Summary
Hierin zeigen wir eine effiziente Methode zur Reinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von Oligodendrozyten-konditionierten Medien, die für Kokulturexperimente verwendet werden können.
Abstract
Im zentralen Nervensystem sind Oligodendrozyten für ihre Rolle bei der Axonmyelination bekannt, die die Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung beschleunigt. Darüber hinaus deuten immer mehr Berichte darauf hin, dass Oligodendrozyten mit Neuronen jenseits der Myelinisierung interagieren, insbesondere durch die Sekretion von löslichen Faktoren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Reinigung von oligodendroglialen Linienzellen aus Gliazellkulturen ermöglicht, die auch Astrozyten und mikrogliaale Zellen enthalten. Die Methode beruht auf dem nächtlichen Schütteln bei 37 °C, das eine selektive Ablösung der darüber liegenden Oligodendroglialzellen und Mikrogliazellen ermöglicht, und der Eliminierung von Mikroglia durch Differentialhaftung. Wir beschreiben dann die Kultur der Oligodendrozyten und die Produktion von Oligodendrozyten-konditioniertem Medium (OCM). Wir bieten auch die Kinetik der OCM-Behandlung oder Oligodendrozyten Zusätzlich zu gereinigten Hippocampus-Neuronen in Co-Kultur-Experimente, Studium der Oligodendrozyten-Neuron-Wechselwirkungen.
Introduction
Oligodendrozyten (OLs) sind Gliazellen des Zentralnervensystems (ZNS), die Myelin um Axone herum umwickeln. OLs stammen von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), die sich innerhalb der ventrikulären Zonen des embryonalen ZNS vermehren und dann in vollausgereifte OLs (d.h. Myelin-bildende Zellen) migrieren und differenzieren1. OPCs sind während der frühen Entwicklung reichlich vorhanden, aber auch im erwachsenen Gehirn bestehen, wo sie die haupthäufigste proliferative Zellpopulation darstellen2. Ein einzelnes OL verschließt mehrere Axone in nicht erregbaren Abschnitten (d. h. Internodien), und der Rand jeder Myelinschleife wird an dem Axon befestigt, der die paranodale Domäne bildet, die für die isolierenden Eigenschaften von Myelin1,3entscheidend ist. Zwischen den Paranoden befinden sich kleine, unmyelinierte Lücken, die als Knoten von Ranvier bezeichnet werden. Diese Knoten sind reich an spannungsgebundenen Natriumkanälen (Nav), was die Regeneration und schnelle Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung4ermöglicht. Diese enge Wechselwirkung ermöglicht auch axonale Energieunterstützung durch neuronale Aufnahme von Laktat aus OLs5,6.
Die Reifung von oligodendroglialen Abstammungszellen und der Myelinisierungsprozess werden durch ihre Wechselwirkungen mit Neuronen streng reguliert7. Tatsächlich exprimieren OLs und OPCs, auch NG2-Zellen genannt, eine Reihe von Rezeptoren für Neurotransmitter und können Input von exzitatorischen und hemmenden Neuronen erhalten, so dass sie neuronale Aktivität spüren können, die ihre Proliferation und/oder Differenzierung in myelinierenden Zellen auslösen kann2. OPCs/OLs wiederum sezernieren Mikrovesikund und Proteine in den extrazellulären Raum, der allein oder synergistisch neuromodulative und neuroprotektive Funktionen8,9,10,11,12. Die molekularen Mechanismen, die die verschiedenen Arten von Wechselwirkungen zwischen oligodendroglialen Abstammungszellen und Neuronen steuern, müssen jedoch noch vollständig entschlüsselt werden.
