Summary
Her karakteriserer vi proteinstruktur og interaktionssteder i levende celler ved hjælp af en proteinaftagende teknik, der kaldes i cellen hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (IC-FPOP).
Abstract
Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) er en hydroxylradikal proteinfodsporsmetode, der bruges til at karakterisere proteinstruktur og interaktioner. FPOP bruger en 248 nm excimer laser til at fotolysere hydrogenperoxid producerer hydroxyl radikaler. Disse radikaler oxidativt ændre opløsningsmiddel eksponeret sidekæder af 19 af de 20 aminosyrer. For nylig, denne metode er blevet anvendt i levende celler (IC-FPOP) til at studere protein interaktioner i deres oprindelige miljø. Studiet af proteiner i celler tegner sig for intermolekylær fortrængning og forskellige proteininteraktioner, der forstyrres for in vitro-studier. Et brugerdefineret enkeltcelleflowsystem er designet til at reducere celleaggregering og tilstopning under IC-FPOP. Dette flow system fokuserer cellerne forbi excimer laser individuelt, hvilket sikrer konsekvent bestråling. Ved at sammenligne omfanget af oxidation fremstillet af FPOP med proteinets opløsningsmiddeltilgængelighed beregnet ud fra en krystalstruktur kan IC-FPOP nøjagtigt sonde proteinernes opløsningsmiddeltilgængelige sidekæder.
Introduction
Hydroxyl radikalprotein fodaftryk (HRPF) er en metode, der sonderer opløsningsmiddel adgang til et protein gennem kovalente ændringer fremstillet af hydroxyl radikaler. Når proteinstruktur eller proteininteraktioner ændrer sig, vil det ændre opløsningsmiddeleksponeringen af aminosyrer og dermed ændre omfanget af ændringen af restkoncentrationer. Med HRPF er proteininteraktioner1,,2,,3 og proteinkonformationelle ændringer4,5,6 med succes blevet afhørt in vitro. Der er flere metoder, der genererer hydroxyl radikaler for HRPF eksperimenter, hvoraf den ene er hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP). FPOP blev udviklet af Hambly og Gross i 2005 og udnytter en 248 nm excimer laser til at producere hydroxyl radikaler gennem fotolyse af hydrogenperoxid (H2O2)7.
For nylig udvidede Espino et al. brugen af FPOP til at sonde proteinstruktur i levende celler, en metode kaldet in-cell FPOP (IC-FPOP)8. I modsætning til in vitro-undersøgelser, studere proteiner i celler tegner sig for molekylær fortrængning sammen med forskellige protein interaktioner, der potentielt kunne påvirke strukturen. Derudover, det præsenterer den fordel, at give et øjebliksbillede af den fulde proteom potentielt give strukturelle oplysninger om mange systemer på én gang til at udføre proteom bred strukturel biologi. Desuden er denne teknik ideel til proteiner, der er vanskelige at studere in vitro, ligesom membranproteiner.
Indledende undersøgelser af IC-FPOP held undersøgt 105 proteiner spænder i protein overflod og cellulære lokalisering. For at forbedre IC-FPOP-metoden udviklede Rinas et al. et mikroflowsystem til enkeltcelleflow9. Forbedringen af det oprindelige flowsystem begrænser celleaggregering og øger den tilgængelige H2O2 til bestråling. I det oprindelige flowsystem resulterede cellerne i sammenklumpning i silicaslangen i træsko og ujævn bestråling. Indarbejdelsen af to vandløb af en kappe buffer hydrodynamisk fokuserer cellerne, giver dem mulighed for at flyde individuelt forbi laseren. Inkorporeringen af en separat sprøjte til H2O2 muliggør en mere kontrolleret og optimeret eksponeringstid, der giver højere H2O2-koncentrationer uden bivirkninger. Desuden begrænser inkubationstiden opdelingen af H2O2 ved endogen to. Ved at indarbejde dette nye flowsystem steg det påviste antal proteiner med en FPOP-modifikation 13 gange, hvilket udvidede denne metodes kapacitet til at sonde et væld af proteiner i levende celler. I denne protokol beskrives et generelt IC-FPOP-eksperiment med fokus på samlingen af IC-FPOP-flowsystemet.
