Summary
In vivo rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (IV-FPOP) er en hydroksylradikal proteinfotavtrykksteknikk som gjør det mulig å kartlegge proteinstruktur i sitt eget miljø. Denne protokollen beskriver montering og oppsett av IV-FPOP mikrofluidic flow system.
Abstract
Rask oksidasjon av proteiner (FPOP) er en hydroksylradikal proteinfotavtrykk (HRPF) metode som brukes til å studere proteinstruktur, protein-ligand interaksjoner og proteinproteininteraksjoner. FPOP benytter en KrF excimer laser på 248 nm for fotolysse av hydrogenperoksid for å generere hydroksylradikaler som igjen oksidativt modifiserer løsemiddel-tilgjengelige aminosyre sidekjeder. Nylig utvidet vi bruken av FPOP av in vivo oksidativ merking i Caenorhabditis elegans (C. elegans), med tittelen IV-FPOP. De gjennomsiktige nematodene har blitt brukt som modellsystemer for mange menneskelige sykdommer. Strukturelle studier i C. elegans av IV-FPOP er mulig på grunn av dyrets evne til å ta opp hydrogenperoksid, deres åpenhet til laserbestråling på 248 nm, og den irreversible karakteren av modifikasjonen. Monteringen av et mikrofluidisk strømningssystem for IV-FPOP-merking, IV-FPOP-parametere, proteinekstraksjon og LC-MS/MS-optimaliserte parametere er beskrevet heri.
Introduction
Proteinfotavtrykk kombinert med massespektrometri (MS) har blitt brukt de siste årene til å studere proteininteraksjoner og konformasjonsendringer. Hydrokylradikal proteinfotavtrykk (HRPF) metoder probeprotein løsemiddel tilgjengelighet ved å modifisere protein aminosyre sidekjeder. HRPF-metoden, rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP)1, har blitt brukt til å undersøke proteinstruktur in vitro2,in-cell (IC-FPOP)3, og senest in vivo (IV-FPOP)4. FPOP benytter en 248 nm bølgelengde excimer laser for å raskt generere hydroksyl radikaler ved fotolysse av hydrogenperoksid for å danne hydroksylradikaler1. I sin tur kan disse radikalerne merke 19 av 20 aminosyrer på en mikrosekund tidsskala, raskere enn proteiner kan utfolde seg. Selv om reaktiviteten til hver aminosyre med hydroksylradikaler strekker seg 1000 ganger, er det mulig å normalisere sidekjedeoksidasjon ved å beregne en beskyttelsesfaktor (PF)5.
Siden FPOP kan oksidativt modifisere proteiner uavhengig av størrelse eller primærsekvens, viser det seg å være en fordel for in-cell og in vivo proteinstudier. IV-FPOP prober proteinstruktur i C. elegans på samme måte som in vitro og in-cell studier4. C. elegans er en del av nematodefamilien og er mye brukt som modell for å studere menneskelige sykdommer. Ormens evne til å ta opp hydrogenperoksid ved både passiv og aktiv diffusjon gjør det mulig å studere proteinstruktur i forskjellige kroppssystemer. I tillegg er C. elegans egnet for IV-FPOP på grunn av deres gjennomsiktighet på 248 nm laser bølgelengde som trengs for FPOP6. Kobling av denne metoden til massespektrometri gjør det mulig å identifisere flere modifiserte proteiner ved hjelp av tradisjonelle nedenfra og opp proteomics tilnærminger.
I denne protokollen beskriver vi hvordan du utfører IV-FPOP for analyse av proteinstruktur i C. elegans. Den eksperimentelle protokollen krever montering og oppsett av mikrofluidic flow system for IV-FPOP tilpasset fra Konermann et al7. Etter IV-FPOP er prøvene homogenisert for proteinekstraksjon. Proteinprøver proteolyzed og peptider analyseres av flytende kromatograf (LC) tandem MS, etterfulgt av kvantifisering.
