Summary
Qui, esponiamo un metodo efficiente per la purificazione degli oligodendrociti e la produzione di mezzo con condizioni oligodendrocite che possono essere utilizzati per esperimenti di co-cultura.
Abstract
Nel sistema nervoso centrale, gli oligodendrociti sono ben noti per il loro ruolo nella mielinazione degli assoni, che accelera la propagazione dei potenziali d'azione attraverso la conduzione saltatoria. Inoltre, un numero crescente di rapporti suggeriscono che gli oligodendrociti interagiscono con neuroni oltre la mielinazione, in particolare attraverso la secrezione di fattori solubili. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che consente la purificazione delle cellule di lignaggio oligodolole da colture cellulari gliali contenenti anche astrociti e cellule microgliali. Il metodo si basa sull'agitazione notturna a 37 gradi centigradi, che consente il distacco selettivo delle cellule oliedendrogliali sovrastanti e delle cellule microgliali e l'eliminazione della microglia mediante adesione differenziale. Descriviamo quindi la cultura degli oligodendrociti e la produzione di mezzi condizionati con oligodendrociti (OCM). Forniamo anche la cinetica del trattamento OCM o oligodendrociti aggiunta ai neuroni ippocampali purificati in esperimenti di co-cultura, studiando le interazioni oligodendrocite-neurone.
Introduction
Gli oligodendrociti (OL) sono cellule gliali del sistema nervoso centrale (SNC) che generano mielina avvolgendo gli assoni. Gli OL provengono da cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) che proliferano all'interno delle zone ventricolari del SNC embrionale e poi migrano e si differenziano in OL completamente maturi (cioè cellule formanti mielina)1. Gli OPC sono abbondanti durante lo sviluppo precoce, ma persistono anche nel cervello adulto dove rappresentano la principale popolazione di cellule proliferanti2. Un singolo OL racchiude più assoni multipli in sezioni non eccitabili (ad esempio, internodi) e il bordo di ogni anello mielina si attacca all'assone formando il dominio paranodale che è cruciale per le proprietà isolanti della mielina1,3. Tra i paranodi ci sono piccole lacune non mielinated chiamate nodi di Ranvier. Questi nodi sono ricchi di canali di sodio legati alla tensione (Nav), permettendo la rigenerazione e la rapida propagazione dei potenziali d'azione attraverso la conduzione saltatoria4. Questa interazione stretta consente anche il supporto energetico assonale attraverso l'assorbimento neuronale di lattato da OLs5,6.
La maturazione delle cellule di lignaggio oligodendrogliale e il processo di mielinazione sono strettamente regolati dalle loro interazioni con i neuroni7. Infatti, OL e OPC, chiamati anche cellule NG2, esprimono una serie di recettori per i neurotrasmettitori, e possono ricevere input da neuroni eccitatori e inibitori, permettendo loro di percepire l'attività neuronale che può innescare la loro proliferazione e/o differenziazione nelle cellule mielinanti2. A sua volta, gli OPC/OL secernono microvescicoli e proteine nello spazio extracellulare che da solo o sinergicamente mediano le funzioni neuromodative e neuroprotettive8,9,10,11,12. Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano le molteplici modalità di interazione tra cellule lignee e neuroni oligodendrocliali devono ancora essere completamente decifrati.
Inoltre, in diverse condizioni patologiche del SNC, gli OL sono principalmente colpiti, disturbando così la loro interazione con i neuroni. Ad esempio, nella sclerosi multipla (MS), la disfunzione neurologica è causata dalla demielinazione focale nel SNC, secondaria alla perdita di OLs che può portare a danni assonali e relativo accumulo di disabilità. La remielinazione può avvenire, anche se in misura insufficiente nella maggior parte dei casi13. I progressi compiuti nell'ultimo decennio, dovuti allo sviluppo di immunoterapie, hanno ridotto il tasso di ricaduta, ma la promozione della remielinazione rimane fino ad oggi un bisogno insoddisfatto. Come tale, una migliore comprensione del ruolo, delle funzioni e delle influenze di OLs è di particolare interesse per lo sviluppo di nuove terapie per un ampio spettro di condizioni del SNC.
