Summary
Ici, nous affichons une méthode efficace pour la purification des oligodendrocytes et la production de milieu conditionné par oligodendrocyte s’il peut être utilisé pour des expériences de co-culture.
Abstract
Dans le système nerveux central, les oligodendrocytes sont bien connus pour leur rôle dans la myélinisation des axones, qui accélère la propagation des potentiels d’action par conduction saltatoire. En outre, un nombre croissant de rapports suggèrent que les oligodendrocytes interagissent avec les neurones au-delà de la myélinisation, notamment par la sécrétion de facteurs solubles. Ici, nous présentons un protocole détaillé permettant la purification des cellules de lignée oligodendroglial des cultures gliales de cellules contenant également des astrocytes et des cellules microgliales. La méthode repose sur des secousses de nuit à 37 oC, ce qui permet le détachement sélectif des cellules oligodendroglial et des cellules microgliales sus-jacentes, et l’élimination des microglies par adhérence différentielle. Nous décrivons ensuite la culture des oligodendrocytes et la production du milieu oligodendrocyte-conditionné (OCM). Nous fournissons également la cinétique du traitement d’OCM ou des oligodendrocytes s’ajoutent aux neurones hippocampiques purifiés dans des expériences de co-culture, étudiant des interactions oligodendrocyte-neuron.
Introduction
Les oligodendrocytes (OL) sont des cellules gliales du système nerveux central (SNC) qui génèrent de la myéline enveloppant autour des axones. Les OL proviennent de cellules précurseurs oligodendrocytes (OPC) qui prolifèrent dans les zones ventriculaires du SNC embryonnaire, puis migrent et se différencient en OL sœurs entièrement matures (c.-à-d. cellules formant la myéline)1. Les CPVP sont abondants au début du développement, mais persistent également dans le cerveau adulte où ils représentent la population principale de cellules proliérantes2. Un seul OL ensheathes plusieurs axones dans des sections non-excitables (c.-à-d., internodes), et le bord de chaque boucle de myéline se fixe à l’axone formant le domaine paranoïaque qui est crucial pour les propriétés isolantes de la myéline1,3. Entre les paranoïdes se trouvent de petites lacunes non myélinistielles appelées les nœuds de Ranvier. Ces nœuds sont riches en canaux de sodium à rayons de tension (Nav), permettant la régénération et la propagation rapide des potentiels d’action par conduction saltatoire4. Cette interaction étroite permet également le soutien de l’énergie axonale par l’apprisesage neuronal du lactate des LO5,6.
La maturation des cellules de lignée oligodendroglial et le processus de myélinisation sont étroitement réglementés par leurs interactions avec les neurones7. En effet, les OL et les CPVP, également appelés cellules NG2, expriment un éventail de récepteurs pour les neurotransmetteurs, et peuvent recevoir l’entrée des neurones excitateurs et inhibiteurs, leur permettant de sentir l’activité neuronale qui peut déclencher leur prolifération et/ou différenciation en cellules myélinisantes2. À leur tour, les CPVP/OL sécrètent des microvésicules et des protéines dans l’espace extracellulaire qui seul ou synergiquement médiateur fonctions neuromodulative et neuroprotectrice8,9,10,11,12. Cependant, les mécanismes moléculaires contrôlant les multiples modes d’interactions entre les cellules de lignée oligodendroglial et les neurones n’ont pas encore été entièrement déchiffrés.
De plus, dans plusieurs conditions pathologiques du SNC, les OL sont principalement affectés, perturbant ainsi leur interaction avec les neurones. Par exemple, dans la sclérose en plaques (SEP), le dysfonctionnement neurologique est causé par la démyélinisation focale dans le SNC, secondaire à la perte de LD qui peut mener aux dommages axonaux et à l’accumulation connexe d’incapacité. La remyélinisation peut avoir lieu, bien qu’insuffisamment dans la plupart des cas13. Les progrès de la dernière décennie, dus au développement d’immunothérapies, ont réduit le taux de rechute, mais la promotion de la remyélinisation demeure à ce jour un besoin non satisfait. En tant que tel, une meilleure compréhension du rôle, des fonctions et des influences des CLO est particulièrement intéressante pour le développement de nouvelles thérapies pour un large éventail de maladies du SNC.