Protocol
1. C. elegans vedlikehold og kultur
- Vokse og synkronisere ormer kolonier til deres fjerde larver (L4) stadium etter standard laboratorieprosedyrer8.
- Dagen for IV-FPOP eksperiment, vask L4 ormer fra bakterielle plener (OP50 E. coli) med M9 buffer (0,02 M KH2PO4,0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
- Få 500 μL aliquots av ~ 10.000 ormer per IV-FPOP prøve.
2. Montering av mikrofluidiske strømningssystemer
- Start strømningssystemenheten ved å kutte et 2 cm stykke fluorert etylenpropylen (FEP) slange (1/16 tommer(o.d.) x 0,020 i indre diameter (dvs.)).
- Bruk en ren dissekerende nål, utvide iD av FEP slangen for å lage et lite krater i den ene enden bare, ~ 50 mm i lengde. Krateret skal være stort nok til å passe to 360 μm o.d. biter av smeltet silika.
MERK: Ikke utvid i motsatt ende, da denne enden kun vil bli brukt til å montere utløpskapillæren. - Med en keramisk kutter, kutt to 15 cm stykker av 250 μm i.d. smeltet silika. Disse to brikkene vil bli de infusing linjene i strømningssystemet.
- Ved hjelp av selvklebende tape, tape de to 250 μm id kapillærer sammen sikre at de er parallelle med hverandre og deres ender er 100% spylt.
MERK: For å sikre at de smeltede silikaendene ikke knuses etter kutting, og er rette og 100 % spylt mot hverandre, anbefales det å undersøke dem ved hjelp av et forstørrelsesglass eller under et stereomikroskop. - Sett de to teipede kapillærene inn i det håndlagde krateret på FEP-slangen. Skyv kapillærene opp til kanten av det håndlagde krateret.
FORSIKTIG: For å opprettholde effekten av strømningssystemet, ikke skyv forbi det håndlagde krateret (Figur 1a). - Plasser en liten prikk av epoksyharpiks på en ren overflate og bland med en dissekerende nål.
- Raskt, ved hjelp av samme nål, legg en liten dråpe harpiks på slutten av de infusing kapillærene der de kobler til FEP-slangen og la harpiksen tørke, hengende utløpssiden opp, i noen minutter (Figur 1a).
- Mens harpikstørker, binder FEP-slangen og to kapillærer sammen, kutter du en ny 250 μm i.d. kapillær. Den nye kapillæren vil bli utløpskapillæren til strømningssystemet. Den ønskede lengden på kapillæren kan beregnes ved hjelp av ligningen nedenfor:
Der l er lengden på kapillæren som skal kuttes i centimeter, er det ønsket reaksjonstid i minutter, f er strømningshastigheten i ml/min, og det vil si er kapillærens indre diameter i centimeter.
MERK: Etter at du har kuttet utløpskapillæren, må du undersøke endene som sikrer at de er rette og ikke knuses. - Når harpiksen har tørket, setter du inn den nye kapillæren gjennom FEP-røruttaketden. Innsiden av utløpskapillæren og de to infusing kapillærene skal skylle mot hverandre inne i FEP-slangen, dette skaper blanding-T (Figur 1b).
- Bind utløpskapillær- og FEP-slangen med fersk epoksyharpiks som beskrevet i trinn 2.6 og 2.7.
- La harpiksen tørke over natten og binde strømningssystemet sammen. Sett opp mikrofluidic flow system neste dag (Figur 1c).
3. Mikrofluidisk strømningssystem for in vivo FPOP
- Sett inn fire magnetiske rørere inne i én 5 ml sprøyte. Denne sprøyten blir prøvesprøyten. Magnetiske omrørere hindrer ormene i å bosette seg inne i sprøyten under IV-FPOP (Figur 2A).
- Fyll de to 5 ml sprøytene med M9. Pass på at det ikke er noen luftbobler inne i hver sprøyte, da de kan påvirke strømningshastigheten og blandeeffektiviteten.
- Koble en Luer-adapter til hver 5 ml sprøyte, slik at de er fingertette og sikret på plass.
