Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisere cellulære proteiner med i cellfast fotokjemisk oksidasjon av proteiner

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60911
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Maryland Baltimore, 2AIT Bioscience

Summary

Her karakteriserer vi proteinstruktur og interaksjonssteder i levende celler ved hjelp av en proteinfotavtrykksteknikk kalt in-cell rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (IC-FPOP).

Abstract

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) er en hydroksylradikal proteinfotavtrykksmetode som brukes til å karakterisere proteinstruktur og interaksjoner. FPOP bruker en 248 nm excimer laser for å fotolyserhydrogenperoksid som produserer hydroksylradikaler. Disse radikaleroksidativt endre løsemiddel eksponert sidekjeder av 19 av de 20 aminosyrene. Nylig har denne metoden blitt brukt i levende celler (IC-FPOP) for å studere proteininteraksjoner i sitt eget miljø. Studien av proteiner i celler står for intermolekylær trengsel og ulike proteininteraksjoner som er forstyrret for in vitro studier. Et tilpasset enkeltcelleflytsystem ble utformet for å redusere celleaggregasjon og tilstopping under IC-FPOP. Dette strømningssystemet fokuserer cellene forbi den excimer laser individuelt, og dermed sikre konsekvent bestråling. Ved å sammenligne omfanget av oksidasjon produsert fra FPOP til proteinets løsningsmiddel tilgjengelighet beregnet fra en krystallstruktur, IC-FPOP kan nøyaktig undersøke løsemiddel tilgjengelige sidekjeder av proteiner.

Introduction

Hydrokylradikal proteinfotavtrykk (HRPF) er en metode som undersøker løsemiddeltilgjengeligheten til et protein gjennom kovalente modifikasjoner produsert av hydroksylradikaler. Når proteinstruktur eller proteininteraksjoner endres, vil det endre løsemiddeleksponeringen av aminosyrer, og dermed endre omfanget av modifikasjon av rester. Med HRPF har proteininteraksjoner1,,2,3 og proteinkonformasjonsendringer4,5,6 med hell blitt forhørt in vitro. Det finnes flere metoder som genererer hydroksylradikaler for HRPF-eksperimenter, en er rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP). FPOP ble utviklet av Hambly og Gross i 2005 og benytter en 248 nm excimer laser for å produsere hydroksylradikaler gjennom fotolysen av hydrogenperoksid (H2O2)7.

Nylig utvidet Espino et al. bruken av FPOP til å sonde proteinstruktur i levende celler, en metode kalt in-cell FPOP (IC-FPOP)8. I motsetning til in vitro studier, studere proteiner i celler står for molekylær trengsel sammen med ulike protein interaksjoner som potensielt kan påvirke strukturen. I tillegg presenterer det fordelen av å gi et øyeblikksbilde av hele proteomet som potensielt gir strukturell informasjon om mange systemer samtidig for å utføre proteome bred strukturell biologi. Videre er denne teknikken ideell for proteiner som er vanskelige å studere in vitro, som membranproteiner.

Innledende studier av IC-FPOP vellykket undersøkt 105 proteiner som spenner i protein overflod og cellulær lokalisering. For å forbedre IC-FPOP-metoden utviklet Rinas et al. et mikrostrømssystem for encellestrøm9. Forbedringen av det opprinnelige strømningssystemet begrenser celleaggregering og øker tilgjengelig E2O2 tilgjengelig for bestråling. I det første strømningssystemet resulterte celler som klumpet seg i silikaslangen, i tresko og ujevn bestråling. Inkorporeringen av to strømmer av en kappebuffer fokuserer hydrodynamisk cellene, slik at de kan strømme individuelt forbi laseren. Inkorporering av en separat sprøyte for H2O2 muliggjør mer kontrollert og optimal eksponeringstid som gir høyere H2O2 konsentrasjoner uten bivirkninger. Også begrense inkubasjonstiden begrenser nedbrytningen av H2O2 ved endogene catalase. Ved å innlemme dette nye strømningssystemet økte det oppdagede antallet proteiner med en FPOP-modifikasjon 13 ganger, og utvider dermed egenskapene til denne metoden for å undersøke en rekke proteiner i levende celler. I denne protokollen er et generelt IC-FPOP-eksperiment beskrevet med fokus på monteringen av IC-FPOP-strømningssystemet.

