Summary
In vivo l’oxydation photochimique rapide des protéines (IV-FPOP) est une technique d’empreinte de protéine radicale hydroxyl qui permet la cartographie de la structure des protéines dans leur environnement indigène. Ce protocole décrit l’assemblage et la mise en place du système de flux microfluidique IV-FPOP.
Abstract
L’oxydation rapide des protéines (FPOP) est une méthode d’empreinte protéique radicale hydroxyl (HRPF) utilisée pour étudier la structure des protéines, les interactions protéines-ligands et les interactions protéines-protéines. FPOP utilise un laser KrF excimer à 248 nm pour la photolyse du peroxyde d’hydrogène pour générer des radicaux hydroxyl qui, à leur tour, modifient oxydativement les chaînes latérales d’acides aminés accessibles au solvant. Récemment, nous avons élargi l’utilisation de FPOP de l’étiquetage oxydatif in vivo à Caenorhabditis elegans (C. elegans), intitulé IV-FPOP. Les nématodes transparents ont été utilisés comme systèmes modèles pour de nombreuses maladies humaines. Les études structurelles dans C. elegans par IV-FPOP est faisable en raison de la capacité de l’animal à prendre le peroxyde d’hydrogène, leur transparence à l’irradiation laser à 248 nm, et la nature irréversible de la modification. L’assemblage d’un système de flux microfluidique pour l’étiquetage IV-FPOP, les paramètres IV-FPOP, l’extraction des protéines et les paramètres optimisés LC-MS/MS sont décrits ici.
Introduction
L’empreinte protéique couplée à la spectrométrie de masse (SEP) a été utilisée ces dernières années pour étudier les interactions protéiques et les changements conformationnels. Les méthodes d’empreinte protéique radicale hydroxyl (HRPF) sondent l’accessibilité des solvants protéiques en modifiant les chaînes latérales d’acides aminés protéiques. La méthode HRPF, oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP)1, a été utilisée pour sonder la structure protéique in vitro2, in-cell (IC-FPOP)3, et plus récemment in vivo (IV-FPOP)4. FPOP utilise un laser d’excimer de longueur d’onde de 248 nm afin de générer rapidement des radicaux hydroxyl par photolyse de peroxyde d’hydrogène pour former des radicaux hydroxyl1. À leur tour, ces radicaux peuvent étiqueter 19 des 20 acides aminés sur une échelle de temps microseconde, plus rapidement que les protéines peuvent se déployer. Bien que, la réactivité de chaque acide aminé avec des radicaux hydroxyl s’étend 1000 fois, il est possible de normaliser l’oxydation de la chaîne latérale en calculant un facteur de protection (PF)5.
Puisque FPOP peut modifier oxydativement des protéines indépendamment de leur taille ou de leur séquence primaire, elle s’avère avantageuse pour des études sur les protéines inocatives et in vivo. IV-FPOP sonde la structure protéique en C. elegans de la même manière que les études in vitro et in-cellulaire4. C. elegans font partie de la famille des nématodes et sont largement utilisés comme modèle pour étudier les maladies humaines. La capacité du ver à prendre du peroxyde d’hydrogène par diffusion passive et active permet l’étude de la structure des protéines dans différents systèmes du corps. En outre, C. elegans sont adaptés pour IV-FPOP en raison de leur transparence à la longueur d’onde laser 248 nm nécessaire pour FPOP6. Le couplage de cette méthode à la spectrométrie de masse permet l’identification de plusieurs protéines modifiées à l’aide d’approches traditionnelles de protéomique ascendante.
Dans ce protocole, nous décrivons comment effectuer IV-FPOP pour l’analyse de la structure des protéines dans C. elegans. Le protocole expérimental nécessite l’assemblage et la mise en place d’un système de débit microfluidique pour IV-FPOP adapté de Konermann etcoll. Après IV-FPOP, les échantillons sont homogénéisés pour l’extraction de protéines. Les échantillons de protéines sont protéolysés et les peptides sont analysés par la SP tandem chromatographique liquide (LC), suivie de la quantification.
Protocol
1. C. elegans entretien et culture
- Cultivez et synchronisez les colonies de vers à leur quatrième stade de larves (L4) suivant les procédures de laboratoirestandard 8.