- Fest hver sprøyte til en enkelt 3-2-ventil. Sprøyten skal festes til ventilens midtre port (Figur 2B).
- Fest hver 5 ml sprøyte til den doble sprøytepumpen og juster den mekaniske stoppkragen for å hindre overtrykk på sprøyten fra skyveblokken. Husk tilsetning av magnetiske rørere når du stiller inn stoppkragen.
- Fest hver infusing kapillær ende av det hjemmelagde mikrofluidiske strømningssystemet til den øverste porten på hver 3-2 ventil ved hjelp av en super flangeless mutter, FEP-hylse og superflangeless ferrule (Figur 2B).
- Til den gjenværende åpnede porten på 3-2-ventilen (bunnporten), fest en 10 cm 450 μm i.d. kapillær ved hjelp av en super flangeless mutter, FEP-hylse og superflangeless ferrule (Figur 2B). Disse kapillærene blir de uttrekkbare prøvekapillærene.
- Start pumpestrømmen og kontroller alle tilkoblinger av mikrofluidic flow system for visuelle lekkasjer. Strøm minst tre sprøytevolumer ved hjelp av den eksperimentelle strømningshastigheten. Den endelige strømningshastigheten er avhengig av laserbestrålingsvinduet, laserfrekvensen og et nullekskluderingsbrøkvolum.
MERK: For denne protokollen ble en endelig strømningshastighet på 375,52 μL/min beregnet ut fra et laserbestrålingsvindu på 2,55 mm, 250 μm i.d. smeltet silika, null eksklusjonsfraksjon og 50 Hz frekvens.- Strømningsbanen er merket av pilene på 3-2 ventilhåndtaket. Hver sprøyte kan etterfylles manuelt ved å flytte ventilhåndtaket fra utviseposisjonen til uttaksposisjonen.
MERK: Lekkasjer på 3-2-ventilen kan festes ved å skru superflangeless mutteren eller erstatte noen av ventiltilkoblingene (superflangeless mutter, FEP-hylse eller superflangeless ferrule). Lekkasjer ved blanding-T krever montering av det mikrofluidiske strømningssystemet (trinn 2.1 til 2.11).
- Strømningsbanen er merket av pilene på 3-2 ventilhåndtaket. Hver sprøyte kan etterfylles manuelt ved å flytte ventilhåndtaket fra utviseposisjonen til uttaksposisjonen.
- Flytt mikrofluidic flow system til den eksperimentelle benken og fest utløpskapillæren til utstrålende stadium ved hjelp av en 360 μm o.d. rustfritt stål union (Figur 2C, D).
- Ved hjelp av en langtrekkende lighter, brenn belegget av smeltet silika på laserbestrålingsvinduet. Rengjør det brente belegget ved hjelp av lofritt vev og metanol.
MERK: Veksle mellom brennende sykluser og metanolrengjøringssykluser for å unngå overoppheting av kapillæren, da overflødig varme kan smelte og/eller bryte kapillæren. - Plasser den magnetiske røreblokken over 5 ml sprøyten som inneholder de magnetiske rørerne. Juster hastigheten og posisjonen til den magnetiske røreblokken slik at de magnetiske rørerne inne i 5 mlsprøyten roterer sakte og hele tiden.
4. I vivo FPOP
- Slå på KrF excimer laser og la thyratron å varme opp.
FORSIKTIG: Laseren avgir synlig og usynlig stråling ved 248 nm bølgelengde som kan skade øynene. Riktig øyebeskyttelse bør brukes før du slår på laseren og åpner stråleutgangsvinduet. - Mål laserenergien med en frekvens på 50 Hz i minst 100 pulser ved å plassere den optiske sensoren ved stråleutgangsvinduet.
MERK: For denne protokollen ble det brukt et 2,55 mm bestrålingsvindu med en laserenergi på 150 ± 2,32 mJ. - Få caimativt 10 000 ormer (500 μL) og trekk prøven inn i prøvesprøyten manuelt.
