Summary
여기서, 우리는 단백질의 빠른 광화학적 산화(IC-FPOP)라고 불리는 단백질 발자국 기술을 사용하여 살아있는 세포에서 단백질 구조 및 상호작용 부위를 특성화한다.
Abstract
단백질의 빠른 광화학적 산화(FPOP)는 단백질 구조 및 상호 작용을 특성화하는 데 사용되는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국 방법입니다. FPOP는 248 nm 엑시머 레이저를 사용하여 과산화수소를 광분해하여 하이드록실 라디칼을 생성합니다. 이러한 라디칼은 20개의 아미노산 중 19개에 대한 용매 노출 측사슬을 산화적으로 변형시. 최근, 이 방법은 그들의 모체 환경에서 단백질 상호 작용을 연구하기 위해 살아있는 세포 (IC-FPOP)에서 사용되었습니다. 세포에 있는 단백질의 연구 결과는 시험관 내 연구 결과를 위해 중단되는 분자 간 crowding 및 각종 단백질 상호 작용을 위한 계정. 사용자 정의 단일 세포 흐름 시스템은 IC-FPOP 동안 세포 응집 및 막힘을 줄이기 위해 설계되었습니다. 이 흐름 시스템은 엑시머 레이저를 지나 셀에 개별적으로 초점을 맞추므로 일관된 조사를 보장합니다. IC-FPOP은 FPOP에서 생성된 산화 정도를 결정 구조에서 계산된 단백질의 용매 접근성과 비교하여 단백질의 용매 접근 가능한 측체인을 정확하게 조사할 수 있습니다.
Introduction
하이드록실 라디칼 단백질 풋프린트(HRPF)는 하이드록실 라디칼로부터 생성된 공유 변형을 통해 단백질의 용매 접근성을 조사하는 방법이다. 단백질 구조 또는 단백질 상호 작용변경하면 아미노산의 용매 노출이 변경되어 잔기 의 변형 정도가 변경됩니다. HRPF를 사용하면, 단백질 상호작용1,,2,,3 및 단백질 형태 변화4,,5,,6이 시험관 내에서 성공적으로 심문되었다. HRPF 실험을 위한 하이드록실 라디칼을 생성하는 몇 가지 방법이 있는데, 하나는 단백질의 빠른 광화학적 산화(FPOP)이다. FPOP는 2005년 Hambly와 Gross에 의해 개발되었으며 248 nm 엑시머 레이저를 사용하여 과산화수소(H2O2)의광분해를 통해 하이드록실 라디칼을 생성합니다(H2O2)7.7
최근, 에스피노 등은 살아있는 세포에서 단백질 구조를 프로브하기 위해 FPOP의 사용을 확장, 세포 내 FPOP (IC-FPOP)라는 방법8. 시험관 내 연구와는 대조적으로, 세포에 있는 단백질을 공부하는 것은 잠재적으로 구조물에 영향을 미칠 수 있는 각종 단백질 상호 작용과 더불어 분자 crowding를 위해 계정합니다. 또한, 프로테오메 광구조적 생물학을 수행하기 위해 수많은 시스템의 구조 정보를 한 번에 제공하는 전체 프로테오메의 스냅샷을 제공하는 이점을 제시한다. 또한, 이 기술은 시험관내에서 공부하기 어려운 단백질, 막 단백질 같이 이상적입니다.
IC-FPOP의 초기 연구는 단백질 풍부와 세포 국소화에 이르는 105개의 단백질을 성공적으로 조사했습니다. IC-FPOP 방법을 개선하기 위해, Rinas 외는 단일 세포 흐름9을위한 마이크로 플로우 시스템을 개발했습니다. 원래 유동 시스템의 향상은 셀 응집을 제한하고 조사에 사용할 수 있는 사용 가능한H2O2를 증가시킵니다. 초기 유동 시스템에서 실리카 튜브에 응집된 세포는 막막류와 고르지 않은 조사를 초래했습니다. 칼집 버퍼의 두 스트림의 통합은 유체 역학적으로 세포를 집중, 그들이 개별적으로 레이저를 지나 흐를 수 있도록. H2O2에 대한 별도의 주사기를 통합하면 더 제어되고 최적화 가능한 노출 시간을 허용하여 부작용 없이 더 높은H2O2 농도를 허용합니다. 또한, 인큐베이션 시간을 제한하면 내인성 카랄라제에 의한H2O2의 분해가 제한됩니다. 이 새로운 유량 시스템을 통합함으로써, FPOP 변형을 가진 검출된 단백질의 수는 13배 증가하여 살아있는 세포에 있는 단백질의 다수를 탐구하는 이 방법의 기능을 확장합니다. 이 프로토콜에서 일반적인 IC-FPOP 실험은 IC-FPOP 유동 시스템의 조립에 초점을 맞추고 설명된다.
