Summary
In vivo snabb fotokemisk oxidation av proteiner (IV-FPOP) är en hydroxyl radikal protein footprinting teknik som möjliggör kartläggning av proteinstruktur i sin inhemska miljö. Detta protokoll beskriver montering och upplägg av IV-FPOP mikrofluidiska flödessystem.
Abstract
Snabb oxidation av proteiner (FPOP) är en hydroxylradikal proteinavtryck (HRPF) metod som används för att studera proteinstruktur, protein-ligand interaktioner, och protein-protein interaktioner. FPOP använder en KrF excimer laser på 248 nm för fotolys av väteperoxid för att generera hydroxylradikaler som i sin tur oxidativt modifiera lösningsmedelsankomlig aminosyra sidokedjor. Nyligen utökade vi användningen av FPOP av in vivo oxidativ märkning i Caenorhabditis elegans (C. elegans), med titeln IV-FPOP. De genomskinliga nematoderna har använts som modellsystem för många mänskliga sjukdomar. Strukturella studier i C. elegans av IV-FPOP är genomförbara på grund av djurets förmåga att upptag av väteperoxid, deras öppenhet för laserbestrålning vid 248 nm och den oåterkalleliga karaktären hos ändringen. Monteringen av ett mikrofluidiskt flödessystem för IV-FPOP-märkning, IV-FPOP-parametrar, proteinutvinning och LC-MS/MS-optimerade parametrar beskrivs häri.
Introduction
Proteinavtryck kopplat till masspektrometri (MS) har använts under de senaste åren för att studera proteininteraktioner och konformationsförändringar. Hydroxylradikal proteinavtryck (HRPF) metoder sond protein lösningsmedel tillgänglighet genom att ändra protein aminosyra sidokedjor. HRPF-metoden, snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP)1, har använts för att undersöka proteinstruktur in vitro2, in-cell (IC-FPOP)3och nu senast in vivo (IV-FPOP)4. FPOP använder en 248 nm våglängd excimer laser för att snabbt generera hydroxylradikaler genom fotolys av väteperoxid för att bilda hydroxylradikaler1. I sin tur kan dessa radikaler märka 19 av 20 aminosyror på en mikrosekt tidsskala, snabbare än proteiner kan utvecklas. Även om reaktiviteten hos varje aminosyra med hydroxylradikaler sträcker sig 1000 gånger, är det möjligt att normalisera oxidation av sidokedjan genom att beräkna en skyddsfaktor (PF)5.
Eftersom FPOP oxidativt kan modifiera proteiner oavsett storlek eller primär sekvens, visar det sig vara fördelaktigt för in-cell och in vivo proteinstudier. IV-FPOP undersöker proteinstrukturen i C. elegans på samma sätt som in vitro- och incellstudier4. C. elegans är en del av nematodfamiljen och används ofta som modell för att studera mänskliga sjukdomar. Maskens förmåga att uppta väteperoxid genom både passiv och aktiv diffusion möjliggör studier av proteinstruktur i olika kroppssystem. Dessutom är C. elegans lämpade för IV-FPOP på grund av deras öppenhet vid 248 nm laservåglängd som behövs för FPOP6. Koppling av denna metod till masspektrometri gör det möjligt att identifiera flera modifierade proteiner med traditionella bottom-up proteomics metoder.
I detta protokoll beskriver vi hur man utför IV-FPOP för analys av proteinstruktur i C. elegans. Det experimentella protokollet kräver montering och uppsättning av mikrofluidiskt flödessystem för IV-FPOP anpassat från Konermann et al7. Efter IV-FPOP homogeniseras proverna för proteinutvinning. Proteinprover är proteolyserade och peptider analyseras med flytande kromatograf (LC) tandem MS, följt av kvantifiering.
Protocol
1. C. elegans underhåll och kultur
- Odla och synkronisera maskar kolonier till deras fjärde larver (L4) skede efter vanliga laboratorieprocedurer8.
- Dagen för IV-FPOP experiment, tvätta L4 maskar från bakteriella gräsmattor (OP50 E. coli) med M9 buffert (0,02 M KH2PO4, 0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 mM MgSO4).