Protocol
1. Opsætning af IC-FPOP flowsystem
- For at begynde samling af flow-systemet, skæres smeltet silica ved hjælp af en spaltning sten til størrelse. IC-FPOP flowsystemet kræver fire 12 cm og en 17 cm sammensmeltet silica med en indvendig diameter (ID) på 450 μm og en ydre diameter (OD) på 670 μm, to 24 cm og en 40 cm med et ID på 75 μm og en OD på 360 μm , og til sidst to 57 cm med et ID på 150 μm og en OD på 360 μm.
BEMÆRK: Når silicaslangen skæres, skal du forsigtigt skrabe polyimidbelægningen væk og bøje den for at få det reneste snit. Kontroller, at det er et lige snit (dette er nødvendigt for at sikre, at der ikke dannes blokeringer eller lækager). - Opsæt 15 tilslutninger med nanotætte ærmer (0,0155" ID X 1/16" OD til 360 μm OD silicaslange og 0,027" ID X 1/16" OD til 670 μm OD silicaslangen) med super flangeless nut PEEK 1/4-28 fladbund til 1/16" OD og superangeless ferrule w/SST ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring Tefzel (ETFE), 1/4-28 fladbund, til 1/16" OD. Konstruere tilslutninger i henhold til producentens protokol (Figur 1).
- Anbring 6 små cylindriske magneter i en 500 μL sprøjte. Fyld sprøjten sammen med en anden 500 μL sprøjte og to 5 ml sprøjter med buffer og fjern luft. Anbring på sprøjtepumpen som vist i figur 2A.
BEMÆRK: 5 ml sprøjterne er større end de 500 μL sprøjter, så der er behov for en afstand til at stramme alle sprøjterne samtidigt(figur 2B). - Stram sprøjtepumpeproppen, så cellesprøjten har ca. 50 μL tilbage, når motoren går i stå. Dette vil give plads til de magnetiske omrørere. (Figur 2C-D).
FORSIGTIG: Hvis sprøjtepumpen lægger pres på magneterne, vil de blokere sprøjten og få sprøjten til at gå i stykker. - Ved hjælp af en Luer adapter, tilslut en manuel ventil til hver sprøjte. Silicaslangen samles som vist i figur 3.
BEMÆRK: Tråd linjen med cellerne + H2O2 hele vejen gennem korset til den anden side. Sæt den derefter i 450 μm ID silicaslangen. Kappebufferne i 5 ml sprøjten flyder hurtigere end cellerne og H2O2. Med kappebuffere på begge sider vil cellerne være hydrodynamisk fokuseret i en enkelt linje til bestråling. - Placer flowsystem ved siden af laser. Brænd silicabelægningen væk på 450 μm ID-slangen for at lave et vindue til laserbestråling.
- Placer en magnetisk omrører over cellesprøjten, der indeholder de seks magneter.
- Sprøjten sat til 492,4 μL/min for en endelig strømningshastighed på 1.083,3 μL/min. Flowbuffer gennem systemet tre gange for at skylle systemet og teste for eventuelle lækager.
- Fokuser excimerlaseren på silicaslangen ved hjælp af en konveks linse. Når bestrålingsvinduet er fokuseret, skal du teste det ved at placere et lille stykke papir bag silicaslangen og tænde for laseren. Mål området brændt fra bestrålingen. Beregn den nødvendige laserfrekvens ved hjælp af bestrålingsvinduet og strømningshastigheden for at opnå en eksklusionsfraktion på nul.
BEMÆRK: Den anbefalede laserenergi til et IC-FPOP-eksperiment er ≥120 mJ. For at få en eksklusionsfraktion på 0 med et bestrålingsvindue på 2,58 mm og en strømningshastighed på 1083,3 μL/min. skal frekvensen være 44. Nedenfor er de ligninger, der er nødvendige for at beregne laserfrekvensen, hvis bestrålingsvinduet, strømningshastigheden og udelukkelsesfraktionen er kendt.
hvor w er volumenet i nL, x er laserpletbredden i mm, y er silicaslange-id'et i μm, v er det samlede volumen i μL, b er udelukkelsesfraktionen, a er strømningshastigheden i μL/min.
2. Gør dæmpning og H2O2
- Lav dæmpning indeholdende 100 mM N-tert-Butyl-alpha-phenylnitrone (PBN) og 100 mM N,N'-dimethylthiourea (DMTU). Aliquot 11 ml dæmpning for hver prøve i et konisk 50 ml rør.