Darüber hinaus sind oLs in mehreren zNS-pathologischen Erkrankungen in erster Linie betroffen und stören so ihre Interaktion mit Neuronen. Zum Beispiel, bei Multipler Sklerose (MS), neurologische Dysfunktion wird durch fokale Demyelination im ZNS verursacht, sekundär zu OLs Verlust, der zu axonalen Schäden und damit verbundenen Behinderung Akkumulation führen kann. Eine Remyelination kann stattfinden, wenn auch in den meisten Fällen nicht ausreichend13. Fortschritte in den letzten zehn Jahren aufgrund der Entwicklung von Immuntherapien haben die Rückfallrate reduziert, aber die Förderung der Remyelination bleibt bis heute ein unerfülltes Bedürfnis. Daher ist ein besseres Verständnis der Rolle, Funktionen und Einflüsse von OLs für die Entwicklung neuer Therapien für ein breites Spektrum von ZNS-Bedingungen von besonderem Interesse.
Hier beschreiben wir die Methoden der OLs Reinigung und Kultur. Dies ermöglicht eine genaue Untersuchung der intrinsischen Mechanismen, die ihre Entwicklung und Biologie regulieren. Darüber hinaus ermöglichen solche hoch angereicherten OLs-Kulturen die Produktion von oligodendrozyten-konditionierten Medien (OCM), die gereinigten Neuronenkulturen hinzugefügt werden können, um Einblicke in die Auswirkungen von OLs-sekretionierten Faktoren auf die neuronale Physiologie und Konnektivität zu gewinnen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie ein In-vitro-Kokultursystem implementiert wird, in dem gereinigte Oligodendrozyten und Neuronen miteinander kombiniert werden, so dass die Mechanismen, die die (Re-)Myelinisierung regulieren, angegangen werden können.
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Protocol
Die Pflege und Verwendung von Ratten in diesem Experiment entspricht den institutionellen Politiken und Leitlinien (UPMC, INSERM und Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaft). Das folgende Protokoll wird für einen Standard-Wurf von 12 Welpen eingerichtet.
1. Vorbereitung der Kolben (ca. 5 min)
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte am Tag vor der Zerlegung in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
- Beschichten Sie die 150 cm2 Kolben (T150) mit Filterkappe (1 Kolben für 2 Welpen) mit 5 ml Polyethylenimin (PEI, 100 mg/L, siehe Protokoll in Zusatzdatei 1).
- Lagern Sie die Kolben über Nacht bei 4 °C.
- Spülen Sie beschichtete Kolben 3 mal mit sterilem destilliertem Wasser am Tag der Zerlegung.
2. Vorbereitung der Medien (ca. 10 min)
HINWEIS: Führen Sie die Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
- Bereiten Sie 500 ml Kulturmedium vor, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum (FCS) und Penicillin-Streptomycin (100 I.E./ml).
- Bereiten Sie 20,6 ml des Enzymverdauungsmediums in einem 50 ml-Rohr vor, bestehend aus 20 ml DMEM, 200 l DNase (50 g/ml), 200 l Papain (30 U/ml) und 200 l L L-Cystein (0,24 mg/ml).
- Filtern Sie die Medien mit einem 0,22 m-Filter.
- Halten Sie die Medien in der laminaren Durchflusshaube bei Raumtemperatur (RT) bis zur Zerlegung.
3. Vorbereitung für die Zerlegung (ca. 10 min)
HINWEIS: Führen Sie die Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
- 100 ml phosphatgepufferte Saline ohne Kalzium und Magnesium (PBS; 1x) vorbereiten. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22-mm-Filter.
- Bereiten Sie 50 ml eiskalte 1x PBS-Lösung vor, die mit 750 l 45% Glukose ergänzt wird. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22-mm-Filter.
- Füllen Sie eine 100 mm Petrischale mit 1x PBS für Reinigungsinstrumente und drei 60 mm Petrischalen mit eiskaltem PBS-Glucose für die Gewebeernte. Die Petrischalen auf Eis legen, bis sie zerlegt sind.
4. Dissektion
HINWEIS: Die Dissektion wird von männlichen und weiblichen Wistar Rattenwelpen am postnatalen Tag (P) 2 durchgeführt.