- Få 500 μL alikvoter av ~10 000 maskar per IV-FPOP-prov.
2. Mikrofluidisk flödessystem montering
- Starta flödessystemets montering genom att skära en 2 cm bit fluorerade etylenpropylen (FEP) slangar (1/16 tum. ytterdiameter (o.d.) x 0,020 in. innerdiameter (i.d.)).
- Med hjälp av en ren dissekering nål, bredda id av FEP slangen för att göra en liten krater i ena änden bara, ~ 50 mm i längd. Kratern bör vara tillräckligt stor för att passa två 360 μm o.d. bitar av smält kiseldioxid.
OBS: Vidga inte den motsatta änden eftersom denna ände endast kommer att användas för att passa utloppskapillären. - Med en keramisk fräs, skär två 15 cm bitar av 250 μm i.d. smält kiseldioxid. Dessa två bitar kommer att bli de infunderande linjerna i flödessystemet.
- Med självhäftande tejp, tejpa de två 250 μm i.d. kapillärerna tillsammans se till att de är parallella med varandra och deras ändar är 100% spolas.
OBS: För att säkerställa att de smält kiseländarna inte krossas efter sågning, och är raka och 100% spolas mot varandra, rekommenderas att undersöka dem med hjälp av ett förstoringsglas eller under ett stereomikroskop. - Sätt in de två tejpade kapillärerna i FEP-slangens handgjorda krater. Tryck kapillärerna upp till kanten av den handgjorda kratern.
VARNING: För att bibehålla flödessystemets effektivitet, tryck inte förbi den handgjorda kratern (bild 1a). - Placera en liten prick av epoxiharts på en ren yta och blanda med en dissekerande nål.
- Snabbt, med samma nål, placera en liten droppe harts i slutet av infundera kapillärer där de ansluter med FEP slangen och låt hartset torka, hängande utlopp-sida upp, i några minuter(Figur 1a).
- Medan hartset torkar, binder FEP-slangen och två kapillärer tillsammans, skär en ny 250 μm i.d. kapillär. Den nya kapillären blir flödessystemets utloppskapillär. Den önskade längden på kapillären kan beräknas med hjälp av ekvationen nedan:
Om l är längden på kapillären som ska skäras i centimeter, är t önskad reaktionstid på några minuter, f är flödeshastigheten i mL/min och i.d. är kapillärens innerdiameter i centimeter.
OBS: När du har klippt utloppslocken, undersök ändarna så att de är raka och inte krossade. - När hartset har torkat, sätt in den nya kapillären genom FEP-slangutloppsänden. Utloppskapillärens invändiga ändar och de två infunderande kapillärerna ska spolas mot varandra inuti FEP-slangen, vilket skapar blandning-T(figur 1b).
- Bind utloppskapillären och FEP-slangen med färsk epoxiharts enligt beskrivningen i steg 2.6 och 2.7.
- Låt hartset torka över natten och binda ihop flödessystemet. Ställ in mikrofluidiskt flödessystem nästa dag (figur 1c).
3. Mikrofluidiskt flödessystem för in vivo FPOP
- Sätt i fyra magnetiska omrörare inuti en 5 ml-spruta. Denna spruta blir provsprutan. De magnetiska omrörarna hindrar maskarna från att sedimentera sprutan under IV-FPOP (figur 2A).
- Fyll de två 5 ml-sprutorna med M9. Se till att det inte finns några luftbubblor inuti varje spruta eftersom de kan påverka flödet och blandningseffektiviteten.
- Anslut en Luer-adapter till varje 5 ml-spruta så att de är fingertäta och fastsatta på plats.
- Fäst varje spruta på en enda 3-2 ventil. Sprutan ska fästas på ventilens mittport (bild 2B).
- Fäst varje 5 ml-spruta på den dubbla sprutpumpen och justera den mekaniska stoppkragen för att förhindra övertryck till sprutan från matarblocket. Tänk på att tillsatsen av magnetomrörare sätts in när du ställer in stoppkragen.
- Fäst varje infunderande kapillärände av det hemmagjorda mikrofluidiska flödessystemet i den övre porten på varje 3-2 ventil med hjälp av en super flangelessmutter, FEP-hylsa och superflangelesshylsa (figur 2B).