Qui, descriviamo i metodi di purificazione e cultura oLs. Ciò consente un esame preciso dei meccanismi intrinseci che regolano il loro sviluppo e la biologia. Inoltre, tali colture OLaltamente arricchite permettono la produzione di un mezzo condizionato dagli oligodendrociti (OCM), che può essere aggiunto alle colture neuronali purificate per ottenere informazioni sull'impatto dei fattori secreti di OL sulla fisiologia e la connettività neuronali. Inoltre, descriviamo come implementare un sistema di cocoltura in vitro in cui gli oligodendrociti purificati e i neuroni sono combinati insieme, permettendo di affrontare i meccanismi che regolano (rielinazione.
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Protocol
La cura e l'uso dei ratti in questo esperimento sono conformi alle politiche e agli orientamenti istituzionali (UPMC, INSERM e alla direttiva 86/609/CEE del Consiglio della Comunità europea). Il seguente protocollo è stabilito per una lettiera standard di 12 cuccioli.
1. Preparazione dei flaconi (5 min)
NOTA: Eseguire i seguenti passaggi il giorno prima della dissezione in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Rivestire i flaconi 150 cm2 (T150) con tappo filtrante (1 flacone per 2 cuccioli) utilizzando 5 mL di polietilenimina (PEI, 100 mg/L, vedere protocollo nel file supplementare 1).
- Conservare i flaconi a 4 gradi durante la notte.
- Risciacquare i flaconi rivestiti 3 volte con acqua distillata sterile il giorno della dissezione.
2. Preparazione dei supporti (10 min)
NOTA: Eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Preparare 500 mL di mezzo di coltura, costituito dal mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% del siero di vitello fetale (FCS) e penicillina-streptomycin (100 IU/mL).
- Preparare 20,6 mL del mezzo di digestione enzimatica in un tubo da 50 mL, composto da 20 mL di DMEM, 200 l di DNase (50 g/mL), 200 lofe di papaina (30 U/mL) e 200 l di L-cisteine (0,24 mg/mL).
- Filtrare-sterilizzare il supporto utilizzando un filtro 0,22 m.
- Tenere il supporto nella cappa del flusso laminare a temperatura ambiente (RT) fino alla dissezione.
3. Preparazione per la dissezione (10 min)
NOTA: Eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Preparare 100 mL di salina tampone di fosfato senza calcio e magnesio (PBS; 1x). Filtra-sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
- Preparare 50 mL di soluzione 1x PBS ghiacciata integrata con 750 - L del 45% di glucosio. Filtra-sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
- Riempire un piatto Petri da 100 mm con 1x PBS per strumenti di pulizia e tre piatti Petri da 60 mm con PBS-glucosio ghiacciato per la raccolta dei tessuti. Mettere i piatti di Petri sul ghiaccio fino alla dissezione.
4. Dissezione
NOTA: La dissezione viene eseguita da cuccioli di ratto Wistar maschi e femmine al giorno postnatale (P) 2.
- Al fine di fornire un ambiente sterile, assicurarsi di pulire il banco con 100% etanolo. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con 100% etanolo.
- Spruzzare delicatamente il collo del cucciolo con il 70% di etanolo.
- Utilizzare grandi forbici chirurgiche per decapitare l'animale e posizionare la testa in una parabola Petri da 100 mm contenente PBS-glucosio ghiacciato.
- Utilizzare pinze curve per mantenere la testa dell'animale a livello degli occhi. Utilizzare piccole forbici chirurgiche per fare una piccola incisione alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la linea mediana del cervello.
- Utilizzare pinze per staccare delicatamente le due parti del cranio dalla linea mediana.
- Utilizzare un piccolo cucchiaio chirurgico per rimuovere il cervello dalla cavità della testa. Mettere il cervello in una teglia Petri da 60 mm contenente PBS-glucosio ghiacciato sul ghiaccio.
- Osservando sotto uno steromicroscopio, utilizzare pinze sottili per rimuovere il cervelletto, il tronco encefalico e bulbi olfattivi dagli emisferi cerebrali.