- Fyll prøvesprøyten med 2,5 ml M9-buffer for et endelig prøvevolum på 3 ml. Kontroller at det ikke innføres luftbobler i prøvesprøyten.
- Fyll den andre sprøyten med 3 ml 200 mM H2O2, igjen for å sikre at ingen luftbobler blir introdusert i sprøyten.
- På slutten av uttaket kapillær, plassere et 15 ml konisk rør innpakket i aluminiumsfolie som inneholder 6 ml 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-fenylnitrone (PBN), og 1% dimetylsulfoksid for å slukke overflødig H2O2,hydroksylradikaler og hemme metionin sulfoksidreksaktivitet, henholdsvis.
- Start excimer laseren fra programvarevinduet, vent på den første pulsen, og start prøvestrømmen fra den doble sprøyten.
MERK: Prøver bør kjøres i biologiske duplikater i tekniske triplicates under 3 prøver forhold: laserbestråling med H2O2 (prøve), ingen laserbestråling med H2O2 og ingen laserbestråling ingen H2O2 (kontroller), totalt til 9 prøver per biologisk sett. - Samle hele prøven i 15 ml rør, mens aktivt overvåke prøvestrømmen for eventuelle visuelle lekkasjer som noen tilbake trykk fra prøvesprøyten kan noen ganger bygge opp.
- Etter IV-FPOP, pellet ormer ved sentrifugering på 805 x g i 2 min. Fjern slukkeoppløsning, tilsett 250 μL lysis buffer (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid [PMSF]). Overfør prøven til et rent mikrosentrifugerør, blits fryse og oppbevar ved -80 °C til prøvefordøyelsen.
5. Proteinekstraksjon, rensing og proteolysis
- Tin frosne prøver på is og homogeniser ved sonikering i 10-tallet, etterfulgt av en 60-s isinkubasjon. Flere runder med sonikering kan være nødvendig, homogenkan observeres under et stereomikroskop ved å plassere en 2 μL prøve aliquot på et mikroskop lysbilde. Prøvehomogenisering er fullført når små eller ingen biter av ormer er sett.
- Sentrifuge homogeniserte ormer ved 400 x g i 5 min ved 4 °C og samle supernatanten i et rent mikrosentrifugerør.
- Bestem prøveproteinkonsentrasjoner ved hjelp av en bicinchoninsyreanalyse (BCA-analyse) ved hjelp av produsentens instruksjoner.
MERK: Prøvekonsentrasjon kan bestemmes ved hjelp av enhver biokjemisk proteinkonsentrasjonsanalyse av valg. Husk reagenskompatibilitet med lysisbuffer (8 M urea, 0,5 % SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). I tillegg kan det være nødvendig med en bufferfortynning. - Få 100 μg protein fra hver prøve og plasser i rene mikrostimulerende rør.
- Legg dithiothreitol (DTT) til en 10 mM endelig konsentrasjon for å redusere disulfidbindinger i alle prøver. Vortex, snurr ned og inkuber prøvene ved 50 °C i 45 min.
- Avkjøl prøver til romtemperatur i 10 min.
- Tilsett iodoacetamid (IAA) til en 50 mM endelig konsentrasjon for å alkylate reduserte rester. Vortex, snurr ned og inkuber prøver i 20 min ved romtemperatur beskyttet mot lys.
- Umiddelbart etter alkylering, utfell proteinprøven ved å legge til 4 volumer av 100% forkjølt aceton og inkubere ved -20 °C over natten.
- Neste dag, pellet protein utfelling ved sentrifugering på 16.000 x g i 10 min. Vask prøvepellet med 90% aceton, fjerne supernatant, og la pellet tørke i 2-3 min.
- Re-suspendere proteinpellet i 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL). Legg trypsin på en endelig protease til protein ratio på 1:50 (w / w) og fordøye prøver ved 37 °C over natten.
- Neste dag slukke trypsin fordøyelsesreaksjonen ved å legge til 5% maursyre.
