Новый капилляр станет выходной капилляром системы потока. Пожеланную длину капилляра можно вычислить с помощью приведенного ниже уравнения:
Там, где l длина капилляра должна быть разрезана в сантиметрах, т является желаемым временем реакции в минутах, f - это скорость потока в мЛ/мин, и т.д. - это внутренний диаметр капилляра в сантиметрах.
ПРИМЕЧАНИЕ: После резки выход капилляра, изучить концы обеспечения они прямые и не дробленая. - После того, как мизаня высохла, вставьте новый капилляр через конец трубы FEP. Внутренние концы капилляра розетки и два вливающих капилляры должны быть заподлицо друг против друга внутри труб FEP, это создает смешивания-T (Рисунок 1b).
- Свяжите капиллярную капиллярную и feP-трубку свежей эпоксидной смолой, описанной в шагах 2.6 и 2.7.
- Разрешить сушу на ночь, чтобы высохнуть, связывая систему потока вместе. Настройка микрофлюидной системы потока на следующий день(рисунок 1c).
3. Микрофлюидическая система потока для in vivo FPOP
- Вставьте четыре магнитных мешалки внутри одного шприца 5 мл. Этот шприц становится образцом шприца. Магнитные мешалки предотвратить червей от урегулирования внутри шприца во время IV-FPOP(рисунок 2A).
- Заполните два шприца 5 мл с M9. Убедитесь, что внутри каждого шприца нет пузырьков воздуха, так как они могут повлиять на скорость потока и эффективность смешивания.
- Подключите адаптер Luer к каждому шприцу 5 мл, гарантируя, что они плотно закрепились и закреплены на месте.
- Прикрепите каждый шприц к одному 3-2 клапану. Шприц должен быть прикреплен к среднему порту клапана(рисунок 2B).
- Закрепите каждый шприц 5 мл к двойному шприцу насоса и отрегулируйте механический воротник стопа, чтобы предотвратить чрезмерное давление на шприц от блока толкателя. Имейте в виду добавление магнитных мешалки при установке стоп воротник.
- Прикрепите каждый вливая капиллярный конец домашней микрофлюидной системы потока к верхнему порту каждого 3-2 клапана, используя супер flangeless гайка, FEP рукав, и супер flangeless ferrule (Рисунок 2B).
- К оставшемуся открытому порту 3-2 клапана (нижний порт) прикрепите 10 см 450 мкм, т.д. капилляр, используя супер флэнезебры гайки, рукав FEP и супер флавенжеры ferrule(рисунок 2B). Эти капилляры становятся выдавливными образцами капилляров.
- Запустите поток насоса и проверьте все соединения микрофлюидной системы потока на наличие визуальных утечек. Поток по крайней мере три шприца объемов, используя экспериментальную скорость потока. Конечная скорость потока зависит от окна лазерного облучения, лазерной частоты и объема фракции с нулевым исключением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола, конечная скорость потока 375,52 л/мин была рассчитана из окна лазерного облучения 2,55 мм, 250 мкм т.д. сросшиеся кремнезема, нулевая фракция исключения, и 50 Гц частоты.- Путь потока отмечен стрелками на ручке клапана 3-2. Каждый шприц можно пополнить вручную, переместив ручку клапана из положения высыхающего в положение снятия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Утечки на 3-2 клапана могут быть исправлены путем повторного завинчивания супер flangeless гайки или заменив любой из клапана соединения (супер flangeless гайки, FEP рукав, или супер flangeless ferrule). Утечки на смешивании-T требуют повторной сборки микрофлюидной системы потока (шаги от 2.1 до 2.11).
- Путь потока отмечен стрелками на ручке клапана 3-2. Каждый шприц можно пополнить вручную, переместив ручку клапана из положения высыхающего в положение снятия.
- Переместите микрофлюидную систему потока на экспериментальную скамейку и закрепите капилляр розетки на излучение, используя союз из нержавеющей стали 360 мкм(рисунок 2C,D).