- Le jour de l’expérience IV-FPOP, laver les vers L4 des pelouses bactériennes (OP50 E. coli) avec tampon M9 (0,02 M KH2PO4, 0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
- Obtenez 500 aliquots de 10 000 vers par échantillon IV-FPOP.
2. Assemblage du système de débit microfluidique
- Démarrer l’assemblage du système d’écoulement en coupant un morceau de propylène fluoré de 2 cm (FEP) tubing (1/16 po. diamètre externe (o.d.) x 0,020 po. diamètre intérieur (c.-à-d.)).
- À l’aide d’une aiguille de dissection propre, élargir l’i.d. de la tuyauterie FEP afin de faire un petit cratère à une extrémité seulement, 50 mm de longueur. Le cratère devrait être assez grand pour s’adapter à deux morceaux de silice fusionnée de 360 m.
REMARQUE : N’élargissez pas l’extrémité opposée car cette extrémité ne sera utilisée que pour s’adapter au capillaire de sortie. - À l’aide d’un coupeur en céramique, couper deux morceaux de 15 cm de 250 m i.d. de la silice fusionnée. Ces deux pièces deviendront les lignes d’infusage du système de débit.
- À l’aide de ruban adhésif auto-adhésif, enregistrez les deux capillaires i.d. de 250 m ensemble, en veillant à ce qu’ils soient parallèles les uns aux autres et que leurs extrémités soient rincées à 100 %.
REMARQUE : Pour s’assurer que les extrémités de silice fusionnées ne sont pas écrasées après la coupe, et sont droites et 100% rincées les unes contre les autres, il est recommandé de les examiner à l’aide d’une loupe ou sous un microscope stéréo. - Insérez les deux capillaires scotchés dans le cratère fait main de la tuyauterie FEP. Poussez les capillaires jusqu’au bord même du cratère fait main.
CAUTION: Pour maintenir l’efficacité du système d’écoulement, ne poussez pas au-delà du cratère fait main(figure 1a). - Déposer un petit point de résine époxy sur une surface propre et mélanger avec une aiguille disséquante.
- Rapidement, à l’aide de la même aiguille, placez une petite goutte de résine à l’extrémité des capillaires infusants où ils se connectent avec le tube FEP et laissez la résine sécher, suspendre le côté de sortie vers le haut, pendant quelques minutes (figure 1a).
- Pendant que la résine sèche, liant les tubes FEP et deux capillaires ensemble, couper un nouveau capillaire i.d. de 250 m. Le nouveau capillaire deviendra le capillaire de sortie du système d’écoulement. La longueur désirée du capillaire peut être calculée à l’aide de l’équation ci-dessous :
Là où j’ai la longueur du capillaire à couper en centimètres, t est le temps de réaction désiré en quelques minutes, f est le taux d’écoulement en mL/min, et i.d. est le diamètre interne du capillaire en centimètres.
REMARQUE : Après avoir coupé le capillaire de sortie, examinez les extrémités en s’assurant qu’elles sont droites et non écrasées. - Une fois la résine séchée, insérez le nouveau capillaire à travers l’extrémité de sortie de tubes FEP. Les extrémités intérieures du capillaire de sortie et les deux capillaires d’infusage doivent être flush contre l’autre à l’intérieur de la tuyauterie FEP, ce qui crée le mélange-T (figure 1b).
- Lier les tubes capillaires et FEP avec de la résine époxy fraîche telle qu’elle est décrite dans les étapes 2.6 et 2.7.
- Laisser sécher la résine pendant la nuit en liant le système d’écoulement ensemble. Configurez le système de débit microfluidique le lendemain(figure 1c).
3. Système de débit microfluidique pour in vivo FPOP
- Insérez quatre agitateurs magnétiques à l’intérieur d’une seringue de 5 ml. Cette seringue devient la seringue de l’échantillon. Les agitateurs magnétiques empêchent les vers de s’installer à l’intérieur de la seringue pendant IV-FPOP(figure 2A).
- Remplir les deux seringues de 5 ml de M9. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur de chaque seringue car elles peuvent affecter le débit et l’efficacité du mélange.