- Utilizzare le pinze sottili per separare i due emisferi cerebrali. Utilizzare le pinze sottili per staccare le meningi. Mettere le cortice cerebrali in una piastra di petri da 60 mm sul ghiaccio.
NOTA: PBS ghiacciato è fondamentale per la corretta rimozione delle meningi.
5. Dissociazione dei tessuti
NOTA: Eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Utilizzare un bisturi affilato per tritare finemente le cortice cerebrali. Trasferire il tessuto macinato in un tubo da 50 mL contenente un mezzo di digestione enzimatica.
- Incubare per 30 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
- Utilizzare una micropipetta p1000 per rimuovere delicatamente il mezzo di digestione enzimatica assicurandosi che il tessuto corticale rimanga nella parte inferiore del tubo da 50 mL.
- Utilizzare una micropipetta p1000 per aggiungere 1 mL di DMEM-10% FCS e triturare delicatamente il tessuto.
- Utilizzare un filtro da 70 m e un pistone di una siringa da 1 mL per filtrare il tessuto corticale in un tubo da 50 mL.
NOTA: Si può risciacquare il tessuto residuo sulla parete della camera d'aria più volte con DMEM-10% FCS. - Riempire il tubo da 50 mL con DMEM-10%FCS. Centrifuga a 423 x g per 5 min a RT. Rimuovere con attenzione il pellet cellulare supernatante e resospendere cellulare con 2 mL di DMEM-10%FCS.
- Triturare delicatamente il pellet cellulare con una micropipetta p1000 e poi con una micropipetta p200. Diluire la sospensione cellulare con il volume appropriato di DMEM-10%FCS.
NOTA: Due cervelli: un T150 e 5 mL di DMEM-10%FCS. - Piastra 5 mL della sospensione cellulare su un T150 ad una densità di 1 x 105 celle / cm2. Aggiungere 20 mL di dMEM-10%FCS caldo a ogni T150. Incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi sotto il 5% di CO2.
- Rinnovare metà del mezzo di coltura dopo 6 giorni in vitro (DIV) con caldo DMEM-10%FCS.
6. Preparazione agitazione
- Eseguire la preparazione agitazione il giorno prima di agitare in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Rinnovare metà del mezzo di coltura aggiungendo fresco mezzo di coltura calda nel pallone e incubare a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
7. Scuotere
- Cappotto tre piatti Petri da 100 mm con PEI. Conservarli a 4 gradi durante la notte.
- Coprire il tappo delle fiasche con pellicola paraffina e mettere i flaconi in un sacchetto di plastica. Agitare flaconi contenenti cellule gliali durante la notte a 250 giri/min a 37 gradi centigradi.
NOTA: La prima agitazione viene eseguita a 8 DIV e si può eseguire fino a tre diversi agitazioni (vedere Figura 1 per la temporizzazione).
8. Raccolta e coltura di cellule di lignaggio OL
NOTA: Questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Il giorno dopo aver tremato, preparare Bottenstein-Sato (BS) medio secondo la tabella 1.
- Risciacquare i piatti Petri rivestiti 3 volte con acqua distillata sterile.
- Il supernatante dei flaconi di raccolta contiene principalmente cellule di lignaggio OL, ma anche alcune cellule microgliali e la piastra su piatti Petri da 100 mm non rivestiti.
NOTA: Questa fase consente la rimozione delle cellule microgliali attraverso l'adesione rapida differenziale sulla superficie del piatto. - Incubare i piatti Petri per 15 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
- Riempire ogni pallone T150 con 25 mL di mezzo di coltura calda appena preparato e incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 fino al secondo scuotimento.
- Trasferire il supernatante dai piatti Petri in nuovi piatti Petri non rivestiti da 100 mm per consentire l'adesione delle cellule microgliali residue.
- Incubare i piatti Petri per 15 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
- Rimuovere il supernatante, che contiene celle di lignaggio OL non aderenti, e trasferirlo in tubi da 50 mL (supernatante da 2 piatti Petri per un tubo da 50 mL). Scartare piatti Petri placcati con microglia.