- Fortyndes H2O2 til 200 mM. Hver prøve kræver 500 μL H2O2.
BEMÆRK: Dæmpningen kan foretages dagen før og opbevares ved 4 °C natten over, beskyttet mod lys. H2O2 skal gøres frisk på forsøgsdagen.
3. Saml celler
- Vokse celler i en T175 kolbe til omkring 70-90% sammenflydende.
- Fjern mediet, og skyl med buffer.
BEMÆRK: Typiske buffere til brug er cellekulturkvalitet Dulbeccos fosfat-buffered saltvand (DPBS) eller Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS). - Fjern celler ved hjælp af enten trypsin-EDTA eller med en skraber.
- Når demonteret resuspendering i 10 ml buffer og tælle cellerne.
- Spin ned, fjerne buffer og trypsin-EDTA, og resuspendere for at gøre 2 x 106 celler / ml.
- Aliquot 500 μL af cellerne pr. prøve.
BEMÆRK: For hver betingelse skal der laves mindst 3 laserprøver og 3 ingen laserstyringer.
4. Udførelse af IC-FPOP
- Fyld de to 5 ml sprøjter med buffer, 500 μL sprøjten, der indeholder magneterne med cellerne, og den endelige 500 μL sprøjte med H2O2. Tænd for magnetomrøreren.
- Spike i 220 μL af dimethylsulfoxid (DMSO) til en prøve af dæmpning, bland forsigtigt, og sted bag flow system til at indsamle bestrålede prøver. Tilsætning af DMSO vil hæmme endogen methionin sulfoxid reduktase.
- Tænd for laseren, vent 7 s, og tænd derefter flowsystemet.
- Når prøven er færdig med at flyde, skal du slukke for laseren og forsigtigt blande dæmpningen med den indsamlede prøve. Placer dette til siden under trin 4.5 og 4.6.
- Fyld alle fire sprøjter med bufferen cellerne er suspenderet i og flyde det gennem flow systemet.
- Når systemet er færdigt med at skylle, gentages trin 4.1 og 4.2. Start strømmen uden bestråling. Dette er ingen laser kontrol til at tage højde for baggrundsoxidation i cellerne.
- Mens den næste prøve kører, skal den foregående prøve drejes ned ved 450-800 x g i 5 minutter, opløsningsmidlet fjernes, og resuspender i 100 μL af en cellelysisbuffer som radioimmunudfældningsassay (RIPA) buffer.
- Prøven overføres til et mikrocentrifugerør, og flashfryses i flydende nitrogen.
- Når alle prøver er færdige med at køre, skal flowsystemet skilles ad til rengøring. Kassér de brugte silicarør og rengør alle de andre tilslutninger ved at sonikere i 1 time i 50% vand: 50% methanol. Rengør sprøjterne i henhold til producentens anvisninger.
5. Digest
- Fordøje hele cellelysatet. Prøverne optøs med at tø prøver og opvarme ved 95 °C i 10 min.
- Efter opvarmning afkøles lysatet på is i 15 min.
- Tilføj 25 enheder af nuclease at fordøje DNA og RNA og inkubere på værelse tempereret i 15 min.
- Spinprøver med en table-top centrifuge ved 16.000 x g i 10 min ved 4 °C.
- Saml supernatanten og overfør den til et rent mikrocentrifugerør.
- Kontroller proteinkoncentrationen ved hjælp af et proteinanalysesæt.
- 20-100 μg prøve overføres til et rent mikrocentrifugerør, og der bringes op på 100 μL.
- Prøverne reduceres med 20 mM dithiothreiotol (DTT) ved 50 °C i 45 min.
- Prøverne afkøles ved stuetemperatur i 15 min.
- Universalkyle med 20 mM iodoacetamid (IAs) ved stuetemperatur i 20 minutter beskyttet mod lys.
- Tilsæt forkølet acetone på et protein med 1:4-forholdet: acetone. Prøverne blandes, og der anbringes -20 °C natten over.
- Næste morgen centrifugeres prøverne ved 16.000 x g i 10 min ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 50 μL 90% forkølet acetone. Prøverne blandes og spindes ved 16.000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Fjern acetone og lad prøverne tørre ved at lade mikrocentrifugens hætter stå åbne med en fnugfri aftørring, der dækker toppen. Når prøverne er tørret, suspenderes proteinpellet med 10 mM Tris buffer pH 8.
