Summary
En este documento, mostramos un método eficiente para la purificación de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos que se puede utilizar para experimentos de cocultivo.
Abstract
En el sistema nervioso central, los oligodendrocitos son bien conocidos por su papel en la mielinización de axón, que acelera la propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria. Por otra parte, un número creciente de informes sugieren que los oligodendrocitos interactúan con las neuronas más allá de la mielinización, en particular a través de la secreción de factores solubles. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite la purificación de células de linaje oligodendroglial de cultivos celulares gliales que también contienen astrocitos y células microgliales. El método se basa en el temblor nocturno a 37 oC, que permite el desprendimiento selectivo de las células oligodendrogliales y microglia superpuestas, y la eliminación de la microglia por adhesión diferencial. A continuación, describimos el cultivo de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM). También proporcionamos la cinética del tratamiento OCM u oligodendrocitos adición a las neuronas hipocampales purificadas en experimentos de cocultivo, estudiando interacciones oligodendrocitos-neuronas.
Introduction
Los oligodendrocitos (OL) son células gliales del sistema nervioso central (SNC) que generan envoltura de mielina alrededor de los axones. Los OL s originan a partir de células precursoras de oligodendrocitos (OPO) que proliferan dentro de las zonas ventriculares del SNC embrionario y luego migran y diferencian en OLs completamente maduras (es decir, células formadoras de mielina)1. Los OPO son abundantes durante el desarrollo temprano, pero también persisten en el cerebro adulto donde representan la mayor población celular proliferativa2. Un solo OL envuelve múltiples axones en secciones no excitables (es decir, internodos), y el borde de cada bucle de mielina se une al axón formando el dominio paranodal que es crucial para las propiedades aislantes de la mielina1,3. Entre los paranodos hay pequeños huecos no mielinizados llamados los nodos de Ranvier. Estos nodos son ricos en canales de sodio (Nav) cerrados por voltaje, lo que permite la regeneración y rápida propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria4. Esta estrecha interacción también permite el apoyo de la energía axonal a través de la toma neuronal de lactato de OLs5,6.
La maduración de las células de linaje oligodendroglial y el proceso de mielinización están estrechamente regulados por sus interacciones con las neuronas7. De hecho, los OL y los OPO, también llamados células NG2, expresan una serie de receptores de neurotransmisores, y pueden recibir información de las neuronas excitatorias e inhibitorias, lo que les permite sentir la actividad neuronal que puede desencadenar su proliferación y / o diferenciación en las células mielinizadoras2. A su vez, los OPO/OLs secretan microvesículas y proteínas en el espacio extracelular que solo o sinérgicamente median las funciones neuromoduladoras y neuroprotectoras8,9,10,11,12. Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan los múltiples modos de interacciones entre las células de linaje oligodendroglial y las neuronas aún no se han descifrado completamente.
Por otra parte, en varias condiciones patológicas del SNC, los OLs se ven afectados principalmente, lo que perturba su interacción con las neuronas. Por ejemplo, en la Esclerosis Múltiple (EP), la disfunción neurológica es causada por la desmielinización focal en el SNC, secundaria a la pérdida de OLs que puede conducir a daño axonal y acumulación de discapacidad relacionada. La remielinización puede tener lugar, aunque insuficientemente en la mayoría de los casos13. Los progresos en la última década, debido al desarrollo de inmunoterapias, han reducido la tasa de recaídas, pero la promoción de la remielinización sigue siendo hasta la fecha una necesidad insatisfecha. Como tal, una mejor comprensión del papel, las funciones y las influencias de los ostales es de particular interés para el desarrollo de nuevas terapias para un amplio espectro de condiciones del SNC.
Aquí, describimos los métodos de purificación y cultivo de OLs. Esto permite un examen preciso de los mecanismos intrínsecos que regulan su desarrollo y biología. Además, estos cultivos de OLs altamente enriquecidos permiten la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM), que se puede agregar a los cultivos de neuronas purificadas para obtener información sobre el impacto de los factores secretos por OLs en la fisiología neuronal y la conectividad. Además, describimos cómo implementar un sistema de cocultivo in vitro donde se combinan oligodendrocitos y neuronas purificados, lo que permite abordar los mecanismos que regulan (re)mielinización.
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Protocol
El cuidado y uso de ratas en este experimento se ajusta a las políticas y directrices institucionales (UPMC, INSERM y la Directiva 86/609/CEE del Consejo de la Comunidad Europea). El siguiente protocolo se establece para una camada estándar de 12 cachorros.