Protocol
1. IC-FPOP 유동 시스템 설정
- 유량 계통의 조립을 시작하려면 분열 석을 사용하여 융합 된 실리카를 크기로 잘라냅니다. IC-FPOP 유동 시스템은 4개의 12cm 및 17cm 의 융합 실리카를 450μm의 내경(ID)과 670μm의 외경(OD) 1개, 24cm 24cm 및 40cm 의 ID로 75μm, 360 μm의 OD를 필요로 합니다. , 마지막으로 150 μm의 ID와 360 μm의 OD와 두 57cm.
참고 : 실리카 튜브를 절단 할 때, 부드럽게 폴리 이미드 코팅을 긁어, 가장 깨끗한 컷을 얻기 위해 구부려. 직선 컷인지 확인하십시오 (막힘이나 누출 폼을 보장하기 위해 필요합니다). - 나노 타이트 슬리브(0.0155" ID X 1/16" OD 360μm OD 실리카 튜브및 0.027" ID X 1/16" OD 670 μm OD 실리카 튜브를 사용하여 15개의 연결을 설정) 슈퍼 플란젤 너트 PEEK 1/4-28 플랫-바텀 1/16" 및 수퍼 플랑스트 스트랑 Tefzel (ETFE), 1/4-28 플랫 바닥, 1/16" OD. 제조업체의 프로토콜에 따라 연결을구성합니다(그림 1).
- 작은 원통형 자석 6개를 500 μL 주사기 하나에 놓습니다. 이 주사기를 다른 500 μL 주사기와 2개의 5mL 주사기와 함께 채우고 공기를 제거합니다. 그림 2A에표시된 대로 주사기 펌프의 위치.
참고: 5mL 주사기는 500 μL 주사기보다 크므로 모든 주사기를 동시에 조이기 위해 스페이서가필요합니다(그림 2B). - 주사기 펌프 스토퍼를 조이면 모터가 정지할 때 셀 주사기가 약 50 μL 남았습니다. 이렇게 하면 마그네틱 스터러를 위한 공간이 남습니다. (그림2C-D).
주의: 주사기 펌프가 자석에 압력을 가하면 주사기가 막히고 주사기가 파손될 수 있습니다. - Luer 어댑터를 사용하여 수동 밸브를 각 주사기에 연결합니다. 그림 3과같이 실리카 튜브를 조립합니다.
참고 : 셀 + H2O2로 선을 다른 쪽으로 십자가를 통과합니다. 그런 다음 450 μm ID 실리카 튜브에 삽입합니다. 5 mL 주사기의 칼집 버퍼는 세포 및H2O2보다더 빠른 속도로 흐를 것이다. 양쪽에 칼집 버퍼를 사용하면 세포가 방사선 조사를 위해 한 줄로 유체 역학적으로 집중됩니다. - 레이저 옆에 위치 흐름 시스템. 라이터를 사용하여 450 μm ID 튜브의 실리카 코팅을 태워 레이저 조사를 위한 창을 만듭니다.
- 6개의 자석을 포함하는 셀 주사기 위에 자기 교반기 위에 놓습니다.
- 주사기 펌프를 492.4 μL/min으로 설정하여 1,083.3 μL/min. 시스템을 통해 유량 버퍼를 세 번 세척하고 누출을 테스트합니다.
- 볼록 렌즈를 사용하여 엑시머 레이저를 실리카 튜브에 초점을 맞춥니다. 일단 집중, 실리카 튜브 뒤에 종이의 작은 조각을 배치 하 여 조사 창을 테스트 하 고 레이저를 켭니다. 방사선 조사에서 연소된 영역을 측정합니다. 조사 창 과 유량을 사용하여 필요한 레이저 주파수를 계산하여 0의 배제 분율을 얻습니다.