- Fäst en 10 cm μm i.d. kapillär med hjälp av en superflangelessmutter, FEP-hylsa och superflangelesshylsa (figur 2B). Dessa kapillärer blir det återta tar prov kapillärer.
- Starta pumpflödet och kontrollera alla anslutningar i mikrofluidiska flödessystemet för visuella läckor. Flöde minst tre sprutvolymer med hjälp av den experimentella flödeshastigheten. Det slutliga flödet är beroende av laserbestrålningsfönstret, laserfrekvensen och en fraktionsvolym utan undantag.
OBS: För detta protokoll beräknades ett slutligt flöde på 375,52 μL/min från ett laserbestrålningsfönster på 2,55 mm, 250 μm i.d. smält kiseldioxid, nollurallur uteslutningsfraktion och 50 Hz frekvens.- Flödesbanan markeras av pilarna på 3-2 ventilhandtaget. Varje spruta kan fyllas på manuellt genom att flytta ventilhandtaget från utvisningsläget till utträd läge.
OBS: Läckor vid 3-2-ventilen kan fixeras genom att skruva om superflangelessmuttern eller byta ut någon av ventilanslutningarna (super flangelessmutter, FEP-hylsa eller superflangelesshylsa). Läckage vid blandning-T kräver en återmontering av mikrofluidiska flödessystemet (steg 2.1 till 2.11).
- Flödesbanan markeras av pilarna på 3-2 ventilhandtaget. Varje spruta kan fyllas på manuellt genom att flytta ventilhandtaget från utvisningsläget till utträd läge.
- Flytta det mikroflytande flödessystemet till försöksbänken och fäst utloppshämjen till utstrålningsstadiet med hjälp av en 360 μm o.d. rostfri stålförening (figur 2C,D).
- Använd en långtgående tändare och bränn beläggningen av den smält kiseldioxiden vid laserbestrålningsfönstret. Rengör den brända beläggningen med luddfri vävnad och metanol.
OBS: Växla mellan förbränningscykler och metanolrengöringscykler för att undvika överhettning av kapillären eftersom överskottsvärme kan smälta och/eller bryta kapillären. - Placera magnetomrörsblocket ovanför den 5 ml-sprutan som innehåller magnetomrörarna. Justera hastigheten och placeringen av magnetomrörsblocket så att magnetomrörarna inuti 5 ml-sprutan roterar långsamt och konstant.
4. In vivo FPOP
- Slå på KrF excimer laser och låt tyratronen att värma upp.
VARNING: Lasern avger synlig och osynlig strålning vid 248 nm våglängd som kan skada ögonen. Rätt ögonskydd bör bäras innan du slår på lasern och öppnar strålutgångsfönstret. - Mät laserenergin med en frekvens av 50 Hz för minst 100 pulser genom att placera den optiska sensorn vid strålutgångsfönstret.
OBS: För detta protokoll användes ett 2,55 mm bestrålningsfönster med en laserenergi på 150 ± 2,32 mJ. - Få ungefär 10 000 maskar (500 μL) och dra manuellt tillbaka provet i provsprutan.
- Fyll provsprutan med 2,5 ml M9-buffert för en slutlig provvolym på 3 ml. Se till att inga luftbubblor förs in i provsprutan.
- Fyll den andra sprutan med 3 ml 200 mM H2O2, se igen se till att inga luftbubblor förs in i sprutan.
- Placera ett koniskt rör på 15 ml insvept i aluminiumfolie som innehåller 6 ml 40 mM N'-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-fenylnitron (PBN) och 1% dimetylsulfaoxid för att släcka överskott H2O2, hydroxylradikaler, och hämma metioninsulfoxidreduktasaktivitet.
- Starta excimer laser från programfönstret, vänta på den första pulsen och starta provflödet från den dubbla sprutan.
OBS: Proverna bör köras i biologiska dubbletter i tekniska tre exemplar under 3 provförhållanden: laserbestrålning med H2O2 (prov), ingen laserbestrålning med H2O2 och ingen laserbestrålning nr H2O2 (kontroller), totalt 9 prover per biologisk uppsättning. - Samla hela provet i 15 ml-röret, samtidigt som provflödet aktivt övervakas för eventuella visuella läckor, eftersom ett visst mottryck från provsprutan ibland kan ansamplas.