1. Preparación de los matraces (5 min)
NOTA: Realice los siguientes pasos el día antes de la disección en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Recubrir los matraces de 150 cm2 (T150) con tapa de filtro (1 matraz para 2 cachorros) utilizando 5 ml de polietilenimina (PEI, 100 mg/L, ver protocolo en el archivo suplementario 1).
- Almacene los matraces a 4oC durante la noche.
- Enjuague los matraces recubiertos 3 veces con agua destilada estéril el día de la disección.
2. Preparación de medios (10 min)
NOTA: Realice los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Preparar 500 ml de medio de cultivo, compuesto por el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con el 10% del suero fetal de la pantorrilla (FCS) y la penicilina-estreptomicina (100 UI/ml).
- Preparar 20,6 ml del medio de digestión enzimática en un tubo de 50 ml, que consiste en 20 ml de DMEM, 200 ml de DNase (50 g/ml), 200 ml de papaína (30 U/ml) y 200 ml de L-cisteína (0,24 mg/ml).
- Filtrar-esterilizar el medio utilizando un filtro de 0,22 m.
- Mantenga el medio en la campana de flujo laminar a temperatura ambiente (RT) hasta la disección.
3. Preparación para la disección (10 min)
NOTA: Realice los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Preparar 100 ml de solución salina con fosfato sin calcio y magnesio (PBS; 1x). Filtrar-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 m.
- Preparar 50 ml de solución de PS p.PBS 1x en frío suplementada con 750 ml de glucosa al 45%. Filtrar-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 m.
- Llene una placa Petri de 100 mm con 1 x PBS para instrumentos de limpieza y tres platos Petri de 60 mm con PBS-glucosa helada para la cosecha de tejidos. Ponga los platos de petri en hielo hasta la disección.
4. Disección
NOTA: La disección se realiza a partir de cachorros de ratas Wistar masculinos y femeninos en el día postnatal (P) 2.
- Con el fin de proporcionar un ambiente estéril, asegúrese de limpiar el banco con 100% etanol. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas con 100% de etanol.
- Rocíe suavemente el cuello del cachorro con un 70% de etanol.
- Use tijeras quirúrgicas grandes para decapitar al animal y colocar la cabeza en un plato Petri de 100 mm que contenga PBS-glucosa helada.
- Utilice fórceps curvos para mantener la cabeza del animal a nivel de los ojos. Use pequeñas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión en la base del cráneo y cortar el cráneo siguiendo la línea media del cerebro.
- Usa fórceps para despegar suavemente las dos partes del cráneo de la línea media.
- Use una cuchara quirúrgica pequeña para extraer el cerebro de la cavidad de la cabeza. Ponga el cerebro en un plato Petri de 60 mm que contenga PBS-glucosa helada en hielo.
- Viendo bajo un esterosmicroscopio, usa fórceps finos para eliminar el cerebelo, el tronco encefálico y los bulbos olfativos de los hemisferios cerebrales.
- Usa fórceps finos para separar los dos hemisferios cerebrales. Usa fórceps finos para despegar las meninges. Ponga los córtices cerebrales en un plato de 60 mm-petri sobre hielo.
NOTA: El PBS helado es fundamental para la eliminación correcta de las meninges.
5. Disociación de tejidos
NOTA: Realice los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Usa un bisturí afilado para cortar finamente los córticos cerebrales. Transfiera el tejido picado a un tubo de 50 ml que contenga un medio de digestión enzimática.
- Incubar durante 30 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% co2.
- Utilice una micropipeta p1000 para eliminar suavemente el medio de digestión enzimática mientras se asegura de que el tejido cortical permanezca en la parte inferior del tubo de 50 ml.
- Utilice un micropita p1000 para agregar 1 ml de DMEM-10% FCS y triturar suavemente el tejido.
- Utilice un filtro de 70 m y un pistón de una jeringa de 1 ml para filtrar el tejido cortical en un tubo de 50 ml.
NOTA: Se puede enjuagar el tejido residual en la pared del tubo interno varias veces con DMEM-10% FCS. - Llene el tubo de 50 ml con DMEM-10%FCS. Centrífuga a 423 x g durante 5 min en RT. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 2 ml de DMEM-10%FCS.
- Triturar suavemente el pellet celular con un micropita p1000 y luego con un micropita p200. Diluir la suspensión celular con el volumen adecuado de DMEM-10%FCS.