- Resuspender 20 μg trypsin i 40 μL af 10 mM Tris buffer pH 8. Der tilsættes 2 μg trypsin (masse: masseforholdet på 1 trypsin: 50 prøve). Inkuberprøver ved 37 °C natten over.
- Næste morgen kontrollerepeptid koncentration ved hjælp af et peptid assay. Når prøven er fjernet for peptidanalysen, skal trypsinfordøjelsen slukkes ved at tilsætte myresyre til prøverne (den endelige koncentration er 5% myresyre).
- Når den endelige peptidkoncentration er bestemt, overføres 10 μg af hver prøve til et rent mikrocentrifugerør. Dette sikrer, at den samme mængde af hver prøve analyseres. Prøven tørres ved hjælp af en vakuumcentrifuge. Efter tørret resuspendering med 20 μL massespektrometrikvalitet 0,1% myresyre. Prøverne overføres til autosamplerglas.
6. Flydende kromatografi-Tandem massespektrometri
- For at lokalisere FPOP-modifikationer analysere den fordøjede celle lysat ved hjælp af LC-MS / MS analyse.
- Brug mobile faser på 0,1% myresyre i vand (A) og 0,1% myresyre i acetonitril (B).
- 0,5 μg prøve anbringes på en 180 μm x 20 mm C18 (5 μm og 100 Å) fældefangstsøjle og vasker prøven med 99 % (A) og 1 % (B) i 15 min.
- Ved hjælp af en analysekolonne på 75 μm x 30 cm C18 (5 μm og 125 Å) føres analyseseparationsmetoden med en strømningshastighed på 0,300 μL/min. fra 3 % (B) i en min. derefter rampe til 10 % (B) fra 1-2 min. Næste rampe til 45% (B) fra 2-100 min derefter 100% (B) fra 100-110 min. Rengør kolonnen ved at holde ved 100% (B) fra 110-115 min. Istandsætte kolonnen ved ramping ned til 3% (B) fra 115-116 min og hold ved 3% (B) fra 116-130 min.
- Indstil MS-anskaffelsesmetoden til at have en opløsning på 60.000 med et m/z-scanningsområde på 375-1500. Indstil aGC-målet (Automatic Gain Control) til 5,0 x 105 med en maksimal injektionstid på 50 ms.
- Under MS-erhvervelsen skal du vælge forløberen med opladningstilstande 2-6 for isolation via dataafhængig erhvervelse (DDA) med et isolationsvindue på 1,2 m/z og en cyklustid på 4 s. Vælg peptiderne med en intensitetstærskel på 5,0 x 104 for HCD-aktivering med en normaliseret energi sat til 32%. Du kan ikke udelade peptiderne efter 1 MS/MS-anskaffelse for 60 s. Indstil MS/MS-opløsningen til 15.000 med et AGC-mål på 5,0 x 104 og en maksimal injektionstid på 35 ms.
7. Databehandling
- Søg i RAW-filerne på en tilgængelig proteinanalysesoftware mod en relevant proteindatabase og det relevante digest-enzym. Her skal du bruge den schweiziske-Prot Homo Sapiens database og trypsin.
- Indstil prækursormassen til at søge mellem 350 til 5.000 Da og en massetolerance på 10 ppm. Der kan højst være 1 savnet spaltning site med et peptid længde mellem 6 til 144 rester. Disse begrænsninger gør det lettere at søge i databasen.
- Indstil fragmentionernes maksimale massetolerance til 0,02 Da med carbamidomethylet (+57.021) som en statisk modifikation og alle FPOP-modifikationer fra 17 aminosyrer som en dynamisk modifikation(figur 4 er et eksempel på den proteinanalysearbejdsgang, der anvendes til at detektere FPOP-modifikationer).
BEMÆRK: FPOP ændringer på serin og threonin er ikke inkluderet i søgningen på grund af deres lavere reaktivitet med hydroxyl radikaler. - Søg med en lokkedue database med en falsk opdagelse sats på 1% og 5%.