Protocol

1. Sett opp IC-FPOP-strømningssystem

  1. For å begynne monteringen av strømningssystemet, kutt den smeltede silikaen ved hjelp av en spaltingsstein til størrelse. IC-FPOP-strømningssystemet krever fire 12 cm og en 17 cm smeltet silika med en indre diameter (ID) på 450 μm og ytre diameter (OD) på 670 μm, to 24 cm og en 40 cm med en ID på 75 μm og en OD på 360 μm , og til slutt to 57 cm med en ID på 150 μm og en OD på 360 μm.
    MERK: Når du kutter silikaslangen, skrap forsiktig bort polyimidbelegget, og bøy for å få det reneste kuttet. Kontroller at det er et rett kutt (dette er nødvendig for å sikre at ingen blokkeringer eller lekkasjer dannes).
  2. Sett opp 15 tilkoblinger med nanotette ermer (0,0155" ID X 1/16" OD for 360 μm OD silikarør og 0,027" ID X 1/16" OD for 670 μm OD-silikaslangen) med superflangeless mutter PEEK 1/4-28 flat bunn for 1/16" OD og superflangeless ferrule w/SST ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring, ring Tefzel (ETFE), 1/4-28 flat bunn, for 1/16" OD. Konstrer tilkoblinger i henhold til produsentens protokoll (figur 1).
  3. Plasser 6 små sylindriske magneter i en 500 μL sprøyte. Fyll denne sprøyten sammen med en annen 500 μL sprøyte og to 5 ml sprøyter med buffer og fjern luft. Posisjon på sprøytepumpen som vist på figur 2A.
    MERK: 5 ml sprøyter er større enn 500 μL sprøyter, så en avstandsavstand er nødvendig for å stramme alle sprøytene samtidig på plass (Figur 2B).
  4. Trekk til sprøytepumpeproppen slik at cellesprøyten har omtrent 50 μL igjen når motoren stopper. Dette vil gi plass til de magnetiske rørerne. (Figur 2C-D).
    FORSIKTIG: Hvis sprøytepumpen legger press på magnetene, vil de sette sprøyten fast og føre til at sprøyten bryter.
  5. Bruk en Luer-adapter til å koble en manuell ventil til hver sprøyte. Monter silikaslangen som vist i figur 3.
    MERK: Tre linjen med cellene + H2O2 hele veien gjennom korset til den andre siden. Sett den deretter inn i 450 μm ID-silikaslangen. Hylsbufferne i 5 ml sprøyten vil flyte raskere enn cellene og H2O2. Med kappebufferne på begge sider, vil cellene være hydrodynamisk fokusert inn i en enkelt linje for bestråling.
  6. Posisjonsstrømningssystem ved siden av laser. Ved hjelp av en lighter, brenne bort silika belegg på 450 μm ID rør for å lage et vindu for laser bestråling.
  7. Plasser en magnetisk røreer over cellesprøyten som inneholder de seks magnetene.
  8. Sett sprøytepumpen til 492,4 μL/min for en endelig strømningshastighet på 1 083,3 μL/min. Strømbuffer gjennom systemet tre ganger for å skylle systemet og teste eventuelle lekkasjer.
  9. Fokuser excimer laseren på silikaslangen ved hjelp av et konveks objektiv. Når fokusert, teste bestråling vinduet ved å plassere et lite stykke papir bak silika slangen og slå laseren på. Mål regionen brent fra bestrålingen. Beregn den nødvendige laserfrekvensen ved hjelp av bestrålingsvinduet og strømningshastigheten for å oppnå en utelukkelsesfraksjon på null.
    MERK: Anbefalt laserenergi for et IC-FPOP-eksperiment er ≥120 mJ. For å få en utelukkelsesfraksjon på 0 med et bestrålingsvindu på 2,58 mm og en strømningshastighet på 1083,3 μL/min, må frekvensen være 44. Nedenfor er ligningene som trengs for å beregne laserfrekvensen hvis bestrålingsvinduet, strømningshastigheten og utelukkelsesfraksjonen er kjent.

    der w er volumet i nL, x er laserspotbredden i mm, y er silikaslangen ID i μm, v er det totale volumet i μL, b er utelukkelsesfraksjonen, a er strømningshastigheten i μL/min, og f er frekvensen i Hz.