참고: IC-FPOP 실험에 권장되는 레이저 에너지는 ≥120 mJ입니다. 조사 창이 2.58mm이고 유량이 1083.3μL/min인 제외 분율을 얻으려면 주파수가 44이어야 합니다. 다음은 조사 창, 유량 및 배제 분율이 알려진 경우 레이저 주파수를 계산하는 데 필요한 방정식입니다.
여기서 w는 nL의 부피이고, x는 mm의 레이저 스폿 폭이고, y는 μm의 실리카 튜브 ID이고, v는 μL의 총 부피이고, b는 배제 분율이고, a는 μL/min의 유량이고, f는 Hz의 주파수이다.
2. 담금질 과 H2O2 확인
- 100 mM N-tert-부틸- 알파-페닐니트론 (PBN) 및 100 mM N, N'-디메틸티우레아 (DMTU)를 포함하는 담금질을 확인하십시오. Aliquot 11 mL의 담금질 각 샘플은 50 mL 원추형 튜브로.
- 희석 H2O2 ~ 200 mM. 각 샘플은 H2 O2의500 μL을 요구합니다.2
참고 : 담금질은 전날 만들 수 있으며 빛으로부터 보호된 밤새 4 °C에서 보관할 수 있습니다. H2O2는 실험당일에 신선하게 만들어야 한다.
3. 세포 수집
- T175 플라스크에서 세포를 약 70-90% 컨플루엔성으로 성장시다.
- 미디어를 제거하고 버퍼로 헹입니다.
참고: 사용할 일반적인 버퍼는 세포 배양 등급 덜베코의 인산 완충 식염수(DPBS) 또는 행크의 균형 잡힌 염분 용액(HBSS)입니다. - 트립신-EDTA 또는 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리합니다.
- 일단 버퍼의 10 mL에서 다시 중단하고 세포를 계산합니다.
- 스핀다운, 버퍼 및 트립신-EDTA를 제거하고 다시 일시 중단하여 2 x 106 셀/mL을 만듭니다.
- 시료당 세포의 500 μL.
참고: 각 조건에 대해 최소 3개의 레이저 샘플을 만들고 3개의 레이저 컨트롤을 제어하지 않습니다.
4. IC-FPOP 수행
- 2개의 5 mL 주사기를 버퍼로 채우고, 500 μL 주사기는 세포와 함께 자석을 함유하고, 최종 500 μL 주사기를H2O2로채웁니다. 마그네틱 교반기의 켜기
- 220 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 담금질의 한 aliquot에 스파이크하고, 부드럽게 혼합하고, 조사된 샘플을 수집하기 위해 유량 시스템 뒤에 놓습니다. DMSO의 첨가는 내인성 메티오닌 설폭사이드 환원효소를 억제한다.
- 레이저를 켜고 7s를 기다린 다음 흐름 시스템을 켭니다.
- 샘플이 흐르는 것을 마치면 레이저를 끄고 채취한 샘플과 담금질을 부드럽게 섞습니다. 4.5 단계 와 4.6 단계에서 이 것을 옆으로 놓습니다.
- 세포가 매달려 있는 버퍼로 네 개의 주사기를 모두 채우고 흐름 시스템을 통해 흐르게 합니다.
- 시스템이 플러싱을 마친 후 4.1 단계와 4.2단계를 반복합니다. 조사 없이 흐름을 시작합니다. 이것은 세포에 있는 배경 산화를 설명하기 위하여 아무 레이저 통제입니다.
- 다음 샘플이 실행되는 동안, 5 분 동안 450-800 x g에서 이전 샘플을 스핀 다운, 용매를 제거하고, 방사성 면역 침전 분석 (RIPA) 버퍼와 같은 세포 용해 버퍼의 100 μL에서 다시 중단.
- 샘플을 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 액체 질소에서 플래시 동결합니다.
- 모든 시료 가동이 완료되면 세척을 위해 유량 계통을 분해합니다. 사용 된 실리카 튜브를 버리고 50 % 물에서 1 시간 동안 초음파 처리하여 다른 모든 연결을 청소하십시오 : 50 % 메탄올. 제조업체의 지침에 따라 주사기를 청소하십시오.