- Используя дальнобойную зажигалку, сожгите покрытие слиэтого кремнезема в окне лазерного облучения. Очистите обожженое покрытие с помощью ткани, свободной от ворса и метанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные циклы горения и метанола очистки циклов, чтобы избежать перегрева капилляра, как избыток тепла может расплава и / или разорвать капилляра. - Расположите блок магнитного мешалки над шприцем 5 мл, содержащим магнитные мешалки. Отрегулируйте скорость и положение блока магнитного мешалки так, чтобы магнитные мешалки внутри шприца 5 мл вращались медленно и постоянно.
4. In vivo FPOP
- Включите эксимерный лазер KrF и дайте тиратрону прогреться.
ВНИМАНИЕ: Лазер излучает видимое и невидимое излучение на длине волны 248 нм, что может повредить глаза. Надлежащая защита глаз следует носить перед включением лазера и открытием окна выхода луча. - Измерьте энергию лазера на частоте 50 Гц для по крайней мере 100 импозав, разместив оптический датчик в окне выхода луча.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола использовалось окно облучения калибра 2,55 мм с лазерной энергией в 150 и 2,32 мДж. - Получить приблизительно 10000 червей (500 л) и вручную вывести образец в образец шприца.
- Заполните образец шприца 2,5 мл буфера M9 для окончательного объема образца 3 мл. Убедитесь, что пузырьки воздуха не вводятся в образец шприца.
- Заполните второй шприц с 3 мл 200 мМ H2O2, снова обеспечение не воздушные пузырьки вводятся в шприц.
- В конце капилляра розетки, место 15 мл конической трубки, завернутые в алюминиевую фольгу, содержащую 6 мл 40 мм N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 мм N-терт-Бутил-я-фенилнитрон (PBN), и 1% диметил сульфок, чтобы утолить избыток2H'-Di2, гидроксил радикальная активность, и метафинина сульфида.2
- Запустите эксимерный лазер из окна программного обеспечения, подождите первого импульса и начните поток образца из двойного шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть запущены в биологических дубликатов в технических трипликатов в 3 образцах условиях: лазерное облучение с H2O2 (образец), нет лазерного облучения с H2O2 и нет лазерного облучения no H2O2 (контроль), в общей сложности до 9 образцов на биологический набор. - Соберите весь образец в трубке 15 мл, при этом активно отслеживая поток образцов для любых визуальных утечек, так как некоторое давление спины от образца шприца иногда может накапливаться.
- После IV-FPOP, гранулы червей центрифугирования при 805 х г в течение 2 мин. Удалите раствор утоления, добавьте 250 л люсис буфера (8 M мочевины, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 мм NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ phenmethyllfonyl флуорид . Перенесите образец в чистую микроцентрифуговую трубку, заморозите вспышку и храните при -80 градусов по Цельсию до пищеварения образца.
5. Экстракция белка, очищение и протеолиза
- Оттепель замороженных образцов на льду и гомогенизации путем sonication в течение 10 с, а затем 60 с ледяной инкубации. Несколько раундов sonication может потребоваться, гоменат можно наблюдать под стереомикроскоп, поместив 2 зл образца aliquot на слайд микроскопа. Образец гомогенизации завершается, когда малы, чтобы не куски червей видны.
- Centrifuge гомогенизированных червей на 400 х г в течение 5 мин при 4 кв и собирать супернатанта в чистую микроцентрифугую трубку.
- Определите концентрацию белка образца с помощью анализа бисингониновой кислоты (BCA assay) с использованием инструкций производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация образца может быть определена с помощью любого биохимического протеинового анализа по выбору. Имейте в виду совместимость реагентов с буфером лисиса (8 М мочевины, 0,5% SDS, 50 мМ HEPES, 50 мм NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ PMSF). Кроме того, может потребоваться разбавление буфера. - Получить 100 мкг белка из каждого образца и поместить в чистые микроцентрифуговых труб.
- Добавьте дитиотрейтол (ДТТ) к конечной концентрации 10 мМ, чтобы уменьшить дисульфидные связи во всех образцах. Вихрь, спина вниз, и инкубировать образцы при 50 градусах по Цельсию в течение 45 минут.