2. Lag slukke og H2O2

  1. Lag slukke som inneholder 100 mM N-tert-Butyl-alpha-phenylnitrone (PBN) og 100 mM N,N'-dimethylthiourea (DMTU). Aliquot 11 ml slukke for hver prøve i et 50 ml konisk rør.
  2. Fortynn H2O2 til 200 mM. Hver prøve krever 500 μL H2O2.
    MERK: Slukkingen kan gjøres dagen før og lagres ved 4 °C over natten, beskyttet mot lys. H2O2 bør gjøres frisk dagen for eksperimentering.

3. Samle celler

  1. Vokse celler i en T175 kolbe til ca 70-90% samløpet.
  2. Fjern media og skyll med bufferen.
    MERK: Typiske buffere som skal brukes er cellekulturklasse Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) eller Hanks balanserte saltløsning (HBSS).
  3. Koble fra celler ved hjelp av enten trypsin-EDTA eller med en skrape.
  4. Når den er frittliggende resuspendere i 10 ml buffer og telle cellene.
  5. Snurr ned, fjern bufferen og trypsin-EDTA, og resuspend for å lage 2 x 106 celler/ml.
  6. Aliquot 500 μL av cellene per prøve.
    MERK: For hver betingelse må du lage minst 3 laserprøver og 3 ingen laserkontroller.

4. Utføre IC-FPOP

  1. Fyll de to 5 ml sprøytene med buffer, 500 μL-sprøyten som inneholder magnetene med cellene, og den endelige 500 μL-sprøyten med H2O2. Slå på den magnetiske røreren.
  2. Spike i 220 μL dimetylsulfoksid (DMSO) til en aliquot av slukke, bland forsiktig og plasser bak strømningssystemet for å samle bestrålte prøver. Tilsetning av DMSO vil hemme endogene metioninsulfoksidreduktase.
  3. Slå på laser, vent 7 s, og slå deretter på strømningssystemet.
  4. Når prøven er ferdig, slå av laseren og bland slukker forsiktig med den innsamlede prøven. Plasser dette til siden under trinn 4.5 og 4.6.
  5. Fyll alle fire sprøytene med bufferen cellene er suspendert i og flyt den gjennom strømningssystemet.
  6. Når systemet er ferdig med å skylle, gjentar du trinn 4.1 og 4.2. Start strømmen uten bestråling. Dette er ingen laserkontroll for å ta hensyn til bakgrunnsoksidasjon i cellene.
  7. Mens neste prøve kjører, setter du ned den forrige prøven på 450-800 x g i 5 min, fjerner løsningsmidlet og resuspenderer i 100 μL av en cellelysisbuffer som radioimmunoprecipitationanalyse (RIPA) buffer.
  8. Overfør prøven til et mikrocentrifugerør og blits fryse i flytende nitrogen.
  9. Når alle prøvene er ferdig med å kjøre, demonteres strømningssystemet for rengjøring. Kast den brukte silikaslangen og rengjør alle de andre tilkoblingene ved å sonikere i 1 t i 50% vann: 50% metanol. Rengjør sprøytene i henhold til produsentens instruksjoner.