- Connectez un adaptateur Luer à chaque seringue de 5 ml pour vous assurer qu’elles sont serrées au doigt et fixées en place.
- Fixez chaque seringue à une seule soupape 3-2. La seringue doit être fixée au port moyen de la vanne(figure 2B).
- Fixer chaque seringue de 5 ml à la double pompe à seringue et ajuster le collier d’arrêt mécanique pour éviter une pression excessive sur la seringue du bloc de poussoir. Gardez à l’esprit l’ajout des agitateurs magnétiques lors de la mise du collier d’arrêt.
- Fixez chaque extrémité capillaire infusante du système de débit microfluidique maison au port supérieur de chaque valve 3-2 à l’aide d’une noix super sans flange, manchon FEP, et ferrule super sans flange(figure 2B).
- Au port ouvert restant de la soupape 3-2 (port inférieur), attachez un capillaire de 10 cm 450 m i.d. à l’aide d’une noix super sans flange, d’une manchon FEP et d’une ferrule super sans flanges(figure 2B). Ces capillaires deviennent les capillaires d’échantillon de retrait.
- Démarrez le débit de la pompe et vérifiez toutes les connexions du système de débit microfluidique pour les fuites visuelles. Flux au moins trois volumes de seringues à l’aide du débit expérimental. Le débit final dépend de la fenêtre d’irradiation laser, de la fréquence laser et d’un volume de fraction zéro exclusion.
REMARQUE : Pour ce protocole, un débit final de 375,52 l/l/min a été calculé à partir d’une fenêtre d’irradiation laser de 2,55 mm, 250 m i.d. silice fusionnée, fraction zéro exclusion et fréquence de 50 Hz.- Le chemin d’écoulement est marqué par les flèches sur la poignée de soupape 3-2. Chaque seringue peut être remplie manuellement en déplaçant la poignée de la soupape de la position d’expulsion à la position de retrait.
REMARQUE : Les fuites à la soupape 3-2 peuvent être corrigées en re-screwing la noix super sans flange ou en remplaçant l’une des connexions de valve (écrou super sans flange, manche FEP, ou ferrule super sans flange). Les fuites au mélange-T nécessitent un réassemblage du système de débit microfluidique (étapes 2.1 à 2.11).
- Le chemin d’écoulement est marqué par les flèches sur la poignée de soupape 3-2. Chaque seringue peut être remplie manuellement en déplaçant la poignée de la soupape de la position d’expulsion à la position de retrait.
- Déplacez le système de débit microfluidique vers le banc expérimental et fixez le capillaire de sortie à l’étape rayonnante à l’aide d’un syndicat en acier inoxydable de 360 m(figure 2C,D).
- À l’aide d’un briquet à longue portée, brûlez le revêtement de la silice fondue à la fenêtre d’irradiation laser. Nettoyer le revêtement brûlé à l’aide de tissus sans peluche et de méthanol.
REMARQUE : Alternez entre les cycles de combustion et les cycles de nettoyage du méthanol pour éviter de surchauffer le capillaire car l’excès de chaleur peut fondre et/ou casser le capillaire. - Placez le bloc d’agitateur magnétique au-dessus de la seringue de 5 ml contenant les agitateurs magnétiques. Ajuster la vitesse et la position du bloc d’agitateur magnétique de sorte que les agitateurs magnétiques à l’intérieur de la seringue de 5 ml tournent lentement et constamment.
4. In vivo FPOP
- Allumez le laser KrF excimer et laissez le thyratron s’échauffer.
CAUTION: Le laser émet un rayonnement visible et invisible à 248 nm longueur d’onde qui peut endommager les yeux. Une protection oculaire appropriée doit être portée avant d’allumer le laser et d’ouvrir la fenêtre de sortie du faisceau. - Mesurez l’énergie laser à une fréquence de 50 Hz pour au moins 100 impulsions en plaçant le capteur optique à la fenêtre de sortie du faisceau.
REMARQUE : Pour ce protocole, une fenêtre d’irradiation de 2,55 mm a été utilisée avec une énergie laser de 150 à 2,32 mJ. - Obtenez approximativement 10 000 vers (500 ll) et retirez manuellement l’échantillon dans la seringue de l’échantillon.