NOTA: Dos cerebros, uno, uno, uno, 5 ml de DMEM-10%FCS. - Placa 5 ml de la suspensión celular en un T150 a una densidad de 1 x 105 células/cm2. Agregue 20 mL de DMEM caliente-10%FCS a cada T150. Incubar en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
- Renovar la mitad del medio de cultivo después de 6 días in vitro (DIV) con cálido DMEM-10%FCS.
6. Preparación de agitación
- Realice la preparación de agitación el día antes de agitar en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Renovar la mitad del medio de cultivo añadiendo un medio de cultivo fresco y cálido al matraz e incubar a 37oC por debajo del 5% deCO2.
7. Temblor
- Recubrir tres platos Petri de 100 mm con PEI. Guárdelos a 4oC durante la noche.
- Cubra la tapa de los frascos con película de parafina y coloque los matraces en una bolsa de plástico. Agitar los matraces que contengan células gliales durante la noche a 250 rpm a 37 oC.
NOTA: El primer temblor se realiza a 8 DIV y se pueden realizar hasta tres temblores diferentes (consulte la figura 1 para la sincronización).
8. Células de linaje OL cosechay cultivo
NOTA: Estos pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- El día después del temblor, preparar el medio Bottenstein-Sato (BS) según la Tabla 1.
- Enjuague los platos Petri recubiertos 3 veces con agua destilada estéril.
- El sobrenadante de los matraces de cosecha que contiene principalmente células de linaje OL, pero también algunas células microgliales y lo clomanan en platos Petri de 100 mm no recubiertos.
NOTA: Este paso permite la eliminación de células microgliales a través de una adhesión rápida diferencial en la superficie del plato. - Incubar los platos de Petri durante 15 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
- Llenar cada matraz T150 con 25 ml de medio de cultivo recién preparado y incubar en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2 hasta el segundo temblor.
- Transfiera el sobrenadante de los platos Petri a nuevos platos Petri de 100 mm no recubiertos para permitir la adhesión de células microgliales residuales.
- Incubar los platos de Petri durante 15 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
- Retire el sobrenadante, que contiene células de linaje OL no adherentes, y transfieralo a tubos de 50 ml (sobrenadante de 2 platos De Petri para un tubo de 50 ml). Deseche los platos de Petri chapados con microglia.
- Centrifugar el sobrenadante durante 5 min a 423 x g. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular con 1 ml de medio de BS. Piscina todos los pellets en un tubo común de 50 ml y ajuste el volumen a 10 ml con medio BS.
- Determinar la densidad celular contando células bajo un microscopio.
NOTA: Se debe obtener una densidad de celda entre 3 x 105/mL y 5 x 105/mL. - Agregue 20 ml de BS si la densidad de celda es mayor o igual que 4 x 105/mL para obtener un volumen final de 30 ml, o agregue solo 10 ml de BS si la densidad de celda es inferior a 4 x 105/mL para obtener un volumen final de 20 ml.
- Placa dos o tres platos Petri pre-revestidos de 100 mm con 10 ml de suspensión celular. Incubar en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
- Limpie los escombros de los platos de Petri refrescando todo el medio BS 2 h más tarde.
NOTA: Examine el cultivo bajo el microscopio antes y después de limpiar para verificar la densidad celular y la eficiencia de la eliminación de escombros. - Incubar durante 2 días en soporte bis en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
NOTA: Examine el cultivo bajo el microscopio. La confluencia debe ser del 70% al 80%.
9. Producción de OCM
NOTA: Realice estos pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Preparar el medio NB-B27low según el Cuadro 2.
- Renovar medio de cultivo con 10 mL de medio cálido NB-B27low. Incubar durante 2 días en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.
- Cosecha el OCM, es decir, sobrenadante que contiene factores secretos de OL. Filtrar-esterilizar OCM utilizando un filtro de 0,22 m.
NOTA: Almacene OCM a 4oC durante un máximo de 2 meses.
10. Adición de OCM
NOTA: Los pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles. OCM se puede añadir a cultivos de neuronas hipocampales purificadas preparados de acuerdo con el siguiente protocolo14,y obtenido según la adición, 24 h después del aislamiento, los agentes antimitóticos uridina y 5- fluorodeoxiruridina (5 m) durante 36 h.
- A 3 DIV, retire todo el medio de cultivo de neuronas que contenga agentes antimitoticos y agregue 500 l de OCM caliente fresco.