- Охладите образцы до комнатной температуры в течение 10 мин.
- Добавьте йодоацетамид (IAA) к конечной концентрации 50 мМ, чтобы алкилировать снижение остатков. Вихрь, спина вниз, и инкубировать образцы в течение 20 минут при комнатной температуре защищены от света.
- Сразу же после алкилирования, осаждать протеиновый образец, добавляя 4 тома 100% предварительно охлажденный ацетон и инкубировать при -20 градусов по Цельсию в одночасье.
- На следующий день, гранулы белка осадок центрифугирования при 16000 х г в течение 10 мин. Вымойте образец гранулы с 90% ацетон, удалить супернатант, и дайте гранулы высохнуть в течение 2-3 мин.
- Повторно приостановить протеиновые гранулы в 25 мм Tris-HCl (1 мкг/л). Добавить трипсин при окончательном соотношении протеаза к белку 1:50 (w/w) и переварить образцы при 37 градусах Цельсия в одночасье.
- На следующий день утоляют реакцию пищеварения трипсина, добавляя 5% формической кислоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа LC-MS/MS (шаги 6.1-6.5) требуется минимум 0,5 мкг пептидов на образец. Определить концентрацию пептида образца с помощью количественного анализа глазного пептида (см. Таблицу материалов),как описано в протоколе производителя.
6. Высокопроизводительная жидкая хроматография-тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS)
- Используйте следующие фазы LC мобильных: вода в 0.1% FA (A) и ACN в 0.1% FA (B).
- Загрузите 0,5 мкг пептидов на столбец ловушки (180 мкм и 20 мм), содержащий C18 (5 мкм, 100 евро) и смойте образец 99% растворителя А и 1% B в течение 15 мин при скорости потока 15 л/мин.
- Отдельные пептиды с использованием штатной упакованной колонки (0,075 мм i.d. и 20 мм) с материалом обратной фазы C18 (5 мкм, 125).
- Используйте следующий аналитический метод разделения: градиент был перекачивается при 300 нл/мин в течение 120 мин: 0-1 мин, 3% В; 2–90 мин, 10–45% B; 100-105 мин, 100% B; 106–120 мин, 3% Б.
- Выполняйте сбор данных пептидов в положительном ионном режиме нано-электроспрепи ионизации (nESI) с помощью масс-спектрометра высокого разрешения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола была использована ультра-производительность LC (UPLC) инструмент пара с высоким разрешением масс-спектрометр. Использовалось приобретение зависимых данных. Диапазон сканирования м/з для MS1 составлял 3750-1500 при разрешении 60 000 и динамическом исключении 60 с. Ионы с состояниями заряда No1 и Nogt;6 были исключены. Использовалась цель автоматического контроля усиления (AGC) 5.5e5 с максимальным временем впрыска 50 мс и порогом интенсивности 5.5e4. Ионы, отобранные для MS2, подвергались разрозненности столкновения с более высокой энергией (HCD) с использованием 32% нормализованной энергии столкновения. Фрагменты были обнаружены в спектрометре с разрешением 15 000 и целью 5.0e4 AGC.
7. Анализ данных
- Поиск тандема MS файлов с снизу вверх протеомики анализа программного обеспечения в отношении базы данных C. elegans.
- Установите параметры поиска анализа белка следующим образом: один трипсин пропустил расщепление, 375-1500 м/з пептидной массы диапазона, допуск массы фрагмента 0,02, и прекурсор массы допуск 10 ppm. Карбамидометилирование устанавливается как статическая модификация и все знают, гидроксил радикальных боковых цепей модификаций9,10 как динамические. Идентификация пептида установлена на 95% уверенности (средний) и остаток на 99% доверия (высокий). Уровень ложного обнаружения (FDR) установлен на уровне 1%.