5. 다이제스트
- 전체 세포 가해를 소화합니다. 샘플을 해동하고 95 °C에서 10 분 동안 가열하여 시작합니다.
- 가열 후, 15 분 동안 얼음에 용해식을 식힙니다.
- DNA와 RNA를 소화하기 위해 25 단위의 뉴클레아아제와 방 온대에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 4 °C에서 10 분 동안 16,000 x g에서 테이블 톱 원심 분리기를 사용하여 샘플을 스핀합니다.
- 상급체를 수집하고 깨끗한 미세 원심 분리튜브로 옮김.
- 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 확인합니다.
- 20-100 μg의 샘플을 깨끗한 미세 원심 분리튜브로 옮기고 100 μL로 가져옵니다.
- 50°C에서 20 mM dithiothreiotol(DTT)으로 시료를 45분 동안 줄입니다.
- 샘플을 실온에서 15분간 식힙니다.
- 실온에서 20 mM 요오도아세타미드 (IAA)를 20 분 동안 빛으로부터 보호합니다.
- 1:4 비율 단백질인 아세톤에 미리 차가운 아세톤을 추가합니다. 샘플을 섞고 -20°C에서 하룻밤 사이에 놓습니다.
- 다음날 아침, 4°C에서 10분 동안 16,000 x g에서 샘플을 스핀합니다.
- 상급체를 제거하고 90% 미리 냉각된 아세톤의 50 μL을 추가합니다. 샘플을 혼합하고 4 °C에서 5 분 동안 16,000 x g에서 스핀 다운하십시오.
- 아세톤을 제거하고 미세 원심 분리기의 뚜껑을 열어 놓고 상단을 덮는 보풀이없는 물티슈로 샘플을 건조시십시오. 시료가 건조된 후, 10 mMTris 완충액 pH 8로 단백질 펠릿을 다시 중단합니다.
- 10 mM Tris 버퍼 pH 8의 40 μL에서 트립신 20 μg를 다시 중단하십시오. 트립신 2 μg를 추가합니다 (질량 : 1 트립신의 질량 비율 : 50 샘플). 밤새 37°C에서 샘플을 배양합니다.
- 다음날 아침 펩티드 분석을 사용하여 펩티드 농도를 확인한다. 펩타이드 분석에 대한 샘플을 제거한 후, 샘플에 포산산을 첨가하여 트립신 소화를 담금질합니다(최종 농도는 5% 포르믹산).
- 최종 펩타이드 농도가 결정되면, 각 시료의 10 μg를 깨끗한 미세원원지 튜브로 옮긴다. 이렇게 하면 각 샘플의 동일한 양을 분석할 수 있습니다. 진공 원심분리기를 사용하여 샘플을 건조시. 일단 건조되면 질량 분석 등급 0.1% 포매산의 20 μL로 다시 중단한다. 샘플을 자동 샘플러 바이알로 전송합니다.
6. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법
- FPOP 수정을 현지화하려면 LC-MS/MS 분석을 사용하여 소화된 세포 용해를 분석합니다.
- 아세토니트릴(B)에서 물(A)에서 0.1% 포르믹산과 0.1%의 포르믹산의 이월상을 사용하십시오.
- 180 μm x 20 mm C18(5 μm 및 100 Å) 트래핑 컬럼에 0.5 μg의 샘플을 적재하고 샘플을 99%(A) 및 1% (B)로 15분 동안 세척합니다.
- 75 μm x 30cm C18(5 μm 및 125Å) 분석 컬럼을 사용하여 3%(B)에서 시작하여 0.300 μL/min의 유량으로 분석 분리 방법을 실행한 다음 1-2분에서 10%(B)로 램프합니다. 다음 경사로는 2-100분에서 2-100분에서 100%(B)로 100%(B)로 110-115분에서 100%(B)로 열을 청소합니다.
- M/z 스캔 범위가 375-1500인 MS 수집 방법을 60,000의 해상도로 설정합니다. 자동 게인 제어(AGC) 타겟을 5.0 x 105로 설정하고 최대 주입 시간은 50ms입니다.