- Remplissez la seringue de l’échantillon de 2,5 ml de tampon M9 pour un volume d’échantillon final de 3 ml. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite dans la seringue de l’échantillon.
- Remplissez la deuxième seringue de 3 ml de H2O2de 2 mM, en veillant à nouveau à ce qu’aucune bulle d’air ne soit introduite dans la seringue.
- À la fin du capillaire de sortie, placez un tube conique de 15 mL enveloppé dans une feuille d’aluminium contenant 6 ml de N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl--phenylnitrone (PBN), et 1% de sulfoxide de diméthylyl pour éteindre l’excès H2O2, hydroxique radical, et inhibent l’activité de réductase de sulfoxide de méthionine, respectivement.
- Démarrez le laser excimer de la fenêtre logicielle, attendez la première impulsion et démarrez le flux de l’échantillon à partir de la double seringue.
REMARQUE : Les échantillons doivent être exécutés en doublons biologiques dans des triplicates techniques dans des conditions de 3 échantillons : irradiation laser avec H2O2 (échantillon), absence d’irradiation laser avec H2O2 et pas d’irradiation laser no H2O2 (contrôles), totalisant 9 échantillons par ensemble biologique. - Recueillir l’échantillon entier dans le tube de 15 ml, tout en surveillant activement le flux de l’échantillon pour toute fuite visuelle, car une certaine pression arrière de la seringue de l’échantillon peut parfois s’accumuler.
- Après IV-FPOP, Supprimer les vers de granulés par centrifugation à 805 x g pendant 2 min. Supprimer la solution d’étanchéité, ajouter 250 l de tampon de lyse (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaClcl, 1 mM EDTA, 1 mM phenylthylysulfon fluor [PMSF]). Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifuge propre, geler les flashs et les conserver à -80 oC jusqu’à ce que l’échantillon soit digérer.
5. Extraction, purification et protéolyse des protéines
- Décongeler les échantillons congelés sur la glace et homogénéiser par sonication pendant 10 s, suivi d’une incubation de glace de 60 s. Plusieurs tours de sonication peuvent être nécessaires, l’homogénéat peut être observé sous un stéréomicroscope en plaçant un aliquot d’échantillon de 2 L sur une diapositive de microscope. L’homogénéisation des échantillons est complète lorsqu’on ne voit pas de petits ou pas de vers.
- Centrifuge a homogénéisé les vers à 400 x g pendant 5 min à 4 oC et recueillir le supernatant dans un tube de microcentrifuge propre.
- Déterminer les concentrations de protéines de l’échantillon à l’aide d’un essai d’acide bicinchoninique (essai BCA) à l’aide des instructions du fabricant.
REMARQUE : La concentration de l’échantillon peut être déterminée à l’aide de n’importe quel essai de concentration de protéine biochimique de choix. Gardez à l’esprit la compatibilité de réactif avec le tampon de lyse (8 M urea, 0.5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). En outre, une dilution tampon peut être nécessaire. - Obtenez 100 g de protéines de chaque échantillon et placez-les dans des tubes de microcentrifugeuses propres.
- Ajouter le dithiothreitol (TNT) à une concentration finale de 10 mM pour réduire les liaisons de disulfide dans tous les échantillons. Vortex, tourner vers le bas, et incuber des échantillons à 50 oC pendant 45 min.
- Refroidir les échantillons à température ambiante pendant 10 min.
- Ajouter l’iodoacetamide (IAA) à une concentration finale de 50 mM pour alkyler les résidus réduits. Vortex, tourner vers le bas, et incuber des échantillons pendant 20 min à température ambiante protégée de la lumière.
- Immédiatement après l’alkylation, précipiter l’échantillon de protéines en ajoutant 4 volumes d’acétone préconsemment réfrigérée à 100 % et incuber à -20 oC pendant la nuit.
- Le lendemain, la protéine granulée se précipite par centrifugation à 16 000 x g pendant 10 min. Laver la pastille avec 90 % d’acétone, retirer le supernatant et laisser sécher les granulés pendant 2 à 3 min.
- Suspendre à nouveau le granule de protéines dans 25 mM Tris-HCl (1 g/L). Ajouter la trypsine à un rapport protéase/protéine final de 1:50 (w/w) et digérer les échantillons à 37 oC pendant la nuit.