- Renueva la mitad del medio cada 3 días con el nB-B27 recién hecho y caliente.
NOTA: Estas culturas se pueden mantener hasta 21 DIV.
11. Adición de OL al cultivo purificado de neuronas hipocampales
NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles. Los OLs se pueden añadir a los cultivos de hipocampo purificados obtenidos de la misma manera que se describió anteriormente.
- Preparar el medio de cocultivo según la Tabla 3.
- Recupere la cultura de OL al 70% a 80% de confluencia. Enjuagar con 2 ml de 1x PBS caliente.
- Para separar las células, agregue 2 ml de trippsina al 0,25% a una placa Petri de 100 mm.
- Incubar durante 5 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5%co2.
- Añadir 2 mL de DMEM-10% FCS para bloquear la reacción enzimática. Cosecha el sobrenadante que contiene células de linaje OL.
- Centrífuga a 423 x g durante 5 min en RT. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cocultivo cálido para obtener una concentración de 1,25 x 105 células/ml.
- Agregue OL al cultivo purificado de neuronas del hipocampo eliminando 200 éL de medio de cultivo de neuronas y agregando 200 s de suspensión celular por pozo (2,5 x 104 células/pozo) de una placa de 24 pocillos.
- Refrescar la mitad del medio de cocultura cada 2-3 días.
NOTA: Los cocultivos se pueden mantener hasta 24 DIV.
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Representative Results
En este protocolo, las células de linaje OL se purifican de cultivos gliales sacudiendo astrocitos y microglia. La pureza y el examen fenotípico de los cultivos de OL se pueden evaluar mediante inmunomancha con marcadores gliales15. El análisis de la expresión de diferentes marcadores indicó que los cultivos de OL eran en su mayoría pre-OLs con 90% - 4% de O4+ células, 85% - 7% NG2+ células, y 4.7% a 2.1% de PLP+ células, mientras que 7.2% - 2.5% de las células fueron GFAP+ astrocitos (media - S.D., n - 3; Figura 2). Además, el 4,6% a 0,7% de las células fueron CD11b+ células microgliales (la media s.D., no se muestra).
OCM producido a partir de tales culturas se puede añadir a 3 DIV a cultivos de neuronas hipocampales purificadas. Este tratamiento promueve la agrupación de proteínas nodal, que consiste en canales Nav asociados con Neurofascin 186 y Ankyrin G a lo largo del axón de las neuronas GABAérgicas hipocampalantes antes de la mielinización, en 17 DIV (Figura 3A,B). Cabe destacar que las grabaciones electrofisiológicas revelaron que estos cúmulos están asociados con un aumento de la conducción de los potenciales de acción14. Además, la expresión de la proteína de filamento intermedio fosforilado H teñida por Smi31 aumenta en las neuronas hipocampales tratadas con OCM(Figura 3A). Por lo tanto, los factores secretos oligodendrogliales están implicados en la maduración neuronal y la fisiología.
La mielinización de las neuronas del hipocampo se puede estudiar mediante la adición de OL a 14 DIV. De 20 DIV a 24 DIV, la inmunomancha de marcadores de mielina, como la proteína básica de mielina (MBP) permite la visualización de segmentos de mielina(Figura 4).