- MS 획득 중에 1.2m/z의 절연 창과 4s의 사이클 시간을 가진 데이터 종속 수집(DDA)을 통한 격리를 위해 전하 상태 2-6의 전구체 이온을 선택합니다. 정규화된 에너지가 32%로 설정된 HCD 활성화를 위해 5.0 x10의 강도 임계값을 가진 펩타이드를 선택합니다. 60s에 대한 1 MS/MS 획득 후 펩티드를 제외. AGC 타겟이 5.0 x 104이고 최대 주입 시간은 35ms인 MS/MS 분해능을 15,000으로 설정합니다.
7. 데이터 처리
- 관련 단백질 데이터베이스 및 관련 다이제스트 효소에 대해 사용 가능한 단백질 분석 소프트웨어에서 RAW 파일을 검색합니다. 여기, 스위스-프로트 호모 사피엔스 데이터베이스와 트립신을 사용합니다.
- 전구체 질량을 설정하여 350~5,000Da와 10 ppm의 질량 허용 오차 사이를 검색합니다. 6 에서 144 잔기 사이의 펩티드 길이를 가진 절단 부위를 놓친 최대 1 이있을 수 있습니다. 이러한 제한은 데이터베이스 검색을 용이하게 합니다.
- 카르바미도메틸(+57.021)을 사용하여 단편 이온 최대 질량 내성을 0.02 Da로 설정하고 동적 변형으로 17개의 아미노산으로부터의 모든 FPOP변형(도 4)을 FPOP 변형을 검출하는 데 사용되는 단백질 분석 워크플로우의 예이다).
참고: 세린과 스레오닌에 대한 FPOP 수정은 하이드록실 라디칼과의 낮은 반응성으로 인해 검색에 포함되지 않습니다. - 1%와 5%의 잘못된 검색 률로 미끼 데이터베이스로 검색합니다.
- 파일 검색이 완료되면 FPOP 수정 의 정도를 계산합니다. 오픈 프로테오메 디스커버러 2.2, 수출 서열, 수정 위치, 단백질 수탁, 스펙트럼 파일, 전구체 풍부, 보존 시간 정보. 수학식 4에서 수정 정도를 계산합니다.
변형된 EIC 영역은 하이드록실 라디칼 변형을 가진 특정 펩티드의 크로마토그래피 영역이다. EIC 영역은 특정 펩티드의 변형 및 변형되지 않은 영역 모두의 총 크로마토그래피 영역입니다. 산화의 정도는 조사 유무에 관계없이 샘플에서 계산됩니다. 시료생략 조사(control)는H2 O2노출 전후에 세포에 존재할 수 있는2 임의의 배경 산화를 차지한다. FPOP 특정 수정사항을 격리하는 데 도움이 되도록 조사 샘플에서 컨트롤이 차감됩니다.
Representative Results
IC-FPOP은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 심문하는 발자국 방법입니다. IC-FPOP 유동 시스템에서,H2O2 노출 시간은 약 3s로 제한되며, 세포에 해로운 결과 없이 더 높은H2O2 농도를 보증한다. 유동 시스템은 또한 두 개의 시스 버퍼 스트림을 통합하여, 이는 유체역학적으로 균일하게 조사될 세포의 단일 흐름을 생성하는 튜브의 중심에 세포를 집중시한다(도 5)9. 직교 YZ 적층 이미지의 형광 이미징(그림 5A)세포 용액 (TMRM 형광 포를 함유)에서 시스 버퍼 (FITC 형광 포를 함유)의 명확한 분리를 보여줍니다. 이러한 분리를 강조하기 위해 그림 5B 및 그림 5C는 시스 버퍼 용액 또는 셀 용액의 3차원 평균 열 맵을 보여 주며 두 솔루션의 최소 혼합을 보여 준다.
단일 세포 유동 시스템의 사용은 산화변형 단백질의 수를 13배 증가시킨다(도6A)Figure 69. 이 방법에서는, 많은 세포 구획에 있는 단백질은 막 단백질, 세포질 단백질 및 핵 내의 단백질이 가장 널리 퍼진8,,9로표지된다. 단백질이 온전한 세포 내에서 변형되도록 하기 위해, 셀로락스 처리 세포의 형광 이미지는H2O2 치료 및 조사(도6B)8에따라 수행되었다. 라벨링 과정 전반에 걸쳐 세포의 안정성은 그들의 모국세포 환경에서 단백질을 프로브하는 IC-FPOP의 효능을 더욱 확인한다. 탠덤 질량 분광법을 사용하여, 이러한 수정은 단백질에 특정 아미노산에 국한 될 수있다. 도 7은 추출된 이온 크로마토그램과 함께 IC-FPOP 동안 일어나는 변형을 나타낸다. 추출된 이온 크로마토그램에서 관찰된 변화는 변형된 펩티드에서 산화된 메티오닌에 의한 소수성의 변화로 변환된다.