Ici, nous décrivons les méthodes de purification et de culture des OL. Cela permet un examen précis des mécanismes intrinsèques régulant leur développement et leur biologie. En outre, ces cultures d’OL fortement enrichies permettent la production de milieu conditionné par oligodendrocyte (OCM), qui peut être ajouté aux cultures de neurones purifiés pour avoir un aperçu de l’impact des facteurs sécrétés par les OL sur la physiologie neuronale et la connectivité. En outre, nous décrivons comment mettre en œuvre un système de co-culture in vitro où les oligodendrocytes purifiés et les neurones sont combinés ensemble, permettant d’aborder les mécanismes de régulation (re)myélinisation.
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Protocol
Le soin et l’utilisation des rats dans cette expérience sont conformes aux politiques et directives institutionnelles (DIRECTIVE 86/609/CEE de l’UPMC, de l’INSERM et du Conseil communautaire européen). Le protocole suivant est établi pour une portée standard de 12 chiots.
1. Préparation des flacons (5 min)
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes la veille de la dissection dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.
- Enrober les flacons de 150 cm2 (T150) d’un bouchon de filtre (1 flacon pour 2 chiots) à l’aide de 5 ml de polyéthylèneinmine (PEI, 100 mg/L, voir protocole dans le fichier supplémentaire 1).
- Conserver les flacons à 4 oC pendant la nuit.
- Rincer les flacons enduits 3 fois avec de l’eau distillée stérile le jour de la dissection.
2. Préparation des médias (10 min)
REMARQUE : Effectuez les étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.
- Préparer 500 ml de milieu de culture, composé du milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété de 10 % de sérum fœtal de veau (FCS) et de pénicilline-streptomycine (100 UI/mL).
- Préparer 20,6 ml du milieu de digestion enzymatique dans un tube de 50 ml, composé de 20 ml de DMEM, de 200 l de DNase (50 g/mL), de 200 oL de papaïne (30 U/mL) et de 200 l de L-cystéine (0,24 mg/mL).
- Filtrer-stériliser le support à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
- Gardez le support dans le capot à débit laminaire à température ambiante (RT) jusqu’à la dissection.
3. Préparation à la dissection (10 min)
REMARQUE : Effectuez les étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.
- Préparer 100 ml de salin tamponné par le phosphate sans calcium et magnésium (PBS; 1x). Filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
- Préparer 50 ml de solution 1x PBS glacée complétée par 750 ll de 45 % de glucose. Filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
- Remplissez un plat Petri de 100 mm avec 1x PBS pour les instruments de nettoyage et trois plats Petri de 60 mm avec du PBS-glucose glacé pour la récolte des tissus. Mettre les boîtes de Pétri sur la glace jusqu’à la dissection.
4. Dissection
REMARQUE : La dissection est effectuée à partir de chiots mâles et femelles de rat Wistar au jour postnatal (P) 2.
- Afin de fournir un environnement stérile, assurez-vous de nettoyer le banc avec 100% d’éthanol. Stériliser tous les outils chirurgicaux avec 100% d’éthanol.
- Vaporiser délicatement le cou du chiot avec 70% d’éthanol.
- Utilisez de gros ciseaux chirurgicaux pour décapiter l’animal et placez la tête dans un plat Petri de 100 mm contenant du PBS-glucose glacé.
- Utilisez des forceps incurvés pour maintenir la tête de l’animal au niveau des yeux. Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux pour faire une petite incision à la base du crâne et couper le crâne en suivant la ligne médiane du cerveau.
- Utilisez des forceps pour décoller délicatement les deux parties du crâne de la ligne médiane.
- Utilisez une petite cuillère chirurgicale pour enlever le cerveau de la cavité de la tête. Placez le cerveau dans un plat Petri de 60 mm contenant du PBS-glucose glacé sur la glace.
- En regardant sous un stéréomicroscope, utiliser des forceps fins pour enlever le cervelet, le tronc cérébral et les ampoules olfactives des hémisphères cérébraux.
