Summary
In vivo snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (IV-FPOP) is een hydroxyl radicale eiwit footprinting techniek die het mogelijk maakt voor het in kaart brengen van eiwitstructuur in hun eigen omgeving. Dit protocol beschrijft de assemblage en opzet van het IV-FPOP microfluidic flow systeem.
Abstract
Snelle oxidatie van eiwitten (FPOP) is een hydroxyl radicale eiwit footprinting (HRPF) methode die wordt gebruikt om eiwitstructuur, eiwit-ligand interacties, en eiwit-eiwit interacties te bestuderen. FPOP maakt gebruik van een KrF excimer laser op 248 nm voor fotolyse van waterstofperoxide om hydroxyl radicalen die op hun beurt oxidatief wijzigen oplosmiddel-toegankelijke aminozuur zijketens te genereren. Onlangs hebben we het gebruik van FPOP van in vivo oxidatieve etikettering in Caenorhabditis elegans (C. elegans), getiteld IV-FPOP, uitgebreid. De transparante aaltjes zijn gebruikt als modelsystemen voor vele menselijke ziekten. Structurele studies in C. elegans door IV-FPOP is haalbaar vanwege het vermogen van het dier om waterstofperoxide te nemen, hun transparantie om bestraling te laseren op 248 nm, en de onomkeerbare aard van de wijziging. De assemblage van een microfluïdische stroomsysteem voor IV-FPOP-etikettering, IV-FPOP-parameters, eiwitextractie en LC-MS/MS geoptimaliseerde parameters worden hierin beschreven.
Introduction
Eiwitfootprinting gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) is de afgelopen jaren gebruikt om eiwitinteracties en conformatieveranderingen te bestuderen. Hydroxyl radicale eiwit footprinting (HRPF) methoden sonde eiwit oplosmiddel toegankelijkheid door het wijzigen van eiwit aminozuur zijketens. De HRPF-methode, snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP)1, is gebruikt om de eiwitstructuur in vitro2, in-cell (IC-FPOP)3en meest recent in vivo (IV-FPOP)4te onderzoeken . FPOP maakt gebruik van een 248 nm golflengte excimer laser om snel hydroxyl radicalen te genereren door fotolyse van waterstofperoxide te vormen hydroxyl radicalen1. Op hun beurt kunnen deze radicalen 19 van de 20 aminozuren op een microsecondeschaal labelen, sneller dan eiwitten zich kunnen ontvouwen. Hoewel de reactiviteit van elk aminozuur met hydroxylradicalen zich 1000 keer uitbreidt, is het mogelijk om zijkettingoxidatie te normaliseren door een beschermingsfactor (PF)5te berekenen.
Aangezien FPOP eiwitten oxidatief kan wijzigen, ongeacht hun grootte of primaire volgorde, blijkt het voordelig te zijn voor in-cell en in vivo eiwitstudies. IV-FPOP sondes eiwitstructuur in C. elegans vergelijkbaar met in vitro en in-cell studies4. C. elegans maken deel uit van de nematodenfamilie en worden veel gebruikt als model om menselijke ziekten te bestuderen. Het vermogen van de worm om waterstofperoxide op te nemen door zowel passieve als actieve diffusie maakt de studie van de eiwitstructuur in verschillende lichaamssystemen mogelijk. Bovendien zijn C. elegans geschikt voor IV-FPOP vanwege hun transparantie op de 248 nm lasergolflengte die nodig is voor FPOP6. Koppeling van deze methode aan massaspectrometrie maakt het mogelijk om meerdere gemodificeerde eiwitten te identificeren met behulp van traditionele bottom-up proteomics benaderingen.
In dit protocol beschrijven we hoe iv-FPOP uit te voeren voor de analyse van eiwitstructuur in C. elegans. Het experimentele protocol vereist de montage en installatie van microfluidic flow systeem voor IV-FPOP aangepast van Konermann etal. 7. Na IV-FPOP worden monsters gehomogeniseerd voor eiwitextractie. Eiwitmonsters worden geproteolyzed en peptiden worden geanalyseerd door vloeibare chromatograaf (LC) tandem MS, gevolgd door kwantificering.