- Efter IV-FPOP pelletmaskar genom centrifugering vid 805 x g i 2 min. Ta bort släckningslösning, tillsätt 250 μL lysbuffert (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfonid fluorid [PMSF]). Överför provet till ett rent mikrocentrifugrör, blixtfrysning och förvara i -80 °C tills provsmältningen.
5. Proteinutvinning, rening och proteolys
- Tina frysta prover på is och homogenisera genom ultraljudsbehandling för 10 s, följt av en 60 s is inkubation. Flera omgångar av ultraljudsbehandling kan krävas, homogenat kan observeras under ett stereomikroskop genom att placera en 2 μL prov aliquot på ett mikroskop bild. Provhomogenisering är klar när små till inga bitar av maskar ses.
- Centrifug homogeniserade maskar vid 400 x g i 5 min vid 4 °C och samla supernatanten i ett rent mikrocentrifugrör.
- Bestäm provproteinkoncentrationer med hjälp av en bicinkoninsyraanalys (BCA-analys) med hjälp av tillverkarens anvisningar.
OBS: Provkoncentrationen kan bestämmas med hjälp av valfri biokemisk proteinkoncentrationsanalys. Tänk på reagenskompatibilitet med lysbuffert (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Dessutom kan en buffertutspädning vara nödvändig. - Få 100 μg protein från varje prov och placera i rena mikrocentrifugrör.
- Tillsätt dithiothreitol (DTT) till en slutlig koncentration på 10 mM för att minska disulfidbindningar i alla prover. Vortex, spin down och inkubera prover vid 50 °C i 45 min.
- Kyl proverna till rumstemperatur i 10 min.
- Tillsätt iodoacetamid (IAA) till en slutlig koncentration på 50 mM till alkylatminerade rester. Vortex, snurra ner och inkubera prover i 20 min vid rumstemperatur skyddad från ljus.
- Omedelbart efter alkylering, fäll ut proteinprovet genom att tillsätta 4 volymer av 100% förkyld aceton och inkubera vid -20 °C över natten.
- Nästa dag fälls pelletproteinet ut genom centrifugering vid 16 000 x g i 10 min. Tvätta provpellet med 90% aceton, ta bort supernatant och låt pelleten torka i 2–3 min.
- Åter suspend proteinpellet i 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL). Tillsätt trypsin vid ett slutligt proteas till proteinförhållande på 1:50 (w/w) och smält proverna vid 37 °C över natten.
- Nästa dag släcka trypsin matsmältningsreaktion genom att lägga till 5% myrsyra.
OBS: Minst 0,5 μg peptider per prov behövs för LC-MS/MS-analys (steg 6.1-6.5). Bestäm provpeptidkoncentrationerna med hjälp av en kvantitativ kolorimetrisk peptidanalys (se materialförteckningen)enligt tillverkarens protokoll.
6. Högpresterande vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS)
- Använd följande LC-mobilfaser: vatten i 0,1 % FA (A) och ACN i 0,1 % FA (B).
- Fyll 0,5 μg peptider på en fällakolonn (180 μm × 20 mm) som innehåller C18 (5 μm, 100 Å) och tvätta provet med 99 % lösningsmedel A och 1% B i 15 min vid 15 μl/min flöde.
- Separata peptider med en egen förpackad kolonn (0,075 mm i.d. × 20 mm) med C18 omvänd fasmaterial (5 μm, 125 Å).
- Använd följande analytiska separationsmetod: lutningen pumpades vid 300 nL/min i 120 min: 0−1 min, 3% B; 2−90 min, 10−45% B; 100−105 min, 100% B; 106−120 min, 3% B.
- Utför datainsamling av peptider i positivt jonläge nanoelektrosprayjonisering (nESI) med hjälp av en högupplöst masspektrometer.