- Centrifugare il supernatante per 5 min a 423 x g. Rimuovere con attenzione il pellet cellulare supernatante e resospendere il pellet cellulare con 1 mL di mezzo BS. Mettere in comune tutti i pellet in un tubo comune da 50 mL e regolare il volume a 10 mL con mezzo BS.
- Determinare le cellule di conteggio della densità delle cellule al microscopio.
NOTA: È necessario ottenere una densità di cella compresa tra 3 x 105/mL e 5 x 105/mL. - Aggiungere 20 mL di BS se la densità cellulare è maggiore o uguale a 4 x 105/mL per ottenere un volume finale di 30 mL, oppure aggiungere solo 10 mL di BS se la densità cellulare è minore di 4 x 105/mL per ottenere un volume finale di 20 mL.
- Piatto due o tre pre-rivestito 100 mm Petri piatti con 10 mL di sospensione cellulare. Incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi sotto il 5% di CO2.
- Eliminare i detriti dai piatti Petri rinfrescando tutto il BS medio 2 h più tardi.
NOTA: Esaminare la coltura al microscopio prima e dopo la compensazione per verificare la densità cellulare e l'efficienza della rimozione dei detriti. - Incubare per 2 giorni in mezzo BS in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
NOTA: Esaminare la coltura al microscopio. La confluenza dovrebbe essere dal 70% all'80%.
9. Produzione OCM
NOTA: Eseguire questi passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Preparare NB-B27basso medio secondo la tabella 2.
- Renew coltur medium con 10 mL di medio caldo NB-B27low. Incubare per 2 giorni in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
- Raccogliere l'OCM, cioè, supernatali contenenti fattori secreti OL. Filtra-sterilizzare OCM utilizzando un filtro da 0,22 m.
NOTA: Conservare OCM a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 mesi.
10. Aggiunta OCM
NOTA: I passi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. L'OCM può essere aggiunto alle colture neuronali ippocampali purificate preparate secondo il seguente protocollo14e ottenute aggiungendo, 24 h dopo l'isolamento, gli agenti anti-mitotici uridina e 5- fluorodeoxyuridina (5 M) per 36 h.
- A 3 DIV, rimuovere tutto il mezzo di coltura del neurone contenente agenti anti-mitotici e aggiungere 500 - L di OCM caldo fresco.
- Rinnovare metà del mezzo ogni 3 giorni con NB-B27 caldo appena fatto.
NOTA: Tali impostazioni cultura possono essere mantenute fino a 21 DIV.
11. Aggiunta di OL alla coltura neuronaca ippocampale purificata
NOTA: eseguire i seguenti passaggi in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Gli OL possono essere aggiunti alle colture ippocampali purificate ottenute nello stesso modo descritto in precedenza.
- Preparare il mezzo di cocoltura secondo la tabella 3.
- Recuperare la cultura OL a 70% a 80% confluenza. Risciacquare con 2 mL di caldo 1x PBS.
- Per staccare le cellule, aggiungere 2 mL di 0,25% di prova in un piatto Petri da 100 mm.
- Incubare per 5 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2.
- Aggiungere 2 mL di DMEM-10% FCS per bloccare la reazione enzimatica. Raccogliere il super-atali contenente cellule di lignaggio OL.
- Centrifuga a 423 x g per 5 min a RT. Rimuovere con attenzione il supernatante e riattendere il pellet cellulare in mezzo di co-coltura caldo per ottenere una concentrazione di 1,25 x 105 cellule / mL.
- Aggiungere OL alla coltura di neuroni ippocampali purificati rimuovendo 200 gradi l di coltura neuronale medio e aggiungendo 200 l di sospensione cellulare per pozzo (2,5 x 104 cellule/pozzo) di una piastra di 24 pozzetti.
- Aggiorna metà del mezzo di co-cultura ogni 2-3 giorni.
NOTA: le coculture possono essere mantenute fino a 24 DIV.