MERK: Minimum 0,5 μg peptider per prøve er nødvendig for LC-MS/MS-analyse (trinn 6,1-6,5). Bestem prøvepeptidkonsentrasjoner ved hjelp av en kvantitativ kolorisk peptidanalyse (se materialtabellen) som beskrevet i produsentens protokoll.
6. Høy ytelse flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS)
- Bruk følgende LC mobile faser: vann i 0,1% FA (A) og ACN i 0,1% FA (B).
- Last 0,5 μg peptider på en fellekolonne (180 μm × 20 mm) som inneholder C18 (5 μm, 100 Å) og vaskeprøve med 99 % løsningsmiddel A og 1 % B i 15 min ved 15 μL/min strømningshastighet.
- Separate peptider med en internpakket kolonne (0,075 mm i.d. × 20 mm) med C18 omvendt fasemateriale (5 μm, 125 Å).
- Bruk følgende analytiske separasjonsmetode: gradienten ble pumpet ved 300 nL/min i 120 min: 0–1 min, 3 % B; 2-90 min, 10-45% B; 100–105 min, 100 % B; 106-120 min, 3% B.
- Utfør datainnhenting av peptider i positiv ionmodus nano-elektrospray ionisering (nESI) ved hjelp av et høyoppløsnings massespektrometer.
MERK: For denne protokollen ble et ultraytelses LC-instrument (UPLC) instrument par til et høyoppløselig massespektrometer brukt. Dataavhengig innhenting ble benyttet. M/z-skanneområdet for MS1 var 3750–1500 ved 60 000 oppløsning og 60 dynamisk eksklusjon. Ioner med ladetilstander på +1 og >6 ble ekskludert. Et automatisk gain control (AGC)-mål på 5,5e5 ble brukt med en maksimal injeksjonstid på 50 ms og en intensitetsterskel på 5,5e4. Ioner valgt for MS2 ble utsatt for høyere energi kollisjonsspredning (HCD) fragmentering ved hjelp av 32% normalisert kollisjonsenergi. Fragmentioner ble oppdaget i spektrometeret med 15 000 oppløsning og et 5.0e4 AGC-mål.
7. Dataanalyse
- Søk tandem MS-filer med en nedenfra og opp proteomics analyse programvare mot C. elegans database.
- Angi proteinanalysesøkeparametrene som følger: en trypsin savnet spalting, 375–1500 m/z peptidmasseområde, fragmentmassetoleranse på 0,02 og forløpermassetoleranse på 10 ppm. Karboamidometylering er satt som en statisk modifikasjon og alle vet hydroksyl radikale sidekjede modifikasjoner9,10 som dynamisk. Peptid identifikasjon er etablert med 95% tillit (medium) og rester på 99% tillit (høy). Den falske oppdagelsesraten (FDR) er angitt en 1%.
- Eksporter data til en elektronisk database og oppsummere omfanget av oksidasjon per peptid eller rester ved hjelp av ligningen under11:
MERK: Der EIC-området er modifisert er det ekstraherte ionkromatografiske området (EIC) av peptidet eller rester med oksidativ modifikasjon, og EIC-området er det totale arealet av samme peptid eller rester med og uten oksidativ modifikasjon.
Representative Results
I mikrofluidic flow system som brukes for IV-FPOP, H2O2 og ormene holdes atskilt til like før laserbestråling. Denne separasjonen eliminerer nedbrytning av H2O2 ved endogene catalase og andre cellulære mekanismer12. Bruken av en kapillær på 250 μm viser en total prøvegjenoppretting mellom 63–89 % på tvers av to biologiske replikater, mens kapillæren på 150 μm viser bare 21–31 % gjenoppretting (figur 3A). Bruk av en større i.d. kapillær (250 μm) fører til bedre ormflyt under IV-FPOP og enkeltormstrømning (figur 3B) sammenlignet med en mindre id kapillær (150 μm) (Figur 3C). Den 150 μm i.d. kapillær tillater ikke enkelt orm flyt (Figur 3C) og flere ormer er sett flyter sammen på laser bestrålevinduet som reduserer mengden lasereksponering per enkelt orm.