För det här protokollet användes ett UPLC-instrumentpar (ultra-performance LC) till en högupplöst masspektrometer. Databeroende förvärv utnyttjades. M/z scan-intervallet för MS1 var 3750–1500 vid 60 000 upplösningar och 60-tals dynamisk uteslutning. Joner med laddningstillstånd på +1 och >6 exkluderades. Ett automatiskt förstärkningskontroll (AGC) mål på 5.5e5 användes med en maximal injektionstid på 50 ms och en intensitet tröskel på 5.5e4. Joner som valts ut för MS2 utsattes för fragmentering av kollisioner med högre energi (HCD) med 32 % normaliserad kollisionsenergi. Fragment joner upptäcktes i spektrometern med 15.000 upplösning och en 5.0e4 AGC mål.
7. Dataanalys
- Sök tandem MS filer med en bottom-up proteomics analys programvara mot C. elegans databasen.
- Ställ in proteinanalyssökparametrarna enligt följande: en trypsin missade klyvning, 375–1500 m/z peptidmassintervall, fragmentviktstolerans på 0,02 och prekursorviktstolerans på 10 ppm. Carbamido metylering är inställd som en statisk modifiering och alla vet hydroxyl radikala sidokedjemodifieringar9,10 som dynamisk. Peptid identifiering är etablerad på 95% förtroende (medium) och rester vid 99% förtroende (hög). Den falska identifieringshastigheten (FDR) anges till 1 %.
- Exportera data till en elektronisk databas och sammanfatta omfattningen av oxidation per peptid eller rester med hjälp av ekvationen nedan11:
OBS: Om EIC-området modifierats är det extraherade jonkromatografiska området (EIC) av peptiden eller rester med en oxidativ modifiering, och EIC-området är den totala ytan av samma peptid eller rester med och utan den oxidativa modifieringen.
Representative Results
I det mikrofluidiska flödessystem som används för IV-FPOP hålls H2O2 och maskarna åtskilda tills strax före laserbestrålning. Denna separation eliminerar nedbrytning av H2O2 med endogen katalas och andra cellulära mekanismer12. Användningen av en kapillär på 250 μm visar en total provåtervinning på mellan 63–89 % för två biologiska replikat, medan kapillären på 150 μm endast visar 21–31 % återhämtning (figur 3A). Användning av ett större id kapillär (250 μm) leder till bättre maskflöde under IV-FPOP och enda maskflöde (figur 3B) jämfört med en mindre i.d. kapillär (150 μm) (figur 3C). Kapillären på 150 μm tillåter inte ett enda maskflöde (figur 3C) och flera maskar ses flöda tillsammans vid laserbestrålningsfönstret, vilket minskar mängden laserexponering per mask.
IV-FPOP är en kovalent märkningsteknik som sonderar lösningsmedelstillgänglighet i C. elegans. Figur 4A visar ett representativt extraherat jonkromatogram (EIC) av en FPOP-modifierad och oförändrad peptid. Den hydroxylradikala etiketten ändrar kemin hos oxidativt modifierade peptider, vilket gör FPOP modifierade peptider mer polära. I omvänd fas kromatografi, IV-FPOP modifierade peptider har tidigare retention gånger än oförändrade peptider. Ms/MS-fragmentering av isolerade peptider gör det möjligt att identifiera oxidativt modifierade rester (figur 4B).