- Um eine sterile Umgebung zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass die Bank mit 100% Ethanol gereinigt wird. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge mit 100% Ethanol.
- Sprühen Sie den Hals des Welpen vorsichtig mit 70% Ethanol.
- Verwenden Sie große chirurgische Scheren, um das Tier zu enthaupten und legen Sie den Kopf in eine 100 mm Petrischale mit eiskaltem PBS-Glucose.
- Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um den Kopf des Tieres auf Augenhöhe zu halten. Verwenden Sie kleine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt an der Schädelbasis zu machen und schneiden Sie den Schädel nach der Gehirnmittellinie.
- Verwenden Sie Zangen, um die beiden Teile des Schädels sanft von der Mittellinie abzuziehen.
- Verwenden Sie einen kleinen chirurgischen Löffel, um das Gehirn aus der Kopfhöhle zu entfernen. Setzen Sie das Gehirn in eine 60 mm Petrischale, die eiskalte PBS-Glucose enthält.
- Betrachten unter einem Steromikroskop, verwenden Sie feine Zange, um das Kleinhirn, das Hirnstamm und olfaktorische Glühbirnen aus zerebralen Hemisphären zu entfernen.
- Verwenden Sie feine Zangen, um die beiden zerebralen Hemisphären zu trennen. Verwenden Sie feine Zange, um die Meninges abzuschälen. Die Hirnkortika in einer 60 mm-Petrischale auf Eis legen.
HINWEIS: Eiskalte Sedieb ist entscheidend für die richtige Entfernung von Meningen.
5. Gewebedissoziation
HINWEIS: Führen Sie die Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
- Verwenden Sie ein scharfes Skalpell, um die Zerebralparese fein zu hacken. Übertragen Sie das gehackte Gewebe in ein 50 ml-Rohr, das Enzymverdauungsmedium enthält.
- 30 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.
- Verwenden Sie eine p1000 Mikropipette, um das Enzymverdauungsmedium sanft zu entfernen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das kortikale Gewebe am Boden des 50 ml-Rohrs verbleibt.
- Verwenden Sie eine p1000 Mikropipette, um 1 ml DMEM-10% FCS hinzuzufügen und das Gewebe sanft zu trituieren.
- Verwenden Sie einen 70-mm-Filter und einen Kolben einer 1 ml Spritze, um das Kortikalgewebe in ein 50 ml-Rohr zu filtern.
HINWEIS: Mit DMEM-10% FCS kann restliches Gewebe mehrmals an der Innenrohrwand abspülen. - Füllen Sie das 50 ml Rohr mit DMEM-10%FCS. Zentrifuge bei 423 x g für 5 min bei RT. Überstand vorsichtig entfernen und Zellpellet mit 2 ml DMEM-10%FCS wieder aufsetzen.
- Zellpellet mit einer p1000-Mikropipette und dann mit einer p200-Mikropipette sanft trituieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem entsprechenden Volumen von DMEM-10%FCS.
HINWEIS: Zwei Gehirne = ein T150 = 5 ml DMEM-10%FCS. - Platte 5 ml der Zellsuspension auf einem T150 mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen/cm2. Fügen Sie jedem T150 20 ml warmes DMEM-10%FCS hinzu. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2.
- Erneuern Sie die Hälfte des Kulturmediums nach 6 Tagen in vitro (DIV) mit warmem DMEM-10%FCS.
6. Schüttelvorbereitung
- Führen Sie die Schüttelvorbereitung am Tag vor dem Schütteln in einer laminaren Fließhaube unter sterilen Bedingungen durch.
- Erneuern Sie die Hälfte des Kulturmediums, indem Sie frisches warmes Kulturmedium in den Kolben einfließen lassen und bei 37 °C unter 5%CO2brüten.
7. Schütteln
- Drei 100 mm Petrischalen mit PEI beschichten. Lagern Sie sie bei 4 °C über Nacht.