Protocol
1. C. elegans onderhoud en cultuur
- Groeien en synchroniseren wormen kolonies om hun vierde larven (L4) stadium na standaard laboratoriumprocedures8.
- De dag van IV-FPOP experiment, was L4 wormen van bacteriële gazons (OP50 E. coli) met M9 buffer (0,02 M KH2PO4, 0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
- Verkrijg 500 μL aliquots van ~10.000 wormen per IV-FPOP monster.
2. Microfluïdische stroomsysteemmontage
- Start de montage van het stroomsysteem door een stuk gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP) buizen (1/16 inch buitendiameter (o.d.) x 0,020 in binnendiameter (i.d.)) te snijden.
- Met behulp van een schone ontleden naald, verwijden de i.d. van de FEP slang om een kleine krater te maken aan de ene kant alleen, ~ 50 mm in lengte. De krater moet groot genoeg zijn om twee 360 μm o.d. stukken gesmolten silica te passen.
LET OP: Verbreed het andere uiteinde niet, omdat dit uiteinde alleen wordt gebruikt om de haarvaten van het stopcontact te passen. - Snijd met een keramische frees twee stukken van 15 cm van 250 μm i.d. gesmolten silica. Deze twee stukken worden de inbrengende lijnen van het stroomsysteem.
- Met behulp van zelfklevende tape, tape de twee 250 μm i.d. haarvaten samen ervoor te zorgen dat ze parallel aan elkaar en hun uiteinden zijn 100% gespoeld.
OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de gesmolten silicauiteinden niet worden verpletterd na het snijden en recht zijn en 100% tegen elkaar worden gespoeld, wordt aanbevolen om ze te onderzoeken met behulp van een vergrootglas of onder een stereomicroscoop. - Steek de twee afgeplakte haarvaten in de handgemaakte krater van de FEP-slang. Duw de haarvaten tot aan de rand van de handgemaakte krater.
LET OP: Om de effectiviteit van het stroomsysteem te behouden, duw niet langs de handgemaakte krater (Figuur 1a). - Plaats een kleine stip epoxyhars op een schoon oppervlak en meng met een ontledennaald.
- Plaats snel, met behulp van dezelfde naald, een kleine druppel hars aan het einde van de inbrengende haarvaten waar ze verbinding maken met de FEP-slang en laat de hars drogen, opknoping uitlaat-kant omhoog, voor een paar minuten (Figuur 1a).
- Terwijl de hars droogt, de FEP-slang en twee haarvaten aan elkaar bindt, snijdt u een nieuwe 250 μm i.d. capillaire. De nieuwe capillaire zal de uitlaat capillair van het stroomsysteem worden. De gewenste lengte van de capillaire kan worden berekend met behulp van de onderstaande vergelijking:
Waar l is lengte van de capillaire te snijden in centimeters, t is de gewenste reactietijd in minuten, f is de stroomsnelheid in mL / min, en i.d. is de binnendiameter van de capillaire in centimeters.
LET OP: Na het snijden van de uitgang capillair, onderzoeken de uiteinden ervoor te zorgen dat ze recht zijn en niet verpletterd. - Zodra de hars is gedroogd, steek de nieuwe capillaire door de FEP buizenuitlaat einde. De uiteinden van de uitgang capillair en de twee inbrengende haarvaten moeten tegen elkaar worden gespoeld in de FEP-slang, dit creëert de meng-T (Figuur 1b).
- Bind de afvoer capillaire en FEP-slang met verse epoxyhars zoals beschreven in stappen 2.6 en 2.7.
- Laat de hars 's nachts drogen en bind het stroomsysteem aan elkaar. Het microfluïdische stroomsysteem de volgende dag instellen (figuur 1c).
3. Microfluïde stroomsysteem voor in vivo FPOP
- Steek vier magnetische roerstaafjes in een 5 mL spuit. Deze spuit wordt de monsterspuit. De magnetische roerderen voorkomen dat de wormen zich in de spuit nestelen tijdens IV-FPOP (Figuur 2A).
- Vul de twee 5 mL spuiten met M9. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in elke spuit als ze kunnen invloed hebben op de debiet en mengefficiëntie.
- Sluit een Luer-adapter aan op elke 5 mL-spuit, zodat deze vingervast en stevig op hun plaats zit.