IV-FPOP har visat sig oxidativt modifierat totalt 545 proteiner över två biologiska replikat inom C. elegans (figur 5A,B). En fördel med IV-FPOP som en proteinavtrycksmetod bygger på teknikens förmåga att modifiera proteiner i en mängd olika kroppssystem i maskarna (figur 5C). Denna metod skulle göra det möjligt att sond proteinstruktur och protein interaktioner oavsett kroppsvävnad eller organ i masken. Ytterligare, tandem MS analys bekräftar IV-FPOP sonder lösningsmedel tillgänglighet in vivo. Oxidationsmönstret för värmechockproteinet 90 (Hsp90) i komplex med myosinförklädeproteinet UNC-45 analyserades (figur 6). MS/MS-analys för Hsp90 visar att fyra oxidativt modifierade rester(figur 6C,D),den normaliserade omfattningen av FPOP-modifiering (ln(PF))5 visar att Hsp90:s rester M698 är mindre åtkomliga än rester R697, E699 och E700 när de är bundna till UNC-45 (figur 6C). Dessa skillnader i oxidation valideras genom beräkningar av litteraturlösningsmedelseradyta (SASA) (PDB 4I2Z13). Resthalt M698 har ett SASA-värde på 0,03 som anses vara en nedgrävd restprodukt jämfört med rester R697, E699 och E700 med högre SASA-värden (figur 6C). 14 år
Bild 1. In vivo FPOP mikrofluidiska flödessystem schematisk. (A)De två infunderande linjerna (orange) i IV-FPOP-flödessystemet visas inuti FEP-slangen (gul), det korrekta bindningsläget för epoxihartsen representeras av den ljusblå cirkeln. B)Komplett sammansatt blandning-T som bildas av de tre kapillärerna på 250 μm i.d. Den korrekta hartsbindningspositionen för utloppskapillären till FEP-slangen representeras av den ljusblå cirkeln. c)Det kompletta sammansatta flödessystemet för in vivo kovalent märkning av C. elegans. Före FPOP hålls maskar åtskilda från H2O2 till strax före märkningen. Laserbestrålningsfönstret visas i ljusblått och laserstrålen representeras av den lila blixten. Siffrorna är inte att skala. Denna siffra har ändrats från Espino et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mikrofluidiskt system under IV-FPOP. (A) Representativ bild av C. elegans inuti 5 ml sprutan. Utan omrörning lägger sig maskarna längst ner på sprutan (vänster). De magnetiska omrörarna och omrörsblocket håller maskarna i suspension under IV-FPOP-experimenten (höger). (B)Representativ bild av en 5 ml-spruta, infundera kapillär och dra tillbaka kapillären ansluten till 3-2 ventilen. 3-2 ventilhandtaget visas i utträdet läge. (C)Mikrofluidiskt flödessystem under IV-FPOP, magnetomrörsblocket är placerat ovanför maskarnas 5 ml-spruta. (D)Utloppskapillär fastsatt i strålningsstadiet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3. Jämförelse av C. elegans flöde och återvinning med hjälp av två id kapillärer. (A) Procent återvinning av maskar efter IV-FPOP för två biologiska replikat (BR) med 250 (grå) och 150 (svart) μm i.d. kapillärer. Felstaplar beräknas utifrån standardavvikelsen över tekniska triplicates. C. elgans som strömmar genom laserbestrålar fönstret genom en 250 μm(B)och 150 μm(C)i.d. kapillärer. Maskarna är mer tätt packade i den mindre kapillären. Kapillären på 150 μm visar klumpar av maskar. Denna siffra har ändrats från Espino et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4. Representativa LC-MS/MS-resultat efter IV-FPOP. (A)EIC för en FPOP modifierad peptid (röd) och oförändrad (blå). Den valda peptiden tillhör aktin-1-proteinet. b)MS/MS-spektrum av dubbelt laddad oförändrad aktin-1 peptid 317-327. (C)MS/MS-spektrum av dubbelt laddad FPOP modifierad aktin-1 peptid 317-327, i detta exempel P323 var oxidativt modifierad (y5+ jon, röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. IV-FPOP oxidativt ändrar proteiner inom C. elegans. (A)Venndiagram över oxidativt modifierade proteiner i närvaro av 200 mM väteperoxid vid 50 Hz över två biologiska replikat (BR), BR1 är i blått och BR2 är i gult. B)Venndiagram över oxidativt modifierade proteiner som identifierats i bestrålade prover, väteperoxidkontroll och kontroll endast av mask i BR2 över tekniska triplicates. (C)Cirkeldiagram över oxidativt modifierade proteiner inom olika C. elegans-karossystem. Denna siffra har ändrats från Espino et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Korrelera IV-FPOP-modifieringar