- Экспорт данных в электронную базу данных и обобщить степень окисления на пептид или остаток с помощью уравнения ниже11:
ПРИМЕЧАНИЕ: Там, где изменена область EIC, извлекается ионная хроматографическая область (EIC) пептида или остатков с окислительной модификацией, а область EIC представляет собой общую площадь того же пептида или остатка с окислительной модификацией и без нее.
Representative Results
В микрофлюидной системе потока, используемой для IV-FPOP, H2O2 и черви остаются разделенными до непосредственно до лазерного облучения. Это разделение устраняет распад H2O2 эндогенной каталазой и другими клеточными механизмами12. Использование 250 мкм i.d. капилляр показывает общее восстановление образца между 63-89% через две биологические репликации, в то время как 150 мкм i.d. капилляр показывает только 21-31% восстановления(рисунок 3A). Использование большего i.d. капилляра (250 мкм) приводит к лучшему потоку червей во время IV-FPOP и одиночного потока червей(рисунок 3B)по сравнению с меньшим т.д. капилляром (150 мкм)(Рисунок 3C). 150 мкм i.d. капилляр не позволяет одного потока червя(рисунок 3C) и несколько червей видны течет вместе на лазерное облучение окно, которое уменьшает количество лазерного воздействия на одного червя.
IV-FPOP является ковалентной технологии маркировки, что зонды платежеспособной доступности в C. elegans. На рисунке 4A показан апрезентированный ионный хроматограмм (EIC) модифицированного и неизмененного пептида FPOP. Гидроксиловая радикальная этикетка изменяет химию окислительно модифицированных пептидов, делая fPOP модифицированные пептиды более полярными. В хроматографии обратной фазы, IV-FPOP модифицированные пептиды имеют более раннее время удержания, чем неизмененные пептиды. MS/MS фрагментация изолированных пептидов позволяет выявить окислительно модифицированные остатки(рисунок 4B).
IV-FPOP показал, окисленно модифицированных в общей сложности 545 белков через два биологических репликации в C. elegans (Рисунок 5A, B). Преимущество IV-FPOP как метод протеинового следа зависит от способности метода модифицировать белки в различных системах тела внутри червей(рисунок 5C). Этот метод позволит исследовать структуру белка и взаимодействия белка независимо от ткани тела или органа внутри червя. Кроме того, тандем MS анализ подтверждает IV-FPOP зондов платежеспособной доступности in vivo. Была проанализирована структура окисления белка теплового шока 90 (Hsp90) в комплексе с белоком сопероном миозина UNC-45(рисунок 6). MS/MS анализ Hsp90 показывает четыре окислительно модифицированных остатка(рисунок 6C,D), нормализованная степень модификации FPOP (ln(PF))5 указывает на остатки Hsp90 M698 быть менее растворимыми, чем остатки R697, E699, и E700, когда связаны с UNC-45).Figure 6C Эти различия в окислении подтверждаются литературой растворителя доступной поверхности (SASA) расчеты (PDB 4I2'13). Остаток M698 имеет значение SASA 0.03, которое считается погребенным остатком по сравнению с остатками R697, E699 и E700 с более высокими значениями SASA(рисунок 6C). 14 Год
Рисунок 1. Схема микрофлюидной системы виво FPOP. (A) Две вливания линий (оранжевый) из системы потока IV-FPOP показаны внутри трубки FEP (желтый), правильное связывающее положение эпоксидной смолы представлено светло-голубой круг. (B) Полное собранное микширование-Т, образованное тремя 250 мкм т.д. капиллярами. Правильное положение связывающей с исьтыки капилляра к трубе FEP представлено светло-голубым кругом. (C) Полная собранная система потока для in vivo ковалентной маркировки C. elegans. До FPOP, черви хранятся отделены от H2O2 до непосредственно до маркировки; окно лазерного облучения показано в светло-голубом цвете, а лазерный луч представлен фиолетовой молнией. Цифры не масштабируются. Эта цифра была изменена с Espino et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Микрофлюидическая система во время IV-FPOP. (A) Представитель изображение C. elegans внутри 5 мл шприц. Не помешивая, черви оседают в нижней части шприца (слева). Магнитные мешалки и блок мешалки держать червей в подвеске во время IV-FPOP экспериментов (справа). (B) Представитель изображение шприца 5 мл, вливая капилляр, и снятие капилляра подключен к 