- Bevestig elke spuit aan een enkele 3-2 klep. De spuit moet aan de middelste poort van de klep worden bevestigd(figuur 2B).
- Zet elke 5 mL spuit vast aan de dubbele spuitpomp en pas de mechanische stopkraag aan om overdruk op de spuit van het duwblok te voorkomen. Houd rekening met de toevoeging van de magnetische roerderen bij het instellen van de stopkraag.
- Bevestig elke infysaire uiteinde van de zelfgemaakte microfluidic flow systeem aan de bovenste poort van elke 3-2 klep met behulp van een super flensless moer, FEP mouw, en super flensless ferrule (Figuur 2B).
- Bevestig aan de resterende geopende poort van de 3-2 klep (onderste poort) een 10 cm 450 μm i.d. capillaire met behulp van een super flensloze moer, FEP-hoes en superflangeless ferrule (Figuur 2B). Deze haarvaten worden de terugtrekkende monsterhaarvaten.
- Start de pompstroom en controleer alle aansluitingen van het microfluïdische stroomsysteem op visuele lekken. Stroom ten minste drie spuitvolumes met behulp van de experimentele stroomsnelheid. De uiteindelijke stroomsnelheid is afhankelijk van het laserstralingsvenster, de laserfrequentie en het volume van de nuluitsluitingsfractie.
OPMERKING: Voor dit protocol werd een eindstroomsnelheid van 375,52 μL/min berekend op basis van een laserbestralingsvenster van 2,55 mm, 250 μm i.d. gesmolten silica, nuluitsluitingsfractie en 50 Hz-frequentie.- Het stroompad wordt gemarkeerd door de pijlen op de 3-2 klepgreep. Elke spuit kan handmatig worden bijgevuld door de klepgreep van de uitrijpositie naar de terugtrekkende positie te verplaatsen.
LET OP: Lekken in de 3-2 klep kunnen worden opgelost door de superflensloze moer opnieuw te schroeven of een van de klepaansluitingen te vervangen (super flensless moer, FEP-hoes of superflangeless ferrule). Lekken bij de meng-T vereisen een hermontage van het microfluïdische stroomsysteem (stappen 2.1 tot en met 2.11).
- Het stroompad wordt gemarkeerd door de pijlen op de 3-2 klepgreep. Elke spuit kan handmatig worden bijgevuld door de klepgreep van de uitrijpositie naar de terugtrekkende positie te verplaatsen.
- Verplaats het microfluïdische stroomsysteem naar de experimentele bank en zet de afvoercapillaire naar het uitstralende stadium met behulp van een 360 μm o.d. roestvrijstalen unie(figuur 2C,D).
- Met behulp van een long-reach aansteker, branden de coating van de gesmolten silica op de laser bestraling venster. Reinig de verbrande coating met pluisvrij weefsel en methanol.
OPMERKING: Wissel tussen verbrandingscycli en methanolreinigingscycli af om oververhitting van de capillaire werking te voorkomen, omdat overtollige warmte kan smelten en/of de capillaire kan breken. - Plaats het magneetroerderblok boven de 5 mL spuit met de magnetische roerderen. Pas de snelheid en positie van het magneetroerderblok aan, zodat de magnetische roerderen in de 5 mL-spuit langzaam en constant draaien.
4. In vivo FPOP
- Zet de KrF excimer laser aan en laat de thyratron opwarmen.
LET OP: De laser zendt zichtbare en onzichtbare straling uit op een golflengte van 248 nm die de ogen kan beschadigen. Een goede oogbescherming moet worden gedragen voordat u de laser inschakelt en het raam van de straaluitgang opent. - Meet de laserenergie op een frequentie van 50 Hz voor ten minste 100 pulsen door de optische sensor bij het straaluitgangsvenster te plaatsen.
OPMERKING: Voor dit protocol werd een bestralingsvenster van 2,55 mm gebruikt met een laserenergie van 150 ± 2,32 mJ. - Verkrijg ongeveer 10.000 wormen (500 μL) en trek het monster handmatig terug in de monsterspuit.
- Vul de monsterspuit met 2,5 mL M9-buffer voor een eindmonstervolume van 3 mL. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit van het monster worden gebracht.