- Bedecken Sie die Flaschenkappe mit Paraffinfolie und legen Sie die Kolben in eine Plastiktüte. Schütteln Sie Kolben mit Gliazellen über Nacht bei 250 U/min bei 37 °C.
HINWEIS: Das erste Schütteln erfolgt bei 8 DIV und man kann bis zu drei verschiedene Schütteln durchführen (siehe Abbildung 1 für Timing).
8. OL Linienzellen Ernte und Kultur
HINWEIS: Diese Schritte sollten in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
- Am Tag nach dem Schütteln bereiten Bottenstein-Sato (BS) Mittel nach Tabelle 1vor.
- Spülen Sie beschichtete Petrischalen 3 mal mit sterilem destilliertem Wasser.
- Erntekolben',-Überstand, der hauptsächlich OL-Linienzellen, aber auch einige mikrogliaale Zellen enthält, und auf nicht beschichteten 100 mm Petrischalen plattieren.
HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Entfernung von mikrogliaalen Zellen durch differenzielle schnelle Haftung auf der Telleroberfläche. - Die Petrischalen 15 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.
- Füllen Sie jeden T150 Kolben mit 25 ml warmem, frisch zubereitetem Kulturmedium und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2 bis zum zweiten Schütteln.
- Übertragen Sie den Überstand aus den Petrischalen in neue unbeschichtete 100 mm Petrischalen, um die Haftung von verbleibenden Mikroglialzellen zu ermöglichen.
- Die Petrischalen 15 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.
- Entfernen Sie den Überstand, der nicht anhaftende OL-Linienzellen enthält, und übertragen Sie ihn in 50 ml-Rohre (Überstand aus 2 Petrischalen für ein 50 ml-Rohr). Entsorgen Sie Petri-Gerichte, die mit Mikroglia überzogen sind.
- Zentrifugieren Sie den Überstand für 5 min bei 423 x g. Entfernen Sie überstand es und setzen Sie das Zellpellet vorsichtig mit 1 ml BS-Medium aus. Alle Pellets in einem gemeinsamen 50 ml-Rohr bündeln und volumen auf 10 ml mit BS-Medium einstellen.
- Bestimmen Sie Zellen, die zellendichte zählen, unter dem Mikroskop.
HINWEIS: Es sollte eine Zelldichte zwischen 3 x 105/ml und 5 x 105/ml erreicht werden. - Fügen Sie 20 ml BS hinzu, wenn die Zelldichte größer oder gleich 4 x 105/ml ist, um ein Endvolumen von 30 ml zu erhalten, oder fügen Sie nur 10 ml BS hinzu, wenn die Zelldichte kleiner als 4 x 105/ml ist, um ein Endvolumen von 20 ml zu erhalten.
- Platte zwei oder drei vorbeschichtete 100 mm Petrischalen mit 10 ml Zellaufhängung. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2.
- Reinigen Sie die Trümmer der Petri-Gerichte, indem Sie das gesamte BS-Medium 2 H später erfrischen.
HINWEIS: Untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop vor und nach der Räumung, um die Zelldichte und die Effizienz der Entfernung von Schmutz zu überprüfen. - 2 Tage in BS-Medium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.
HINWEIS: Untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop. Der Zusammenfluss sollte 70 % bis 80 % betragen.
9. OCM-Produktion
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
- Vorbereiten NB-B27low Medium nach Tabelle 2.
- Erneuern Sie das Kulturmedium mit 10 ml warmem NB-B27low Medium. 2 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.
- Ernten Sie das OCM, d.h. Überstand, der OL-Sekretfaktoren enthält. Filtern Sie OCM mit einem 0,22-mm-Filter.
HINWEIS: OCM maximal 2 Monate bei 4 °C lagern.
10. OCM-Zusatz
HINWEIS: Die Schritte sollten in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. OCM kann gereinigten Hippocampus-Neuronenkulturen hinzugefügt werden, die nach dem folgenden Protokoll14hergestellt und durch Zugabe von 24 h nach Isolation, den Anti-Mito-Wirkstoffen Uridin und 5-Fluorodeoxyuridin (5 m) für 36 h erhalten werden.