IV-FPOP er en kovalent merkingsteknikk som sonderer løsemiddeltilgjengelighet i C. elegans. Figur 4A viser en representativ ekstrahert ionkromatogram (EIC) av et FPOP modifisert og umodifisert peptid. Hydroksylradikal etiketten endrer kjemien til oksidativt modifiserte peptider, og gjør dermed FPOP modifiserte peptider mer polare. I omvendt fase kromatografi har IV-FPOP modifiserte peptider tidligere oppbevaringstider enn umodifiserte peptider. MS/MS fragmentering av isolerte peptider gjør det mulig å identifisere oksidativt modifiserte rester (figur 4B).
IV-FPOP har vist seg å oksidativt modifisert totalt 545 proteiner på tvers av to biologiske replikater innenfor C. elegans (Figur 5A,B). En fordel med IV-FPOP som proteinfotavtrykkmetode er avhengig av teknikkens evne til å modifisere proteiner i en rekke kroppssystemer i ormene (Figur 5C). Denne metoden ville tillate å sonde proteinstruktur og proteininteraksjoner uavhengig av kroppsvev eller organ i ormen. Videre bekrefter tandem MS-analyse IV-FPOP-prober løsningsmiddeltilgjengelighet in vivo. Oksidasjonsmønsteret til varmesjokkproteinet 90 (Hsp90) i kompleks med myosinchaperonproteinet UNC-45 ble analysert (Figur 6). MS/MS-analyse for Hsp90 viser fire oksidativt modifiserte rester (figur 6C,D), normalisert grad av FPOP-modifikasjon (ln(PF))5 indikerer Hsp90s rester M698 for å være mindre løsemiddel tilgjengelig enn rester R697, E699 og E700 når den er bundet til UNC-45 (Figur 6C). Disse forskjellene i oksidasjon er validert ved beregninger av tilgjengelige overflatearealberegninger (PDB 4I2Z13). Rester M698 har en SASA-verdi på 0,03 som anses å være en begravet rest sammenlignet med rester R697, E699 og E700 med høyere SASA-verdier (Figur 6C). 14.
Figur 1. In vivo FPOP mikrofluidic flow system skjematisk. (A) De to infusing linjene (oransje) av IV-FPOP strømningssystemet vises inne i FEP slangen (gul), er riktig bindingposisjon av epoksyharpiksen representert av den lyseblå sirkelen. (B) Komplett montert blanding-T dannet av de tre 250 μm i.d. kapillærer. Den riktige harpiksbindingsposisjonen til utløpskapillæren til FEP-slangen er representert av den lyseblå sirkelen. (C) Det komplette monterte strømningssystemet for in vivo kovalent merking av C. elegans. Før FPOP holdes ormer atskilt fra H2O2 til like før merking; laserbestrålingsvinduet vises i lyseblått og laserstrålen representeres av det lilla lynet. Tallene skal ikke skaleres. Dette tallet er endret fra Espino et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Mikrofluidisk system under IV-FPOP. (A) Representativt bilde av C. elegans inne i 5 ml sprøyten. Uten omrøring legger ormene seg på bunnen av sprøyten (venstre). Magnetrørerne og rørerblokken holder ormene i fjæring under IV-FPOP-forsøkene (høyre). (B) Representativt bilde av en 5 ml sprøyte, infusing kapillær, og trekke kapillær koblet til 3-2 ventilen. 3-2 ventilhåndtaket vises i trekkstilling. (C) Mikrofluidic flow system under IV-FPOP, den magnetiske rørerblokken er plassert over ormenes 5 ml sprøyte. (D) Utløpskapillær festet til utstrålende stadium. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Sammenligning av C. elegans flyt og gjenoppretting ved hjelp av to i.d. kapillærer. (A) Prosent utvinning av ormer etter IV-FPOP for to biologiske replikater (BR) med 250 (grå) og 150 (svart) μm i.d. kapillærer. Feilfelt beregnes ut fra standardavviket på tvers av tekniske triplicates. C. elgans strømmer gjennom laserbestrålte vinduet gjennom en 250 μm (B) og 150 μm (C) i.d. kapillærer. Ormene er tettere komprimert i mindre kapillær. Den 150 μm i.d. kapillær viser klumping av ormer. Dette tallet er endret fra Espino et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Representative LC-MS/MS-resultater etter IV-FPOP. (A) EIC av et FPOP modifisert peptid (rødt) og umodifisert (blått). Det valgte peptidet tilhører actin-1-proteinet. (B) MS/MS spektrum av dobbelt ladet umodifisert actin-1 peptid 317-327. (C) MS/MS spektrum av dobbelt ladet FPOP modifisert actin-1 peptid 317-327, i dette eksemplet P323 ble oksidativt endret (y5+ ion, rød). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. IV-FPOP endrer oksidativt proteiner i C. elegans. (A) Venn diagram av oksidativt modifiserte proteiner i nærvær av 200 mM hydrogenperoksid ved 50 Hz over to biologiske replikater (BR), BR1 er i blått og BR2 er i gult. (B) Venn diagram av oksidativt modifiserte proteiner identifisert i bestrålte prøver, hydrogenperoksid kontroll, og orm-bare kontroll i BR2 på tvers av tekniske triplicates. (C) Sektordiagram med oksidativt modifiserte proteiner i forskjellige C. elegans kroppssystemer. Dette tallet er endret fra Espino et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Correlating IV-FPOP modifikasjoner på løsemiddel tilgjengelighet. (A) Myosin chaperon protein UNC-45 (grå) (PDB ID 4I2Z13) utheving to modifiserte peptider identifisert av LC / MS / MS analyse, 669-680 og 698−706 (grønn, venstre innfelt). UNC-45 er bundet til Hsp90 peptidfragmentet (blå). Oksidativt modifiserte rester i dette fragmentet er vist i pinner (rød), og UNC-45 gjengis som en overflate (høyre innfelt). (B) Tandem MS spectra av UNC-45 peptid 669−680 (øverst) og 698−706 (nederst) som viser b- og y-ioner for tap av CO2, en FPOP modifikasjon. (C) Beregnet ln(PF) for Hsp90 oksidativt modifiserte rester, R697, M698, E699 og E700. Beregnede SASA-verdier for Hsp90 er merket over hver rest. (D) Tandem MS spectra for R697, M698, E699 og E700 viser en +16 FPOP modifikasjon. Dette tallet er endret fra Espino et al.4. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Den nåværende referansen for studiet av in vivo protein-protein interaksjoner (PPI) er fluorescens resonans energioverføring (FRET). I sin enkleste form studerer denne teknikken PPI ved energioverføring mellom to molekyler når de er i nærheten av hverandre15. I motsetning til MS-teknikker har FRET ikke oppløsning en karakterisering av konformasjonsendringer og interaksjonssteder på aminosyrenivå. MS-baserte teknikker har i økende grad blitt brukt til studiet av PPI16. IV-FPOP er en HRPF-metode som muliggjør in vivo protein strukturell analyse i C. elegans. For å kunne merke C. elegans av IV-FPOP, er det viktig å montere mikrofluidic flow-systemet på riktig måte for å redusere prøvetap. Den 250 μm i.d. kapillær har vist seg å maksimere prøveutvinning sammenlignet med mindre i.d. kapillærer4. Større i.d. kapillærer har ikke blitt testet, men det mikrofluidiske strømningssystemet er utformet ved hjelp av en kapillær med samme i.d. som et kommersielt tilgjengelig flytcytometrisystem for sortering av C. elegans. 17 Ormprøvestørrelsen er også viktig, en prøvestørrelse på mindre enn ~ 10 000 per prøve før FPOP gir ikke proteinkonsentrasjoner høyt nok for LC-MS/MS-analyse. Høyere prøvestørrelser (> 10 000 ormer) kan også brukes ved å justere det opprinnelige startvolumet (trinn 4.5).