- Når filerne er færdig med at søge beregne omfanget af FPOP modifikation. Åbn Proteome Discoverer 2.2, eksportsekvens, ændringssteder, proteintiltrædelse, spektrumfil, forløbertæthed og oplysninger om opbevaringstid. Beregn ændringens omfang ud fra ligning 4:
Det modificerede EIC-område er det kromatografiske område af et specifikt peptid med en hydroxylradikal modifikation. EIC-området er det samlede kromatografiske område af både modificerede og uændrede områder af det specifikke peptid. Oxidationsomfanget beregnes i prøverne med og uden bestråling. Den prøve, der udelader bestråling (kontrol), tegner sig for enhver baggrundsoxidation, der kunne have været til stede i cellerne før og efter eksponering en eksponering af H2O2. Kontrollerne trækkes fra bestrålingsprøverne for at hjælpe med at isolere FPOP-specifikke ændringer.
Representative Results
IC-FPOP er en fodsporsmetode til at afhøre proteininteraktioner i levende celler. I IC-FPOP-flowsystemet er Eksponeringstiden For H2O2 begrænset til ca. 3 s, hvilket berettiger til højere H2O2-koncentrationer uden skadelige konsekvenser for cellerne. Flowsystemet omfatter også to strømme af kappebuffer, som hydrodynamisk fokuserer cellerne på midten af slangen, der producerer en enkelt strøm af celler, der skal bestråles ensartet (figur 5)9. Fluorescensbilleddannelse af ortogonale YZ stablede billeder (Figur 5A) viser en klar adskillelse af kappebufferen (indeholdende en FITC fluorophore) fra celleopløsningen (indeholdende en TMRM fluorophore). For at understrege denne adskillelse viser figur 5B og figur 5C tredimensionale gennemsnitlige varmekort over enten kappebufferopløsningen eller celleopløsningen, hvilket illustrerer minimal blanding af de to opløsninger.
Brugen af enkeltcelleflowsystemet øger antallet af oxidativt modificerede proteiner med 13 gange (figur 6A)9. I denne metode er proteiner i mange af de cellulære rum mærket med membranproteiner, cytoplasmatiske proteiner, og proteiner i kernen er den mest udbredte8,9. For at sikre, at proteiner blev modificeret i intakte celler, blev der udført fluorescerende billeder af CellROX-behandlede celler efter H2O2-behandling og bestråling (figur 6B)8. Cellernes stabilitet i hele mærkningsprocessen bekræfter yderligere effekten af IC-FPOP til at sonde proteiner i deres oprindelige cellulære miljø. Ved at bruge tandem-masse spektrometri, kan disse ændringer lokaliseres til specifikke aminosyrer på et protein. Figur 7 repræsenterer en ændring, der finder sted under IC-FPOP sammen med dets ekstraherede ionkromatogram. Skiftet observeret i det ekstraherede ionkromatogram kan oversættes til ændringen i hydrofobicity forårsaget af det oxiderede methionin i det modificerede peptid.
For at teste, om FPOP modifikationerne omsondisk sondret inde i cellerne, blev in-celled actin sammenlignet med både en in vitro-fodaftryksundersøgelse og forskellige krystalstrukturer af actin (figur 8)8. In-celled actin er repræsenteret i figur 8A viser sammenlignelige oxidationsgrad er fra In vitro-undersøgelsen af Guan et al.10 (Figur 8B),konkluderende actin har lignende adgang til opløsningsmiddel for både in-cell og in vitro-studier. For yderligere at bekræfte IC-FPOP var sondering opløsningsmiddel tilgængelighed actin, omfanget af FPOP ændringer blev sammenlignet med opløsningsmiddel tilgængelighed af de mærkede rester beregnet ud fra to actin krystal strukturer (Figur 8C). Denne korrelation viser, at IC-FPOP sonderer opløsningsmidlet tilgængelighed af monomeriske protein godt.