5. Fordøye

  1. Fordøye hele cellelysate. Begynn med å tine prøvene og varme ved 95 °C i 10 min.
  2. Etter oppvarming, avkjøl lysatet på is i 15 min.
  3. Tilsett 25 enheter kjerner for å fordøye DNA og RNA og inkuber ei romtemperert i 15 min.
  4. Spinnprøver med en sentrifuge på 16 000 x g i 10 min ved 4 °C.
  5. Samle supernatant og overføre den til en ren mikrocentrifuge rør.
  6. Kontroller proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et proteinanalysesett.
  7. Overfør 20-100 μg prøve til et rent mikrosentrifugerør og bringe til 100 μL.
  8. Reduser prøvene med 20 mM dithiothreiotol (DTT) ved 50 °C i 45 min.
  9. Avkjøl prøvene ved romtemperatur i 15 min.
  10. Alkylate med 20 mM iodoacetamid (IAA) ved romtemperatur i 20 min beskyttet mot lys.
  11. Tilsett prekjølt aceton på et 1:4-forholdsprotein: aceton. Bland prøver og plasser i -20 °C over natten.
  12. Neste morgen, spinn prøver på 16.000 x g for 10 min ved 4 °C.
  13. Fjern supernatanten og tilsett 50 μL av 90 % forkjølt aceton. Bland prøver og snurr ned på 16 000 x gr i 5 min ved 4 °C.
  14. Fjern aceton og la prøvene tørke ved å la caps av mikrocentrifuge åpne med en lo fri klut som dekker toppen. Etter at prøvene har tørket, resuspenderer proteinpellet med 10 mM Tris buffer pH 8.
  15. Resuspend20 μg trypsin i 40 μL av 10 m M Tris buffer pH 8. Tilsett 2 μg trypsin (masse: masseforhold på 1 trypsin: 50 prøve). Inkuber prøvene ved 37 °C over natten.
  16. Neste morgen kontrollerer du peptidkonsentrasjonen ved hjelp av en peptidanalyse. Etter at prøven er fjernet for peptidanalysen, slukker trypsinfordøyelsen ved å legge til maursyre til prøvene (endelig konsentrasjon er 5% maursyre).
  17. Når endelig peptidkonsentrasjon er bestemt, overføre 10 μg av hver prøve til et rent mikrocentrifugerør. Dette sikrer at samme mengde av hver prøve analyseres. Tørk prøven ved hjelp av en vakuumsentrifuge. Når tørket resuspend med 20 μL massespektrometri klasse 0,1% maursyre. Overfør prøver til autosampler hetteglass.

6. Flytende kromatografi-Tandem massespektrometri

  1. For å lokalisere FPOP-modifikasjoner analysere den fordøyde cellelysaten ved hjelp av LC-MS/MS-analyse.
  2. Bruk mobile faser av 0,1 % maursyre i vann (A) og 0,1 % maursyre i acetonnitrile (B).
  3. Last 0,5 μg prøvepå en 180 μm x 20 mm C18 (5 μm og 100 Å) fangstkolonne og vaskeprøve med 99 % (A) og 1 % (B) i 15 min.
  4. Ved hjelp av en analytisk kolonne på 75 μm x 30 cm C18 (5 μm og 125 Å) kjører du den analytiske separasjonsmetoden med en strømningshastighet på 0,300 μL/min som starter på 3 % (B) i ett minutt og deretter rampe til 10 % (B) fra 1-2 min. Neste rampe til 45% (B) fra 2-100 min deretter 100% (B) fra 100-110 min. Rengjør kolonnen ved å holde på 100% (B) fra 110-115 min. Rekondisjoner kolonnen ved å ramping ned til 3% (B) fra 115-116 min og hold på 3% (B) fra 116-130 min.
  5. Angi ms-anskaffelsesmetoden for å ha en oppløsning på 60 000 med et m/z-skanneområde på 375-1500. Sett målet for automatisk forsterkningskontroll (AGC) til 5,0 x 105 med en maksimal injeksjonstid på 50 ms.
  6. Under MS-oppkjøpet velger du forløperionene med ladetilstander 2-6 for isolasjon via dataavhengig innhenting (DDA) med et isolasjonsvindu på 1,2 m/z og en syklustid på 4 s. Velg peptidene med en intensitetsterskel på 5,0 x 104 for HCD-aktivering med en normalisert energi satt til 32 %. Utelat peptidene etter 1 MS/MS-anskaffelse for 60 s. Sett MS/MS-oppløsningen til 15 000 med et AGC-mål på 5,0 x 104 og en maksimal injeksjonstid på 35 ms.