- Utilisez des forceps fins pour séparer les deux hémisphères cérébraux. Utilisez des pinces fines pour décoller les méninges. Mettre les cortices cérébraux dans un plat de 60 mm-petri sur la glace.
REMARQUE : Le PBS glacé est essentiel pour corriger l’élimination des méninges.
5. Dissociation tissulaire
REMARQUE : Effectuez les étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.
- Utilisez un scalpel pointu pour hacher finement les cortices cérébraux. Transférer le tissu haché dans un tube de 50 ml contenant un milieu de digestion enzymatique.
- Incuber pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
- Utilisez une micropipette p1000 pour enlever doucement le milieu de digestion enzymatique tout en vous assurant que le tissu cortical reste au fond du tube de 50 ml.
- Utilisez une micropipette p1000 pour ajouter 1 ml de DMEM-10% FCS et triturate doucement le tissu.
- Utilisez un filtre de 70 m et un piston d’une seringue de 1 ml pour filtrer le tissu cortical dans un tube de 50 ml.
REMARQUE: On peut rincer le tissu résiduel sur la paroi du tube intérieur à plusieurs reprises avec DMEM-10% FCS. - Remplissez le tube de 50 ml avec DMEM-10%FCS. Centrifugeuse à 423 x g pendant 5 min à RT. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez le granule de cellules avec 2 mL de DMEM-10%FCS.
- Triturate doucement le granule de cellules avec une micropipette p1000, puis avec une micropipette p200. Diluer la suspension cellulaire avec le volume approprié de DMEM-10%FCS.
REMARQUE : Deux cerveaux, un T150 et 5 ml de DMEM-10 %FCS. - Plaque 5 ml de la suspension cellulaire sur un T150 à une densité de 1 x 105 cellules/cm2. Ajouter 20 ml de DMEM-10%FCS chaud à chaque T150. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
- Renouveler la moitié du milieu de culture après 6 jours in vitro (DIV) avec dMEM-10%FCS chaud.
6. Préparation de secousses
- Effectuer la préparation de secousses le jour avant de secouer dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
- Renouveler la moitié du milieu de culture en ajoutant un milieu de culture frais et chaud dans le flacon et incuber à 37 oC sous 5 % co2.
7. Secouer
- Enrober trois plats Petri de 100 mm avec pei. Conservez-les à 4 oC pendant la nuit.
- Couvrir le bouchon de flacons de film de paraffine et mettre les flacons dans un sac en plastique. Secouer les flacons contenant des cellules gliales pendant la nuit à 250 tr/min à 37 oC.
REMARQUE : Les premières secousses sont effectuées à 8 DIV et on peut effectuer jusqu’à trois secousses différentes (voir la figure 1 pour le moment).
8. Récolte et culture des cellules de lignée d’OL
REMARQUE : Ces étapes doivent être exécutées dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
- Le lendemain de la secousse, préparer Bottenstein-Sato (BS) moyen selon le tableau 1.
- Rincer les plats Petri enrobés 3 fois avec de l’eau distillée stérile.
- Récolte des flacons supernatant contenant principalement des cellules de lignée d’OL mais aussi quelques cellules microgliales et l’aplatons sur des plats Petri non enrobés de 100 mm.
REMARQUE : Cette étape permet d’enlever les cellules microgliales par l’adhérence rapide différentielle sur la surface du plat. - Incuber les plats Petri pendant 15 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
- Remplir chaque flacon T150 de 25 ml de milieu de culture chaud fraîchement préparé et couver dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % de CO2 jusqu’à la deuxième secousse.
- Transférer le supernatant des plats Petri dans de nouveaux plats Petri non enrobés de 100 mm pour permettre l’adhérence des cellules microgliales résiduelles.
- Incuber les plats Petri pendant 15 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
- Retirez le supernatant, qui contient des cellules de lignée OL non adhérentes, et transférez-le en tubes de 50 ml (supernatant de 2 plats Petri pour un tube de 50 ml). Jeter les plats Petri plaqués de microglies.