- Le lendemain, étancher la réaction de digestion de la trypsine en ajoutant 5% d’acide formic.
REMARQUE : Un minimum de 0,5 g de peptides par échantillon est nécessaire pour l’analyse LC-MS/MS (étapes 6.1-6.5). Déterminer les concentrations de peptides échantillon à l’aide d’un essai quantitatif de peptide colorimétrique (voir le tableau des matériaux) tel que décrit par le protocole du fabricant.
6. Spectrométrie de masse liquide haute performance-tandem (LC-MS/MS)
- Utilisez les phases mobiles LC suivantes : l’eau en FA (A) à 0,1 % et ACN dans 0,1 % FA (B).
- Chargez 0,5 g de peptides sur une colonne de piège (180 m à 20 mm) contenant du C18 (5 m, 100 ') et l’échantillon de lavage avec 99% de solvant A et 1% B pour 15 minutes à 15 'L/débit min.
- Peptides séparés à l’aide d’une colonne emballée à l’interne (0,075 mm i.d. - 20 mm) avec du matériau de phase inverse C18 (5 m, 125 euros).
- Utilisez la méthode de séparation analytique suivante : le gradient a été pompé à 300 nL/min pendant 120 min : 0 à 1 min, 3 % B ; 2 à 90 min, 10 à 45 % B; 100 à 105 min, 100% B; 106 à 120 min, 3 % B.
- Effectuez l’acquisition de peptides en mode ion iony-électrospray (nESI) à l’aide d’un spectromètre de masse haute résolution.
REMARQUE : Pour ce protocole, un couple d’instruments LC (UPLC) ultra-performant à un spectromètre de masse haute résolution a été utilisé. L’acquisition dépendante des données a été utilisée. La plage de balayage m/z pour MS1 était de 3750 à 1500 à 60 000 résolutions et 60 s d’exclusion dynamique. Les ions avec les états de charge de 1 et 'gt;6 ont été exclus. Un objectif de contrôle automatique du gain (AGC) de 5,5e5 a été utilisé avec un temps d’injection maximum de 50 ms et un seuil d’intensité de 5,5e4. Les ions sélectionnés pour le MS2 ont été soumis à la fragmentation de dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD) utilisant 32 % d’énergie de collision normalisée. Des ions fragmentés ont été détectés dans le spectromètre avec 15 000 résolutions et une cible AGC de 5,0e4.
7. Analyse des données
- Rechercher des fichiers MS tandem avec un logiciel d’analyse protéomique ascendant contre la base de données C. elegans.
- Définissez les paramètres de recherche d’analyse des protéines comme suit : un clivage manqué par trypsine, une plage de masse de peptide de 375 à 1500 m/z, une tolérance de masse fragmentée de 0,02 et une tolérance de masse précurseur de 10 ppm. Carbamidomethylation est définie comme une modification statique et tous connaissent hydroxyl radical modifications de la chaîne latérale9,10 comme dynamique. L’identification peptide est établie à 95% de confiance (moyenne) et résidus à 99% de confiance (élevée). Le taux de fausse découverte (FDR) est fixé à 1%.
- Exporter des données vers une base de données électronique et résumer l’étendue de l’oxydation par peptide ou résidu à l’aide de l’équation inférieureà 11:
REMARQUE : Lorsque la zone EIC modifiée est la zone chromatographique extraite (EIC) du peptide ou des résidus avec une modification oxydative, et la zone EIC est la zone totale du même peptide ou des résidus avec et sans la modification oxydative.
Representative Results
Dans le système de débit microfluidique utilisé pour IV-FPOP, H2O2 et les vers sont gardés séparés jusqu’à juste avant l’irradiation laser. Cette séparation élimine la dégradation de H2O2 par catalase endogène et d’autres mécanismes cellulaires12. L’utilisation d’un capillaire i.d. de 250 m montre une récupération totale de l’échantillon entre 63 et 89 % sur deux répliques biologiques, tandis que la capillaire de 150 m i.d. ne montre que 21 à 31 % de récupération(figure 3A). L’utilisation d’un plus grand i.d. capillaire (250 m) conduit à un meilleur flux de vers pendant le FLUX DE ver IV-FPOP et un seul ver(figure 3B) par rapport à un plus petit i.d. capillaire (150 m)(figure 3C). Le capillaire i.d. de 150 m ne permet pas le flux de vers unique(figure 3C) et les vers multiples sont vus s’écoulant ensemble à la fenêtre d’irradiation au laser qui diminue la quantité d’exposition au laser par ver unique.