- Bei 3 DIV entfernen Sie alle Neuronenkulturmedium mit Anti-Mitotik-Mitteln und fügen Sie 500 l frische warme OCM.
- Erneuern Sie alle 3 Tage die Hälfte des Mediums mit frisch zubereitetem warmen NB-B27.
HINWEIS: Solche Kulturen können bis zu 21 DIV beibehalten werden.
11. Zugabe von OL zur gereinigten Hippocampus-Neuronenkultur
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus. OLs können gereinigten Hippocampuskulturen hinzugefügt werden, die auf die gleiche Weise erhalten werden wie oben beschrieben.
- Vorbereiten von Co-Kultur-Medium gemäß Tabelle 3.
- Rufen Sie die OL-Kultur bei 70% bis 80% Zusammenfluss ab. Spülen Sie mit 2 ml warmem 1x PBS.
- Um die Zellen zu lösen, fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin zu einer 100 mm Petrischale hinzu.
- Inkubieren Sie für 5 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2.
- Fügen Sie 2 ml DMEM-10% FCS hinzu, um die enzymatische Reaktion zu blockieren. Ernten Sie den Überstand, der OL-Abstammungszellen enthält.
- Zentrifuge bei 423 x g für 5 min bei RT. Überstand vorsichtig entfernen und das Zellpellet in warmem Co-Kulturmedium wieder aufsetzen, um eine Konzentration von 1,25 x 105 Zellen/ml zu erhalten.
- Fügen Sie OL zu gereinigten Hippocampus-Neuronen Kultur durch entfernen 200 l Neuronkultur Medium und Hinzufügen von 200 l Zellsuspension pro Brunnen (2,5 x 104 Zellen/ Well) einer 24-Well-Platte.
- Erfrischen Sie alle 2-3 Tage die Hälfte des Co-Kulturmediums.
HINWEIS: Kokulturen können bis zu 24 DIV gepflegt werden.
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Representative Results
In diesem Protokoll werden OL-Linienzellen aus Gliakulturen gereinigt, indem Astrozyten und Mikroglia abgeschüttelt werden. Reinheit und phänotypische Untersuchung von OL-Kulturen kann durch Immunfärbung mit Gliamarkern15beurteilt werden. Die Analyse der Expression verschiedener Marker ergab, dass OL-Kulturen meist Vor-OLs waren, wobei 90 % 4 % der O4+-Zellen, 85 % bei 7 % NG2+ Zellen und 4,7 % 2,1 % der PLP+ Zellen, während 7,2 % bei 2,5 % der Zellen GFAP+ Astrozyten waren (Mittelwert s.D., n = 3; Abbildung 2). Darüber hinaus waren 4,6 % bis 0,7 % der Zellen CD11b+ Mikrogliazellen (mittelwertig S.D., nicht dargestellt).
OCM, das aus solchen Kulturen hergestellt wird, kann bei 3 DIV zu gereinigten Hippocampus-Neuronkulturen hinzugefügt werden. Diese Behandlung fördert die Clusterbildung von Knotenproteinen, bestehend aus Nav Kanälen, die mit Neurofascin 186 und Ankyrin G entlang des Axons von Hippocampus GABAergen Neuronen vor der Myelinierung verbunden sind, bei 17 DIV (Abbildung 3A,B). Bemerkenswerterweise ergaben elektrophysiologische Aufnahmen, dass diese Cluster mit einer erhöhten Durchführung von Aktionspotentialen verbunden sind14. Darüber hinaus wird die Expression des phosphorylierten Zwischenfilamentproteins H, das durch Smi31 gebeizt wird, in OCM-behandelten Hippocampus-Neuronen erhöht (Abbildung 3A). Oligodendroglial sekretionierte Faktoren sind daher in die neuronale Reifung und Physiologie involviert.