Figura 1: Cronología del protocolo del aislamiento de las células de linaje OL y la producción de OCM. Después de disecar los córticos cerebrales de ratas P2 Wistar (paso 4), realice la disociación del tejido a las células gliales de cultivo (paso 5). A 8, 12 y 15 DIV (es decir, días antes de temblar), renueve medio medio con DMEM-10% FCS caliente (paso 6). Al día siguiente, agitar los cultivos de glial durante la noche a 250 rpm a 37 oC (paso 7.2). Cosecha sobrenadante que contiene células de linaje OL y pocas células de microglia y placa durante 15 minutos en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% de CO2 (pasos 8.3 a 8.7). Centrifugar el sobrenadante durante 5 min a 423 x g,resuspender el pellet celular con EB e incubar durante 2 días en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2 (pasos 8.8 a 8.12). Para producir OCM, incubar durante 2 días en NB-B27low (paso 9). Para aislar los ols para experimentos de cocultivo, separe la célula mediante trippsina (paso 11.3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Fenotipo de células de linaje OL en cultivos. Las imágenes fueron adquiridas con un microscopio confocal. Se presentan proyecciones de intensidad máxima. (A) los cultivos OL contienen principalmente pre-OL (es decir, expresando sólo NG2 (rojo), o o O4 (verde) y NG2 (rojo); las células que expresan ambos marcadores están indicadas con estrellas amarillas), pero también algunas OL inmaduras (es decir, sólo expresando O4 y no NG2; estrellas blancas). (B) Pocos OL maduros (es decir, PLP+; verde) y pocos astrocitos (GFAP+ células; rojo) se encuentran en los cultivos celulares de linaje OL. Barras de escala de 25 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aplicaciones representativas. (A,B) Las neuronas hipocampales tratadas con OCM en 3 DIV y fijadas en 17 DIV expresan la proteína de filamento intermedio fosforilado H (Smi31; verde; panel A). Neuronas GABAérgicas, identificadas por isoforma de glutamato decarboxilasa de expresión de 67 kDa (GAD67) (blanco), acumulación de pantalla de canales de anquirina G y Nav de sodio (rojo; paneles A y B, respectivamente) en el segmento inicial de axón y forman cúmulos Ankyrin G y Nav a lo largo de su axón (paneles A y B, respectivamente). Barras de escala de 25 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Aplicaciones representativas. Células de linaje OL añadidas al cultivo de neuronas hipocampales a 14 DIV mielinate algunos axones hipocampales, aquí fijados en 23 DIV (MBP como un marcador de mielina; verde). Los nodos de Ranvier (Nav; rojo) se observan entre segmentos de mielina. Barra de escala de 25 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medios Bottenstein-Sato (BS) | Concentración final |
| Medio de águila modificado de Dulbecco | |
| Penicilina-Streptomicina | 100 UI/ml |
| apo-Transferin humano | 100 g/ml |
| BSA (Bovino Serum Albumin) | 100 g/ml |
| Insulina | 5 g/ml |
| Pdgf | 10 ng/mL |
| Progesterona | 62 ng/mL |
| Dihidrocloruro de Putrescine | 16 g/ml |
| Selenita sódica | 40 ng/mL |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironina sal sódica) | 30 ng/mL |
| T4 (L-tiroxina) | 40 ng/mL |
Tabla 1: Preparación de los medios Bottenstein-Sato (BS).
| Medios bajos NB-B27 | Concentración final |
| Neurobasal | |
| Suplemento B27 | 0.5x |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicilina-Streptomicina | 100 UI/ml |
| Medios NB-B27 | Concentración final |
| Neurobasal | |
| Suplemento B27 | 1x |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicilina-Streptomicina | 100 UI/ml |
Cuadro 2: Preparación de medios NB-B27low y NB-B27.
| Medios de cultura cocultura | Concentración final |
| Medio de águila modificado de Dulbecco | 1 vol |
| Neurobasal | 1 vol |
| Suplemento B27 | 1x |
| Penicilina-Streptomicina | 100 UI/ml |
| apo-Transferin humano | 50 g/ml |
| Biotina | 10 ng/mL |
| BSA (Bovino Serum Albumin) | 50 g/ml |
| Ceruloplasmina | 100 ng/mL |
| Hidrocortisona | 0,05 m |
| Insulina | 5 g/ml |
| N-acetil-L-cisteína | 5 g/ml |
| Progesterona | 6.2 ng/mL |
| Putrescina | 16 g/ml |
| CNTF humano recombinante | 0,1 ng/mL |
| Selenita sódica | 5 ng/mL |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-tironina sal sódica) | 40 ng/mL |
| Vitamina B12 | 27,2 ng/mL |
Tabla 3: Preparación de medios de cocultura.
Archivo Suplementario 1. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para obtener cultivos celulares de linaje oligodendroglial altamente enriquecidos a partir de cultivos glialmixtos, adaptados a partir de un método publicado previamente16,y la posterior producción de medio condicionado por OL. Esta técnica de agitación no es costosa, se puede repetir tres veces y es óptima para obtener una gran cantidad de obsturas purificadas, ya que proliferan las células cultivadas en el medio Bottenstein-Sato (BS) que contiene PDGF. Las células gliales se preparan utilizando cortices cerebrales de ratas Wistar en P2, un punto de tiempo en el que una gran mayoría de las células de linaje oligodendroglial son preoligodendrocitos que expresan NG2 y O415. Cabe destacar que la maduración del linaje OL es similar en P2 en ratón y rata, y este protocolo también se puede utilizar para aislar los preoligodendrocitos del ratón17.