av tillgänglighet till lösningsmedel. (A)Myosin chaperon protein UNC-45 (grå) (PDB ID 4I2Z13) belyser två modifierade peptider identifieras genom LC/MS/MS analys, 669−680 och 698−706 (grön, vänster infälld). UNC-45 är bunden till Hsp90 peptidfragment (blå). Oxidativt modifierade rester inom detta fragment visas i pinnar (röd), och UNC-45 återges som en yta (höger infälld). (B)Tandem MS spektra av UNC-45 peptid 669−680 (överst) och 698−706 (botten) som visar b- och y-ions för förlust av CO2, en FPOP-modifiering. C)Den beräknade ln(PF) för Hsp90 oxidativt modifierade rester, R697, M698, E699 och E700. Beräknade SASA-värden för Hsp90 betecknas ovanför varje rest. (D)Tandem MS-spektra för R697, M698, E699 och E700 som visar en +16 FPOP-ändring. Denna siffra har ändrats från Espino et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det nuvarande riktmärket för studiet av in vivo protein-proteininteraktioner (PPI) är fluorescensresonans energiöverföring (FRET). I sin enklaste form, denna teknik studier PPI genom energiöverföring mellan två molekyler när de är i närheten av varandra15. Till skillnad från MS-tekniker har FRET inte upplösningen att karakterisera konformationsförändringar och interaktionsplatser på aminosyranivå. MS-baserade tekniker har i allt högre grad använts för studier av PPI16. IV-FPOP är en HRPF-metod som möjliggör in vivo-proteinstrukturanalys i C. elegans. För att framgångsrikt märka C. elegans av IV-FPOP är det viktigt att korrekt montera mikrofluidiska flödessystemet för att minska provförlusten. Kapillären på 250 μm i.d. har visat sig maximera provåtervinningen jämfört med mindre i.d. kapillärer4. Större id kapillärer har inte testats, men mikrofluidiska flödessystemet är utformat med hjälp av en kapillär med samma id som ett kommersiellt tillgängligt flödescytometrisystem för sortering av C. elegans. 17 Maskprovets storlek är också viktig, en provstorlek på mindre än ~10 000 per prov före FPOP ger inte proteinkoncentrationer tillräckligt höga för LC-MS/MS-analys. Högre samplingsstorlekar (>10 000 maskar) kan också användas genom att justera den ursprungliga startvolymen (steg 4.5).
Korrekt montering av mikrofluidiska flödessystemet är viktigt. Läckor i provvägen resulterar i ett inkonsekvent flöde av maskarna eller H2O2. De tior, hylsor och 3-2 ventiler kan återanvändas från flera IV-FPOP experiment om de rengörs ordentligt efter varje experiment. Vi rekommenderar dock att man monterar ett nytt mikrofluidiskt flödessystem för varje biologisk replikat. Om mikrofluidikerna är ordentligt monterade blandas maskarna och H2O2 vid blandning-T med minimalt mottryck. Som kvalitetskontroll (QC) av mikrofluidiska flödessystemet rekommenderar vi att du testar blandningseffektiviteten med hjälp av färgade färgämnen. Det är viktigt att övervaka rörelsen hos de magnetiska omrörarna inuti masksprutan under IV-FPOP, felaktig provblandning vid masksprutan eller blandning-T kan resultera i mottryck som orsakar läckor. Dessutom leder dåliga blandningsförhållanden till stora provförluster, dålig laserexponering av maskar vid laserfönstret och igensättning.
C. elegans underhåll är viktigt för att minska bakgrund oxidation. Vi rekommenderar att man odlar maskarna vid låga temperaturer under låga stressförhållanden eftersom höga temperaturer kan påverka den totala bakgrundsoxidationen. Endast en kontrollprovsuppsättning maskar, nr H2O2 och ingen laserbestrålning rekommenderas för alla IV-FPOP-experiment för att ta hänsyn till bakgrundsoxidation på grund av laboratorieunderhåll. En av de nuvarande begränsningarna av denna teknik är det totala antalet oxidativt modifierade peptider identifieras och det totala antalet rester oxiderat per peptid för att få högre protein strukturell information. Även om det inte rekommenderas, en ökning av oxidativa modifieringar kan uppnås genom att använda högre koncentrationer av väteperoxid. En ökning av väteperoxid kan avsevärt förändra viktiga biologiska vägar samt leda till oxidation-inducerad utfällning. Om väteperoxidkoncentrationen för IV-FPOP ökas rekommenderas att maskens bärkraft och bakgrundsoxidation testas eftersom koncentrationer som är högre än 200 mM inte har testats.