Myelinisierung von Hippocampus-Neuronen kann durch Zugabe von OL bei 14 DIV untersucht werden. Von 20 DIV bis 24 DIV ermöglicht die Immunfärbung von Myelinmarkern wie Myelin-Basisprotein (MBP) die Visualisierung von Myelinsegmenten (Abbildung 4).
Abbildung 1: Protokollzeitleiste der OL-Abstammungszellenisolation und OCM-Produktion. Nach der Trennung von Zerebralparese von P2 Wistar Ratten (Schritt 4), Durchführung Gewebedissoziation zu Kultur Glialzellen (Schritt 5). Bei 8, 12 und 15 DIV (d.h. Tage vor dem Schütteln) erneuern Sie das halbe Medium mit warmem DMEM-10% FCS (Schritt 6). Am nächsten Tag die Gliakulturen über Nacht bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C (Schritt 7.2) schütteln. Ernte überstand OL-Abstammungszellen und wenige Mikrogliazellen und plattiert sie 15 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2 (Schritte 8,3 bis 8,7). Zentrifugieren Sie den Überstand für 5 min bei 423 x g, setzen Sie das Zellpellet mit BS wieder auf und inkubieren Sie 2 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2 (Schritte 8,8 bis 8,12). Um OCM zu produzieren, inkubieren Sie für 2 Tage in NB-B27low (Schritt 9). Um OLs für Co-Kultur-Experimente zu isolieren, lösen Sie die Zelle mit Trypsin ab (Schritt 11.3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: OL-Linienzellen-Phänotyp in Kulturen. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Maximale Intensitätsprojektionen werden dargestellt. (A) OL-Kulturen enthalten meist Vor-OLs (d. h. nur NG2 (rot) oder sowohl O4 (grün) als auch NG2 (rot); Zellen, die beide Marker exemiten, sind mit gelben Sternen angegeben), aber auch einige unreife OLs (d. h. nur O4 und nicht NG2; weiße Sterne). (B) Wenige reife OLs (d.h. PLP+; grün) und wenige Astrozyten (GFAP+ Zellen; rot) finden sich in OL-Linienzellkulturen. Skalenbalken = 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Anträge. (A,B) Hippocampus-Neuronen, die mit OCM bei 3 DIV behandelt und bei 17 DIV fixiert sind, drücken phosphoryliertes Zwischenfilamentprotein H (Smi31; grün; Panel A). GABAerge Neuronen, identifiziert durch Glutamat-Decarboxylase-Isoform von 67 kDa (GAD67) Expression (weiß), Anzeige Akkumulation von Ankyrin G und Nav Natriumkanäle (rot; Panels A bzw. B) am Axon-Anfangssegment und bilden Ankyrin G und Nav Cluster entlang ihrer Axon (Panels A bzw. B). Skalenbalken = 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Anträge. OL Abstammungszellen, die der Hippocampus-Neuronenkultur bei 14 DIV-Myeliat einige Hippocampus-Axone hinzugefügt wurden, hier auf 23 DIV (MBP als Myelinmarker; grün) festgelegt. Knoten von Ranvier (Nav; rot) werden zwischen Deninsegmenten beobachtet. Maßstabsleiste = 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Bottenstein-Sato (BS) | Endgültige Konzentration |
| Dulbeccos modifizierter Adler Medium | |
| Penicillin-Streptomycin | 100 I.E./ml |
| apo-Transferrin human | 100 g/ml |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | 100 g/ml |
| Insulin | 5 g/ml |
| PDGF | 10 ng/mL |
| Progesteron | 62 ng/ml |
| Putrescindihydrochlorid | 16 g/ml |
| Natriumselenit | 40 ng/ml |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-Thyronin-Natriumsalz) | 30 ng/ml |
| T4 (L-Thyroxin) | 40 ng/ml |
Tabelle 1: Vorbereitung der Bottenstein-Sato (BS) Medien.