- Vul de tweede spuit met 3 mL van 200 mM H2O2,zodat er geen luchtbellen in de spuit worden gebracht.
- Aan het einde van de uitgangcapillair, plaats een conische buis van 15 mL verpakt in aluminiumfolie met 6 mL van 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-fenylnitrone (PBN) en 1% dimethylsulfoxide om overtollige H2O2, hydroradicalen xyl xyl en rem te doven methioninesulfoxide reductaseactiviteit.
- Start de excimerlaser vanuit het softwarevenster, wacht op de eerste puls en start de monsterstroom van de dubbele spuit.
OPMERKING: Monsters moeten worden uitgevoerd in biologische duplicaten in technische drievoud onder 3 monsteromstandigheden: laserbestraling met H 2O2 (monster), geen laserbestraling met H2O2 en geen laserbestraling nr.2 - Verzamel het hele monster in de buis van 15 mL, terwijl actief de monsterstroom wordt gecontroleerd op visuele lekken, omdat sommige tegendruk van de monsterspuit zich soms kan ophopen.
- Na IV-FPOP voegen pelletwormen door centrifugering bij 805 x g gedurende 2 min. Verwijder de blusoplossing, voeg 250 μL lysisbuffer toe (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride [PMSF]). Breng het monster over op een schone microcentrifugebuis, vriesvast en bewaar op -80 °C tot de spijsvertering van het monster.
5. Eiwitextractie, zuivering en proteolyse
- Ontdooi bevroren monsters op ijs en homogeniseer door middel van sonicatie voor 10 s, gevolgd door een 60 s ijs incubatie. Er kunnen meerdere geluidsrondes nodig zijn, homogenaat kan onder een stereomicroscoop worden waargenomen door een monster van 2 μL op een microscoopplaat te plaatsen. Monsterhomogenisatie is voltooid wanneer kleine tot geen stukjes wormen worden gezien.
- Centrifugeer gehomogeniseerde wormen op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C en verzamel de supernatant in een schone microcentrifugebuis.
- Bepaal de eiwitconcentraties in monsters met behulp van een bicinchoninezuurtest (BCA-test) met behulp van de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: De monsterconcentratie kan worden bepaald met behulp van een biochemische eiwitconcentratietest naar keuze. Houd rekening met reagenscompatibiliteit met lysisbuffer (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Bovendien kan een bufferverdunning nodig zijn. - Verkrijg 100 μg eiwit uit elk monster en plaats in schone microcentrifugebuizen.
- Voeg dithiothreitol (DTT) toe aan een eindconcentratie van 10 mM om disulfidebindingen in alle monsters te verminderen. Vortex, spin naar beneden, en incuberen monsters op 50 °C gedurende 45 min.
- Koel monsters tot kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Voeg iodoacetamide (IAA) toe aan een uiteindelijke concentratie van 50 mm om minder residuen te alkyleren. Vortex, spin naar beneden, en incubeer monsters voor 20 min bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Onmiddellijk na de alkylation, neerslaan het eiwitmonster door het toevoegen van 4 volumes van 100% voorgekoelde aceton en incubeerbij -20 °C 's nachts.
- De volgende dag, pellet eiwit neerslag door centrifugering op 16.000 x g voor 10 min. Wash monster pellet met 90% aceton, verwijder supernatant, en laat pellet te drogen voor 2-3 min.
- Schort de eiwitpellet opnieuw op in 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL). Voeg trypsine toe bij een laatste protease-eiwitverhouding van 1:50 (w/w) en verteer monsters bij 37 °C 's nachts.
- De volgende dag doven de trypsin ederreactie door het toevoegen van 5% mierenzuur.
OPMERKING: Voor LC-MS/MS-analyse (stappen 6.1-6.5) is minimaal 0,5 μg peptiden per monster nodig. Bepaal de peptideconcentraties van het monster met behulp van een kwantitatieve colorimetrische peptidetest (zie de materiaaltabel),zoals beschreven in het protocol van de fabrikant.
6. Krachtige vloeibare chromatografie-tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS)
- Gebruik de volgende LC mobiele fasen: water in 0,1% FA (A) en ACN in 0,1% FA (B).