3-2 клапана. Ручка клапана 3-2 отображается в положении снятия. (C) Микрофлюидная система потока во время IV-FPOP, блок магнитного мешалки положение над шприцем 5 mL червей. (D) Выход капилляра закреплены на излучении стадии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Сравнение потока и восстановления C. elegans с использованием двух i.d. капилляров. (A) Процентное восстановление червей после IV-FPOP для двух биологических репликаций (BR) с 250 (серый) и 150 (черный) мкм i.d. капилляров. Бары ошибок рассчитываются из стандартного отклонения в технических триплицах. C. elgans течет через лазерное облучение окно через 250 мкм (B) и 150 мкм (C) i.d. капилляры. Черви более плотно уплотняются в меньшем капилляре. 150 мкм i.d. капилляр показывает слипание червей. Эта цифра была изменена с Espino et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Представитель LC-MS/MS результаты после IV-FPOP. (A) EIC модифицированного пептида FPOP (красный) и неизмененный (синий). Выбранный пептид относится к белку атин-1. (B)MS/MS спектр вдвойне заряженный актин-1 пептид 317-327. (C)MS/MS спектр авт.с. вдвойне заряженный fPOP модифицированный актид-1 пептид 317-327, в этом примере P323 был окислительно модифицирован (y5ион, красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5. IV-FPOP окисляет белки в C. elegans. (A) Venn диаграмма окислительно модифицированных белков в присутствии 200 мм перекиси водорода на 50 Гц через две биологические репликации (BR), BR1 в синем и BR2 в желтом. (B) Venn диаграмма окислительно модифицированных белков, определенных в облученных образцах, контроль перекиси водорода, и только для гельмив управления в BR2 через технические трипликаты. (C) Pie диаграмма окислительно модифицированных белков в различных системах тела C. elegans. Эта цифра была изменена с Espino et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6. Сопоставление модификаций IV-FPOP с платежеспособной доступностью. (A) Белок myosin chaperon UNC-45 (серый) (PDB ID 4I2'13) подчеркивая два модифицированных пептида, выявленных анализом LC/MS/MS, 669-680 и 698-706 (зеленый, левый всет). КООН-45 связан с пептидным фрагментом Hsp90 (синим). Окислительно модифицированные остатки в этом фрагменте отображаются в палочках (красный), а UNC-45 отображается как поверхность (правая влинее). (B) Тандем MS спектра коонц-45 пептида 669-680 (вверху) и 698-706 (внизу) показаны b- и y-ионы для потери CO2, модификация FPOP. (C) Рассчитанный ln (PF) для окислительно модифицированных остатков Hsp90, R697, M698, E699 и E700. Рассчитанные значения SASA для Hsp90 обозначаются выше каждого остатка. (D) Тандем MS спектра для R697, M698, E699, и E700 показаны модификации FPOP No 16. Эта цифра была изменена с Espino et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Текущий ориентир для изучения in vivo белково-белковых взаимодействий (PPI) является флуоресценция резонансной передачи энергии (FRET). В своей самой простой форме, этот метод исследования PPI по передаче энергии между двумя молекулами, когда они находятся в непосредственной близости друг от друга15. В отличие от методов MS, FRET не имеет разрешения для характеристики конформантарных изменений и мест взаимодействия на аминокислотном уровне. МЕТОДы ms на основе все чаще используются для изучения ИЦП16. IV-FPOP является методом HRPF, который позволяет для инвиво-белка структурного анализа в C. elegans. Для того, чтобы успешно маркировать C. elegans IV-FPOP, важно правильно собрать микрофлюидную систему потока, чтобы уменьшить потерю образца. 250 мкм i.d. капилляр показал, чтобы максимизировать восстановление образца по сравнению с меньшими i.d. капилляры4. Большие i.d. капилляры не были протестированы, однако микрофлюидная система потока разработана с использованием капилляра с тем же i.d. как коммерчески доступная система цитометрии потока для сортировки C. elegans. 17 Размер выборки червя также имеет важное значение, размер выборки менее 10 000 евро за образец до того, как FPOP не дает концентраций белка, достаточно высоких для анализа LC-MS/MS. Более высокие размеры образцов (10 000 червей) также могут быть использованы путем корректировки начального стартового объема (шаг 4.5).