- Centrifugeuse le supernatant pendant 5 min à 423 x g. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendre le granule de cellules avec 1 ml de milieu BS. Mettre toutes les pastilles dans un tube commun de 50 ml et ajuster le volume à 10 ml avec le milieu BS.
- Déterminer la densité cellulaire en comptant les cellules au microscope.
REMARQUE : Il faut obtenir une densité cellulaire comprise entre 3 x 105/mL et 5 x 105/mL. - Ajouter 20 ml de BS si la densité cellulaire est supérieure ou égale à 4 x 105/mL pour obtenir un volume final de 30 ml, ou ajouter seulement 10 ml de BS si la densité cellulaire est inférieure à 4 x 105/mL pour obtenir un volume final de 20 ml.
- Assiette deux ou trois plats Petri pré-enduits de 100 mm avec 10 ml de suspension cellulaire. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
- Effacer les débris de la vaisselle Petri en rafraîchissant tous les BS moyen 2 h plus tard.
REMARQUE : Examiner la culture au microscope avant et après le déblaiement pour vérifier la densité cellulaire et l’efficacité de l’enlèvement des débris. - Incuber pendant 2 jours en milieu BS dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
REMARQUE : Examinez la culture au microscope. La confluence devrait être de 70% à 80%.
9. Production d’OCM
REMARQUE : Effectuez ces étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.
- Préparer nb-B27low medium selon le tableau 2.
- Renouveler le milieu de culture avec 10 ml de milieu chaud NB-B27low. Incuber pendant 2 jours dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
- Récoltez l’OCM, c’est-à-- c’est-à-d. le supernatant contenant des facteurs sécrétés par les OL. Filtrer-stériliser OCM à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
REMARQUE : Conserver l’OCM à 4 oC pendant un maximum de 2 mois.
10. Ajout d’OCM
REMARQUE : Les étapes doivent être effectuées dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles. L’OCM peut être ajouté aux cultures purifiées de neurones hippocampiques préparées selon le protocole suivant14,et obtenues en ajoutant, 24 h après l’isolement, l’uridine des agents antimitotiques et 5- fluorodeoxyuridine (5 M) pour 36 h.
- À 3 DIV, retirez tous les milieux de culture neuronale contenant des agents anti-mitotiques et ajoutez 500 L d’OCM chaud frais.
- Renouveler la moitié du milieu tous les 3 jours avec nb-B27 chaud fraîchement préparé.
REMARQUE: De telles cultures peuvent être maintenues jusqu’à 21 DIV.
11. Ajout de l’OL à la culture des neurones hippocampiques purifiés
REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles. Les OL peuvent être ajoutés aux cultures hippocampales purifiées obtenues de la même manière que décrite ci-dessus.
- Préparer le milieu de la co-culture selon le tableau 3.
- Récupérez la culture des OL à 70% à 80% de confluence. Rincer à 2 ml de 1x PBS chaud.
- Pour détacher les cellules, ajouter 2 ml de trypsine de 0,25 % à un plat Petri de 100 mm.
- Incuber 5 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
- Ajouter 2 mL de DMEM-10% FCS pour bloquer la réaction enzymatique. Récoltez le supernatant contenant des cellules de lignée d’OL.
- Centrifugeuse à 423 x g pendant 5 min à RT. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez le granule cellulaire dans un milieu de co-culture chaud pour obtenir une concentration de 1,25 x 105 cellules/mL.
- Ajouter l’OL à la culture des neurones hippocampes purifiés en supprimant 200 L du milieu de culture neuronale et en ajoutant 200 ll de suspension cellulaire par puits (2,5 x 104 cellules/puits) d’une plaque de 24 puits.
- Rafraîchir la moitié du milieu de co-culture tous les 2-3 jours.
REMARQUE : Les co-cultures peuvent être maintenues jusqu’à 24 DIV.