- Laad 0,5 μg peptiden op een valkolom (180 μm × 20 mm) met C18 (5 μm, 100 Å) en was monster met 99% oplosmiddel A en 1% B voor 15 min bij 15 μL/min debiet.
- Afzonderlijke peptiden met behulp van een in-house verpakte kolom (0,075 mm i.d. × 20 mm) met C18 omgekeerde fase materiaal (5 μm, 125 Å).
- Gebruik de volgende analysescheidingsmethode: de helling werd gepompt op 300 nL/min gedurende 120 min: 0−1 min, 3% B; 2−90 min, 10−45% B; 100−105 min, 100% B; 106−120 min, 3% B.
- Gegevensverwerving van peptiden uitvoeren in positieve ionenmodus nano-elektrospray ionisatie (nESI) met behulp van een hoge resolutie massaspectrometer.
OPMERKING: Voor dit protocol werd gebruik gemaakt van een ultra-performance LC (UPLC) instrument koppel aan een hoge resolutie massaspectrometer. Gegevensafhankelijke acquisitie werd gebruikt. De m/z-scanbereik voor MS1 was 3750-1500 bij een resolutie van 60.000 en 60 s dynamische uitsluiting. Ionen met kostenstatussen van +1 en >6 zijn uitgesloten. Een automatische gain control (AGC) doelstelling van 5.5e5 werd gebruikt met een maximale injectietijd van 50 ms en een intensiteitsdrempel van 5,5e4. Ionen geselecteerd voor MS2 werden onderworpen aan een hogere energie collisional dissociatie (HCD) fragmentatie met behulp van 32% genormaliseerde botsing energie. Fragmentionen werden gedetecteerd in de spectrometer met 15.000 resolutie en een 5.0e4 AGC doel.
7. Gegevensanalyse
- Zoek tandem MS-bestanden met een bottom-up proteomics analyse software tegen de C. elegans database.
- Stel de eiwitanalyse zoekparameters als volgt: een trypsine gemist decolleté, 375-1500 m / z peptide massa bereik, fragment massa tolerantie van 0,02, en voorloper massa tolerantie van 10 ppm. Carbamidomethylatie is ingesteld als een statische modificatie en alle weten hydroxyl radicale side-chain modificaties9,10 als dynamisch. Peptide identificatie wordt vastgesteld op 95% vertrouwen (medium) en residu op 99% vertrouwen (hoog). Het foute detectiepercentage (FDR) is vastgesteld op 1%.
- Gegevens exporteren naar een elektronische database en de omvang van de oxidatie per peptide of residu samenvatten met behulp van de vergelijking onder11:
OPMERKING: Wanneer het eic-gebied gewijzigd is, is het geëxtraheerde ionchromatografische gebied (EIC) van het peptide of residu met een oxidatieve wijziging, en het EIC-gebied is het totale gebied van hetzelfde peptide of residu met en zonder oxidatieve wijziging.
Representative Results
In het microfluïdische stroomsysteem dat wordt gebruikt voor IV-FPOP, worden H2O2 en de wormen gescheiden gehouden tot vlak voor laserbestraling. Deze scheiding elimineert afbraak van H2O2 door endogene catalase en andere cellulaire mechanismen12. Het gebruik van een i.d. capillaire van 250 μm toont een totaal monsterherstel tussen 63-89% over twee biologische replicaties, terwijl de 150 μm i.d. capillaire slechts 21-31% herstel laat zien (figuur 3A). Het gebruik van een grotere i.d. capillaire (250 μm) leidt tot een betere wormstroom tijdens IV-FPOP en enkele wormstroom (figuur 3B)in vergelijking met een kleinere i.d. capillaire (150 μm) (Figuur 3C). De 150 μm i.d. capillaire staat geen enkele wormstroom toe (Figuur 3C) en meerdere wormen worden samen zien stromen bij het laserbekeerde venster dat de hoeveelheid laserblootstelling per enkele worm vermindert.