| NB-B27 Low Media | Endgültige Konzentration |
| Neurobasal | |
| B27 Ergänzung | 0,5x |
| L-Glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 I.E./ml |
| NB-B27-Medien | Endgültige Konzentration |
| Neurobasal | |
| B27 Ergänzung | 1x |
| L-Glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 I.E./ml |
Tabelle 2: Herstellung von NB-B27low- und NB-B27-Medien.
| Co-Kultur-Medien | Endgültige Konzentration |
| Dulbeccos modifizierter Adler Medium | 1 Vol |
| Neurobasal | 1 Vol |
| B27 Ergänzung | 1x |
| Penicillin-Streptomycin | 100 I.E./ml |
| apo-Transferrin human | 50 g/ml |
| Biotin | 10 ng/mL |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | 50 g/ml |
| Ceruloplasmin | 100 ng/mL |
| Hydrocortison | 0,05 m |
| Insulin | 5 g/ml |
| N-Acetyl-L-Cystein | 5 g/ml |
| Progesteron | 6,2 ng/ml |
| Putrescin | 16 g/ml |
| Rekombinantes menschliches CNTF | 0,1 ng/ml |
| Natriumselenit | 5 ng/ml |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-Thyronin-Natriumsalz) | 40 ng/ml |
| Vitamin B12 | 27,2 ng/ml |
Tabelle 3: Vorbereitung der Co-Kultur-Medien.
Ergänzende Datei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).
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Discussion
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um hoch angereicherte oligodendrogliale Linienzellkulturen aus gemischten Gliakulturen zu erhalten, angepasst an eine zuvor veröffentlichte Methode16, und die anschließende Produktion von OL-konditioniertem Medium. Diese Schütteltechnik ist nicht teuer, kann dreimal wiederholt werden und ist optimal, um eine hohe Menge an gereinigten OLs zu erhalten, da Zellen, die in Bottenstein-Sato (BS) Medium kultiviert werden, das PDGF-Vermehrung enthält. Gliazellen werden mit zerebralen Kortiken von Wistar-Ratten bei P2 hergestellt, einem Zeitpunkt, an dem die überwiegende Mehrheit der oligodendroglialen Linienzellen Voroligodendrozyten sind, die NG2 und O415exezieren. Bemerkenswert ist, OL Linie Reifung ist ähnlich bei P2 in Maus und Ratte, und dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Maus Pre-Oligodendrozyten zu isolieren17.
Nach dem Schütteln der gemischten Gliazellkulturen bestehen abgetrennte Zellen hauptsächlich aus oligodendroglialen Linienzellen, aber auch aus einigen mikroglialen Zellen und wenigen Astrozyten. Mikrogliazellen werden durch Differentialhaftung auf unbeschichteten Petrischalen entfernt. Bemerkenswert ist, dass die Effizienz des Entfernens durch die Durchführung eines zusätzlichen Haftschritts verbessert werden kann. Jedoch, etwa 5% der mikroglialen Zellen sind immer noch in angereicherten oligodendroglialen Zellkulturen gefunden, sowie 5% bis 9% der Astrozyten. Es ist möglich, die Kontamination von Astrozyten auf weniger als 5% zu verringern, indem ein zusätzlicher Immunschwenkschritt mit O4-Antikörper-beschichteten Petrischalen ausgeführt wird; für ein detailliertes Protokoll siehe ergänzende Informationen in Freeman et al.14. Die Entfernung von Schmutz 2 h nach der Beschichtung oligodendroglialer Zellen ist ein kritischer Schritt, der auf der Stärke des Flusses beruht, der mit der Pipte aufgebracht wird. In diesem Schritt ist es wichtig, die Kultur unter dem Mikroskop vor und nach der Räumung zu untersuchen, um die Effizienz zu überprüfen, da das Vorhandensein von zu viel Schmutz die Zelllebensfähigkeit und das Wachstum beeinträchtigen kann. Bemerkenswert ist auch, dass es wichtig ist, frisch hergestelltes BS-Medium zu verwenden, da es sonst das Überleben von Oligodendrozyten verändern könnte. Darüber hinaus überleben gereinigte Zellen nur bis zu 6 Tage nach der Beschichtung. Tatsächlich ist bekannt, dass andere Gliazellen und Neuronen das Überleben und die Proliferation oder Differenzierung von OPC durch sekrete Faktoren oder direkte Kontakte fördern2,18.
Andere Methoden ermöglichen oLs Isolation unmittelbar nach der Gehirndissoziation, mit Immunolabelling mit O4-Antikörper gefolgt von fluoreszierend-aktivierter Zellsortierung durch Durchflusszytometrie (FACS) oder magnetaktivierte Zellsortierung (MACS). Darüber hinaus können GFP-positive OPCs oder GFP-positive Oligodendrozyten durch fluoreszierende Zellsortierung aus PDGF-R:GFP- bzw. PLP:GFP-Mäusen bzw.19,20gereinigt werden. Diese Sortiermethoden sind relevanter für die Untersuchung des physiologischen Zustands von Oligodendrozyten im Vergleich zu Kulturen, die mit Wachstumsfaktoren behandelt werden, die ihren Phänotyp verändern könnten. Insbesondere wurde die fluoreszierende Zellsortierung für Genprofilierungsansätze im normalen physiologischen Zustand und entmyzinsierenden Bedingungeneingesetzt 21. Da das Zellüberleben durch Zellsortierung verändert werden könnte, ist es besser, funktionelle Tests sofort nach der Sortierung durchzuführen.
Wir haben gezeigt, dass OL-Kulturen bei 14 DIV getrennt und gereinigten Hippocampus-Neuronkulturen hinzugefügt werden können. Eine solche OL-Neuron-Kokultur ermöglicht das Studium der frühen Schritte der Myelinisierung, die während der ersten Woche der Co-Kultur beginnt (Dubessy, unveröffentlichte Ergebnisse). Andere Modelle der OL-hippocampalneuron myelinierenden Co-Kultur wurden durch Zugabe von Oligodendrozyten sofort nach der Sortierung22,23erreicht. Darüber hinaus haben wir OCM produziert, um OL-Neuron-Wechselwirkungen weiter zu sezieren und die Rolle von OL-sekretierten Faktoren auf Neuronenkulturen anzusprechen. Mit dieser Technik haben wir gezeigt, dass hippocampale GABAerge Neuronensubtypen (d.h. Parvalbumin+ und/oder Somatostatin+) Cluster von Knotenproteinen entlang ihres Axons bilden können, die durch OCM vor der Myelinierung induziert werden14,24. Die Massenspektrometrie-Analyse von OCM hat mehrere sezernierte Proteine entwirrt und dazu geführt, oligodendrogliales Contactin-1 zu identifizieren, das in Synergie mit extrazellulären Matrixproteinen frühe Schritte der Knotenclusterbildung vermittelt24. Primärkulturen sind nützliche Modelle, die die Beurteilung der Differenzierung oligodendroglialer Linienzellen und Interaktionen mit Neuronen ermöglichen. Es wurden jedoch auch andere Ansätze entwickelt, um OL-Funktionen und Myelinierung, Demyelination und Remyelination aus ex vivo kleinhirnorganischen Scheibenkulturen25,26und In-vivo-Studien zu bewerten, insbesondere mit Zebrafisch- und Kaulquappenmodellen27, die in letzten Schritten vorklinischer Studien benötigt werden.
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Disclosures
Keiner der Autoren hat konkurrierende oder gegensätzende Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Rémi Ronzano für seinen klugen Rat in der Manuskriptbearbeitung. Diese Arbeit wurde durch ICM, INSERM, ARSEP Stiftung Zuschuss an NSF und Bouvet-Labruyére Preis finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
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