7. Databehandling

  1. Søk i RAW-filene på en tilgjengelig proteinanalyseprogramvare mot en relevant proteindatabase og det relevante fordøyeenzymet. Her bruker du den sveitsiske Prot Homo Sapiens-databasen og trypsin.
  2. Sett forløpermassen til å søke mellom 350 til 5000 Da og en massetoleranse på 10 ppm. Det kan være på det meste 1 savnet cleavage området med en peptid lengde mellom 6 til 144 rester. Disse begrensningene forenkler databasesøk.
  3. Sett fragmentionene maksimal massetoleranse til 0,02 Da med karboamidomeyleten (+57.021) som en statisk modifikasjon og alle FPOP-modifikasjoner fra 17 aminosyrer som en dynamisk endring (Figur 4 er et eksempel på proteinanalysearbeidsflyten som brukes til å oppdage FPOP-modifikasjoner).
    MERK: FPOP-modifikasjoner på serin og treonin er ikke inkludert i søket på grunn av deres lavere reaktivitet med hydroksylradikaler.
  4. Søk med en lokkedatabase med en falsk oppdagelsesfrekvens på 1% og 5%.
  5. Når filene er ferdige med å søke, beregner du omfanget av FPOP-endring. Åpne Proteome Discoverer 2.2, eksportsekvens, modifikasjonssteder, proteintiltredelse, spektrumfil, forløperoverflod og oppbevaringstidsinformasjon. Beregn omfanget av endring fra ligning 4:

    EIC-området som er modifisert er det kromatografiske området til et bestemt peptid med en hydroksylradikal modifikasjon. EIC-området er det totale kromatografiske området av både modifiserte og umodifiserte områder av det spesifikke peptidet. Omfanget av oksidasjon beregnes i prøvene med og uten bestråling. Prøven som utelater bestråling (kontroll) står for bakgrunnsoksidasjon som kunne ha vært tilstede i cellene før og etter H2O2 eksponering. Kontrollene trekkes fra bestrålingsprøvene for å isolere FPOP-spesifikke modifikasjoner.

Representative Results

IC-FPOP er en fotavtrykksmetode for å avhøre proteininteraksjoner i levende celler. I IC-FPOP-strømningssystemet er Eksponeringstiden H2O2 begrenset til omtrent 3 s, noe som garanterer høyere H2O2-konsentrasjoner uten skadelige konsekvenser for cellene. Strømningssystemet inneholder også to strømmer av kappebuffer, som hydrodynamisk fokuserer cellene til midten av slangen som produserer en enkelt strøm av celler som skal være jevnt bestrålt (Figur 5)9. Fluorescensavbildning av ortogonale YZ-stablede bilder (figur 5A) viser en klar separasjon av hylsebufferen (som inneholder en FITC fluoroforfor) fra celleoppløsningen (som inneholder en TMRM-fluorofan). For å understreke denne separasjonen viser figur 5B og figur 5C tredimensjonale gjennomsnittlige varmekart over enten hylsebufferløsningen eller celleløsningen, som illustrerer minimal blanding av de to løsningene.

Bruken av enkeltcellestrømningssystemet øker antall oksidativt modifiserte proteiner med 13 ganger (figur 6A)9. I denne metoden er proteiner i mange av cellerommene merket med membranproteiner, cytoplasmatiske proteiner og proteiner i kjernen som er den mest utbredte8,9. For å sikre at proteiner ble modifisert i intakte celler, ble fluorescerende bilder av CellROX-behandlede celler utført etter H2O2 behandling og bestråling (Figur 6B)8. Stabiliteten til cellene gjennom hele merkingsprosessen bekrefter ytterligere effekten av IC-FPOP for å undersøke proteiner i sitt opprinnelige cellulære miljø. Ved å bruke tandem-masse spektrometri, disse modifikasjonene kan lokaliseres til bestemte aminosyrer på et protein. Figur 7 representerer en endring som finner sted under IC-FPOP sammen med det ekstraherte ionkromatogram. Skiftet observert i det ekstraherte ionkromatogram oversettes til endringen i hydrofobiitet forårsaket av oksidert metionin i det modifiserte peptidet.

For å teste om FPOP modifikasjoner sonde løsemiddel tilgjengelighet inne i cellene, in-cell merket actin ble sammenlignet med både en in vitro fotavtrykk studie og ulike krystall strukturer av actin (Figur 8)8. In-cell merket actin er representert i figur 8A viser sammenlignbare mengder oksidasjon fra in vitro studien av Guan et al.10 (Figur 8B), avsluttende actin har lignende løsemiddel tilgjengelighet for både in-cell og in vitro studier. For ytterligere å bekrefte ic-FPOP var sondering løsemiddel tilgjengelighet av actin, omfanget av FPOP modifikasjoner ble sammenlignet med løsemiddel tilgjengelighet av merkede rester beregnet fra to actin krystall strukturer (Figur 8C). Denne korrelasjonen viser at IC-FPOP undersøker løsningsmidlet tilgjengeligheten av monomeriske protein godt.