IV-FPOP is een covalente etiketteringstechniek die de toegankelijkheid van oplosmiddelen in C. elegans sondes. Figuur 4A toont een representatieve geëxtraheerde ionchromatogram (EIC) van een FPOP gewijzigd en ongewijzigd peptide. De hydroxyl radicale label verandert de chemie van oxidatief gemodificeerde peptiden, waardoor FPOP gemodificeerde peptiden meer polaire. In omgekeerde fase chromatografie, IV-FPOP gemodificeerde peptiden hebben eerdere retentie tijden dan ongewijzigde peptiden. Ms/MS fragmentatie van geïsoleerde peptiden maakt het mogelijk om oxidatief gemodificeerde residuen te identificeren (figuur 4B).
IV-FPOP heeft aangetoond in totaal 545 eiwitten te hebben gemodificeerd in twee biologische repliceert binnen C. elegans (figuur 5A,B). Een voordeel van IV-FPOP als eiwitvoetafdrukmethode is afhankelijk van het vermogen van de techniek om eiwitten te wijzigen in verschillende lichaamssystemen binnen de wormen (Figuur 5C). Deze methode zou het mogelijk maken om eiwitstructuur en eiwitinteracties te onderzoeken, ongeacht lichaamsweefsel of orgaan in de worm. Verder bevestigt de TANDEM MS-analyse de toegankelijkheid van oplosmiddelen in vivo. Het oxidatiepatroon van het hitteshockeiwit 90 (Hsp90) in complex met het myosine chaperoneiwit UNC-45 werd geanalyseerd (Figuur 6). Ms/MS-analyse voor Hsp90 toont vier oxidatief gemodificeerde residuen (figuur 6C,D), de genormaliseerde omvang van FPOP-modificatie (ln(PF))5 geeft aan dat De residuen M698 van Hsp90 minder oplosmiddelen zijn die toegankelijk zijn dan residuen R697, E699 en E700 wanneer zij gebonden zijn aan UNC-45 (figuur 6C). Deze verschillen in oxidatie worden gevalideerd door literatuuroplosmiddel toegankelijke oppervlakte (SASA) berekeningen (PDB 4I2Z13). Residu M698 heeft een SASA-waarde van 0,03, wat wordt gezien als een begraven residu in vergelijking met residuen R697, E699 en E700 met hogere SASA-waarden (figuur 6C). 14.
Figuur 1. In vivo FPOP microfluidic flow systeem schematisch. (A) De twee inbrengende lijnen (oranje) van het IV-FPOP-stroomsysteem worden weergegeven in de FEP-slang (geel), de juiste bindingspositie van de epoxyhars wordt weergegeven door de lichtblauwe cirkel. (B) Volledig geassembleerde meng-T gevormd door de drie 250 μm i.d. haarvaten. De juiste harsbindingspositie van de afvoercapillaire aan de FEP-slang wordt weergegeven door de lichtblauwe cirkel. cC) Het volledige geassembleerde stroomsysteem voor in vivo covalente etikettering van C. elegans. Voorafgaand aan FPOP worden wormen gescheiden gehouden van H2O2 tot vlak voor de etikettering; het laserbestralingsvenster wordt in lichtblauw weergegeven en de laserstraal wordt vertegenwoordigd door de paarse bliksemschicht. Cijfers zijn niet op schaal. Dit cijfer is gewijzigd van Espino et al.4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Microfluïdisch systeem tijdens IV-FPOP. (A) Representatieve foto van C. elegans in de 5 mL spuit. Zonder te roeren nestelen de wormen zich op de bodem van de spuit (links). De magnetische roerderen en roerderblok houden de wormen in suspensie tijdens de IV-FPOP experimenten (rechts). (B) Representatieve afbeelding van een 5 mL spuit, inbrengen capillair, en intrekking capillair aangesloten op de 3-2 klep. De 3-2 klepgreep wordt weergegeven in de terugtrekkende positie. (C) Microfluidic flow systeem tijdens IV-FPOP, de magnetische roerder blok is positie boven de wormen '5 mL spuit. dD) Uitlaathaarvaten bevestigd aan het uitstralende stadium. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Vergelijking van C. elegans stroom en herstel met behulp van twee i.d. haarvaten. (A) Procentherstel van wormen na IV-FPOP voor twee biologische repliceert (BR) met 250 (grijs) en 150 (zwart) μm i.d. haarvaten. Foutbalken worden berekend op basis van de standaarddeviatie voor technische drievoud. C. elgans die door het laserbekeerde venster door een 250 μm (B) en 150 μm (C) d. haarvaten stromen. De wormen zijn strakker verdicht in de kleinere capillaire. De 150 μm i.d. capillaire toont klonteren van wormen. Dit cijfer is gewijzigd van Espino et al.4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Representatieve LC-MS/MS resultaten na IV-FPOP. (A) EIC van een FPOP gewijzigd peptide (rood) en ongewijzigd (blauw). Het geselecteerde peptide behoort tot het actin-1 eiwit. (B) MS/MS spectrum van dubbel geladen ongewijzigde actin-1 peptide 317-327. (C) MS/MS spectrum van dubbel geladen FPOP gemodificeerde actin-1 peptide 317-327, in dit voorbeeld werd P323 oxidatief gewijzigd (y5+ ion, red). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. IV-FPOP wijzigt eiwitten binnen C. elegans oxidatief. (A) Venn diagram van oxidatief gemodificeerde eiwitten in aanwezigheid van 200 mM waterstofperoxide bij 50 Hz over twee biologische repliceert (BR), BR1 is in blauw en BR2 is in geel. BB) Venn-diagram van oxidatief gemodificeerde eiwitten die zijn geïdentificeerd in bestraalde monsters, de controle op waterstofperoxide en wormalleencontrole in BR2 over technische drievoud. (C) Cirkeldiagram van oxidatief gemodificeerde eiwitten binnen verschillende C. elegans lichaamssystemen. Dit cijfer is gewijzigd van Espino et al.4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6. Correleren van IV-FPOP wijzigingen aan de toegankelijkheid van oplosmiddelen. (A) Myosine chaperon eiwit UNC-45 (grijs) (PDB ID 4I2Z13) met twee gemodificeerde peptiden geïdentificeerd door LC/MS/MS analyse, 669−680 en 698−706 (groen, links begin). UNC-45 is gebonden aan het Hsp90 peptide fragment (blauw). Oxidatief gemodificeerde residuen in dit fragment worden weergegeven in stokken (rood), en UNC-45 wordt weergegeven als een oppervlak (rechts begin). BB) Tandem MS spectra van UNC-45 peptide 669−680 (boven) en 698−706 (onder) met b- en y-ionen voor het verlies van CO2, een FPOP modificatie. cC) De berekende ln(PF) voor de hsp90 oxidatief gemodificeerde residuen, R697, M698, E699 en E700. Boven elk residu worden berekende SASA-waarden voor Hsp90 aangeduid. (D) Tandem MS spectra voor R697, M698, E699 en E700 met een +16 FPOP wijziging. Dit cijfer is gewijzigd van Espino et al.4. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De huidige benchmark voor de studie van in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) is fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET). In zijn meest eenvoudige vorm, deze techniek bestudeert PPI door energie-overdracht tussen twee moleculen wanneer ze in de nabijheid van elkaar15. In tegenstelling tot MS-technieken heeft FRET niet de resolutie om conformatieveranderingen en interactieplaatsen op aminozuurniveau te karakteriseren. MS-gebaseerde technieken worden steeds vaker gebruikt voor de studie van PPI16. IV-FPOP is een HRPF-methode die de in vivo eiwitstructurele analyse in C. elegans mogelijk maakt. Om C. elegans met succes te labelen door IV-FPOP, is het belangrijk om het microfluïdische stroomsysteem goed te monteren om monsterverlies te verminderen. De 250 μm i.d. capillaire heeft aangetoond dat het monsterherstel maximaliseert in vergelijking met kleinere i.d. haarvaten4. Grotere i.d. haarvaten zijn niet getest, maar het microfluïdische stroomsysteem is ontworpen met behulp van een capillair met dezelfde i.d. als een commercieel beschikbare flow cytometrie systeem voor het sorteren van C. elegans. 17 De grootte van het wormmonster is ook belangrijk, een steekproefgrootte van minder dan ~ 10.000 per monster voorafgaand aan FPOP levert geen eiwitconcentraties op die hoog genoeg zijn voor LC-MS/MS-analyse. Hogere monstersmaten (>10.000 wormen) kunnen ook worden gebruikt door het oorspronkelijke startvolume aan te passen (stap 4.5).