IV-FPOP est une technique d’étiquetage covalent qui sonde l’accessibilité des solvants à C. elegans. La figure 4A montre un chromatogramme d’ion extrait représentatif (EIC) d’un peptide modifié et non modifié de FPOP. L’étiquette radicale hydroxyl modifie la chimie des peptides oxydativement modifiés, rendant ainsi les peptides modifiés FPOP plus polaires. Dans la chromatographie de phase inverse, les peptides modifiés IV-FPOP ont des temps de rétention plus tôt que les peptides non modifiés. La fragmentation de la SP/SEP des peptides isolés permet d’identifier les résidus oxydativement modifiés(figure 4B).
IV-FPOP a montré qu’il a modifié avec oxydativement un total de 545 protéines sur deux répliques biologiques dans C. elegans (figure 5A,B). Un avantage de IV-FPOP en tant que méthode d’empreinte protéique repose sur la capacité de la technique à modifier les protéines dans une variété de systèmes corporels dans les vers (figure 5C). Cette méthode permettrait de sonder la structure des protéines et les interactions protéiques indépendamment du tissu corporel ou de l’organe dans le ver. De plus, l’analyse de la SP en tandem confirme l’accessibilité des sondes IV-FPOP in vivo. Le modèle d’oxydation de la protéine de choc thermique 90 (Hsp90) en complexe avec la protéine de chaperon de myosine UNC-45 a été analysée(figure 6). L’analyse MS/MS pour Hsp90 montre que quatre résidus oxydativement modifiés(figure 6C,D),l’étendue normalisée de la modification FPOP (ln(PF))5 indique que les résidus M698 de Hsp90 sont moins solvables que les résidus R697, E699 et E700 lorsqu’ils sont liés à UNC-45(figure 6C). Ces différences d’oxydation sont validées par des calculs de surface accessibles aux solvants (SASA) (PDB 4I2Z13). Résidu M698 a une valeur SASA de 0,03 qui est considéré comme un résidu enfoui par rapport aux résidus R697, E699, et E700 avec des valeurs SASA plus élevées (figure 6C). 14
Figure 1. In vivo FPOP système de débit microfluidique schématique. (A) Les deux lignes d’infusion (orange) du système de débit IV-FPOP sont montrées à l’intérieur du tube FEP (jaune), la position de liaison correcte de la résine époxy est représentée par le cercle bleu clair. (B) Compléter le mixage-T assemblé formé par les trois capillaires i.d. de 250 m. La position correcte de liaison de résine du capillaire de sortie au tube FEP est représentée par le cercle bleu clair. (C) Le système de débit assemblé complet pour l’étiquetage covalent in vivo de C. elegans. Avant FPOP, les vers sont séparés de H2O2 jusqu’à ce que juste avant l’étiquetage; la fenêtre d’irradiation laser est montrée en bleu clair et le faisceau laser est représenté par l’éclair violet. Les chiffres ne sont pas à l’échelle. Ce chiffre a été modifié à partir d’Espino et coll.4. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Système microfluidique pendant IV-FPOP. (A) Image représentative de C. elegans à l’intérieur de la seringue de 5 ml. Sans remuer, les vers s’installent au fond de la seringue (à gauche). Les agitateurs magnétiques et le bloc d’agitateur maintiennent les vers en suspension pendant les expériences IV-FPOP (à droite). (B) Image représentative d’une seringue de 5 ml, infusant le capillaire et retirant le capillaire relié à la soupape 3-2. La poignée de soupape 3-2 est indiquée dans la position de retrait. (C) Système de débit microfluidique pendant IV-FPOP, le bloc d’agitateur magnétique est position au-dessus de la seringue de 5 mL des vers. (D) Outlet capillaire fixé à l’étape rayonnante. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Comparaison du flux et de la récupération de C. elegans à l’aide de deux capillaires i.d. (A) Pourcentage de récupération des vers après IV-FPOP pour deux répliques biologiques (BR) avec 250 (gris) et 150 (noir) i.d. capillaires. Les barres d’erreur sont calculées à partir de l’écart standard entre les triplicates techniques. C. elgans circulant à travers la fenêtre d’irradiation laser à travers un 250 m (B) et 150 m ( C ) c.