Важнейшее значение имеет правильное собрание микрофлюидной системы потока. Утечки в образец пути привести к несовместимым потоком червей или H2O2. Феррулес, рукава и 3-2 клапана могут быть использованы повторно из нескольких iv-FPOP экспериментов, если правильно очищены после каждого эксперимента. Тем не менее, мы рекомендуем собрать новую микрофлюидную систему потока для каждой биологической репликации. Если микрофлюитика правильно собрана, черви и H2O2 будут смешиваться на смешивании-T с минимальным давлением спины. В качестве контроля качества (КК) микрофлюидной системы потока, мы рекомендуем проверить эффективность смешивания с помощью цветных красителей. Важно контролировать движение магнитных мешалки внутри шприца червя во время IV-FPOP, неправильного смешивания образцов на шприц червя или смешивания-T может привести к обратно давление вызывает утечки. Кроме того, плохие условия смешивания приводят к большим потерям образцов, плохому лазеровому воздействию червей в лазерном окне и засорению.
C. elegans техническое обслуживание важно для того, чтобы уменьшить фоновое окисление. Мы рекомендуем выращивать червей при низких температурах при низких стрессовых условиях, так как высокие температуры могут повлиять на полное окисление фона. Контрольный набор проб только червей, нет H2O2 и не лазерное облучение, рекомендуется для всех IV-FPOP экспериментов для учета фонового окисления из-за лабораторного обслуживания. Одним из нынешних ограничений этого метода является общее количество идентифицированных окислительно модифицированных пептидов и общее количество остатков, окисленных на пептид, чтобы получить более высокую структурную информацию о белка. Хотя это и не рекомендуется, увеличение окислительных модификаций может быть достигнут за счет использования более высоких концентраций перекиси водорода. Увеличение перекиси водорода может значительно изменить важные биологические пути, а также привести к окислению индуцированной разворачивается. Если концентрация перекиси водорода для IV-FPOP увеличена, рекомендуется проверить жизнеспособность червя и фоновое окисление, так как концентрации выше 200 мМ не были протестированы.
Описанный протокол LC-MS/MS может быть оптимизирован и изменен в соответствии с MS КК других лабораторий. Использование 2D-хроматографии методы ранее было показано, чтобы увеличить идентификацию окислительно модифицированных пептидов и белков18. Тем не менее, методы обогащения белка, которые нацелены на конкретный белок, представляющий интерес, не рекомендуются, в том числе, но не ограничивались выпадениями антител или выдвижной анализы. Эти методы могут смещения к одному конформеру белка, если эпитоп / связывание сайт белка был окислительно изменен IV-FPOP. Новые разработки в области следов радикальных реагентов, таких как сульфат радикальный анион10 или трифторметилирование19 может увеличить универсальность IV-FPOP. Хотя единственным реагентом маркировки, испытанным в vivo, является перекись водорода, другие лазерные радикалы могут быть оптимизированы. Использование других радикалов должно быть совместимым с жизнеспособностью червя, проницаемой клеткой, и 248 нм лазерной длины волны. Благодаря использованию C. elegans в качестве модели системы для многих заболеваний человека, IV-FPOP имеет потенциал, чтобы иметь сильное влияние в изучении роли структуры белка в патогенезе болезни.
Disclosures
Эта публикация была написана в частичном выполнении кандидатской диссертации JAE. Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана стартовыми фондами Из Университета Мэриленда, Балтимора и NIH 1R01 GM 127595, присужденной LMJ. Авторы благодарят доктора Даниэля Дереджа за помощь в редактировании рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
- Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
- Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
- Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
- Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
- Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
- Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).