FPOP 변형 프로브 용매가 세포 내부의 용매 접근성을 시험하기 위해, 세포 내 표지된 액틴은 체외 발자국 연구 및 액틴의 다양한 결정 구조 모두에 비교하였다(도8)8. 도 8에A 나타난 세포 내 표지된 액틴은 Guan et al.10에 의한 시험관 내 연구에서 의한 유사한 산화 정도를나타낸다(도 8B),결론 액틴은 세포 내 및 시험관내 연구 모두에 대해 유사한 용매 접근성을 가지고 있다. IC-FPOP이 액틴의 용매 접근성을 조사하고 있는지 를 추가로 확인하기 위해, FPOP 변형의 정도는 두 개의 액틴 결정 구조로부터 계산된 표지된 잔기의 용매 접근성과 비교하였다(도8C). 이러한 상관관계는 IC-FPOP이 단일성 단백질의 용매 접근성을 잘 프로브한다는 것을 보여준다.
그림 1: 페드룰을 올바르게 구성하는 방법. (A)조이기 전에 페룰, 실리카 튜브, 슬리브를 함께 놓습니다. (B)모든 구성 요소를 함께 조입니다. (C)최종 제품은 소매에 조여진 태아를 생산합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: IC-FPOP 플로우 시스템 설정. (A)레이저 옆에 위치한 완전히 조립된 IC-FPOP 유동 시스템의 이미지. (B)모든 주사기를 성공적으로 조이기 위해 500 μL 주사기의 외경을 증가시키는 데 필요한 스페이서의 예. (C)자기 교반기에 필요한 공간을 보여주는 대표적인 사진. (D)스토퍼는 주사기를 깨지 않고 주사기 펌프를 실속시킬 필요가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: IC-FPOP용으로 개발된 유량 시스템의 회로도. 파란색 선은 450 μm ID와 670 μm OD를 가진 실리카 튜브를 나타내고, 빨간색 선은 150 μm ID및 360 μm OD를 가지며, 주황색 선은 75μm ID 및 360 μm OD를 가짐을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FPOP 수정을 검출하는 데 사용되는 단백질 분석 소프트웨어. 각 노드에서 검색된 해당 수정 사항이 있는 일반적인 워크플로입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 단일 세포 흐름 시스템은 유체역학적으로 세포를 단일 스트림으로 집중시다. (a)외피 완충제(green, FITC 형광포)로 둘러싸인 세포 성암(적색, TMRM 형광포)의 3D 포커싱을 예시하는 직교 YZ 스택. Three-dimensional average intensity heat map of the sheath buffer (B) and cellular analyte (C). 낮은 강도는 파란색이고 가장 높은 빨간색(B-C)입니다. 이 그림은 Rinas 등에서 수정되었습니다.9이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: IC-FPOP 유동 시스템의 활용은 섭취 세포에서 FPOP 변형 단백질을 크게 증가시킨다. (A)유동 계통의 유무에 관계없이 확인된 산화 단백질의 비교. 유동 시스템은 1391개의 FPOP 변형 단백질을 확인하였고, 105개의 단백질만이 58개의 변형된 단백질이 겹치는 유량 시스템으로 확인되었다. 이 수치는 IC-FPOP 후 세포가 산화 표지 후 여전히 온전하다는 것을 보여 준 후 CellROX 처리 된 세포의 Rinas et al.9 (B)형광 이미징으로부터 변형되었다. 세포는 665 nm에서 올림푸스 플루오뷰 FV1000 MPE 다광자 현미경을 사용하여 이미지화하였다. 표시된 이미지는 단일 슬라이스입니다. 이 그림은 Espino 등에서 수정되었습니다.8이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: IC-FPOP 동안 일어나는 탠덤 MS/MS 스펙트럼의 예. (A)변형되지 않은 펩티드의 생성물 이온(MS/MS) 스펙트럼, 및(B)그 펩티드상에서 발견되는 잔류물 M8에서 검출된 산화. 