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Representative Results
In questo protocollo, le cellule di lignaggio OL vengono purificate dalle colture gliali scrollandosi di dosso gli astrociti e microglia. La purezza e l'esame fenotipica delle colture OL possono essere valutati immunostaining con marcatori gliali15. L'analisi dell'espressione di diversi marcatori ha indicato che le colture OL erano per lo più pre-OL con il 90% diO4 - cellule, 85% - 7% NG2, cellule, e 4.7% - 2,1% di PLP- cellule, mentre 7.2% - 2.5% delle cellule erano GFAP- astrociti (media - S.D., n - 3; figura 2). Inoltre, il 4,6% - 0,7% delle cellule era CD11b- cellule microgliali (media - S.D., non mostrato).
OCM prodotto da tali colture può essere aggiunto a 3 DIV alle colture neuronali ippocampali purificati. Questo trattamento promuove il raggruppamento di proteine nodali, costituite da canali Nav associati a Neurofascin 186 e Ankyrin G lungo l'assone dei neuroni GABAergichi ippocampali prima della mielinizzazione, a 17 DIV (Figura 3A,B). Da notare che le registrazioni elettrofisiologiche hanno rivelato che questi ammassi sono associati a una maggiore conduzione dei potenziali di azione14. Inoltre, l'espressione della proteina del filamento intermedio al fosfolato H macchiata da Smi31 è aumentata nei neuroni ippocampali trattati con OCM (Figura 3A). I fattori oligodendrocli al tempo secreti sono quindi implicati nella maturazione neuronale e nella fisiologia.
La mielinizzazione dei neuroni ippocampali può essere studiata attraverso l'aggiunta di OL a 14 DIV. Da 20 DIV a 24 DIV, l'immunostaining dei marcatori mielina, come la proteina di base della mielina (MBP) consente la visualizzazione dei segmenti di mielina (Figura 4).
Figura 1: sequenza temporale del protocollo dell'isolamento delle celle di derivazione OL e della produzione OCM. Dopo aver sezionato cortice cerebrali da ratti P2 Wistar (passaggio 4), eseguire la dissociazione dei tessuti alle cellule liali di coltura (passaggio 5). A 8, 12 e 15 DIV (cioè, giorni prima di agitare), rinnovare metà media con caldo DMEM-10% FCS (passaggio 6). Il giorno successivo, scuotere le colture gliali durante la notte a 250 rpm a 37 gradi centigradi (passaggio 7.2). Supernatante di raccolta contenente cellule di lignaggio OL e poche cellule di microglia e la piastra per 15 min in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi sotto il 5% di CO2 (passaggi da 8,3 a 8,7). Centrifugare il supernatante per 5 min a 423 x g, risospendere il pellet cellulare con BS e incubare per 2 giorni in un'incubatrice umidificata a 37 s C sotto il 5% DI CO2 (passaggi da 8,8 a 8,12). Per produrre OCM, incubare per 2 giorni in NB-B27low (passaggio 9). Per isolare gli OL per gli esperimenti di cocoltura, staccare la cella usando trypsin (passaggio 11.3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: fenotipo delle cellule di lignaggio OL nelle colture. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale. Vengono presentate proiezioni di intensità massima. (A) Le colture OL contengono per lo più oL pre-OL (cioè esprimendo solo NG2 (rosso), o entrambi O4 (verde) e NG2 (rosso); le cellule che esprimono entrambi i marcatori sono indicate con stelle gialle), ma anche alcuni OL immaturi (cioè, che esprimono solo O4 e non NG2; stelle bianche). (B) Nelle colture delle cellule di lignaggio OL si trovano pochi OL maturi (ad es.PLP;; verde) e pochi astrociti (GFAPe celle; rosso). Barre di scala : 25 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Applicazioni