Figure 1
Figur 1: Hvordan konstruere ferules på riktig måte. (A) Plasser ferrules, silikarør og hylse sammen før du strammer. (B) Stram alle komponentene sammen. (C) Sluttproduktet vil produsere en ferule som er strammet ned på ermet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Definere IC-FPOP-strømningssystem. (A) Bilde av et ferdigmontert IC-FPOP-strømningssystem plassert ved siden av laseren. (B) Eksempel på et avstandsstykke som trengs for å øke den ytre diameteren på 500 μL-sprøytene for å stramme alle sprøytene sammen. (C) Representative bilder som viser plassen som kreves for magnetiske omrørere. (D) Stoppere er nødvendig for å stoppe sprøytepumpen uten å bryte sprøytene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk av strømningssystemet utviklet for IC-FPOP. Blå linjer representerer silikarør med en 450 μm ID og 670 μm OD, røde linjer har en 150 μm ID og 360 μm OD, og oransje linjer har en 75 μm ID og 360 μm OD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Proteinanalyseprogramvare som brukes til å oppdage FPOP-modifikasjoner. En typisk arbeidsflyt med tilsvarende endringer som søkes i hver node. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Enkeltcellestrømningssystemet fokuserer hydrodynamisk cellene inn i en enkelt strøm. (A) Orthogonal YZ stabel som illustrerer 3D-fokusering av cellulær analyte (rød, TMRM fluorophore) omgitt av kappebufferen (grønn, FITC fluorophore). Tredimensjonal gjennomsnittlig intensitet varme kart over hylsbufferen (B) og cellulær analyte (C). Lavere intensiteter er blå og høyest er røde (B-C). Denne figuren er endret fra Rinas et al.9Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Utnyttelse av IC-FPOP Flow System øker fpopmodifiserte proteiner i inntaksceller drastisk. (A) Sammenligning av oksiderte proteiner identifisert med og uten strømningssystemet. Strømningssystemet identifiserte 1391 FPOP modifiserte proteiner, mens bare 105 proteiner ble identifisert uten strømningssystem med en overlapping på 58 modifiserte proteiner. Dette tallet er endret fra Rinas et al.9 (B) Fluorescensavbildning av CellROX-behandlede celler etter IC-FPOP viser at cellene fortsatt er intakte etter oksidativ merking. Celler ble avbildet ved hjelp av en Olympus Fluoview FV1000 MPE multiphoton mikroskop på 665 nm. Bildet som vises er et enkelt stykke. Denne figuren er endret fra Espino et al.8Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Eksempler på tandem MS/MS-spektra som finner sted under IC-FPOP. Produkt-ion (MS/MS) spektra av en (A) umodifisert peptid, og en (B) oksidasjon oppdaget på rester M8 funnet på det peptidet. En representativ EIC av (C) umodifisert peptid og (D) modifisert peptid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: IC-FPOP er effektiv i å undersøke løsningsmiddeltilgjengeligheten av proteiner. (A) Endringsomfang for de 9 oksidativt modifiserte peptidene fra actin. Verdier vises som gjennomsnitt pluss og minus standardavvik (n = 3). (B) Endring av actin peptider oksidert in vitro av synchrotron radiolyse fra Guan et al.10 (C) Korrelasjon av rester FPOP modifikasjoner med SASA i trange (trekanter, stiplet trendlinje) og åpne (sirkler, solid trend linje) tilstander av actin. Denne figuren er endret fra Espino et al.8Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Flere massespektromebaserte teknikker er utviklet for å studere proteinstruktur og protein-ligand komplekser på en proteome-wide måte i hele celler eller celle lysates. Disse teknikkene inkluderer, men er ikke begrenset til stabilitet av proteiner fra oksidasjonshastigheten (SPROX), termisk proteomprofilering (TPP), kjemisk krysskobling (XL-MS) og hydroksylradikal proteinfotavtrykk (HRPF). Hver teknikk har unike begrensninger og fordeler i forhold til hverandre, som har blitt grundig gjennomgått12. Hver av disse metodene har blitt brukt til proteome bred strukturell biologi for å belyse proteinstruktur og til slutt fungere innenfor det komplekse cellulære miljøet. IC-FPOP er en HRPF-teknikk som benytter hydroksylradikaler til å oksidativt modifisere løsemiddeleksponerte sidekjeder av aminosyrer, sondering av proteinstruktur og proteinligog interaksjoner i levedyktige celler13. IC-FPOP er en forbedring av første HRPF i levende celler som brukte Fenton kjemi for å generere radikaler på minutter tidsskala14. I denne studien ble strukturelle endringer i et integrert membranprotein som svar på å senke pH eller ionisk styrke av bufferen med hell preget med god oksidasjonsdekning på tvers av proteinet. Sammenlignet med Fentonkjemi er IC-FPOP mye raskere, og endrer proteiner på mikrosekundtidsskalaen, slik at den innfødte proteinkonformasjonen kan studeres.