-à-d. capillaires.C Les vers sont plus étroitement compactés dans le plus petit capillaire. Le capillaire i.d. de 150 m montre des vers agglutinants. Ce chiffre a été modifié à partir d’Espino et coll.4. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Résultats représentatifs LC-MS/MS après IV-FPOP. (A) EIC d’un peptide modifié FPOP (rouge) et non modifié (bleu). Le peptide sélectionné appartient à la protéine actin-1. (B) SPECTRE MS/MS de peptide non modifié doublement chargé 317-327. (C) MS/MS spectrum of doublely charged FPOP modified actin-1 peptide 317-327, in this example P323 was oxidatively modified (y5'ion, red). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. IV-FPOP modifie oxydativement les protéines dans C. elegans. (A) Diagramme venin de protéines oxydativement modifiées en présence de peroxyde d’hydrogène de 200 mM à 50 Hz sur deux répliques biologiques (BR), BR1 est en bleu et BR2 est en jaune. (B) Diagramme venin des protéines oxydativement modifiées identifiées dans les échantillons irradiés, le contrôle du peroxyde d’hydrogène, et le contrôle de ver-seulement dans BR2 à travers les triplicates techniques. (C) Graphique à tarte des protéines oxydativement modifiées dans différents systèmes de corps C. elegans. Ce chiffre a été modifié à partir d’Espino et coll.4. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6. Corrélation des modifications IV-FPOP à l’accessibilité des solvants. (A) Myosin chaperon protéine UNC-45 (gris) (PDB ID 4I2Z13) mettant en évidence deux peptides modifiés identifiés par LC / MS / MS / MS analyse, 669-680 et 698-706 (vert, encart gauche). UNC-45 est lié au fragment de peptide Hsp90 (bleu). Les résidus oxydatifs modifiés à l’intérieur de ce fragment sont indiqués dans des bâtons (rouges), et l’UNC-45 est rendu en surface (encart droit). (B) Spectres de la M.A. Tandem de peptide UNC-45 669-680 (en haut) et 698-706 (en bas) montrant b- et y-ions pour la perte de CO2, une modification FPOP. (C) Le ln calculé (PF) pour les résidus Hsp90 oxydativement modifiés, R697, M698, E699 et E700. Les valeurs SASA calculées pour Hsp90 sont indiquées au-dessus de chaque résidu. (D) Tandem MS spectra pour R697, M698, E699, et E700 montrant une modification FPOP de 16. Ce chiffre a été modifié à partir d’Espino et coll.4. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
La référence actuelle pour l’étude des interactions protéines in vivo-protéines (PPI) est le transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET). Dans sa forme la plus simple, cette technique étudie l’IPP par transfert d’énergie entre deux molécules lorsqu’elles sont à proximité l’une de l’autre15. Contrairement aux techniques de SP, FRET n’a pas la résolution pour caractériser les changements conformationnels et les sites d’interaction au niveau aminé-acide. Les techniques basées sur la SP ont été de plus en plus utilisées pour l’étude del’IPP 16. IV-FPOP est une méthode HRPF qui permet l’analyse structurelle des protéines in vivo dans C. elegans. Afin d’étiqueter avec succès C. elegans par IV-FPOP, il est important d’assembler correctement le système de débit microfluidique pour réduire la perte d’échantillons. Le capillaire i.d. de 250 m a montré qu’il maximise la récupération de l’échantillon par rapport aux plus petits capillaires i.d.4. Les plus grands capillaires d’i.d. n’ont pas été testés, cependant le système de débit microfluidique est conçu utilisant un capillaire avec le même i.d. comme un système de cytométrie de flux disponible commercialement pour le tri de C. elegans. 17 La taille de l’échantillon de ver est également importante, une taille d’échantillon inférieure à 10 000 euros par échantillon avant FPOP ne donne pas des concentrations de protéines assez élevées pour l’analyse LC-MS/MS. Des échantillons plus élevés (10 000 vers) peuvent également être utilisés en ajustant le volume de départ initial (étape 4.5).