rappresentative. (A,B) I neuroni ippocampali trattati con OCM a 3 DIV e fissati a 17 DIV espresso proteina di filamento intermedio H (Smi31; verde; pannello A). I neuroni GABAergici, identificati dalla decarboxylase del glutammato isoforma di 67 kDa (GAD67) espressione (bianco), mostrano l'accumulo di Ankyrin G e Nav sodio canali (rosso; pannelli A e B, rispettivamente) al segmento iniziale dell'assone e formano gruppi di Ankyrin G e Nav lungo il loro assone (pannelli A e B, rispettivamente). Barre di scala : 25 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Applicazioni rappresentative. Cellule di lignaggio OL aggiunto alla coltura del neurone ippocampale a 14 DIV mielinate alcuni assoni ippocampali, qui fissato a 23 DIV (MBP come un marcatore di mielina; verde). I nodi di Ranvier (Nav; rosso) sono osservati tra i segmenti di mielina. Barra di scala : 25 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Supporti Bottenstein-Sato (BS) | Concentrazione finale |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillina-Streptomicina | 100 IU/mL |
| apo-Transferrin umano | 100 g/mL |
| BSA (Albumin del siero bovino) | 100 g/mL |
| Insulina | 5 g/mL |
| Pdgf | 10 ng/mL |
| Progesterone | 62 ng/mL |
| Diidrocloruro di putrescina | 16 g/mL |
| Selenite di sodio | 40 ng/mL |
| T3 (sale di sodio 3,3',5-Triiodo-L-tironano) | 30 ng/mL |
| T4 (L-Tiroxina) | 40 ng/mL |
Tabella 1: Preparazione dei supporti Bottenstein-Sato (BS).
| NB-B27 basso supporto | Concentrazione finale |
| Neurobasal | |
| Supplemento B27 | 0,5x |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicillina-Streptomicina | 100 IU/mL |
| Supporti NB-B27 | Concentrazione finale |
| Neurobasal | |
| Supplemento B27 | 1x (in modo non il |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicillina-Streptomicina | 100 IU/mL |
Tabella 2: Preparazione dei supporti NB-B27low e NB-B27.
| Media di cocultura | Concentrazione finale |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | 1 vol |
| Neurobasal | 1 vol |
| Supplemento B27 | 1x (in modo non il |
| Penicillina-Streptomicina | 100 IU/mL |
| apo-Transferrin umano | 50 g/mL |
| Biotina | 10 ng/mL |
| BSA (Albumin del siero bovino) | 50 g/mL |
| Ceruloplasmina | 100 ng/mL |
| Idrocortisone | 0,05 M |
| Insulina | 5 g/mL |
| N-Acetilo-L-cysteine | 5 g/mL |
| Progesterone | 6.2 ng/mL |
| Putrescina | 16 g/mL |
| CNTF umano ricombinante | 0.1 ng/mL |
| Selenite di sodio | 5 ng/mL |
| T3 (sale di sodio 3,3',5-Triiodo-L-tironano) | 40 ng/mL |
| Vitamina B12 | 27,2 ng/mL |
Tabella 3: Preparazione dei mezzi di comunicazione di cocultura.
File supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per ottenere impostazioni cellulari l'oligodendrogliale altamente arricchite da colture gliali miste, adattate da un metodo pubblicato in precedenza16,e la successiva produzione di mezzo condizionato da OL. Questa tecnica di agitazione non è costosa, può essere ripetuta tre volte ed è ottimale per ottenere un'elevata quantità di OL purificati, come le cellule coltivate in Bottenstein-Sato (BS) proliferano PDGF. Le cellule gliali sono preparate utilizzando cortice cerebrali di ratti Wistar a P2, un punto temporale in cui la stragrande maggioranza delle cellule di lignaggio oligodendrocliali sono pre-oligodendrociti che esprimono NG2 e O415. Da notare che la maturazione del lignaggio OL è simile alla P2 nel topo e nel ratto, e questo protocollo può essere utilizzato anche per isolare i pre-oligodendrociti del topo17.