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Representative Results
Dans ce protocole, les cellules de lignée d’OL sont purifiées des cultures gliales en secouant des astrocytes et des microglies. L’examen de pureté et phénotypique des cultures d’OL peut être évalué par immunostaining avec des marqueurs glial15. L’analyse de l’expression de différents marqueurs a indiqué que les cultures d’OL étaient pour la plupart des pré-OL avec 90 % - 4 % des cellulesO4, 85 % et 7 % decellules NG2, et 4,7 % - 2,1 % descellules PLP, tandis que 7,2 % - 2,5 % des cellules étaient GFAP- astrocytes (moyenne - S.D., n 3 ; Figure 2). De plus, 4,6 % et 0,7 % des cellules étaient des cellules CD11bet microgliales (moyenne et S.D., non montrées).
OCM produit à partir de ces cultures peut être ajouté à 3 DIV aux cultures purifiées de neurones hippocampiques. Ce traitement favorise le regroupement des protéines nodales, composées de canaux Nav associés à la neurofascine 186 et à l’ankyrine G le long de l’axone des neurones GABAergic hippocampal avant la myélinisation, à 17 DIV (Figure 3A,B). Il convient de noter que les enregistrements électrophysiologiques ont révélé que ces grappes sont associées à une conduction accrue des potentiels d’action14. En outre, l’expression de la protéine de filament intermédiaire phosphorylé H souillé e par Smi31 est augmentée dans les neurones hippocampaux traités par LCM(figure 3A). Les facteurs sécrétés oligodendroglial sont donc impliqués dans la maturation neuronale et la physiologie.
La myélinisation des neurones hippocampiques peut être étudiée par l’ajout de l’OL à 14 DIV. De 20 DIV à 24 DIV, l’immunostaining des marqueurs de myéline, comme la protéine de base de myéline (MBP) permet la visualisation des segments de myéline (figure 4).
Figure 1 : Chronologie du protocole de l’isolement des cellules de lignée OL et de la production d’OCM. Après avoir disséqué les cortices cérébraux des rats P2 Wistar (étape 4), effectuer la dissociation des tissus aux cellules gliales de la culture (étape 5). À 8, 12 et 15 DIV (c.-à-d., jours avant de secouer), renouveler la moitié moyenne avec chaud DMEM-10% FCS (étape 6). Le lendemain, secouez les cultures gliales pendant la nuit à 250 tr/min à 37 oC (étape 7.2). Récolte supernatant contenant des cellules de lignée d’OL et quelques cellules de microglies et la plaque pendant 15 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2 (étapes 8,3 à 8,7). Centrifuger le supernatant pendant 5 min à 423 x g,resuspendre le granule cellulaire avec BS et incuber pendant 2 jours dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2 (étapes 8,8 à 8,12). Pour produire de l’OCM, incuber pendant 2 jours à NB-B27low (étape 9). Pour isoler les OL pour les expériences de co-culture, détachez les cellules à l’aide de la trypsine (étape 11.3). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Phénotype des cellules de lignée d’OL dans les cultures. Des images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal. Les projections d’intensité maximale sont présentées. (A) Les cultures oL contiennent principalement des pré-OL (c.-à-d. n’exprimant que ng2 (rouge), ou les deux O4 (vert) et NG2 (rouge); les cellules exprimant les deux marqueurs sont indiquées avec des étoiles jaunes), mais aussi quelques OL immatures (c.-à-d., exprimant seulement O4 et non NG2 ; étoiles blanches). (B) Peu d’OL matures (c.-à-d. PLPetvert) et peu d’astrocytes (GFAPet cellules, rouge) se trouvent dans les cultures cellulaires de lignée sl. Barres d’échelle de 25 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Demandes représentatives. (A,B) Neurones hippocampiques traités avec OCM à 3 DIV et fixés à 17 DIV express protéine de filament intermédiaire au phosphorylé H (Smi31; vert; panneau A). Les neurones GABAergic, identifiés par l’isoforme de carbboxylase de glutamate de 67 kDa (GAD67) expression (blanc), affichent l’accumulation des canaux d’ankyrin Ekyrin G et de Nav sodium (rouge; panneaux A et B, respectivement) au segment initial d’axon et forment des clusters Ankyrin G et Nav le long de leurs axons (panneaux A et B, respectivement). Barres d’échelle de 25 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Demandes représentatives. Les cellules de lignée d’OL ont ajouté à la culture hippocampal de neurone à 14 DIV myelinate quelques axones hippocampal, ici fixés à 23 DIV (MBP comme marqueur de myéline ; vert). Des nœuds de Ranvier (Nav; rouge) sont observés entre les segments de myéline. Barre d’échelle de 25 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Bottenstein-Sato (BS) médias | Concentration finale |
| Moyen d’aigle modifié de Dulbecco | |
| Pénicilline-Streptomycine | 100 UI/mL |
| apo-Transferrin humain | 100 g/mL |
| BSA (Albumin e du sérum bovin) | 100 g/mL |
| Insuline | 5 g/mL |
| PDGF (EN) | 10 ng/mL |
| Progestérone | 62 ng/mL |
| Dihydrochlorure de putrescine | 16 g/mL |
| Sélénite de sodium | 40 ng/mL |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium sel) | 30 ng/mL |
| T4 (L-Thyroxine) | 40 ng/mL |
Tableau 1 : Préparation des médias Bottenstein-Sato (BS).