대표적인 EIC(C)변형되지 않은 펩티드 및(D)변형 펩티드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: IC-FPOP은 단백질의 용매 접근성을 조사하는 데 효과적이다. (a)액틴으로부터의 9개의 산화변형 펩티드에 대한 변형의 범위. 값은 평균 플러스 및 마이너스 표준 편차(n = 3)로 표시됩니다. (B)안틴의 정전기 내 산화된 액틴 펩타이드의 변형은 관외10(C) 잔류물 FPOP 변형과 SASA의 잔류물(삼각형, 파선 추세선) 및 개방(원, 단색 추세선) 상태에서 의 한-정해질(%)에 의해 전파중 산화된다.C 이 그림은 Espino 등에서 수정되었습니다.8이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
몇몇 질량 분광학 기지를 둔 기술은 전체 세포 또는 세포 용해에서 단백질-리간드 복합체를 단백질 전체 방식으로 연구하기 위하여 개발되었습니다. 이러한 기술은 산화 속도(SPROX), 열 프로테오메 프로파일링(TPP), 화학 적 가교(XL-MS) 및 하이드록실 라디칼 단백질 풋프린트(HRPF)로부터의 단백질의 안정성을 포함하되 이에 제한되지 는 않는다. 각 기술은 광범위하게12검토 된 서로에 비해 고유 한 한계와 장점을 가지고있다. 이 방법의 각각은 단백질 구조를 해명하고 궁극적으로 복잡한 세포 환경 내에서 기능하기 위하여 proteome 넓은 구조 생물학을 위해 이용되었습니다. IC-FPOP은 하이드록실 라디칼을 이용하여 아미노산의 용매 노출 측사슬을 산화적으로 변형시키는 HRPF 기술로서, 생존 세포 내의 단백질 구조 및 단백질-리간드 상호작용을프로빙(13) IC-FPOP은 펜톤 화학을 사용하여 분 시간척도 14에라디칼을 생성하는 살아있는 세포에서 초기 HRPF에 대한 개선이다. 본 연구에서, 완충제의 pH 또는 이온 강도를 낮추는 것에 반응하여 일체막 단백질의 구조적 변화는 단백질 전반에 걸쳐 양호한 산화 커버리지를 성공적으로 특징으로 하였다. 펜톤 화학에 비해 IC-FPOP은 훨씬 빠르며 마이크로초 타임스케일에서 단백질을 변형하여 기본 단백질 형태를 연구할 수 있습니다.
IC-FPOP에 대한 주요 시험은H2 O2에노출된 후2세포의 생존 가능성을 확인하는 것입니다. 40 cm 혼합 라인을 사용하여, 세포는 조사 전에 대략 3 s에 대한H2O2에서 배양된다. 이 시간은이 실리카 튜브의 길이를 변경하여 조정할 수 있습니다. 세포 생존가능성을 테스트하기 위해 trypan blue의 사용이H2 O2배양 후2 세포의 무결성이 지속되는 것을 보여 주지만, 세포는H2O2와상호 작용하는 스트레스 효과 신호 경로를 받을 수 있다는 점에 주목할 만하다. 다행히짧은 배양 시간은 단백질 합성보다 빠르며 현재 존재하는 단백질이H2O2에의해 유도되지 않는다는 자신감을 제공한다.2
다음 중요한 단계는 유량 시스템의 적절한 조립을 확인하는 것입니다. 조립된 후에는 원하는 버퍼로 시스템을 플러시한 후 누출이 없는지 확인하십시오. 누출이 있는 경우 실리카 튜브를 제대로 절단하고 페룰에 플러시하여 한 번 조이면 적절한 씰을 만들어야 합니다. 모든 부품은 손으로 조여 있으므로 공구가 필요하지 않습니다. 각 IC-FPOP 실험 중에 세포 주사기의 자기 교반기가 움직이지 않도록 하십시오. 이 작은 교반은 주사기의 바닥에 정착하지만 세포를 전단할 만큼 가혹하지 않은 세포의 수를 제한합니다. 한 번 실행 한 후, 주사기에 남아있는 세포의 약 50 μL이있다. 항상 다음 실험으로 이월되는 세포의 수를 제한하기 위해 헹구는 단계로 이것을 희석하십시오. 여러 세포 치료를 비교 하는 경우 신선한 세포 주사기를 사용 하는 것이 좋습니다. 또한 테스트 중인 셀에 적합한 버퍼를 선택하는 것도 중요합니다. 일부 버퍼는 단백질에 적은 수정으로 이어지는 하이드록실 라디칼을 담금질. Xu 등은 일반적으로 사용되는 일부 버퍼가 하이드록실 라디칼 수명을 감소시키는 것으로나타났습니다(11). DPBS 및 HBSS는 IC-FPOP 실험에 사용되는 일반적인 버퍼입니다.