Dopo aver agitato le colture miste di cellule gliali, le cellule distaccate sono costituite principalmente da cellule ligneee, ma anche da alcune cellule microgliali e da pochi astrociti. Le cellule microgliali vengono rimosse attraverso l'adesione differenziale ai piatti Petri non rivestiti. Da notare che l'efficienza di rimozione può essere migliorata eseguendo un ulteriore passo di adesione. Tuttavia, circa il 5% delle cellule microgliali si trova ancora nelle colture cellulari oligodendroce arricchite, così come dal 5% al 9% degli astrociti. È possibile ridurre la contaminazione da astrociti a meno del 5% eseguendo un'ulteriore fase immuno-panning utilizzando piatti Petri rivestiti di anticorpi O4; per un protocollo dettagliato vedere informazioni supplementari in Freeman etal. La rimozione dei detriti 2 h dopo la placcatura delle cellule oliedendrogliali è un passo critico, che si basa sulla forza del flusso applicato con il pipet. In questa fase, è importante esaminare la coltura al microscopio prima e dopo la compensazione per verificare l'efficienza in quanto la presenza di troppi detriti può compromettere la vitalità e la crescita delle cellule. Da notare, è anche importante utilizzare il mezzo BS appena fatto, altrimenti potrebbe alterare la sopravvivenza degli oligodendrociti. Inoltre, le cellule purificate sopravvivono solo fino a 6 giorni dopo la placcatura. Infatti, è noto che altre cellule gliali e neuroni promuovono la sopravvivenza e la proliferazione OPC o la differenziazione attraverso fattori secreti o contatti diretti2,18.
Altri metodi consentono l'isolamento degli OL immediatamente dopo la dissociazione cerebrale, utilizzando l'immunolabelling con anticorpo O4 seguito dallo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza per citometria di flusso (FACS) o dallo smistamento delle cellule magnetiche (MACS). Inoltre, gli OPC positivi alla GFP o gli oligodendrociti GFP positivi possono essere purificati mediante lo smistamento di cellule attivate da fluorescenza dai topi PDGFR:GFP o PLP:GFP, rispettivamente19,20. Questi metodi di selezione sono più rilevanti per studiare lo stato fisiologico degli oligodendrociti rispetto alle colture trattate con fattori di crescita che potrebbero alterare il loro fenotipo. In particolare, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescente è stato utilizzato per approcci di profilazione genica nello stato fisiologico normale e nelle condizioni demielinanti21. Poiché la sopravvivenza delle cellule potrebbe essere alterata dallo smistamento cellulare, è meglio eseguire saggi funzionali immediatamente dopo l'ordinamento.
Abbiamo dimostrato che le colture OL possono essere staccate e aggiunte alle colture neuronali ippocampali purificate a 14 DIV. Tale co-cultura OL-neurone consente lo studio dei primi passi della mielinazione che inizia durante la prima settimana di co-cultura (Dubessy, risultati inediti). Altri modelli di co-cultura mielinatodelo oL-ippocampale sono stati raggiunti aggiungendo oligodendrociti immediatamente dopo lo smistamento22,23. Inoltre, abbiamo prodotto OCM per sezionare ulteriormente le interazioni OL-neurone e affrontare il ruolo dei fattori secreti OL sulle colture neuronali. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato che i sottotipi di neuroni gabAergici gabaergici ippocampali (cioè parvalbumina e/o somatostatina ) possono formare cluster di proteine nodali lungo il loro assone che sono indotte da OCM prima della mielinizzazione14, 24. L'analisi della spettrometria di massa di OCM ha svelato diverse proteine secrete e ha portato a identificare l'oligodolo contatto Contatto in 1 che, in sinergia con le proteine della matrice extracellulare, media i primi passi del clusteringnodale 24. Le colture primarie sono modelli utili che consentono la valutazione della differenziazione delle cellule di lignaggio oligodrolo e delle interazioni con i neuroni. Tuttavia, sono stati sviluppati anche altri approcci per valutare le funzioni OL e la mielinizzazione, la demielinizzazione e la remielinizzazione da colture organotipiche di cerebellar ex vivo25,26, e studi in vivo, in particolare con i modelli di pesce zebra e tadpole27 che sono necessari nelle fasi finali degli studi preclinici.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha interessi contraddittori o interessi contrastanti.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Rémi Ronzano per i suoi saggi consigli nel montaggio di manoscritti. Questo lavoro è stato finanziato da ICM, INSERM, sovvenzione della fondazione ARSEP per NSF e Bouvet-Labruyère price.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
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