Een goede montage van het microfluïdische stroomsysteem is belangrijk. Lekken in de monsterroute resulteren in een inconsistente stroom van de wormen of H2O2. De ferrules, sleeves en 3-2 kleppen kunnen worden hergebruikt van meerdere IV-FPOP experimenten als deze na elk experiment goed worden gereinigd. We raden echter aan om een nieuw microfluïdisch stroomsysteem in te stellen voor elke biologische replicatie. Als de microfluidics goed is gemonteerd, zullen de wormen en H2O2 mengen op de meng-T met minimale tegendruk. Als kwaliteitscontrole (QC) van het microfluïdische stroomsysteem raden we aan om de mengefficiëntie te testen met gekleurde kleurstoffen. Het is belangrijk om de beweging van de magnetische roerderen in de wormspuit tijdens IV-FPOP te controleren, onjuiste monstermenging bij de wormspuit of de meng-T kan leiden tot tegendruk die lekken veroorzaakt. Bovendien leiden slechte mengomstandigheden tot grote monsterverliezen, slechte laserblootstelling van wormen bij het laservenster en verstopping.
C. elegans onderhoud is belangrijk om de achtergrond oxidatie te verminderen. We raden aan om de wormen bij lage temperaturen te laten groeien bij lage stressomstandigheden, omdat hoge temperaturen de totale achtergrondoxidatie kunnen beïnvloeden. Een controlemonsterset van alleen wormen, geen H2O2 en geen laserbestraling, wordt aanbevolen voor alle IV-FPOP-experimenten om rekening te houden met achtergrondoxidatie als gevolg van laboratoriumonderhoud. Een van de huidige beperkingen van deze techniek is het totale aantal oxidatief gemodificeerde peptiden geïdentificeerd en het totale aantal residuen geoxideerd per peptide om hogere eiwit structurele informatie te krijgen. Hoewel niet aanbevolen, een toename van oxidatieve wijzigingen kunnen worden bereikt door het gebruik van hogere concentraties van waterstofperoxide. Een toename van waterstofperoxide kan belangrijke biologische paden aanzienlijk veranderen en leiden tot oxidatie-geïnduceerde ontplooiing. Als de waterstofperoxideconcentratie voor IV-FPOP wordt verhoogd, wordt aanbevolen om de levensvatbaarheid van de worm en de achtergrondoxidatie te testen, omdat concentraties hoger dan 200 mM niet zijn getest.
Het beschreven LC-MS/MS protocol kan worden geoptimaliseerd en aangepast aan de MS QC van andere laboratoria. Het gebruik van 2D-chromatografietechnieken is eerder aangetoond dat het verhogen van de identificatie van oxidatief gemodificeerde peptiden en eiwitten18. Niettemin, eiwitverrijking technieken die zich richten op een specifiek eiwit van belang zijn niet aan te bevelen, met inbegrip van, maar niet beperkt tot antilichaam neerslag of pull-down tests. Deze technieken kunnen bias naar één eiwitconformer als de epitoop/bindende plaats van het eiwit oxidatief door IV-FPOP is gewijzigd. Nieuwe ontwikkelingen in voetafdrukradicale reagentia, zoals sulfaatradicale anion10 of trifluoromethylatie19 zouden de veelzijdigheid van IV-FPOP kunnen vergroten. Hoewel het enige labelingreaa dat tot nu toe in vivo is getest waterstofperoxide is, kunnen andere lasergeactiveerde radicalen worden geoptimaliseerd. Het gebruik van andere radicalen moet blijken te zijn compatibel met worm levensvatbaarheid, cel doorlatend, en de 248 nm laser golflengte. Door het gebruik van C. elegans als modelsysteem voor veel menselijke ziekten heeft IV-FPOP het potentieel om een sterke invloed te hebben bij het bestuderen van de rol van eiwitstructuur in ziektepathogenese.
Disclosures
Deze publicatie is geschreven in gedeeltelijke vervulling van JAE Ph.D. thesis. De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door startfondsen van de Universiteit van Maryland, Baltimore en de NIH 1R01 GM 127595 toegekend aan LMJ. De auteurs bedanken Dr. Daniel Deredge voor zijn hulp bij het bewerken van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
- Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
- Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
- Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
- Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
- Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
- Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).