| NB-B27 médias bas | Concentration finale |
| Neurobasal (Neurobasal) | |
| Supplément B27 | 0,5x (en) |
| L-glutamine | 0,5 mm |
| Pénicilline-Streptomycine | 100 UI/mL |
| Nb-B27 médias | Concentration finale |
| Neurobasal (Neurobasal) | |
| Supplément B27 | 1x 1x |
| L-glutamine | 0,5 mm |
| Pénicilline-Streptomycine | 100 UI/mL |
Tableau 2 : Préparation des médias NB-B27low et NB-B27.
| Médias de co-culture | Concentration finale |
| Moyen d’aigle modifié de Dulbecco | 1 vol |
| Neurobasal (Neurobasal) | 1 vol |
| Supplément B27 | 1x 1x |
| Pénicilline-Streptomycine | 100 UI/mL |
| apo-Transferrin humain | 50 g/mL |
| Biotine | 10 ng/mL |
| BSA (Albumin e du sérum bovin) | 50 g/mL |
| Ceruloplasmin (Ceruloplasmin) | 100 ng/mL |
| Hydrocortisone | 0,05 M |
| Insuline | 5 g/mL |
| N-Acetyl-L-cystéine | 5 g/mL |
| Progestérone | 6,2 ng/mL |
| Putrescine Putrescine | 16 g/mL |
| CNTF humain recombinant | 0,1 ng/mL |
| Sélénite de sodium | 5 ng/mL |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium sel) | 40 ng/mL |
| Vitamine B12 | 27,2 ng/mL |
Tableau 3 : Préparation des médias de co-culture.
Dossier supplémentaire 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).
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Discussion
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour obtenir des cultures cellulaires oligodendroglial hautement enrichies de cellules de lignée de glial, adapté d’une méthode précédemment éditée16, et la production suivante du milieu OL-conditionné. Cette technique de secousse n’est pas coûteuse, peut être répétée trois fois et est optimale pour obtenir une grande quantité d’OL purifiés, comme les cellules cultivées dans Bottenstein-Sato (BS) milieu contenant PDGF prolifèrent. Les cellules gliales sont préparées à l’aide de cortices cérébraux de rats Wistar à P2, un point de temps où une grande majorité des cellules de lignée oligodendroglial sont des pré-oligodendrocytes exprimant NG2 et O415. Il convient de noter que la maturation de la lignée des OL est similaire à P2 chez la souris et le rat, et ce protocole peut également être utilisé pour isoler les pré-oligodendrocytes de souris17.