Figur 1: Sådan konstrueres ferules korrekt. (A) Placer ferrules, silicaslanger og ærme sammen, før der strammes. BB) Stram alle komponenter sammen. (C) Slutproduktet vil frembringe en ferule, der er blevet strammet ned på ærmet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Opsætning af IC-FPOP flowsystem. (A) Billede af et fuldt samlet IC-FPOP flowsystem placeret ved siden af laseren. (B) Eksempel på en afstandsplads, der er nødvendig for at øge den ydre diameter af de 500 μL sprøjter for at kunne stramme alle sprøjter ned sammen. (C) Repræsentative billeder, der viser den plads, der kræves til magnetomrørerne. (D) Propper er nødvendige for at standse sprøjtepumpen uden at sprænge sprøjterne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Skemaaf det flowsystem, der er udviklet til IC-FPOP. Blå linjer repræsenterer silicarør med et 450 μm ID og 670 μm OD, røde linjer har et 150 μm ID og 360 μm OD, og orange linjer har et 75 μm ID og 360 μm OD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Proteinanalysesoftware, der bruges til at detektere FPOP-modifikationer. Der blev søgt i en typisk arbejdsproces med de tilsvarende ændringer i hver node. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Det encellede flowsystem fokuserer hydrodynamisk cellerne i en enkelt strøm. (A) Ortogonale YZ stak illustrerer 3D-fokusering af cellulære analysand (rød, TMRM fluorophore) omgivet af kappe buffer (grøn, FITC fluorophore). Tre-dimensionelle gennemsnitlige intensitet varme kort over kappe buffer (B) og cellulære analysand (C). Lavere intensiteter er blå og højest er røde (B-C). Dette tal er blevet ændret fra Rinas et al.9Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Udnyttelsen af IC-FPOP Flow System øger kraftigt FPOP-modificerede proteiner i indtagsceller. (A) Sammenligning af oxiderede proteiner identificeret med og uden flowsystemet. Flowsystemet identificerede 1391 FPOP-modificerede proteiner, mens kun 105 proteiner blev identificeret uden flowsystem med en overlapning af 58 modificerede proteiner. Dette tal er blevet ændret fra Rinas et al.9 (B) Fluorescensbilleddannelse af CellROX-behandlede celler, efter at IC-FPOP viser, at cellerne stadig er intakte efter oxidativ mærkning. Celler blev afbildet ved hjælp af en Olympus Fluoview FV1000 MPE multiphoton mikroskop på 665 nm. Det viste billede er et enkelt udsnit. Dette tal er blevet ændret fra Espino et al.8Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Eksempler på tandem MS/MS-spektre, der finder sted under IC-FPOP. Produkt-ion(MS/MS) spektre af et (A)umodificeret peptid og en(B)oxidation på rest M8 fundet på peptidet. Et repræsentativt EIC for det (C)umodificerede peptid og (D) modificeret peptid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: IC-FPOP er effektivt til at undersøge proteiners adgang til opløsningsmiddel. (A) Omfanget af modifikation for de 9 oxidativt modificerede peptider fra actin. Værdier vises som gennemsnit plus og minus standardafvigelse (n = 3). (B) Ændring af actin peptider oxideret in vitro ved synkrotron radiolyse fra Guan et al.10 (C) Korrelation af rester FPOP ændringer med SASA i den stramme (trekanter, stiplede trend linje) og åbne (cirkler, solid trend linje) tilstande af actin. Dette tal er blevet ændret fra Espino et al.8Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Der er udviklet adskillige massespektrometribaserede teknikker til at studere proteinstruktur og protein-ligandkomplekser på en proteomdækkende måde i hele celler eller cellelysater. Disse teknikker omfatter, men er ikke begrænset til, stabilitet af proteiner fra oxidationshastigheden (SPROX), termisk proteomprofilering (TPP), kemisk krydsbinding (XL-MS) og hydroxylradikal proteinfodaftryk (HRPF). Hver teknik har unikke begrænsninger og fordele i forhold til hinanden, som er blevet grundigt gennemgået12. Hver af disse metoder er blevet brugt til proteom bred strukturel biologi til at belyse proteinstruktur og i sidste ende fungere inden for det komplekse cellulære miljø. IC-FPOP er en HRPF teknik, der udnytter hydroxyl radikaler til oxidativt ændre opløsningsmiddel eksponerede sidekæder af aminosyrer, sondering protein struktur og protein-ligand interaktioner inden levedygtige celler13. IC-FPOP er en forbedring af den oprindelige HRPF i levende celler, der brugte Fenton kemi til at generere radikaler på minutter tidsskala14. I denne undersøgelse blev strukturelle ændringer i et integreret membranprotein som reaktion på at sænke bufferens pH- eller ioniske styrke med succes karakteriseret med god oxidationsdækning på tværs af proteinet. Sammenlignet med Fenton kemi, IC-FPOP er meget hurtigere, ændre proteiner på mikrosekund tidsskala, således at den indfødte protein kropsbygning, der skal undersøges.