Un bon assemblage du système de débit microfluidique est important. Les fuites dans la voie de l’échantillon entraînent un flux incohérent des vers ou H2O2. Les ferrules, les manches et les valves 3-2 peuvent être réutilisées à partir de multiples expériences IV-FPOP si elles sont correctement nettoyées après chaque expérience. Cependant, nous recommandons d’assembler un nouveau système de débit microfluidique pour chaque réplique biologique. Si la microfluidique est bien assemblée, les vers et H2O2 se mélangeront au mélange-T avec une pression arrière minimale. En tant que contrôle de la qualité (QC) du système de débit microfluidique, nous recommandons de tester l’efficacité du mélange en utilisant des colorants colorés. Il est important de surveiller le mouvement des agitateurs magnétiques à l’intérieur de la seringue ver pendant IV-FPOP, un mauvais mélange d’échantillon à la seringue de ver ou le mélange-T peut entraîner une pression arrière causant des fuites. En outre, de mauvaises conditions de mélange entraînent de grandes pertes d’échantillons, une faible exposition au laser des vers à la fenêtre laser et un colmatage.
L’entretien de C. elegans est important afin de diminuer l’oxydation de fond. Nous recommandons de cultiver les vers à basse température dans des conditions de faible stress, car des températures élevées peuvent affecter l’oxydation totale du fond. Un ensemble d’échantillons de contrôle des vers seulement, pas de H2O2 et pas d’irradiation laser, est recommandé pour toutes les expériences IV-FPOP pour tenir compte de l’oxydation de fond due à l’entretien de laboratoire. L’une des limites actuelles de cette technique est le nombre total de peptides oxydatifs identifiés et le nombre total de résidus oxydés par peptide afin d’obtenir des informations structurelles de protéines plus élevées. Bien qu’elles ne soient pas recommandées, une augmentation des modifications oxydatives pourrait être possible en utilisant des concentrations plus élevées de peroxyde d’hydrogène. Une augmentation du peroxyde d’hydrogène pourrait modifier de manière significative d’importantes voies biologiques et conduire à l’oxydation induite se déroulant. Si la concentration de peroxyde d’hydrogène pour IV-FPOP est augmentée, il est recommandé de tester la viabilité du ver et l’oxydation de fond que les concentrations supérieures à 200 mM n’ont pas été testés.
Le protocole LC-MS/MS décrit peut être optimisé et modifié pour répondre au MS QC d’autres laboratoires. L’utilisation de techniques de 2D-chromatographie a été précédemment montré pour augmenter l’identification des peptides et des protéines oxydativement modifiés18. Néanmoins, les techniques d’enrichissement des protéines qui ciblent une protéine spécifique d’intérêt ne sont pas recommandées, y compris, mais non limitée aux précipitations d’anticorps ou aux essais de traction vers le bas. Ces techniques peuvent biaiser vers un conformiste de protéine si le site épitope/contraignant de la protéine a été oxydativement modifié par IV-FPOP. De nouveaux développements dans les réactifs radicaux de l’empreinte, tels que l’anion radical de sulfate10 ou la trifluoromethylation19 pourraient augmenter la polyvalence de IV-FPOP. Bien que le seul réactif d’étiquetage testé in vivo jusqu’à présent soit le peroxyde d’hydrogène, d’autres radicaux activés par laser pourraient être optimisés. L’utilisation d’autres radicaux devrait s’avérer compatible avec la viabilité du ver, la cellule perméable, et la longueur d’onde laser 248 nm. En raison de l’utilisation de C. elegans comme un système modèle pour de nombreuses maladies humaines, IV-FPOP a le potentiel d’avoir un fort impact dans l’étude du rôle de la structure des protéines dans la pathogénie des maladies.
Disclosures
Cette publication a été écrite en réponse partielle à la thèse du doctorat JAE. Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de l’Université du Maryland, Baltimore et les NIH 1R01 GM 127595 attribués à LMJ. Les auteurs remercient le Dr Daniel Deredge pour son aide dans l’édition du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
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