Après avoir secoué les cultures mixtes des cellules gliales, les cellules détachées se composent principalement de cellules de lignée oligodendroglial, mais aussi de cellules microgliales et de quelques astrocytes. Les cellules microgliales sont enlevées par adhérence différentielle sur les plats Petri non couchés. Il convient de noter que l’efficacité de l’élimination peut être améliorée en effectuant une étape d’adhérence supplémentaire. Cependant, environ 5% des cellules microgliales se trouvent encore dans les cultures cellulaires oligodendroglial enrichies, ainsi que 5% à 9% des astrocytes. Il est possible de réduire la contamination des astrocytes à moins de 5 % en effectuant une étape immuno-panoramique supplémentaire à l’aide de boîtes De Petri recouvertes d’anticorps O4; pour un protocole détaillé voir des informations supplémentaires dans Freeman et al.14. L’enlèvement des débris 2 h après le placage des cellules oligodendroglial est une étape critique, qui repose sur la force du flux appliqué avec la tuyauterie. À cette étape, il est important d’examiner la culture au microscope avant et après le dégagement pour vérifier l’efficacité que la présence de trop de débris peut nuire à la viabilité et à la croissance cellulaires. Il est également important d’utiliser un milieu BS fraîchement fait, sinon il pourrait altérer la survie des oligodendrocytes. En outre, les cellules purifiées ne survivent que jusqu’à 6 jours après le placage. En effet, on sait que d’autres cellules gliales et neurones favorisent la survie et la prolifération du CPVP ou la différenciation par des facteurs sécrétés ou des contacts directs2,18.
D’autres méthodes permettent l’isolement des OL immédiatement après la dissociation du cerveau, en utilisant l’immunoétiquetage avec l’anticorps O4 suivi d’un tri cellulaire activé par fluorescent par cytométrie du débit (FACS) ou tri cellulaire à activation magnétique (MACS). En outre, les CPVP positifs au GFP ou les oligodendrocytes gFP-positifs peuvent être purifiés par le tri des cellules fluorescentes à partir de souris PDGF-R:GFP ou PLP:GFP, respectivement19,20. Ces méthodes de tri sont plus pertinentes pour l’étude de l’état physiologique des oligodendrocytes par rapport aux cultures traitées avec des facteurs de croissance qui pourraient altérer leur phénotype. Notamment, le tri des cellules fluorescentes a été utilisé pour les approches de profilage génétique dans l’état physiologique normal et les conditions démyélinisantes21. Comme la survie cellulaire pourrait être altérée par le tri cellulaire, il est préférable d’effectuer des analyses fonctionnelles immédiatement après le tri.
Nous avons montré que les cultures d’OL peuvent être détachées et ajoutées aux cultures purifiées de neurones hippocampiques à 14 DIV. Une telle co-culture OL-neuron permet l’étude des premières étapes de la myélinisation qui commence au cours de la première semaine de co-culture (Dubessy, résultats inédits). D’autres modèles de neurone oL-hippocampal myélinisant co-culture ont été atteints en ajoutant oligodendrocytes immédiatement après le tri22,23. En outre, nous avons produit OCM pour disséquer davantage les interactions OL-neuron et aborder le rôle des facteurs secrets d’OL sur les cultures neuronales. En utilisant cette technique, nous avons démontré que les sous-types de neurones GABAergiques hippocampal (c.-à-d. parvalbuminetinet/ou somatostatine) peuvent former des grappes de protéines nodales le long de leur axone qui sont induites par l’OCM avant la myélinisation14,24. L’analyse de spectrométrie de masse de l’OCM a démêlé plusieurs protéines sécrétées et a mené à identifier le Contactin-1 oligodendroglial qui, en synergie avec les protéines extracellulaires de matrice médier les premières étapes de l’amas nodal24. Les cultures primaires sont des modèles utiles qui permettent l’évaluation de la différenciation des cellules de lignée oligodendroglial et des interactions avec les neurones. Cependant, d’autres approches ont également été développées pour évaluer les fonctions et la myélinisation des Lpo, la démyélinisation et la remyélinisation des cultures de tranches organotypiques ex vivo25,26, et des études in vivo, notamment avec les modèles de poissons zèbres et de têtards27 qui sont nécessaires dans les étapes finales des études précliniques.
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Disclosures
Aucun des auteurs n’a d’intérêts contradictoires ou contradictoires.
Acknowledgments
Les auteurs tient à remercier Rémi Ronzano pour ses sages conseils en édition manuscrite. Ces travaux ont été financés par l’ICM, l’INSERM, la subvention de la fondation ARSEP à NSF et le prix Bouvet-Labruyère.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
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