Riktig montering av mikrofluidic flow system er viktig. Lekkasjer i prøvebanen resulterer i en inkonsekvent strøm av ormene eller H2O2. Ferrules, ermer og 3-2 ventiler kan gjenbrukes fra flere IV-FPOP eksperimenter hvis riktig rengjort etter hvert eksperiment. Vi anbefaler imidlertid å sette sammen et nytt mikrofluidisk strømningssystem for hver biologisk elikm. Hvis mikrofluidics er riktig montert, vil ormene og H2O2 blande senk ved blanding-T med minimalt ryggtrykk. Som kvalitetskontroll (QC) av mikrofluidic flow system, anbefaler vi teste blandeeffektiviteten ved hjelp av fargede fargestoffer. Det er viktig å overvåke bevegelsen til de magnetiske omrørerne inne i ormsprøyten under IV-FPOP, feil prøveblanding i ormsprøyten eller blandingen-T kan føre til at bakgrunnstrykket forårsaker lekkasjer. I tillegg fører dårlige blandeforhold til store prøvetap, dårlig lasereksponering av ormer ved laservinduet og tilstopping.
C. elegans vedlikehold er viktig for å redusere bakgrunnsoksidasjon. Vi anbefaler at du vokser ormene ved lave temperaturer under lave stressforhold, da høye temperaturer kan påvirke total bakgrunnsoksidasjon. En kontrollprøve sett med ormer bare, ingen H2O2 og ingen laserbestråling, anbefales for alle IV-FPOP eksperimenter for å ta hensyn til bakgrunnsoksidasjon på grunn av laboratorievedlikehold. En av dagens begrensninger i denne teknikken er totalt antall oksidativt modifiserte peptider identifisert og det totale antall rester oksidert per peptid for å få høyere protein strukturell informasjon. Selv om det ikke anbefales, kan en økning i oksidative modifikasjoner oppnås ved å bruke høyere konsentrasjoner av hydrogenperoksid. En økning i hydrogenperoksid kan betydelig endre viktige biologiske veier samt føre til oksidasjonsindusert utfolder. Hvis hydrogenperoksidkonsentrasjonen for IV-FPOP økes, anbefales det å teste ormlevedyktighet og bakgrunnsoksidasjon, da konsentrasjoner høyere enn 200 mM ikke er testet.
LC-MS/MS-protokollen som er beskrevet, kan optimaliseres og endres for å møte MS QC for andre laboratorier. Bruken av 2D-kromatografiteknikker har tidligere vist seg å øke identifiseringen av oksidativt modifiserte peptider og proteiner18. Likevel er proteinberikelsesteknikker som retter seg mot et bestemt protein av interesse, ikke anbefalt, inkludert, men ikke begrenset til antistoffnedbør eller nedtrekksanalyser. Disse teknikkene kan forutse mot en proteinconformer hvis epitope / bindende stedet for proteinet har blitt oksidativt modifisert av IV-FPOP. Nye utviklinger i fotavtrykk radikale reagenser, som sulfat radikal anion10 eller trifluoromethylation19 kan øke allsidigheten av IV-FPOP. Selv om den eneste merking reagens testet in vivo så langt er hydrogenperoksid, andre laser-aktivert radikaler kan optimaliseres. Bruken av andre radikaler bør vise seg å være kompatibel med orm levedyktighet, celle gjennomtrengelig, og 248 nm laser bølgelengde. På grunn av bruk av C. elegans som modellsystem for mange menneskelige sykdommer, iv-FPOP har potensial til å ha en sterk innvirkning i å studere rollen protein struktur i sykdom patogenese.
Disclosures
Denne publikasjonen ble skrevet i delvis oppfyllelse av JAE Ph.D. avhandlingen. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av oppstartsmidler fra University of Maryland, Baltimore og NIH 1R01 GM 127595 tildelt LMJ. Forfatterne takker Dr. Daniel Deredge for hans hjelp til å redigere manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
- Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
- Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
- Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
- Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
- Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
- Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).