IC-FPOP에 이어 필요한 파라미터에 따라 소화 프로토콜을 최적화합니다. FPOP는 돌이킬 수 없는 공유 수정을 생성하기 때문에 라벨링 커버리지를 잃지 않고 철저한 소화와 정리에 충분한 시간을 할애할 수 있습니다. 균일한 펩티드 농도가 탠덤 질량 분석법을 위해 적재되도록 항상 단백질 농도를 테스트하고 정상화하십시오. 마지막으로, 면역 침전은 IC-FPOP와 함께 수행 될 수 없다는 것을 염두에 두어야합니다. FPOP 변형이 상호작용의 영역을 표적으로 하는 경우 항체의 친화성은 저하될 것이다. FPOP 변형의 식별을 증가시키는 데 도움을 주기 위해, 2D-크로마토그래피 분리 단계는 검출된 산화 펩티드의 수가15개보다3배 이상 많은 것으로 나타났다.
모든 FPOP 실험의 과제는 발생할 수 있는 산화 산물로 인해 복잡한 수준의 데이터 분석입니다. 이것은 세포 내 또는 시험관내 둘 다에 대 한 사실 이지만 세포 용해 분석의 추가 복잡성으로 크게 증가. IC-FPOP의 추가 최적화와 함께 더 높은 수정 범위를 가진 더 많은 단백질이 발생하고, 따라서 신속하 게 분석 더 힘든 만들기. 단일 IC-FPOP 실험에서 생성된 데이터의 전단량은 수동 유효성 검사의 사용을 제한하여 연구원이 소프트웨어에 더 많이 의존하게 만듭니다. 이 때문에, 리나스 외. 프로테오메 디스커버러 (PD)16을사용하여 HRPF에 대한 정량화 전략을 개발했다. 이 메서드는 스프레드시트의 정량적 플랫폼과 결합된 PD의 다중 검색 노드 워크플로를 사용합니다. IC-FPOP 플랫폼에 대한 추가 개선은 증가 된 재현성 및 정량 정확도와 함께 FPOP 변형으로 식별 된 펩티드의 수를 증가시키기 위해 진행되고 있습니다.
Disclosures
Lisa Jones는 세포 특허에 대한 유동 어셈블리에 대한 발명자입니다 (발행 번호 : 20180079998).
Acknowledgments
이 작품은 LMJ에 대한 NSF 커리어 어워드 (MCB1701692)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | any brand is sufficient |
| 500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
| ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ACQUITY UPLC M-Class System | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
| Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | 04A-4299 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| EX350 excimer laser | GAM Laser | EX350 excimer laser | |
| FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Science | 1548L | |
| Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
| Legato 210 syringe pump | KD Scientific | 788212 | Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work |
| Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Science | P-618L | |
| Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
| NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-242X | |
| NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Science | F-246 | |
| N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis | Fisher Scientific | 88702 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 | Polymicro Technologies | 1068150024 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150025 | |
| Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
| Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
| Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
| Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Science | P-259X | |
| Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Science | P-255X | |
| Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
| Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer | Fisher Scientific | PI89900 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-182 | |
| Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK | Fisher Scientific | 05-700-178 | |
| UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses | THORLABS | LA4052 | |
| V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 | V&P Scientific, Inc. | VP724F | |
| VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Science | UH-436 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
- Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
- Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein− ligand complexes: the calmodulin− peptide model system. Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).
- Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
- Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).
- Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
- Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
- Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent. Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
- Kaur, U., et al. Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
- Zhu, Y., et al. Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).
- Rinas, A., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
- Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).