Det LC-MS/MS-protokoll som beskrivs kan optimeras och modifieras för att uppfylla MS QC i andra laboratorier. Användningen av 2D-kromatografi tekniker har tidigare visat sig öka identifieringen av oxidativt modifierade peptider och proteiner18. Icke desto mindre, protein anrikning tekniker som riktar sig till ett visst protein av intresse rekommenderas inte, inklusive men inte begränsat till antikroppar nederbörd eller pull-down analyser. Dessa tekniker kan bias mot ett protein conformer om epitop /bindningsstället för proteinet har oxidativt modifierats av IV-FPOP. Ny utveckling när det gäller fotavtryck av radikala reagenser, såsom sulfatradikal anjon10 eller trifluormetylering19, skulle kunna öka mångsidigheten hos IV-FPOP. Även om den enda märkning reagens testas in vivo hittills är väteperoxid, andra laseraktiverade radikaler kan optimeras. Användningen av andra radikaler bör visa sig vara kompatibel med mask livskraft, cell genomsläpplig, och 248 nm laser våglängd. På grund av användningen av C. elegans som modellsystem för många sjukdomar hos människor har IV-FPOP potential att ha en stark inverkan på att studera proteinstrukturens roll i sjukdomspatogenes.
Disclosures
Denna publikation skrevs i partiell uppfyllelse av JAE Ph.D. avhandling. Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av start-up medel från University of Maryland, Baltimore och NIH 1R01 GM 127595 tilldelas LMJ. Författarna tackar Dr Daniel Deredge för hans hjälp med att redigera manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
| 60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
| EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
| Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
| Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
| Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
| Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. J Am Soc Mass Spectrom. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Jones, L. M., Sperry, J. A., Carroll, J., Gross, M. L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins for Epitope Mapping. Analytical Chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry for the Structural Analysis of Proteins in Live Cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Espino, J. A., Jones, L. M. Illuminating Biological Interactions with in Vivo Protein Footprinting. Analytical Chemistry. 91 (10), 6577-6584 (2019).
- Huang, W., Ravikumar, K. M., Chance, M. R., Yang, S. Quantitative mapping of protein structure by hydroxyl radical footprinting-mediated structural mass spectrometry: a protection factor analysis. Biophysical Journal. 108 (1), 107-115 (2015).
- Keller, C. I., Calkins, J., Hartman, P. S., Rupert, C. S. UV photobiology of the nematode Caenorhabditis elegans: action spectra, absence of photoreactivation and effects of caffeine. Photochemistry and Photobiology. 46 (4), 483-488 (1987).
- Konermann, L., Collings, B. A., Douglas, D. J. Cytochrome c Folding Kinetics Studied by Time-Resolved Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biochemistry. 36 (18), 5554-5559 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Gau, B. C., Chen, H., Zhang, Y., Gross, M. L. Sulfate radical anion as a new reagent for fast photochemical oxidation of proteins. Analytical Chemistry. 82 (18), 7821-7827 (2010).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
- Wagner, B. A., Witmer, J. R., van't Erve, T. J., Buettner, G. R. An Assay for the Rate of Removal of Extracellular Hydrogen Peroxide by Cells. Redox Biology. 1 (1), 210-217 (2013).
- Gazda, L., et al. The myosin chaperone UNC-45 is organized in tandem modules to support myofilament formation in C. elegans. Cell. 152 (1-2), 183-195 (2013).
- Willard, L., et al. VADAR: a web server for quantitative evaluation of protein structure quality. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3316-3319 (2003).
- Broussard, J. A., Green, K. J. Research Techniques Made Simple: Methodology and of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
- Kaur, U., et al. Evolution of Structural Biology through the Lens of Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (1), 142-155 (2019).
- Pulak, R. C. elegans: Methods and Applications. Strange, K. , Humana Press. 275-286 (2006).
- Rinas, A., Jones, L. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPIT): Expanding Footprinting Strategies to Complex Systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Cheng, M., Zhang, B., Cui, W., Gross, M. L. Laser-Initiated Radical Trifluoromethylation of Peptides and Proteins: Application to Mass-Spectrometry-Based Protein Footprinting. Angewandte Chemie International Edition. 56 (45), 14007-14010 (2017).