En viktig test for IC-FPOP er å bekrefte levedyktigheten til cellene etter eksponering for H2O2. Ved hjelp av en 40 cm blandelinje inkuberes cellene i H2O2 for omtrent 3 s før bestråling. Denne gangen kan justeres ved å endre lengden på denne silikaslangen. Det er bemerkelsesverdig at selv om bruk av trypan blå for å teste celle levedyktighet viser integriteten til cellene opprettholdes etter H2O2 inkubasjon, cellene kan potensiale være under stress effekt signalering veier som samhandler med H2O2. Heldigvis er den korte inkubasjonstiden raskere enn proteinsyntese som gir tillit til at proteinene som er tilstede, ikke induseres av H2O2.

Det neste viktige trinnet er å bekrefte riktig montering av strømningssystemet. Når det er montert, må du sørge for at det ikke finnes noen lekkasjer etter at systemet er spylet med ønsket buffer. Hvis det er lekkasjer, må du kontrollere at silikaslangen ble kuttet riktig og er i flukt mot ferrule for å lage en skikkelig forsegling når den er strammet ned. Alle deler er håndstrammet, så det er ikke nødvendig med verktøy. Under hvert IC-FPOP-eksperiment må du kontrollere at de magnetiske rørerne i cellesprøyten forblir i bevegelse. Denne lille agitasjonen begrenser antall celler som bosetter seg nederst i sprøyten, men som ikke er harde nok til å skjære cellene. Etter ett løp er det omtrent 50 μL celler igjen i sprøyten. Sørg alltid for å fortynne dette med et snertrinn for å begrense antall celler som overføres til neste eksperiment. Det anbefales å bruke en fersk cellesprøyte hvis flere cellebehandlinger sammenlignes. Det er også viktig å velge en passende buffer for cellene som testes. Noen buffere slukker hydroksylradikaleren som fører til færre modifikasjoner på proteiner. Xu et al. har vist at noen vanlige buffere reduserer hydroksylradikal levetid11. DPBS og HBSS er vanlige buffere som brukes for IC-FPOP-eksperimenter.

Etter IC-FPOP optimaliserer du fordøyelsesprotokollen basert på parameterne som trengs. Siden FPOP produserer irreversible kovalente modifikasjoner, er det god tid tilgjengelig for en grundig fordøyelse og opprydding uten å miste merkingsdekningen. Test og normaliser proteinkonsentrasjonen slik at ensartede peptidkonsentrasjoner lastes for tandemmassespektrometri. Til slutt, vær oppmerksom på at en immunnedbør ikke kan utføres i forbindelse med IC-FPOP. Hvis en FPOP-modifikasjon retter seg mot interaksjonsområdet, senkes affiniteten til antistoffet. For å øke identifiseringen av FPOP modifikasjoner, 2D-kromatografiske separasjontrinn har vist seg å mer enn tredoble antall oksiderte peptider oppdaget15.

En utfordring med ethvert FPOP-eksperiment er det kompliserte nivået av dataanalyse på grunn av mulige oksidasjonsprodukter som kan oppstå. Dette gjelder for både in-cell eller in vitro, men er drastisk økt med den ekstra kompleksiteten ved å analysere cellelysates. Med ytterligere optimalisering av IC-FPOP oppstår flere proteiner med høyere modifikasjonsdekning, og dermed raskt gjør analysen mer krevende. Skjærmengden data generert fra et enkelt IC-FPOP-eksperiment begrenser bruken av manuell validering som får forskerne til å stole tyngre på programvare. På grunn av dette utviklet Rinas et al. en kvantitetsstrategi for HRPF ved hjelp av Proteome Discoverer (PD)16. Denne metoden bruker en arbeidsflyt for flersøksnode på PD kombinert med en kvantitativ plattform i et regneark. Ytterligere forbedringer på IC-FPOP-plattformen er i gang for å øke antall identifiserte peptider med FPOP-modifikasjoner sammen med økt reproduserbarhet og kvantitetsnøyaktighet.