Después de agitar los cultivos de células gliales mixtas, las células separadas consisten principalmente en células de linaje oligodendroglial, pero también algunas células microgliales y pocos astrocitos. Las células microgliales se eliminan a través de la adhesión diferencial en platos Petri sin recubrimiento. Cabe destacar que la eficiencia de eliminación se puede mejorar realizando un paso de adhesión adicional. Sin embargo, alrededor del 5% de las células microgliales todavía se encuentran en cultivos celulares oligodendrogliales enriquecidos, así como entre el 5% y el 9% de los astrocitos. Es posible disminuir la contaminación de los astrocitos a menos del 5% realizando un paso adicional de inmuno-panning utilizando platos Petri recubiertos de anticuerpos O4; para un protocolo detallado ver información complementaria en Freeman et al.14. La eliminación de escombros 2 h después de chapar células oligodendroglial es un paso crítico, que se basa en la fuerza del flujo aplicado con la tubería. En este paso, es importante examinar el cultivo bajo el microscopio antes y después de limpiar para verificar la eficiencia ya que la presencia de demasiados desechos puede afectar la viabilidad celular y el crecimiento. Cabe destacar que también es importante utilizar el medio DeB recién hecho, de lo contrario podría alterar la supervivencia de los oligodendrocitos. Además, las células purificadas sobreviven sólo hasta 6 días después del enchapado. De hecho, se sabe que otras células gliales y neuronas promueven la supervivencia de la OPC y la proliferación o diferenciación a través de factores secretos o contactos directos2,18.
Otros métodos permiten el aislamiento de oLs inmediatamente después de la disociación cerebral, utilizando inmunoetiquetado con anticuerpo O4 seguido de clasificación celular activada por fluorescente por citometría de flujo (FACS) o clasificación celular activada magnéticamente (MACS). Además, los OPC positivos de GFP o los oligodendrocitos GFP positivos pueden purificarse mediante la clasificación de células activadas fluorescentes a partir de ratones PDGF-R:GFP o PLP:GFP, respectivamente19,20. Estos métodos de clasificación son más relevantes para el estudio del estado fisiológico de los oligodendrocitos en comparación con los cultivos tratados con factores de crecimiento que podrían alterar su fenotipo. En particular, la clasificación celular activada por fluorescentes se ha utilizado para los enfoques de perfil a genes en el estado fisiológico normal y las condiciones desmieliniantes21. Como la supervivencia celular podría ser alterada por la clasificación celular, es mejor realizar ensayos funcionales inmediatamente después de la clasificación.
Hemos demostrado que los cultivos de OL se pueden separar y añadir a cultivos de neuronas hipocampales purificadas a 14 DIV. Este tipo de cocultivo de la neurona OL permite el estudio de los primeros pasos de la mielinización que comienza durante la primera semana de cocultura (Dubessy, resultados inéditos). Otros modelos de cocultivo mielinante de neuronas OL-hippocampal se han logrado mediante la adición de oligodendrocitos inmediatamente después de la clasificación22,23. Además, producimos OCM para diseccionar aún más las interacciones de la neurona OL y abordar el papel de los factores secretos por OL en los cultivos de neuronas. Mediante el uso de esta técnica, demostramos que los subtipos de neuronas GABAérgicas hipocampales (es decir, parvalbumina+ y/o somatostatina+) pueden formar racimos de proteínas nodala a lo largo de su axón que son inducidos por OCM antes de la mielinización14,24. El análisis de espectrometría de masas de OCM ha desentrañado varias proteínas secretadas y ha llevado a identificar el oligodendroglial Contactin-1 que en sinergia con proteínas de matriz extracelular media los primeros pasos de la agrupación nodal24. Los cultivos primarios son modelos útiles que permiten la evaluación de la diferenciación de células del linaje oligodendroglial y las interacciones con las neuronas. Sin embargo, también se han desarrollado otros enfoques para evaluar las funciones de OL y los estudios de mielinización, desmielinización y remielinización a partir de cultivos de rodajas organotípicas ex vivos25,26,e in vivo, en particular con los modelos 27 de peces cebra y renacuajo27 que son necesarios en los pasos finales de los estudios preclínicos.
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Disclosures
Ninguno de los autores tiene intereses en conflicto o en conflicto.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Rémi Ronzano por su sabio consejo en la edición de manuscritos. Este trabajo fue financiado por iCM, INSERM, la fundación ARSEP a NSF, y el precio Bouvet-Labruyére.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
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