En vigtig test for IC-FPOP er at bekræfte cellernes levedygtighed efter eksponering for H2O2. Ved hjælp af en 40 cm blandingslinje inkuberes cellerne i H2O2 for ca. 3 s før bestråling. Denne gang kan justeres ved at ændre længden af denne silica slange. Det er bemærkelsesværdigt, at selv om brugen af trypanblå til at teste cellernes levedygtighed viser, at cellernes integritet opretholdes efter H2O 2-inkubation, kan cellerne potentielt være under stress, der påvirker signalveje, der interagerer med H2O2.2 Heldigvis er den korte inkubationstid hurtigere end proteinsyntesen, der giver tillid til, at de tilstedeværende proteiner ikke fremkaldes af H2O2.
Det næste vigtige skridt er at bekræfte korrekt samling af flowsystemet. Når de er samlet, skal du sikre dig, at der ikke er utætheder til stede efter skylning af systemet med den ønskede buffer. Hvis der er utætheder til stede, skal du sørge for, at silicaslangen er skåret korrekt og flugter mod ferruleforatet for at lave en ordentlig forsegling, når den er strammet ned. Alle dele er håndstrammet, så ingen værktøj er nødvendige. Under hvert IC-FPOP-eksperiment skal du sørge for, at de magnetiske omrørere i cellesprøjten forbliver i bevægelse. Denne lille agitation begrænser antallet af celler, der sætter sig i bunden af sprøjten, men er ikke hård nok til at vride cellerne. Efter en løbetur er der ca. 50 μL celler tilbage i sprøjten. Sørg altid for at fortynde dette med et skylningstrin for at begrænse antallet af celler, der overføres til det næste eksperiment. Det anbefales at bruge en frisk cellesprøjte, hvis flere cellebehandlinger sammenlignes. Det er også vigtigt at vælge en passende buffer til de celler, der testes. Nogle buffere slukker hydroxylradikalen, hvilket fører til færre ændringer på proteiner. Xu et al. har vist, at nogle almindeligt anvendte buffere reducere hydroxyl radikal levetid11. DPBS og HBSS er almindelige buffere, der anvendes til IC-FPOP-eksperimenter.
Efter IC-FPOP skal du optimere fordøjelsesprotokollen baseret på de nødvendige parametre. Da FPOP producerer irreversible kovalente ændringer, er der rigelig tid til rådighed til en grundig fordøjelse og oprydning uden at miste mærkningsdækningen. Test og normaliser altid proteinkoncentrationen, så ensartede peptidkoncentrationer belastes for tandemmassespektrometri. Endelig skal du være opmærksom på, at et immunudfældning ikke kan udføres sammen med IC-FPOP. Hvis en FPOP-modifikation er rettet mod interaktionsregionen, sænkes antistoffets affinitet. For at bidrage til at øge identifikationen af FPOP ændringer, 2D-kromatografiske adskillelse trin har vist sig at mere end tredoble antallet af oxiderede peptider opdaget15.
En udfordring ved ethvert FPOP-eksperiment er det komplicerede niveau af dataanalyse på grund af de mulige oxidationsprodukter, der kan opstå. Dette gælder for både in-cell eller in vitro, men er drastisk øget med den ekstra kompleksitet analysere celle lysater. Med yderligere optimering af IC-FPOP flere proteiner med højere modifikation dækninger opstår, hvilket hurtigt gør analysen mere besværlig. Forskydningsmængden af data, der genereres fra et enkelt IC-FPOP-eksperiment, begrænser brugen af manuel validering, hvilket får forskere til at stole mere på software. På grund af dette udviklede Rinas et al. en kvantitationsstrategi for HRPF ved hjælp af Proteome Discoverer (PD)16. Denne metode bruger en arbejdsproces for en platform med flere søgninger i PD kombineret med en kvantitativ platform i et regneark. Yderligere forbedringer på IC-FPOP platformen er i gang for at øge antallet af identificerede peptider med FPOP-modifikationer sammen med øget reproducerbarhed og kvantificeringsnøjagtighed.
Disclosures
Lisa Jones er opfinder på flowsamling for celler patent (offentliggørelse nummer: 20180079998).
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSF CAREER Award (MCB1701692) for LMJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
| 500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
| Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
| UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
| V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
- Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
- Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein− ligand complexes: the calmodulin− peptide model system. Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).
- Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
- Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).
- Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
- Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent. Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Kaur, U., et al. Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
- Zhu, Y., et al. Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).
- Rinas, A., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