Disclosures

Lisa Jones er oppfinner på flytenheten for celler patent (publiseringsnummer: 20180079998).

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NSF CAREER Award (MCB1701692) for LMJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock SGE Analytical Science 008760
50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22 any brand is sufficient
500 µL SGE Gastight Syringes: Fixed Luer-Lok Models Fisher Scientific SG-00723
Acetone, HPLC Grade Fisher Scientific A929-4 4 L quantity is not necessary
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100 Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg Waters 186007496
ACQUITY UPLC M-Class System Waters ACQUITY UPLC M-Class System
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-100 any brand is sufficient
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material Phenomenex 04A-4299
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Dithiothreiotol (DTT) AmericanBio AB00490-00005
DMSO, Anhydrous Invitrogen D12345
EX350 excimer laser GAM Laser EX350 excimer laser
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID IDEX Health & Science 1548L
Formic Acid, LC/MS Grade Fisher Scientific A117-50
HV3-2 VALVE Hamilton 86728
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Iodoacetamide (IAA) ACROS Organics 122270050
Legato 210 syringe pump KD Scientific 788212 Any syringe pump that can hold 4, 5 mL syringes, withdraw and expel liquid, and have a way to stale the motor should work
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene IDEX Health & Science P-618L
Methanol, LC/MS Grade Fisher Scientific A454SK-4 4 L quantity is not necessary
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
N,N'-Dimethylthiourea (DMTU) ACROS Organics 116891000
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x 1.6" IDEX Health & Science F-242X
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" IDEX Health & Science F-246
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) ACROS Organics 177350250
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
PE50-C pyroelectric energy meter Ophir Optronics 7Z02936
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Scientific 23275
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific A53225
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Pierce Universal Nuclease for Cell Lysis Fisher Scientific 88702
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32" Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 150 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP150350 Polymicro Technologies 1068150024
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450 µm, Outer Diameter 670 µm, TSP450670 Polymicro Technologies 1068150025
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75 µm, Outer Diameter 360 µm, TSP075375 Polymicro Technologies 1068150019
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P382-500
Proteome Discover 2.2 (bottom-up proteomics software) Thermo Scientific OPTON-30799
Rotary Magnetic Tumble Stirrer V&P Scientific, Inc. VP 710D3
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps V&P Scientific, Inc. VP 710D3-4
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel™ (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD IDEX Health & Science P-259X
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD IDEX Health & Science P-255X
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick V&P Scientific, Inc. VP 722F
Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer Fisher Scientific PI89900
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Upchurch Scientific Low-Pressure Crosses: PEEK Fisher Scientific 05-700-182
Upchurch Scientific Low-Pressure Tees: PEEK Fisher Scientific 05-700-178
UV Fused Silica Plano-Convex Spherical Lenses THORLABS LA4052
V&P Scientific IncSupplier Diversity Partner TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000 V&P Scientific, Inc. VP724F
VHP MicroTight Union for 360µm OD IDEX Health & Science UH-436
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4. Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).
  2. Li, Z., et al. High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).
  3. Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein− ligand complexes: the calmodulin− peptide model system. Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).
  4. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  5. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  6. Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  8. Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells. Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).
  9. Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).
  10. Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent. Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).
  11. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  12. Kaur, U., et al. Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).
  13. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  14. Zhu, Y., et al. Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting. Molecular & Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).
  15. Rinas, A., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).
  16. Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).

Tags

Biokjemi Utgave 157 Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) proteinfotavtrykk hydroksylradikaler proteome bred strukturell biologi proteomikk massespektrometri encellestrømningssystem
Karakterisere cellulære proteiner med i cellfast fotokjemisk oksidasjon av proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J.… More

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins. J. Vis. Exp. (157), e60911, doi:10.3791/60911 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter