Summary
Her viser vi en effektiv metode for rensing av oligodendrocytes og produksjon av oligodendrocyte-betinget medium som kan brukes til co-kultur eksperimenter.
Abstract
I sentralnervesystemet er oligodendrocytes kjent for sin rolle i aksonmyelinasjon, som akselererer forplantningen av handlingspotensialer gjennom saltatorisk ledning. Videre tyder et økende antall rapporter på at oligodendrocytes samhandler med nevroner utover myelinisering, spesielt gjennom sekresjon av løselige faktorer. Her presenterer vi en detaljert protokoll som tillater rensing av oligodendroglial avstamningceller fra glialcellekulturer som også inneholder astrocytter og mikroglialceller. Metoden er avhengig av at natten rister ved 37 °C, noe som gjør det mulig å selektiv løsrivelse av de overliggende oligodendroglialcellene og mikroglialceller, og eliminering av mikroglia ved differensial ved hedhesjon. Vi beskriver deretter kulturen til oligodendrocytes og produksjon av oligodendrocyte-betinget medium (OCM). Vi gir også kinetikken til OCM-behandling eller oligodendrocytes tillegg til renset hippocampal nevroner i co-kultur eksperimenter, studere oligodendrocyte-neuron interaksjoner.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) er glial celler i sentralnervesystemet (CNS) som genererer myelin innpakning rundt aksoner. OLs stammer fra oligodendrocyte forløperceller (OPCs) som sprer seg innenfor ventrikulære soner av embryonale CNS og deretter migrere og differensiere til fullt modne OLs (dvs. myelindannende celler)1. OPCs er rikelig under tidlig utvikling, men også vedvarer i den voksne hjernen hvor de representerer den store proliferative cellepopulasjonen2. En enkelt OL omslutter flere aksoner i ikke-spennende seksjoner (dvs. internoder), og kanten av hver myelinsløyfe festes til aksonen som danner paranodaldomenet som er avgjørende for de isolerende egenskapene til myelin1,3. Mellom paranodene er små umyelinerte hull kalt noder av Ranvier. Disse nodene er rike på spenningsinngjerdede natriumkanaler (Nav), slik at regenerering og rask forplantning av handlingspotensialer gjennom saltatorisk ledning4. Denne tette interaksjonen muliggjør også axonal energistøtte gjennom nevronal opptak av laktat fra OLs5,6.
Modningen av oligodendroglial avstamning celler og myelinisering sprosessen er tett regulert av deres interaksjoner med nevroner7. Faktisk, OLs og OPCs, også kalt NG2 celler, uttrykke en rekke reseptorer for nevrotransmittere, og kan motta innspill fra spennende og hemmende nevroner, slik at de kan føle nevronal aktivitet som kan utløse deres spredning og / eller differensiering i myeliniserende celler2. I sin tur utskiller OPCer / OLs mikrovesikler og proteiner inn i det ekstracellulære rommet som alene eller synergististisk medierer nevromodulative og nevrobeskyttende funksjoner8,9,10,11,12. Imidlertid er de molekylære mekanismene som kontrollerer flere moduser for interaksjoner mellom oligodendroglial avstamningceller og nevroner ennå ikke fullstendig dechiffrert.
Videre, i flere CNS patologiske forhold, påvirkes OLs først og fremst, og forstyrrer dermed deres interaksjon med nevroner. For eksempel, i multippel sklerose (MS), er nevrologisk dysfunksjon forårsaket av fokal demyelinasjon i CNS, sekundært til OLs tap som kan føre til aksonal skade og relatert uførhet akkumulering. Remyelinasjon kan finne sted, om enn utilstrekkelig i de fleste tilfeller13. Fremgang i det siste tiåret, på grunn av utviklingen av immunterapier, har redusert tilbakefallsraten, men fremme remyelinasjon forblir til dags dato et udekket behov. Som sådan er en bedre forståelse av OLs rolle, funksjoner og påvirkninger av særlig interesse for utvikling av nye terapier for et bredt spekter av CNS-forhold.
Her beskriver vi metodene for OLs rensing og kultur. Dette muliggjør presis undersøkelse av iboende mekanismer som regulerer deres utvikling og biologi. I tillegg tillater slike svært berikede OLs kulturer produksjonen av oligodendrocyte-betinget medium (OCM), som kan legges til rensede nevronkulturer for å få innsikt i virkningen av OLs-utskillede faktorer på nevronal fysiologi og tilkobling. Videre beskriver vi hvordan man implementerer et in vitro co-kultursystem der rensede oligodendrocytes og nevroner kombineres sammen, slik at de kan håndtere mekanismene som regulerer (re)myelinasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Omsorg og bruk av rotter i dette eksperimentet er i samsvar med institusjonelle retningslinjer og retningslinjer (UPMC, INSERM og European Community Council Directive 86/609/EEC). Følgende protokoll er etablert for et standard kull på 12 valper.
1. Utarbeidelse av kolber (~ 5 min)
MERK: Utfør følgende trinn dagen før disseksjon i lamimerstrømningshette under sterile forhold.
- Coat 150 cm2 kolber (T150) med filtercap (1 kolbe for 2 valper) ved hjelp av 5 ml polyetylenimin (PEI, 100 mg / L, se protokollen i supplerende fil 1).
- Oppbevar flaskene ved 4 °C over natten.
- Skyll belagte flasker 3 ganger med sterilt destillert vann på disseksjonsdagen.
2. Utarbeidelse av medier (~ 10 min)
MERK: Utfør trinnene i en lamimerstrømningshette under sterile forhold.
- Forbered 500 ml kulturmedium, bestående av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplert med 10% av føtal kalv serum (FCS) og penicillin-streptomycin (100 IE / ml).
- Forbered 20,6 ml av fordøyelsesmediet med en zym i et 50 ml rør, bestående av 20 ml DMEM, 200 μL DNase (50 μg/ml), 200 μL papain (30 U/ml) og 200 μL L-cystein (0,24 mg/ml).
- Filtersteriliser mediet med et 0,22 μm filter.
- Oppbevar mediet i laminarstrømningshetten ved romtemperatur (RT) til disseksjon.
3. Forberedelse til disseksjon (~ 10 min)
MERK: Utfør trinnene i en lamimerstrømningshette under sterile forhold.
- Forbered 100 ml fosfatbufret saltvann uten kalsium og magnesium (PBS; 1x). Filtersteriliser ved hjelp av et 0,22 μm filter.
- Forbered 50 ml iskald 1x PBS-løsning supplert med 750 μL med 45 % glukose. Filtersteriliser ved hjelp av et 0,22 μm filter.
- Fyll en 100 mm Petriskål med 1x PBS for rengjøringsinstrumenter og tre 60 mm Petri-retter med iskald PBS-glukose for vevshøsting. Sett petriskålene på is til disseksjon.
4. Disseksjon
MERK: Disseksjon utføres fra mannlige og kvinnelige Wistar rottevalper på postnatal dag (P) 2.
- For å gi et sterilt miljø, sørg for å rengjøre benken med 100% etanol. Steriliser alle kirurgiske verktøy med 100% etanol.
- Spray forsiktig halsen på valpen med 70% etanol.
- Bruk stor kirurgisk saks til å halshugge dyret og legg hodet i en 100 mm Petri-tallerken som inneholder iskald PBS-glukose.
- Bruk buede tang for å opprettholde dyrets hode i øyehøyde. Bruk liten kirurgisk saks for å lage et lite snitt ved foten av skallen og kutt skallen etter hjernens midtlinje.
- Bruk tang til å forsiktig skrelle av de to delene av skallen fra midtlinjen.
- Bruk en liten kirurgisk skje for å fjerne hjernen fra hodehulen. Sett hjernen i en 60 mm Petri-tallerken som inneholder iskald PBS-glukose på is.
- Visning under et steromikroskop, bruk fine tang for å fjerne lillehjernen, hjernestammen og olfaktoriske pærer fra cerebrale halvkuler.
- Bruk fine tang for å skille de to cerebrale halvkulene. Bruk fine tang til å skrelle av meningene. Sett cerebrale kortices i en 60 mm petriskål på is.
MERK: Iskald PBS er avgjørende for korrekt fjerning av meninger.
5. Vevsdissosiasjon
MERK: Utfør trinnene i en lamimerstrømningshette under sterile forhold.
- Bruk en skarp skalpell til å finhakke hjernekortisene. Overfør hakket vev til et 50 ml rør som inneholder enzym fordøyelsesmedium.
- Inkuber i 30 min i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2.
- Bruk en p1000 mikropipette for å fjerne fordøyelsesmediet på enzymet forsiktig samtidig som det kortikale vevet forblir på bunnen av 50 ml røret.
- Bruk en p1000 mikropipette for å legge til 1 ml DMEM-10% FCS og triturate vevet forsiktig.
- Bruk et 70 μm filter og et stempel på en 1 ml sprøyte for å filtrere kortikale vev i et 50 ml rør.
MERK: Man kan skylle gjenværende vev på den indre rørveggen flere ganger med DMEM-10% FCS. - Fyll 50 ml-røret med DMEM-10%FCS. Sentrifuge ved 423 x g i 5 min ved RT. Fjern forsiktig supernatant og resuspender cellepellet med 2 ml DMEM-10%FCS.
- Triturate cellepellet forsiktig med en p1000 mikropipette og deretter med en p200 mikropipette. Fortynn cellesuspensjonen med riktig volum av DMEM-10%FCS.
MERK: To hjerner = en T150 = 5 ml DMEM-10%FCS. - Plate 5 ml av cellesuspensjonen på en T150 med en tetthet på 1 x 105 celler/cm2. Legg til 20 ml varm DMEM-10%FCS til hver T150. Inkuber i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2.
- Forny halvparten av kulturmediet etter 6 dager in vitro (DIV) med varm DMEM-10%FCS.
6. Risting forberedelse
- Utfør risting av preparatet dagen før risting i en lamimerstrømningshette under sterile forhold.
- Forny halvparten av kulturmediet ved å legge til friskt varmt kulturmedium i kolben og inkuber ved 37 °C under 5 % CO2.
7. Risting
- Coat tre 100 mm Petri retter med PEI. Oppbevar dem ved 4 °C over natten.
- Dekk kolbehetten med parafinfilm og legg kolbene i en plastpose. Rist flasker som inneholder glialceller over natten ved 250 o/min ved 37 °C.
MERK: Første risting utføres på 8 DIV og man kan utføre opptil tre forskjellige ristinger (se figur 1 for timing).
8. OL avstamning celler høsting og kultur
MERK: Disse trinnene skal utføres i en lamimerstrømningshette under sterile forhold.
- På dagen etter risting, forberede Bottenstein-Sato (BS) medium i henhold til tabell 1.
- Skyll belagtpetriretter 3 ganger med sterilt destillert vann.
- Harvest flasker supernatant inneholder hovedsakelig OL avstamning celler, men også noen mikroglial celler og plate den på ikke-belagt 100 mm Petri retter.
MERK: Dette trinnet tillater fjerning av mikroglialceller gjennom differensial rask vedheking på parabolen. - Inkuber Petri-rettene i 15 min i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2.
- Fyll hver T150 kolbe med 25 ml varm nylaget kulturmedium og inkuber i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2 til den andre ristingen.
- Overfør supernatanten fra Petri-rettene til nye ikke-belagte 100 mm Petri-retter for å tillate vedhemsing av gjenværende mikroglialceller.
- Inkuber Petri-rettene i 15 min i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2.
- Fjern supernatanten, som inneholder ikke-tilhengerske OL-avstamningceller, og overfør den til 50 ml rør (supernatant fra 2 Petri-retter for et 50 ml rør). Kast Petri-retter belagt med microglia.
- Sentrifuge supernatant en 5 min på 423 x g. Fjern nøye supernatant og resuspender cellepellet med 1 ml BS medium. Pool alle pellets i en vanlig 50 ml rør og justere volumet til 10 ml med BS medium.
- Bestem celletetthettelleceller under et mikroskop.
MERK: En celletetthet mellom 3 x 105/ml og 5 x 105/ml skal oppnås. - Tilsett 20 ml BS hvis celletettheten er høyere enn eller lik 4 x 105/ml for å få et endelig volum på 30 ml, eller legg til bare 10 ml BS hvis celletettheten er mindre enn 4 x 105/ml for å få et endelig volum på 20 ml.
- Plate to eller tre forhåndsbelagte 100 mm Petri-retter med 10 ml cellesuspensjon. Inkuber i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2.
- Fjern rusk fra Petri retter ved å forfriske alle BS medium 2 h senere.
MERK: Undersøk kulturen under mikroskopet før og etter rydding for å verifisere celletetthet og effektivitet av fjerning av rusk. - Inkuber i 2 dager i BS medium i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2.
MERK: Undersøk kulturen under mikroskopet. Samtidighet bør være 70% til 80%.
9. OCM produksjon
MERK: Utfør disse trinnene i en lamimerstrømningshette under sterile forhold.
- Forbered NB-B27low medium i henhold til tabell 2.
- Forny kulturmedium med 10 ml varmt NB-B27low medium. Inkuber i 2 dager i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2.
- Høst OCM, det vil si supernatant som inneholder OL-utskillede faktorer. Filtersteriliser OCM ved hjelp av et 0,22 μm filter.
MERK: Oppbevar OCM ved 4 °C i maksimalt 2 måneder.
10. OCM tillegg
MERK: Trinn skal utføres i en lamimerstrømningshette under sterile forhold. OCM kan legges til renset hippocampal nevron kulturer utarbeidet i henhold til følgende protokoll14,og oppnås ved å legge til, 24 timer etter isolasjon, anti-mitotic midler uridin og 5- fluorodeoxyuridine (5 μM) for 36 h.
- Ved 3 DIV, fjern alle nevron kultur medium som inneholder anti-mitotic midler og tilsett 500 μL frisk varm OCM.
- Forny halvparten av mediet hver tredje dag med nylaget varm NB-B27.
MERK: Slike kulturer kan opprettholdes opptil 21 DIV.
11. Tillegg av OL til renset hippocampal nevron kultur
MERK: Utfør følgende trinn i en lamimerstrømningshette under sterile forhold. OLs kan legges til rensede hippocampal kulturer oppnådd på samme måte som beskrevet ovenfor.
- Forbered co-kultur medium i henhold til tabell 3.
- Hent OL-kulturen på 70% til 80% samløpet. Skyll med 2 ml varm 1x PBS.
- For å løsne cellene, legg til 2 ml 0,25% trypsin til en 100 mm Petri-tallerken.
- Inkuber i 5 min i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2.
- Tilsett 2 ml DMEM-10% FCS for å blokkere den enzymatiske reaksjonen. Høst supernatanten som inneholder OL-avstamningceller.
- Sentrifuge ved 423 x g i 5 min ved RT. Fjern forsiktig supernatant og resuspender cellepellet i varmt co-kulturmedium for å oppnå en konsentrasjon på 1,25 x 105 celler/ml.
- Legg OL til renset hippocampal nevroner kultur ved å fjerne 200 μL nevron kultur medium og legge til 200 μL celle suspensjon per brønn (2,5 x 104 celler / brønn) av en 24-brønn plate.
- Oppdater halvparten av co-kultur medium hver 2-3 dager.
MERK: Co-kulturer kan opprettholdes opptil 24 DIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen renses OL-avstamningceller fra glialkulturer ved å riste av astrocytter og microglia. Renhet og fanofitypisk undersøkelse av OL-kulturer kan vurderes ved immunstaining med glialmarkører15. Analyse av uttrykket av forskjellige markører indikerte at OL-kulturer for det meste var pre-OLs med 90% ± 4% av O4+ celler, 85% ± 7% NG2+ celler, og 4,7% ± 2,1% av PLP+ celler, mens 7,2% ± 2,5% av cellene var GFAP+ astrocytter (gjennomsnitt ± SD, n = 3; Figur 2). I tillegg var 4,6 % ± 0,7 % av cellene CD11b+ mikrogliale celler (gjennomsnitt ± SD, ikke vist).
OCM produsert fra slike kulturer kan legges til ved 3 DIV til rensede hippocampal nevron kulturer. Denne behandlingen fremmer klynger av nodale proteiner, bestående av Nav kanaler forbundet med Neurofascin 186 og Ankyrin G langs aksonen av hippocampal GABAergic nevroner før myelinasjon, ved 17 DIV (Figur 3A,B). Legg merke til at elektrofysiologiske opptak viste at disse klyngene er forbundet med økt ledning av handlingspotensialer14. I tillegg er uttrykk for fosforylert mellomliggende filamentprotein H farget av Smi31 økt i OCM-behandlede hippocampal nevroner (Figur 3A). Oligodendroglial utskillede faktorer er derfor innblandet i nevronal modning og fysiologi.
Myelinasjon av hippocampal nevroner kan studeres gjennom tillegg av OL ved 14 DIV. Fra 20 DIV til 24 DIV tillater immunbeising av myelinmarkører, som myelin grunnleggende protein (MBP) visualisering av myelinsegmenter (figur 4).
Figur 1: Protokolltidslinjen for OL-linjeceller isolasjon og OCM-produksjon. Etter å ha dissekert ut cerebrale kortices fra P2 Wistar rotter (trinn 4), utføre vev dissosiasjon til kultur glial celler (trinn 5). På 8, 12 og 15 DIV (dvs. dager før risting), forny halvmedium med varm DMEM-10% FCS (trinn 6). Neste dag rister du glialkulturer over natten ved 250 o/min ved 37 °C (trinn 7,2). Harvest supernatant inneholder OL avstamning celler og få microglia celler og plate det for 15 min i en fuktet inkubator ved 37 ° C under 5% CO2 (trinn 8,3 til 8,7). Sentrifuge supernatant en 5 min ved 423 x g, resuspendercellepellet med BS og inkubator i 2 dager i en fuktet inkubator ved 37 °C under 5 % CO2 (trinn 8,8 til 8,12). For å produsere OCM, inkuber i 2 dager i NB-B27low (trinn 9). Hvis du vil isolere OLs for co-kultureksperimenter, kobler du fra celle ved hjelp av trypsin (trinn 11.3). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: OL lineage celler fenotype i kulturer. Bilder ble anskaffet ved hjelp av et konfokalmikroskop. Maksimal intensitetprojeksjoner presenteres. (A) OL kulturer inneholder det meste pre-OLs (dvs. uttrykke bare NG2 (rød), eller både O4 (grønn) og NG2 (rød); celler som uttrykker begge markører er indikert med gule stjerner), men også noen umodne OLs (dvs. bare uttrykke O4 og ikke NG2; hvite stjerner). (B) Få modne OLs (dvs. PLP+; grønn) og få astrocytter (GFAP+ celler; rød) finnes i OL avstamning celle kulturer. Skalerstenger = 25 μm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative søknader. - Jeg har ikke noe åsi. Hippocampal nevroner behandlet med OCM på 3 DIV og fast ved 17 DIV uttrykke fosforylert mellomliggende filament protein H (Smi31; grønn; panel A). GABAergic nevroner, identifisert av glutamat decarboxylase isoform av 67 kDa (GAD67) uttrykk (hvit), vise akkumulering av Ankyrin G og Nav natriumkanaler (rød; paneler A og B, henholdsvis) på axon første segmentet og danner Ankyrin G og Nav klynger langs deres akson (paneler A og B, henholdsvis). Skalerstenger = 25 μm. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative søknader. OL avstamning celler lagt til hippocampal neuron kultur på 14 DIV myelinate noen hippocampal aksoner, her fast på 23 DIV (MBP som en myelin markør; grønn). Noder av Ranvier (Nav; rød) observeres mellom myelinsegmenter. Skala bar = 25 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Bottenstein-Sato (BS) medier | Endelig konsentrasjon |
| Dulbecco's Modifisert Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/ml |
| apo-Transferrin menneske | 100 μg/ml |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | 100 μg/ml |
| Insulin | 5 μg/ml |
| POLITIET | 10 ng/ml |
| Progesteron | 62 ng/ml |
| Putrescine dihydrochloride | 16 μg/ml |
| Natriumselenitt | 40 ng/ml |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumsalt) | 30 ng/ml |
| T4 (L-Tyroksin) | 40 ng/ml |
Tabell 1: Utarbeidelse av Bottenstein-Sato (BS) media.
| NB-B27 lave medier | Endelig konsentrasjon |
| Neurobasal (andre) | |
| B27 supplement | 0.5x (andre) |
| L-glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/ml |
| NB-B27 medier | Endelig konsentrasjon |
| Neurobasal (andre) | |
| B27 supplement | 1x (andre) |
| L-glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/ml |
Tabell 2: Utarbeidelse av NB-B27low og NB-B27 media.
| Co-kultur media | Endelig konsentrasjon |
| Dulbecco's Modifisert Eagle Medium | 1 vol |
| Neurobasal (andre) | 1 vol |
| B27 supplement | 1x (andre) |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/ml |
| apo-Transferrin menneske | 50 μg/ml |
| Biotin | 10 ng/ml |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | 50 μg/ml |
| Ceruloplasmin (nær Ceruloplasmin) | 100 ng/ml |
| Hydrocortisone | 0,05 μM |
| Insulin | 5 μg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | 5 μg/ml |
| Progesteron | 6.2 ng/ml |
| Putrescin (andre) | 16 μg/ml |
| Rekombinant Human CNTF | 0.1 ng/ml |
| Natriumselenitt | 5 ng/ml |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumsalt) | 40 ng/ml |
| Vitamin B12 | 27.2 ng/ml |
Tabell 3: Utarbeidelse av co-kultur media.
Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å vise denne filen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gir vi en detaljert protokoll for å oppnå svært berikede oligodendroglial avstamning cellekulturer fra blandede glial kulturer, tilpasset fra en tidligere publisert metode16,og den påfølgende produksjonen av OL-betinget medium. Denne risting teknikken er ikke dyrt, kan gjentas tre ganger og er optimal for å oppnå høy mengde rensede OLs, som celler dyrket i Bottenstein-Sato (BS) medium som inneholder PDGFα spredning. Glialceller er utarbeidet ved hjelp av cerebrale kortices av Wistar rotter på P2, et tidspunkt der et stort flertall av oligodendroglial avstamning celler er pre-oligodendrocytes uttrykkng NG2 og O415. Av notat, OL avstamning modning er lik ved P2 i mus og rotte, og denne protokollen kan også brukes til å isolere mus pre-oligodendrocytes17.
Etter å ha ristet de blandede glialcellekulturene, består frittliggende celler hovedsakelig av oligodendroglial avstamningceller, men også noen mikroglialceller og få astrocytter. Mikroglialceller fjernes gjennom differensialvedheking på ubestrøkede Petri-retter. Vær oppmerksom på at fjerningseffektiviteten kan forbedres ved å utføre et ekstra vedhendestrinn. Imidlertid er ca 5% av mikroglialceller fortsatt funnet i berikede oligodendroglial cellekulturer, samt 5% til 9% av astrocytter. Det er mulig å redusere kontaminering fra astrocytter til mindre enn 5% ved å utføre et ekstra immunpanoreringtrinn ved hjelp av O4 antistoffbelagte Petri-retter; for en detaljert protokoll, se tilleggsinformasjon i Freeman et al.14. Fjerning av rusk 2 t etter plating oligodendroglial celler er et kritisk skritt, som er avhengig av styrken av strømmen som brukes med pipetten. På dette trinnet er det viktig å undersøke kulturen under mikroskopet før og etter rydding for å verifisere effektiviteten, da tilstedeværelsen av for mye rusk kan svekke cellelevedyktighet og vekst. Merk, det er også viktig å bruke nylaget BS medium, ellers kan det endre oligodendrocytes overlevelse. I tillegg overlever rensede celler bare opptil 6 dager etter plating. Faktisk er det kjent at andre glialceller og nevroner fremmer OPC overlevelse og spredning eller differensiering gjennom utskillede faktorer eller direkte kontakter2,18.
Andre metoder tillater OLs isolasjon umiddelbart etter hjernedissosiasjon, ved hjelp av immunmerking med O4 antistoff etterfulgt av fluorescerende aktivert cellesortering ved flyt cytometri (FACS) eller magnetisk aktivert cellesortering (MACS). I tillegg kan GFP-positive OPCer eller GFP-positive oligodendrocytes renses ved fluorescerende aktivert cellesortering fra HENHOLDSVIS PDGFαR:GFP eller PLP:GFP-mus, henholdsvis 19,20. Disse sorteringsmetodene er mer relevante for å studere fysiologisk tilstand av oligodendrocytes sammenlignet med kulturer behandlet med vekstfaktorer som kan endre deres fenotype. Spesielt har fluorescerende aktivert cellesortering blitt brukt til genprofileringstilnærminger i normal fysiologisk tilstand og demyeliniserende forhold21. Som celle overlevelse kan endres av celle sortering, er det bedre å utføre funksjonelle analyser umiddelbart etter sortering.
Vi har vist at OL kulturer kan løsnes og legges til renset hippocampal nevron kulturer på 14 DIV. Slike OL-neuron co-kultur tillater studiet av tidlige trinn av myelinasjon som starter i løpet av den første uken av co-kultur (Dubessy, upubliserte resultater). Andre modeller av OL-hippocampal neuron myelinating co-kultur har blitt oppnådd ved å legge oligodendrocytes umiddelbart etter sortering22,23. Videre produserte vi OCM for ytterligere dissekere OL-nevroninteraksjoner og adressere rollen som OL-utskillede faktorer på nevronkulturer. Ved hjelp av denne teknikken viste vi at hippocampal GABAergic neuron subtyper (dvs. parvalbumin+ og / eller somatostatin+) kan danne klynger av nodal proteiner langs deres axon som er indusert av OCM før myelinasjon14,24. Massespektrometrianalyse av OCM har raknet flere utskillede proteiner og førte til å identifisere oligodendroglial Contactin-1 som isynergi med ekstracellulære matriseproteiner formidler tidlige trinn av nodalklynge24 . Primære kulturer er nyttige modeller som tillater vurdering av oligodendroglial avstamning celle differensiering og interaksjoner med nevroner. Imidlertid har andre tilnærminger også blitt utviklet for å evaluere OL-funksjoner og myelinasjon, demyelinasjon og remyelinasjon fra ex vivo cerebellar organotypiske skivekulturer25,26og in vivo studier, spesielt med sebrafisk og rumpetrollmodeller27 som er nødvendig i siste trinn av prekliniske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har konkurrerende interesser eller motstridende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Rémi Ronzano for hans kloke råd i manuskriptredigering. Dette arbeidet ble finansiert av ICM, INSERM, ARSEP foundation tilskudd til NSF, og Bouvet-Labruyère pris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
